用于工业生产柠檬酸的基因的制作方法

专利名称：：用于工业生产柠檬酸的基因的制作方法用于工业生产柠檬酸的基因本发明涉及新鉴定出的基因，其编码柠檬酸(生物)合成中涉及的蛋白质。本发明还涉及包含所述新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产柠檬酸中的用途，其中对所述多核苷酸和/或被编码的多肽的修饰对在所述微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影响。本发明还包括使用所述多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法/工艺。本发明还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于生产柠檬酸的用途。发明背景柠檬酸(2-羟基-丙烷-l，2，3-三羧酸)是已知的工业上重要的有机酸，其可用作为，例如，食物添加剂、防腐剂或油或脂肪的稳定性，因为其具有络合重金属离子，例如铜和铁的能力。最初，从柑橘类植物中分离出柠檬酸。对柠檬酸的化学合成也是可能的，但是，这根本不适合进行工业生产，因为原材料昂贵，工艺复杂，产率低下。因此，在过去数十年来，人们在研究使用微生物转化制造柠檬酸的其它手段，这将更经济更环保。使用不同培养方法从多种底物(包括葡萄糖或蔗糖)生产柠檬酸已被报道于若干种微生物中，例如真菌，包括酵母。能直接生产柠檬酸的已知真菌的例子包括，例如，来自J^e^7/^属的菌株，特别是Am'ger，或酵母，例如y"/rcw/"，特另!j是yia;rcw/fl/ir》o/jricfl。底物(例如，碳水化合物)向柠檬酸的转化可能涉及很多不同的代谢途径，并且牵涉到很多酶促步骤，以产生柠檬酸。此外，转运蛋白可能在底物向拧檬酸的高效转化中发挥重要作用。在将物质，例如碳水化合物(例如葡萄糖或糖醇)、羧酸盐/酯、矿物质、毒性化合物(例如反应活性氧)以及相关化合物在膜上转运的过程中具有活性的蛋白质(特别是转运蛋白)，在本文中被认为涉及转运系统(TS)。这种转运可以是运进胞质，运进/出线粒体、液泡、内质网、过氧化物酶体或运经另外的膜屏障。此类蛋白在本文中被縮写为TS蛋白，其在柠檬酸合成中具有功能，或在细胞内合成柠檬酸的过程中具有功能。一般而言，TS蛋白是膜结合的，或者与膜结合的结构相关，它们作为单种蛋白质或作为蛋白质复合物(例如透性酶或活性转运蛋白)中的亚基发挥功能。TS蛋白已知负责选择性促进、协助或使得化合物(例如，糖、糖醇、羧酸盐/酯、矿物质、毒性化合物)能够被转运经过细胞膜、周质膜或线粒体的液泡膜、内质网膜或过氧化物酶体膜。可基于其机制将TS蛋白质分为若干类。第一组转运蛋白也被称为离子通道，其使用来自质子运动力的能量，逆浓度梯度转运分子。同向转运和反向转运系统将两种不同分子经过膜的移动偶联起来(通过针对两种不同分子具有两个单独结合位点的透性酶)；在同向转运中，两种分子以同样的方向被转运；而在反向转运中，一种分子运进而另一种运出。还有一类被称为"次级转运蛋白"的转运蛋白一一磷酸转移酶系统(PTS)通过高能量磷酸基团从磷酸烯醇丙酮酸经由多种蛋白组分向底物的转移获得能量，底物在运入时被磷酸化为磷酸酯形式。该组的离子转运蛋白协助在膜上的扩散，例如，阳离子扩散协助蛋白(CDF)家族，或协助交换阴离子，例如阴离子交换蛋白(AE)家族。该组主要易化超家族(MajorFacilitatorSuperfamily，MFS)含有多种重要的糖转运蛋白。另一组转运蛋白将ATP的水解与底物易位偶联起来。这些系统被称为ATP结合盒(ABC)型转运蛋白。ABC转运系统由底物特异性结合蛋白(在革兰氏阴性细菌中位于周质中，或者，在革兰氏阳性细菌中与膜相关)、整合膜结构域和面向胞质的ATP水解结构域构成。对膜转运系统的更详细描述可在Bamberg,E.etal(1993)"Chargetransportofionpumpsonlipidbilayermembranes",Q.Rev.Biophys.26:1-25;Findlay，J.B.C.(1991)"Structureandfunctionofmembranetransportsystems",Curr.Opin.Struct.Biol.丄:804-810;Higgins,C.F.(1992)"ABCtransportersfrommicroorganismtoman"Ann.Rev.CellBiol.3:67-113;Gennis，R.B.(1989)"Pores,channelsandtransporters"in:Biomembranes,MolecularStructureandFunction,Springer,Heidelberg,p.270-322;Nikaido，H.&SaierH.(1992)"Transportproteinsinbacteria:commonthemesintheirdesign"Science258:936-942中找到。优选地，TS蛋白或此类蛋白的具有针对从碳水化合物合成拧檬酸的活性或涉及所述合成的亚基选自由己糖转运蛋白、离子转运蛋白、激酶、透性酶、同向转运蛋白、反向转运动蛋白、线粒体运载体(例如柠檬酸盐转运蛋白)或三羧酸盐运载体、线粒体组蛋白的遏制子(suppresor)和金属转运蛋白(例如，锰转运蛋白或锰抗性蛋白或铁转运蛋白)构成的组。在参与柠檬酸盐/酯合成的蛋白质，特别是酶，例如参与TCA的酶，例如，催化乙酰CoA与草酰乙酸盐/酯縮合形成柠檬酸的酶，在本文中被称为涉及柠檬酸盐/酯合成系统，并被縮写为CS蛋白，其在柠檬酸合成中发挥功能。优选地，CS蛋白或者此类蛋白的具有针对柠檬酸盐/酯合成的活性或参与柠檬酸盐/酯合成的亚基选自由柠檬酸盐合酶、乙醛酸循环体柠檬酸盐合酶、乌头酸酶、乌头酸盐水合酶或水解酶以及6-磷酸果糖激酶。参与侧支反应的蛋白质，特别是酶，例如，Mn依赖性线粒体超氧化物歧化酶(MnSOD)，参与所谓的柠檬酸合成途径"旁路"的基因，例如，草酰乙酸水解酶、葡糖氧化酶和/或乙醇酸盐(氧化)还原酶，可能对柠檬酸合成的细胞内过程造成影响。此类酶在本文中被縮写为BS蛋白或BS酶。以前已报道过用Aspergillus的菌株来生产柠檬酸(见，例如，KaraffaandKubicek,ApplMicrobiolBiotechnol，61:169-196,2003)。然而，如现有技术所知，柠檬酸生产的产率和/或生产能力仍可被提高，这正是本发明的目的之一。图1:BS08基因置换型载体pGBDEL-SODA的质粒图谱。该质粒用于打断BS08基因。标出了相对于amdS标记而言的5'BS08侧翼区域(示为5，sodA)和3，BS08侧翼区域(示为3，sodA)。BS083，片段的序列在序列上覆盖至少数百bp。通过在转化A.niger菌株之前用限制性酶^出I和Xwal消化来除去E.coliDNA。图2:BS08基因缺失的示意图。通过双交叉同源重组(X)，将包含侧翼有BS08基因同源区域(5'和3，)的amdS选择标记的线性DNA构建体pGBDEL-SODA(1)整合进基因组的BS08基因座(2)，并且替换基因组BS08基因拷贝(3)。随后，正向重复上的重组(U)除去了amdS标记，导致了对BS08基因的精确切割(4)。图3:表达载体pGBFIN-23的质粒图谱。这是基于pGBFIN的表达载体的例子，例如，pGBFIN-23。标出了相对于g/flA启动子而言的glaA侧翼区域和克隆位点(针对目标基因)。可通过在转化Am'gw菌株之前用限制性酶7VwI消化来除去Eco〃DNA。图4:表达载体pGBTOPGLA-l的质粒图谱。这是基于pGBTOP的表达载体的例子。标出了pBTOPGLA-l的质粒图谱，这是整合型表达载体，其含有与目标基因编码序列可操作相关的启动子。图5:过量表达载体pGBFINMNR-l的质粒图谱。该质粒包含TS08基因，其示为mnrl。标出了相对于g/aA启动子而言的glaA侧翼区域以及编码本发明锰抗性蛋白的插入(在///mffll-loI克隆位点中)。可通过在转化Am'gw菌株之前用限制性酶A^I消化来除去五.DNA。图6:过量表达菌株在表面发酵中的表现。示出了表2的菌株，按照实施例4所述进行发酵。多种菌株的表现被示出为较之WT3菌株产率(被设定为100%)而言的柠檬酸生产产率。图7:BS08打断背景的过量表达菌株在表面发酵中的表现。示出了表2的菌株，按照实施例4所述进行发酵。多种菌株的表现被示出为较之WT3菌株产率(被设定为100%)而言的柠檬酸生产产率。图8:过量表达菌株在深浸发酵中的表现。示出了表2的菌株，按照实施例5所述进行发酵。多种菌株的表现被示出为较之WT3菌株产率(被设定为100%)而言的柠檬酸生产产率。图9:BS08打断背景的过量表达菌株在深浸发酵中的表现。示出了表2的菌株，按照实施例5所述进行发酵。多种菌株的表现被示出为较之WT3菌株产率(被设定为100%)而言的柠檬酸生产产率。发明详述令人吃惊地，我们发现，具有下述核苷酸序列的多核苷酸编码的蛋白在对柠檬酸的生物技术生产中具有重要作用，所述核苷酸序列优选在高度严谨条件下分别与选自SEQIDNOs:1、6、11和16的组的TS08、TS09、CS07和BS08核苷酸序列杂交。现还已发现，通过在能直接生产柠檬酸的微生物(例如Aspergillus)中对根据本发明的核苷酸的表达水平进行遗传改变，可很大程度地提高所述微生物中柠檬酸生产的效率，导致，例如，更高的柠檬酸产量和/或产率。因此，本发明涉及选自下述组的TS08、TS09、CS07禾卩/或BS08多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述组由(a)编码分别包含选自SEQIDNOs:2、7、12和17的组的氨基酸序列的TS08、TS09、CS07或BS08多肽的多核苷酸；(b)包含选自SEQIDNOs:1、6、11和16的组的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并分别使用选自SEQIDNO:3和SEQIDNO:4、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14或SEQIDNO:18和SEQIDNO:19的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得；(d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有TS08、TS09、CS07或BS08多肽的活性;(e)编码TS08、TS09、CS07或BS08多肽的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及(f)编码TS08、TS09、CS07或BS08多肽的多核苷酸，且其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少70%同源，例如75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源；构成。在本发明的一种优选实施方式中，本发明涉及选自下述组的TS08和/或TS09多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述组由(a)编码分别包含选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的氨基酸序列的TS08或TS09多肽的多核苷酸；(b)包含根据SEQIDNO:l或SEQIDNO:6的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并分别使用根据SEQIDNO:3和SEQIDNO:4或SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得；(d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有TS08或TS09多肽的活性；(e)编码TS08或TS09多肽的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及(f)编码TS08或TS09的多核苷酸，且其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少70%同源，例如75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源;构成。我们发现，本文中描述的SEQIDNOs:2、7、12和17示出的从A^wgz7/wsm'gwCBS513.88分离的TS、CS和BS蛋白是特别有用的TS蛋白，因为看起来其在微生物(特别是真菌，例如^^wg///^)中的柠檬酸生产中发挥关键作用。因此，本发明涉及编码选自SEQIDNOs:2、7、12和17的多肽的多核苷酸。所述蛋白可由分别选自SEQIDNOs:1、6、11和16的组的核苷酸序列编码。本发明因此还涉及包含选自SEQIDNOs:1、6、ll和16的组的核苷酸序列的多核苷酸。对应的cDNA's分别示于SEQIDNOs:5、10、15和20中。上文确定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作为"查询序列"，以用来自NationalCenterforBiotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)针对数据库PROSW-SwissProt(完全发布版本加上增加的更新)进行搜索。由这些搜索中，将根据SEQIDNO:1的TS08多核苷酸标注为编码具有锰抗性蛋白1活性的蛋白。将根据SEQIDNO:6的TS09多核苷酸标注为编码具有对铁和锰的转运活性的蛋白。将根据SEQIDNO:11的CS07多核苷酸标注为编码具有柠檬酸盐合酶活性的蛋白。可从CS和/或TS基因表达的增强和TS和/或CS多肽活性的增加或提高预计到拧檬酸产量的提高。将根据SEQIDNO:16的BS08多核苷酸标注为编码具有线粒体超氧化物歧化酶MnSOD活性的蛋白。可从编码锰依赖性线粒体超氧化物歧化酶的MnSOD基因的打断/下调，预计到柠檬酸产量的提高。对MnSOD的打断可能导致形成的超氧化物离子基降解受损。超氧化物导致的对蛋白质、脂类和核酸的"损伤"可解释A.niger中Mn缺陷导致柠檬酸积累的很多多效性影响。可使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物(例如分别根据SEQIDNO:3禾卩SEQIDNO:4、SEQIDNO:8禾口SEQIDNO:9、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14或SEQIDNO:18和SEQIDNO:19的核苷酸引物组)，按照标准PCR扩增技术，通过核酸扩增来获得编码分别根据SEQIDNOs:2、7、12和17的TS08、TS09、CS07或BS08多肽的核酸。优选地，根据SEQIDNO:3和SEQIDNO:4或SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的引物组被用于获得编码TS多肽(优选地，分别根掘SEQIDNOs:2禾P7的TS08或TS09多肽)的核酸。由此扩增出的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析对其进行表征。此外，可通过对核酸的合成构建来获得核酸。表1显示了对本发明的DNA、多肽、编码序列和核苷酸引物的SEQIDNOs的总览。本文中使用的术语"多核苷酸"和"核酸"意欲描述DNA或编码序列。从而，例如，术语"TS08多核苷酸"等包括根据SEQIDNO:1的TS08DNA和SEQIDNO:5的TS08编码序列，但不包括根据SEQIDNOs:3和3的TS08正向/反向引物。类似地，本文中使用的术语"多肽"或"蛋白"意欲描述蛋白或多肽序列。从而，例如，术语"TS08多肽"等包括根据SEQIDNO:2的TS08多肽。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表1:本发明的DNA、多肽、编码序列和核苷酸引物的SEQIDNOs的总览本文中使用的术语"基因"指可从染色体DNA分离的多核苷酸。从而，例如，术语"TS08基因"等包括根据SEQIDNO:1的TS08多核苷酸。用于反应的模板可以是通过对从已知包含或怀疑包含根据本发明的多核苷酸的菌株制备的mRNA进行逆转录获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆和测序，以确保扩增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通过多种已知方法，用PCR片段分离全长CDNA克隆。例如，可标记扩增出的片段，用其筛选噬菌体或粘粒(cosmid)cDNA文库。或者，经标记的片段可用于筛选基因组文库。因此，本发明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并分别使用选自SEQIDNO:3禾口SEQIDNO:4、SEQIDNO:8禾卩SEQIDNO:9、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14或SEQIDNO:18和SEQIDNO:19的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得。优选地，根据SEQIDNO:3和SEQIDNO:4或SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的引物组被用于分别获得本发明的TS08或TS09多核苷酸。本发明还涉及下述多核苷酸，其包含编码被编码的CS07、BS08、TS08或TS09多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有TS、CS或BS多肽(优选地，CS07、BS08、TS08或TS09多肽)的活性。本发明还涉及下述多核苷酸，其编码TS、CS或BS多肽(优选地，CS07、BS08、TS08或TS09多肽)，其互补链能在严谨条件下与本文定义的多核苷酸杂交。本发明还涉及下述多核苷酸，其与本文定义的多核苷酸至少70%同源，并且其编码CS07、BS08、TS08或TS09多肽；本发明还涉及是上文定义的多核苷酸的互补链的多核苷酸。本发明还涉及可用于扩增或探测根据本发明的TS、CS和/或BS多核苷酸，以及可用于鉴定也携带有此类基因的微生物的种或科的引物、探针和片段。本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体。因此，本发明涉及包含本发明的TS08、TS09、CS07禾口/或BS08多核苷酸(优选地，TS08禾口/或TS09多核苷酸)的载体以及含有本发明的TS08、TS09、CS07禾卩/或BS08多核苷酸(优选地，TS08和/或TS09多核苷酸)的载体，其中，所述多核苷酸与表达控制序列可操作地相连，以允许在原核和真核细胞中表达。本发明还涉及用本发明的TS08、TS09和/或CS07多核苷酸和/或上文刚描述的载体遗传工程改造过的微生物。这些经工程改造的微生物被命名为TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07和TS08/TS09/CS07微生物。在另一实施方式中，上述微生物还经过包含下述多核苷酸的多核苷酸的额外遗传工程改造，所述多核苷酸用于打断或下调BS08多核苷酸。这些经工程改造的微生物可被命名为TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、deltaBS08曙TS08、deltaBS08-TS09、deltaBS08-CS07、deltaBS08-TS08/TS09、deltaBS08-TS08/CS07、deltaBS08-TS09/CS07禾卩deltaBS08陽TS08/TS09/CS07微生物。在另一实施方式中，在上述微生物中，通过对细胞中存在的、对于BS08多核苷酸的表达来说必要的核酸序列的修饰或失活来获得BS08多肽产量或活性的降低。本发明还涉及经遗传工程改造的微生物TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、deltaBS08-TS08、deltaBS08-TS09、deltaBS08-CS07、deltaBS08-TS08/TS09、deltaBS08-TS08/CS07、deltaBS08-TS09/CS07和deltaBS08-TS08/TS09/CS07，其中，通过对细胞中存在的、对于BS08多核苷酸的表达来说必要的核酸序列的修饰或失活获得了可选被降低的BS08多肽产量或活性，所述微生物能以100g/l或更多的量从蔗糖生产柠檬酸。本发明还涉及生产能表达上文定义的多核苷酸编码的的多肽的微生物和上文定义的多核苷酸编码的多肽的工艺。因此，本发明涉及生产能表达TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的细胞的工艺，所述工艺包括用本发明的TS08、TS09和/或CS07多核苷酸或包含本发明的TS08、TS09和/或CS07多核苷酸的载体对细胞进行遗传工程改造。优选地，所述工艺包括用编码TS08、TS09禾P/或CS07多肽的多核苷酸对细胞进行遗传工程改造，其中，所述多核苷酸可被包含于载体中。在另一实施方式中，用于生产能表达上文所述的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的细胞的工艺额外包含用包含下述多核苷酸的多核苷酸进行的额外遗传工程改造，所述多核苷酸用于打断或下调BS08多核苷酸。本发明还涉及上文定义的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多核苷酸用于从碳水化合物生产柠檬酸的用途。在一种优选实施方式中，上文所述的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多核苷酸用于从碳水化合物生产柠檬酸的用途与包含下述多核苷酸的多核苷酸用途组合，所述多核苷酸用于打断或下调BS08多核苷酸。在另一实施方式中，TS08、TS09或CS07多核苷酸与表达控制序列可操作地相连，并被转入微生物中。更优选地，所述表达控制序列包含调控序列和/或启动子序列和/或终止子序列，其中，这些序列中的至少一种被改变，所述改变以使得所述微生物从碳水化合物生产柠檬酸的产率和/或效率提高的方式进行。进一步更优选地，所述表达控制序列被改变，所述改变以使得分别编码TS08、TS09禾n/或CS07多肽的活性增加和/或提高的方式进行。优选地，用于生产柠檬酸的碳水化合物优选是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、玉米、木薯和多元醇构成的组的碳水化合物。本发明还涉及下述微生物，其中，TS和/或CS多肽的活性，优选地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的活性，例如，分别根据SEQIDNOs:2、7和12的多肽的活性被增强和/或提高，使得从碳水化合物生产的柠檬酸的产率增加。优选地，上文所述的包含具有增强和/或提高的活性的多肽的微生物生产的柠檬酸的产率较之亲本微生物生产的柠檬酸的量增加至少1%、2%、3%、4%、8%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500%或者更高。这可例如通过将根据本发明的多核苷酸转入重组或非重组微生物来实现，所述微生物可以含有CS07、BS08、TS08禾口/或TS09基因的内源等同物，或者可以不含。本发明还涉及下述微生物，其中，TS和/或CS多肽的活性，优选地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的活性，例如，分别根据SEQIDNOs:2、7和12的多肽的活性被增强和/或提高，并且，BS08蛋白，例如根据SEQIDNO:17的多肽的活性被减少或消失，使得从碳水化合物生产的拧檬酸的产率增加。优选地，上文所述的包含具有增强和/或提高的活性的多肽的微生物生产的柠檬酸的产率较之亲本微生物生产的柠檬酸的量增加至少1%、2%、3%、4%、8%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500%或者更高。因此，本发明涉及在微生物中生产增强的内源TS08、TS09或TS08/TS08基因的工艺，所述微生物包含编码TS08或TS09多肽的多核苷酸，例如，分别根据SEQIDNOs:2和7的TS08或TS09多肽，所述工艺包括对所述多核苷酸进行改变的步骤，所述改变以使得所述微生物对从碳水化合物生产的柠檬酸的生产的产率和/或效率提高的方式来进行。在另一实施方式中，额外地，在上文所述具有增强的内源TS08、TS09或TS08/TS09基因的微生物中，通过对所述微生物中含有的、包含编码CS07多肽(例如，根据SEQIDNO:12的CS07多肽)的多核苷酸的多核苷酸进行改变来增强CS07基因。在另一实施方式中，额外地，在上文所述具有增强的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因的微生物中，内源BS08基因被打断和/或下调，这通过改变所述微生物中含有的、编码BS08多肽(例如，根据SEQIDNO:17的多肽)的多核苷酸来实现。在另一实施方式中，在上文所述具有增强的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因，或具有增强的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因以及打断或下调的BS08基因的组合的微生物中，通过修饰或失活BS08基因表达所需的多核苷酸序列(优选地，控制序列)来获得对内源BS08基因的降低的表达。在另一实施方式中，本发明涉及在微生物中生产TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的工艺，所述工艺包括改变所述微生物的步骤，使得所述微生物生产具有增加和/或提高的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07活性的所述多肽，可选地，组合有减少的或消失的BS08活性，使得所述微生物对从碳水化合物生产的柠檬酸的生产产率和/或效率提咼°在另一实施方式中，本发明涉及生产能生产柠檬酸的微生物的工艺，所述工艺包括改变所述微生物的步骤，使得所述微生物生产具有增加和/或提高的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07活性的多肽，可选地，组合有减少的或消失的BS08活性，使得所述微生物对从碳水化合物生产的柠檬酸的生产产率和/或效率提咼。在另一实施方式中，本发明涉及生产含有至少一种包含本发明的多核苷酸(优选地，编码TS08、TS09)的内源基因的微生物的工艺，所述工艺包括改变所述微生物的步骤，使得所述至少一种内源基因过量表达，导致所述微生物对从碳水化合物生产的柠檬酸的产率和/或效率提高。在一种优选的实施方式中，所述工艺额外包括下述改变微生物的步骤，使得包含编码BS08多肽的多核苷酸的内源基因被下调或打断。技术人员将知道如何增强和/或提高TS禾口/或CS蛋白(优选地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白)的活性。这些可以例通过对宿主生物进行遗传修饰来完成，所述遗传修饰以较之野生型生物产生更多或更稳定的TS和/或CS蛋白(优选地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白)的拷贝的方式来进行。技术人员将理解，重组和经典遗传技术都可用于突变、修饰、增强或过量表达TS和/或CS基因，以使得基因或多个基因的活性提高和/或表达增加。类似地，技术人员将知道如何使BS蛋白(优选地，BS08蛋白)的活性降低或消失。这例如可以通过对宿主生物进行遗传修饰来完成，所述遗传修饰以较之野生型生物产生更少或不产生BS蛋白(优选地，BS08蛋白)的拷贝的方式来进行。类似地，技术人员将理解，重组和经典遗传技术都可用于使BS蛋白的比活性减少或消失。此外，技术人员将理解，重组和经典遗传技术都可用于使基因(优选地，BS08基因)突变、打断、缺失、修饰或失活，从而使得基因或多个基因的表达减少。此外，例如可通过重组和经典诱变技术的组合，来获得包含多种被上调和下调基因的组合的微生物。例如，可通过重组方法获得TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的过量表达；随后，可使用经典诱变来下调BS08多核苷酸。根据另一实施例，可通过经典诱变来下调或打断内源BS08多核苷酸，接着重组过量表达TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多核苷酸。经典和重组技术的其它组合也是本发明所包括的。在下述说明书中，将对通过增加TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白的活性，增加对从碳水化合物生产的柠檬酸的产率和/或产量的流程进行详细描述。在进行必要修正后，这些方案可应用于其它TS和/或CS蛋白。为获得产生更多拷贝的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因和/或蛋白的生物进行的修饰可包括使用强启动子，或者对TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因(的部分)或其调控元件加以突变(例如，插入、缺失或点突变)。这还可包括将多个拷贝的基因插入到合适的微生物中。TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白比活性的增加也可通过本领域已知的方法来完成。此类方法可包括对TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因(的部分)的突变(例如，插入、缺失或点突变)。适合经典诱变的物理或化学诱变剂的例子包括Y射线或紫外(UV)照射、羟胺、N-甲基-N，-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、蚁酸和核苷酸类似物。使用此类试剂时，典型地，通过下述方法来进行诱变在存在选用的诱变剂的情况下，在合适条件下培养待诱变的亲本细胞，以及选出展示出基因的表达降低的突变体细胞。本领域中还已知可以通过将TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白与特定增强子相接触或与能与TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白发生特异性相互作用的其它物质相接触，来增强给定蛋白质活性的方法。为鉴定出此类特定增强子，可表达TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白，并对存在怀疑能增强各TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白活性的化合物时的活性加以测试。还可通过对分别编码TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白的信使RNA进行稳定化来增加TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白的活性。此类方法也是本领域己知的，见，例如Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.禾口Ausubeletal.(eds.),1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)。在下述说明书中，将对通过使BS08蛋白的活性降低或消失，增加从碳水化合物生产的柠檬酸的产率和/或产量的流程进行详细描述。在进行必要修正后，这些方案可应用于其它BS蛋白。为获得产生更少拷贝的或不产生BS08基因和/或蛋白的生物所进行的修饰可包括使用弱启动子，或者对BS08基因(的部分)或其调控元件加以突变(例如，插入、缺失或点突变)。使BS08蛋白比活性减少或消失也可通过本领域已知的方法来完成。此类方法可包括对BS08基因(的部分)的突变(例如，插入、缺失或点突变)。本领域中还已知可以通过将BS08蛋白与特定抑制剂相接触或与能与BS08蛋白发生特异性相互作用的其它物质相接触，来使给定蛋白质活性降低或消失。为鉴定出此类特定抑制剂，可表达BS08蛋白，并对存在怀疑能抑制BS08蛋白活性的化合物时的活性加以测试。可能的抑制用化合物可例如是针对BS08蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。此类抗体可通过对合适的实验动物进行常规免疫方案来获得。本发明可在携带有TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/Bs08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/Bs08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08基因或其同源物的任何微生物中进行。合适的微生物可选自真菌，特别是有丝真菌，或酵母，它们可作为野生型菌株存在，或者作为通过经典诱变和选择方法获得的突变体菌株存在，或者作为重组菌株存在。"有丝真菌"包括Eumycota和Oomycota亚门的所有有丝形式(如前文Hawksworthetal.，1995所定义的)。此类微生物的例子包括但不限于J5^erg7'〃us、^cremom.w附、v4wreo6os7.t//Mm、Ojptococci^、Fz加cwWww、Fws腦'謹、//簡/co/a、Magwa/oW/e、Mwcw、Afyce/z'op融ora、脸ocfl〃z7wos"'x、7Vewras^ora、i3aec//om_yc&s\尸em'"'〃z'wm、尸^om少ces、；Sc/n.zo//z_y〃wm、ra/aro附yces、TTzermooscws、77u'e/avi.a、7b/_y;oc/a&wm禾P7Wc/oAmra。本发明的优选的微生物选自有丝真菌的组，优选地，选自Aspergillus,更优选地，选自J.m'ger、Aa丽,n'、Aacw/e"加、i.y'opom'cws、Ao，ae、J.vflt/e腦's、J.car6ow腦'MS、A励/"ge/w^、A/a"z'co,幽s、爿.Zra577/e聽、、J.n's、J.cost鎖'cae腦^或J./o幼V/ws，进一步更优选地，选自Aybe/油svarac油s或A/oe"V/ws，；"腿W5S进一步更优选地，选自爿.m'，var，謂on'，进一步更优选地，选自vlATCC1015,以及最优选地，选自Am'gwCBS513.88。本发明的微生物可在DNA水平或蛋白质水平上携带其它修饰(见上文所述)，只要此类修饰对生产柠檬酸的产率、产量和/或效率具有直接影响即可。由此，本发明的微生物可通过经典诱变和分子生物学的组合携带其它修饰，使得柠檬酸生产能力提高。此类其它修饰可例如影响编码TS蛋白(例如，离子或糖转运蛋白)的其它基因；涉及所谓"旁路"，例如，草酰乙酸盐水解酶、葡糖氧化酶和/或乙醇酸盐(氧化)还原酶的BS基因；编码涉及柠檬酸盐/酯生物合成的蛋白(例如，柠檬酸盐合酶、乌头酸酶)的CS基因；编码涉及呼吸系统的蛋白(例如线粒体质子泵NADH:泛醌还原酶或氧化酶、6-磷酸果糖激酶pfkA，或细胞色素依赖性呼吸酶中的突变或替代性呼吸途径)的基因。进行此类修饰的方法是本领域已知的，一些例子在本文中有进一步描述。在一种实施方式中，本发明涉及经修饰的微生物，其中，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的活性被增强和/或提高，BS蛋白，优选地，BS08蛋白的活性被减少或消失，使得从碳水化合物生产的柠檬酸的产率增加，同时组合上文定义的其它修饰，特别在可用于生产柠檬酸的编码草酰乙酸盐水解酶的基因中携带进一步的缺陷，例如，WO04/070022所述的。根据本发明的另一目的，提供了本文定义的多核苷酸或者已用此类多核苷酸进行过遗传工程改造的微生物在生产柠檬酸中的用途。本发明还涉及在微生物中表达内源基因的工艺，涉及在微生物中生产上文定义的多肽的工艺，以及生产能产生柠檬酸的微生物的工艺。所有这些工艺都可包含改变微生物的步骤，其中，本文中使用的"改变"包括下述工艺，该工艺以使得发酵产物的产率和/或生产能力较之野生型生物有所提高的方式来进行"遗传改变"或"改变细胞培养基的组成和/或改变用于培养的方法"。根据本发明的另一方面，提供了通过发酵生产柠檬酸的工艺。因此，本发明提供了从碳水化合物生产柠檬酸的工艺，其中，在允许从所述碳水化合物生产柠檬酸的条件下，在水性营养培养基中培养上文所述的微生物，并且，其中，柠檬酸作为发酵产物被分离。在一种优选的实施方式中，本发明提供了用可从本发明的方法之一获得的微生物来生产柠檬酸的工艺，其中，在允许从碳水化合物生产柠檬酸的条件下，在水性营养培养基中培养所述微生物，并且，其中，柠檬酸作为发酵产物被分离。更优选地，碳水化合物选自由葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、玉米、木薯和多元醇构成的组。本实施方式的微生物包含1)用本发明的TS08、TS09禾卩/或CS07多核苷酸和/或本文刚描述过的载体进行过遗传工程改造的微生物。这些经工程改造的微生物被命名为TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07和TS08/TS09/CS07微生物。可选地，上述微生物经过了下述多核苷酸进行的额外遗传工程改造，所述多核苷酸包含用于打断或下调BS08多核苷酸的多核苷酸。这些经工程改造的微生物被命名为TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、deltaBS08-TS08、deltaBS08-TS09、deltaBS08-CS07、deltaBS08-TS08/TS09、deltaBS08-TS08/CS07、deltaBS08-TS09/CS07和deltaBS08-TS08/TS09/CS07微生物。可选地，在上述微生物中，通过对细胞中存在的、对于BS08多核苷酸表达来说必要的核酸序列进行修饰或失活来获得BS08多肽活性或产量的降低。2)能以100g/l或更多的量从蔗糖生产柠檬酸的(1)的微生物。3)下述微生物，其中，TS和/或CS多肽的活性，优选地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的活性，例如，分别根据SEQIDNOs:2、7和12的多肽的活性被增强和/或提高，使得从碳水化合物生产的柠檬酸的产率增加。优选地，上文所述的包含具有增强和/或提高的活性的多肽的微生物生产的柠檬酸的产率较之亲本微生物生产的柠檬酸的量增加至少1%、2%、3%、4%、8%、10%、15°/。、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500。/。或者更高。4)下述微生物，其中，TS和/或CS多肽的活性，优选地，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的活性，例如，分别根据SEQIDNOs:2、7和12的多肽的活性被增强和/或提高，并且，BS08蛋白，例如根据SEQIDNO:17的多肽的活性被减少或消失，使得从碳水化合物生产的柠檬酸的产率增加。优选地，上文所述的包含具有增强和/或提高的活性的多肽的微生物生产的柠檬酸的产率较之亲本微生物生产的柠檬酸的量增加至少1%、2%、3%、4%、8%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500%或者更高。5)如(1)至(4)中任意一项所述的微生物，其中，所述微生物选自有丝真菌的组，优选地，选自As^e^/〃ws，更优选地，选自Am'gw、Aa丽mon'、Aacw/e齒s、Aya/画'ci^、Ao，ae、爿.vat/e腦、、J.carZwzan'ws、A励z7zgms^、i./"Wco,齒5"、AZra威e/W7、、n、、爿.cost"r/cae腦^或爿./o"油s，进一步更优选地，选自爿.var或j./be"'fifi^var戸〃油s，进一步更优选地，选自Am'gwvar譜画on'，进一步更优选地，选自A"/gwATCC1015，以及最优选地，选自Am'g^CBS513.88。可被转化为柠檬酸的合适的碳水化合物可以例如是葡萄糖，或选自对其的吸收导致葡萄糖形成的碳源的组，例如，蔗糖、淀粉、玉米、糖蜜、木薯或多元醇。在糖蜜的情况下，可以使用甜菜或甘蔗糖蜜。碳水化合物可以是液化的形式，例如液化的玉米、淀粉或木薯，或者其可以是糖浆形式，例如葡萄糖、果糖、蔗糖或糖蜜的糖浆。所述底物的组合也是可行的。取决于发酵条件和所用的菌株，用作为底物的碳水化合物可变动。在深浸发酵的情况下，优选的碳水化合物选自，例如，葡萄糖、蔗糖糖浆或液化淀粉。在表面发酵的情况下，优选的碳水化合物选自，例如，糖蜜或蔗糖糖浆。深浸和表面发酵都是本发明所包括的。对柠檬酸工业生产的一个例子见US5081025所述。在使用微生物进行上述工艺的方面，将碳水化合物转化为柠檬酸表示，碳水化合物转化导致柠檬酸产生的过程是所述微生物进行的，即，底物可直接转化为柠檬酸。在上文所述允许从碳水化合物进行此类转化的条件下培养所述微生物。适合从给定碳水化合物生产柠檬酸的微生物能通过一个或多个生物转化步骤将所述碳水化合物转化为特定的产物，即，柠檬酸，而无须任何额外的化学转化步骤。在本文中用于使用微生物进行的上述工艺的培养基可以是用于生产柠檬酸的任何合适的培养基。典型地，该培养基是包含例如盐和(多种)底物，并具有一定pH的水性培养基。本文中使用的"发酵"或"生产"或"发酵工艺"可以是在适合于将合适的底物转化为想要的产物(例如柠檬酸)的合适条件下，利用技术人员已知的培养基、条件和方案，使用生长中的细胞，或使用非生长中的所谓静止细胞来进行，这在使用技术人员已知的培养基、条件和方案对所述静止细胞进行培养之后进行。关于生产柠檬酸的此类工艺的一个例子见"CitricAcid",MaxRoehr，ChristianKubicek，JiriKominek,inBiotechnology2ndEd,WileyVCH,1997,pp308-345(通过引用并入本文)所述。典型地，发酵以分批、补料分批或连续模式进行。通过对从Ay/e^/〃wm'gerCBS513.88获得的基因组克隆进行测序，来分别测定包含选自编码TS08、TS09、CS07或BS08蛋白的SEQIDNOs:1、6、ll和16构成的组的核苷酸序列的基因的序列。本发明还涉及编码分别根据SEQIDNOs:2、7、12和17的TS08、TS09、CS07或BS08多肽的至少一个生物活性片段或衍生物的多核苷酸。本文中使用的"生物活性片段或衍生物"表示保留有与选自SEQIDNOs:2、7、12和17的组的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信号传递活性、转运蛋白活性或抗体反应活性。术语"生物功能"或"功能等同物"在本文中使用时表示蛋白质与选自SEQIDNOs:2、7、12和17的组的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活性、信号传递活性或者抗体反应活性。本发明的多肽和多核苷酸优选以经分离的形式提供，优选地，被纯化至均质。术语"经分离的"表示物质被移出其原来的环境(例如，如果其天然存在的话，就是天然环境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的，但与天然系统中的一些或全部共存物质分开的同样的多核苷酸或多肽就是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，但仍然是经分离的，因为此类载体或组合物并非其天然环境的一部分。本文中使用的经分离的多核苷酸或核酸可以是这样的DNA或RNA，它们与从中获得该多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因组中紧密相邻的两条编码序列(5'末端一条，3，末端一条)并非紧密相邻。因此，在一种实施方式中，核酸包括与编码序列紧密相邻的5'非编码(例如，启动子)序列的一些或全部。术语"经分离的多核苷酸"因此包括，例如，加入到载体中、加入到自主复制质粒或病毒中，或者加入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或者作为独立于其它序列的单独分子(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。其还包括是杂合体基因的一部分的重组DNA，所述基因编码基本不含细胞物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其它化学物质(当通过化学方式合成时)的额外多肽。此外，"经分离的核酸片段"是这样的核酸片段其天然并不作为片段存在，并且将不会在天然状态被发现。本文中使用的术语"多核苷酸"、"基因"和"重组基因"指可与染色体DNA分离开的、包括编码蛋白质(例如，ACBS513.88TS、CS或BS蛋白)的开放读码框的核酸分子。多核苷酸可包括，例如，选自SEQIDNOs:1、6、ll和16构成的组的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或下游的区域，所述区域可包括，例如，对于由其获得的多肽的适当表达和稳定来说重要的启动子区域、调控子区域和终止子区域。基因可包括编码序列、非编码序列(例如，位于基因编码区域3'末端和5'末端的非翻译序列)和调控序列。此外，基因指本文定义的经分离的核酸分子。技术人员还将理解，导致TS、CS或BS蛋白氨基酸序列的变化的DNA序列多态性可存在于种群(population)中，例如，vi^erg/〃1^肌'ger种群中。CS07、BS08、TS08或TS09基因中的此类遗传多态性可由于天然变异存在于种群的个体间，或者存在于不同种群的细胞中。典型地，此类天然变异可导致CS07、BS08、TS08或TS09基因核苷酸序列中1-5%的变化度。作为天然变异结果的、并且不会改变TS蛋白的功能活性的CS07、BS08、TS08或TS09中的任何以及全部此类核苷酸变异和由此得到的氨基酸多态性也包括在本发明的范围内。本文中使用的术语"多核苷酸"或"核酸分子"或"核酸"可互换使用，它们意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)禾nRNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。可使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，肌苷或磷硫酰核苷酸)来合成核酸。此类寡核苷酸可用于例如，制备具有改变的碱基配对能力或增加的对核酸酶的抗性的核酸。本发明的多核苷酸可以全部或部分地是合成多核苷酸。多核苷酸密码子的使用可被改变，以增加在特定宿主中的表达。改变多核苷酸密码子使用的一个例子见WO2006/077258所述。本文中提供的序列信息不应被狭义理解为需要包括进被错误鉴定的碱基。本文公开的特定序列可以很容易地用于从能将碳水化合物转化为柠檬酸的重组或非重组微生物(特别是J^wgz7/wsw&er，优选地，^^wgz'〃Mm'g^CBS513.88)中分离出完整基因，随后可容易地对该基因进行进一步的序列分析，由此鉴定出测序错误。除非特别指明，本文中通过对DNA分子进行测序来确定的所有核苷酸序列都是用自动DNA测序仪测定的，并且，本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都是通过对按照上文所述测定的DNA序列进行翻译来推测的。因此，如本领域所已知的，对由该自动方法所测定的任何DNA序列而言，本文所测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。典型地，通过自动方法测出的核苷酸序列与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少大约90%相同，更典型地，至少大约95%至至少大约99.9%相同。通过其它方法，包括本领域内公知的人工DNA测序方法，可对实际序列进行更为精确的测定。也如本领域所已知的，测得的核苷酸序列中较之实际序列的单个插入或缺失将会导致核苷酸序列翻译中的读码框位移，使得从此类插入或缺失的点开始，测得的核苷酸序列编码的预计氨基酸序列完全不同于被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。本领域技术人员能鉴定出此类被错误鉴定的碱基，并且知道如何改正此类错误。根据本发明的核酸分子可以仅包含本发明提供的核酸序列(例如，SEQIDNOs:1、6、11或16示出的序列)的一部分或片段，例如，可用作为探针或引物的片段(例如SEQIDNOs:3、4、8、9、13、14、18或19)或编码根据本发明的蛋白的一部分的片段。从对TS08、TS09、CS07或BS08基因的克隆测定的核苷酸序列允许产生被设计来鉴定和/或克隆TS08、TS09、CS07或BS08家族其它成员以及来自其它物种的TS08、TS09、CS07或BS08同源体的探针和引物。典型地，所述探针/引物包含基本纯化的寡核苷酸，其典型地包含与SEQIDNOs:1、6、11或16所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大约12或15个、优选大约18或20个、更优选大约22或25个、进一步更优选大约30、35、40、45、50、55、60、65或75个或更多个连续核苷酸杂交(优选地，在高度严谨条件下杂交)的核苷酸序列区域。还可通过聚合酶链式反应(PCR)，使用基于本文含有的序列信息设计的合成寡核苷酸引物，分离出包含选自SEQIDNOs:1、6、11或16的组的核酸序列的全部或一部分的核酸分子。此外，可通过基因合成产生核酸分子。可按照标准PCR扩增技术，用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，来扩增本发明的核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析加以表征。根据本发明的多核苷酸的片段还可包含不编码功能多肽的多核苷酸。此类多核苷酸可作为探针或引物用于PCR反应。不管其编码功能或非功能多肽，根据本发明的核酸都可用作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有TS08、TS09、CS07或BS08活性的多肽的本发明核酸分子的用途包括(1)从cDNA文库(例如来自除j^w^7/m外的其它生物)分离编码本发明蛋白的基因或其等位变体，以及(2)用于探测特定细胞中所述蛋白的mRNA的表达的Northern印迹分析，或(3)用于增强和/或提高同源TS08、TS09、CS07或BS08基因在所述其它生物中的功能或活性。基于本文提供的核苷酸序列的探针可用于检测编码同样或同源蛋白(例如，其它生物中的)的转录本或基因组序列。可基于其与本文公开的Am'gerTS08、TS09、CS07或BS08核酸的同源性，使用Am'gwDNA或其一部分作为杂交探针，按照标准杂交技术，优选在高度严谨杂交条件下，分离出对应于本发明的Am'gerTS08、TS09、CS07或BS08DNA的天然变体或非G.ox;^mw同源体的核酸分子，它们也包括在本发明内。在优选的实施方式中，探针还包含与其附着的标记基团，例如，标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶的辅助因子。例如，可使用基于本文教导的核苷酸序列设计的两套简并寡核苷酸引物库，进行PCR来分离同源基因序列。用于反应的模板可以是通过对从已知能表达或怀疑能表达根据本发明的多核苷酸的菌株制备的mRNA进行逆转录获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆及测序，以确保扩增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通过多种已知方法，用PCR片段分离全长cDNA克隆。例如，可标记扩增出的片段，用其筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。或者，经标记的片段可用于筛选基因组文库。PCR技术还可用于从其它生物分离全长cDNA。例如，可按照标准方案，从合适的细胞或组织来源分离RNA。可在RNA上进行逆转录反应，其中使用与扩增片段的5'最末端具有特异性的寡核苷酸引物，以引导第一链合成。然后可使用标准的末端转移酶反应，对得到的RNA/DNA杂交体"加尾"(例如，用鸟嘌呤)，可用RNaseH消化杂交体，然后可(例如，用poly-C引物)引导第二链合成。由此，可容易地分离扩增的片段上游的cDNA序列。关于有用的克隆策略的综述，参见，例如上文所述的Sambrooketal.和上文所述的Ausubeletal.。此外，编码TS08、TS09、CS07或BS08家族其它成员、具有与根据SEQIDNOs:1、6、ll或16的各核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。此外，编码来自其它物种的TS08、TS09、CS07或BS08蛋白、具有与SEQIDNOs:1、6、11或16示出的各核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。本发明还涉及经分离的多核苷酸，其可在严谨条件下(优选地，高度严谨条件下)与本发明的多核苷酸(例如，SEQIDNOs:1、6、11或16所示的多核苷酸)杂交。有利地，此类多核苷酸可从能将碳水化合物转化为柠檬酸的微生物(特别是As^erg/〃Mm'ger，优选地，^s/ergz7/i^m'gerCBS513.88)中获得。本文中用到的术语"杂交"被用来描述杂交和洗涤，在所述杂交和洗涤条件下，典型地，互相之间同源性为至少约50%、至少约60%、至少约70%、更优选为至少约80%、进一步优选为至少约85%到90%、最优选为至少95%的核苷酸序列保持相互杂交的状态。在一种实施方式中，本发明的核酸与选自SEQIDNOs:1、6、11或16的组的核酸序列或其互补序列至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源。此类严谨杂交条件的一个优选的非限制的例子是在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，大约45。C下杂交，随后在lxSSC、0.1。/。SDS中，50°C下进行一次或多次洗涤，洗涤优选在55。C下，更优选在60。C下，进一步更优选在65。C下进行。高度严谨条件包括在68°C，于6xSSC/5xDenhardt，s溶液/1.0%SDS中杂交，以及在0.2xSSC/0.1%SDS中于室温下洗涤。或者，洗涤可在42°C、50°C、60°C、65。C或68。C下进行，以实现非常高的严谨度。杂交反应的"严谨度"是本领域普通技术人员易于确定的。关于杂交反应严谨度的其它细节和解释，见Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995)。优选地，与本发明的核苷酸序列杂交(优选在高度严谨条件下杂交)的本发明的经分离的核酸对应于天然存在的核酸分子。本文中使用的"天然存在的"核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，编码天然蛋白质)。在一种实施方式中，核酸编码天然的A"/g^TS08、TS09、CS07或BS08蛋白。技术人员知道何种条件适合用于严谨杂交条件及高度严谨杂交条件。本领域中易于获得关于此类条件的其它指导，例如，在Sambrooketal.,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;禾卩Ausubeletal.(eds.)，1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。当然，仅与poly(A)序列(例如mRNA的3，末端poly(A)区)或仅与T(或U)残基的互补性延伸区段(stretch)杂交的多核苷酸将不会被包括在用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的本发明多核苷酸中，因为此类多核苷酸将与任何含有poly(A)延伸区段的核酸分子或其互补序列(例如，实际上是任何双链的cDNA克隆)杂交。采用典型手段，可以对从其它生物，例如能将碳水化合物转化为柠檬酸的微生物(特别是其它A/e^7/w物种)构建的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。例如，可以通过Southern禾口/或Northern印迹分析来对A;^gz'〃uy的菌株进行筛选。在探测到与本发明多核苷酸同源的转录本之后，可以利用本领域技术人员公知的标准技术，由分离自合适菌株的RNA来构建DNA文库。或者，可以使用能与本发明多核苷酸杂交的探针来对全基因组DNA文库进行筛选。可使用标准的分子生物学技术以及本文提供的序列信息，来分离本发明的核酸序列，例如选自SEQIDNOs:1、6、11或16的组的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用标准杂交和克隆技术(例如，Sambrook,J.,Fritsh，E.F.，禾卩Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989所述)，使用选自SEQIDNOs:1、6、11或16的组的核酸序列的全部或一部分作为杂交探针，分离根据本发明的核酸分子。此外，可通过标准合成技术(例如，使用自动DNA合成仪)来制备对应于本发明的核苷酸序列的寡核苷酸或可与本发明的核苷酸序列杂交的寡核苷酸。术语"同源性"或"相同性百分比"在本文中可互换使用。就本发明的目的而言，在此定义为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的相同性百分比，本着最优比较的目的(例如，可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的比对)，对序列进行比对。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一条序列上某位置的氨基酸残基或核苷酸与第二条序列上相应位置的相同，那么这些分子在此位置就是相同的。两条序列间的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即，%相同性=相同位置的数量/位置(即重叠位置)总数X100)。优选地，这两条序列长度相同。技术人员会知道有若干计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如，可以使用数学算法来完成对序列的比对和对两条序列间相同性百分比的确定。在一种优选的实施方式中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法来确定两条氨基酸序列间的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG软件包(可从h加:〃www.accelrvs.com获得)的GAP程序中，其中使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员会意识到上述的所有不同参数将导致有细微区别的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体百分比相同性不会有显著改变。在又一种实施方式中，使用GCG软件包(可从http:〃www.accelrvs.com获得)的GAP程序来确定两条核苷酸序列间的相同性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵，缺口权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中，使用E.Meyers禾nW.Miller(CABIOS，4:11-17(1989))的算法来确定两条氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2.0版)(可从http:〃vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi获得)中，其中使用PAM120权重残基表，缺口长度惩罚(penalty)为12，缺口惩罚为4。在又一种实施方式中，使用CDA程序(Huang,1994，AContextDependentMethodforComparingSequences,Proceedingsofthe5thSymposiumonCombinatorialPatternMatching,LectureNotesinComputerScience807,Springer-Verlag,54-63)来确定两条核苷酸序列间的相同性，其中参数如下设置(i)对于(多)肽比对而言错配-2，缺口出现11，缺口延伸1，上下文长度(ContextLength):10，匹配奖励1，以及(ii)对核苷酸序列对比而言，错配-15，缺口出现5，缺口延伸2，上下文长度10，匹配奖励1。用于比对和确定同源性的其它程序的例子是Clustal方法(Higgins,1989，CABIOS5:151-153)或ClustalW(ThompsonJD,HigginsDG，andGibsonTJ(1994)-CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsResearch22:4673-4680)。本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步地被用作"查询序列"来进行针对公众数据库的搜索，例如，去鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用Altschul,etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)来进行此类搜索。可以用BLASTN程序，以分数=100，字长(wordlength)=11来进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，以分数=50，字长=3来进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的，为获得有缺口的比对，可以利用Altschuletal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中描述的GappedBLAST。当利用BLAST禾nGappedBLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTX禾口BLASTN)的缺省参数。见http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。在另一种优选的实施方式中，本发明的经分离的核酸分子包含是本发明的核苷酸序列(例如，选自SEQIDNOs:1、6、11或16的组的序列)的互补序列的核酸分子。与本文公开的核苷酸序列互补的核酸分子是这样的序列其与选自SEQIDNOs:1、6、11或16的组的核苷酸序列足够互补，从而其可与所述核苷酸序列杂交，由此形成稳定的双链体(duplex)。在另一种优选的实施方式中，选自SEQIDNOs:1、6、11或16的组的本发明的核酸或其互补序列含有至少一处突变，所述突变导致基因产物具有经修饰的功能/活性。所述至少一处突变可通过本文所述的方法引入。在一个方面，所述至少一处突变导致产生这样的各TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白其功能和/或活性较之野生型副本而言有所增强或提高。用于引入此类突变的方法是本领域公知的。本文中使用的术语_—活性的"增加"包括增加生产生物中一种或多种多肽的活性，所述多肽是本文所述的相应的多核苷酸编码的。本领域中可获得用于增加给定蛋白(在本文的情况下是TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白)活性的多种方法。通常，可增加蛋白质的比活性或者可以增加蛋白质的拷贝数。术语增加活性或者等同表达还包括下述情形其中，TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白活性被引入以前不含该活性的细胞，这例如通过将编码TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08的基因引入以前不含该基因等同物的细胞或以前不能表达相应蛋白的活性形式的细胞来实现。为协助这种增加，对应于本文所述多核苷酸的基因的拷贝数可被增加。或者，可使用强启动子来指导多核苷酸的表达。在另一种实施方式中，基因上游的启动子、调控区域和/或核糖体结合位点可被改变，以增加表达。还可以通过增加信使RNA的相对半寿期来增强或加强表达。在另一种实施方式中，还可以通过利用多肽氨基酸序列中能增加活性的一处或多处突变来增加多肽自身的活性。例如，改变多肽与其相应底物的亲和性可导致活性提高。类似地，可增加肽的相对半寿期。在基因表达增强或者比活性增加的情况下，可通过改变细胞培养基的组成和/或用于培养的方法来达成这种提高。本文中使用的"增强的表达"或"提高的活性"表示较之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被增强和/或提高之前存在的蛋白的活性和/或浓度而言，至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%的增加。还可通过将蛋白与其活性的特异性或一般性增强剂相接触来增加TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白的活性。在另一实施方式中，除了增强和/或提高TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白的活性之外，SEQIDNO:16所示的本发明的编码BS08的核酸或其互补序列含有至少一处突变，所述突变导致基因产物具有经修饰的功能/活性，优选地，降低的活性。所述(至少一处)突变可通过本文所述的方法引入。在一个方面，所述(至少一处)突变导致产生这样的BS08蛋白其功能和/或活性较之野生型副本而言被部分或全部破坏。用于引入此类突变的方法是本领域公知的。本文中使用的术语_一活性的"降低"包括减少生产生物中一种或多种多肽的活性，所述多肽是本文所述的相应的多核苷酸编码的。本领域中可获得用于降低给定蛋白(在本文的情况下是BS08蛋白)活性的多种方法。通常，可减少蛋白质的比活性或者可以减少蛋白质的拷贝数。为协助这种减少，对应于本文所述多核苷酸的基因的拷贝数可被减少。这种减少可包括打断、修饰或失活对应于本文所述多核苷酸的基因。对基因的修饰或失活可以通过已经建立的反义技术来进行，这使用与所述基因的核酸序列互补的核苷酸序列来进行。更具体地，可通过引入与可在细胞中转录或能与细胞中产生的mRNA杂交的核酸序列互补的核苷酸序列，来降低或消除有丝真菌细胞对基因的表达。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译的蛋白质的量由此减少或消失。表达反义RNA的例子如ApplEnvironMicrobiol.2000Feb;66(2):775-82.(Characterizationofafoldase,proteindisulfideisomeraseA，intheproteinsecretorypathwayofAspergillusniger.NgiamC,JeenesDJ，PuntPJ,VanDenHondelCA,ArcherDB)或(ZrennerR，WillmitzerL,SonnewaldU.Analysisoftheexpressionofpotatouridinediphosphate-glucosepyrophosphorylaseanditsinhibitionbyantisenseRNA.Planta.(1993);190(2):247-52.)所示。此外，可通过RNA干扰(RNAi)技术来获得对基因的修饰、下调或失活(FEMSMicrob.Lett.237(2004):317-324)。WO05/05672Al禾口/或WO05/026356Al所述的RNA干扰技术可用于对基因的修饰、下调或失活。或者，可使用弱启动子来指导多核苷酸的表达。在另一种实施方式中，基因上游的启动子、调控区域和/或核糖体结合位点可被改变，以获得对表达的下调。还可以通过减少信使RNA的相对半寿期来降低表达。在另一种实施方式中，还可以通过利用多肽氨基酸序列中能减少活性的一处或多处突变来减少多肽自身的活性。例如，改变多肽与其相应底物的亲和性可导致活性降低。类似地，可减少肽的相对半寿期。在基因表达降低或者活性降低的情况下，可通过改变细胞培养基的组成和/或用于培养的方法来达成这种降低。本文中使用的"降低的表达"、"下调"或"降低的活性"表示较之野生型(BS08)蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被降低之前存在的蛋白的活性和/或浓度而言，至少5%、10%、25%、50%、75%、80%、90%、95%或甚至100%的减少。还可通过将蛋白与其活性的特异性或一般性抑制剂相接触来降低BS08蛋白的活性。本发明的另一方面涉及载体，所述载体含有编码本发明蛋白质的核酸或其功能等同物或一部分。在本文中使用的术语"载体"指能运送连接到其上的另一个核酸分子的核酸分子。一种载体类型是"质粒"，"质粒"指环状的双链DNA环，另外的DNA片断可以连接到所述的环上。另一种载体的类型是病毒载体，其中，另外的DNA片断可以连接到病毒基因组中。某些载体能在其被引入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和游离体哺乳动物载体)。用于有丝真菌的自主保持克隆载体可包含AMA-1序列(见，例如，AleksenkoandClutterbuck(1997),FungalGenet.Biol.21:373-397)。其它载体(例如，非游离体哺乳动物载体)在被引入宿主细胞之后就被整合进宿主细胞的基因组中，因此它们与宿主基因组一同复制。此外，某些载体能指导可操作地连接到其上的基因的表达。此类载体在本文中被称为"表达载体"。一般而言，在重组DNA技术中用到的表达载体通常是质粒的形式。在本文中术语"质粒"和"载体"可以互换使用，因为质粒是最常用到的载体形式。然而，本发明也将包括其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们能提供等同的功能。关于表达载体的一般设计和表达载体用于基因过量表达的用途的例子可在WO99/32617、WO01/21779或WO05/100573中找到。本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，所述核酸存在的形式适合于该核酸在宿主细胞中的表达，这意味着该重组表达载体包括一段或多段调控序列，所述调控序列是基于将用于表达的宿主细胞来选择的，其被可操作地连接到将要表达的核酸序列上。在重组表达载体中，"可操作地连接"被用来表示人们感兴趣的核苷酸序列被连接到调控序列上，所述的连接以允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中表达，或者当载体被引入宿主细胞中时，在该宿主细胞中的表达)的方式进行。术语"调控序列"将包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，弱化子)。例如，在Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中对此类调控序列进行了描述。调控序列包括在很多种宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型或诱导型表达的调控序列，也包括仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域的技术人员将意识到，对表达载体的设计可能取决于以下因素例如对将被转化的宿主细胞的选择，期望获得的蛋白质的表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞，由此生产本文所述的核酸编码的蛋白质或肽，其包括但不限于本文所述的核酸编码的突变体蛋白、其片段、其变体或功能等同物以及融合蛋白，例如，TS08、TS09、CS07禾口/或BS08蛋白、TS08、TS09、CS07和/或BS08蛋白的突变体形式，融合蛋白等。为了在合适的微生物中表达TS08、TS09、CS07禾口/或BS08蛋白，可对本发明的重组表达载体加以设计。例如，根据本发明的蛋白可在真菌细胞中表达，例如，在属于^4s/ergf〃ws、爿cremom'wm、JwreoZjo^W/wm、尸em'cz7/z.wm、尸^o附yces1、ScA/zop/zj^/wm、、77ermoasci^、7Tn.e/av/a、Tb/j^oc/ad/wm禾口JWc/ocferma属的菌株中表达。在本发明中有用的表达载体包括源自染色体、游离体和病毒的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体、酵母游离体、酵母染色体元件、病毒(例如杆状病毒、乳头状多瘤空泡病毒、痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆病毒)的载体和源自上述物质的组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。或者，载体可以是下述载体，当其被引入有丝真菌细胞时，其整合进基因组，与其已整合进的染色体一起复制。整合型克隆载体可在有丝真菌宿主的染色体中随机整合或在预定目标位点整合。在本发明的一种优选的实施方式中，整合型克隆载体包含下述DNA片段，该片段与有丝真菌宿主细胞基因组中预定目标基因座中的、用于将克隆载体整合到预定基因座上的DNA序列同源。为促进靶向整合，优选在转化宿主细胞之前对克隆载体进行线性化。线性化优选进行至如下程度使得克隆载体的至少一端，但优选地，任意一端侧翼有与目标基因座同源的序列。目标基因座侧翼的同源序列的长度优选为至少30bp，优选地，至少50bp，优选地，至少0.1kb，进一步优选地，至少0.2kb，更优选地，至少0.5kb，进一步更优选地，至少lkb，最优选地，至少2kb。优选地，靶向整合进宿主细胞基因组的效率，即，整合进预定靶基因座的效率可由宿主细胞的增加的同源重组能力来增加。细胞的此类表型包括ku70缺陷型，如WO2005/095624所述。WO2005/095624通过引用并入本文，其公开了获得包含增加的靶向整合效率的有丝真菌细胞的优选方法。优选地，克隆载体中与目标基因座同源的DNA序列是从高度表达的基因座获得的，这意味着，其是从能在有丝真菌宿主细胞中高水平表达的基因获得的。能高水平表达的基因，即，能高度表达的基因在本文中被定义为其mRNA占细胞总mRNA的至少0.5"5/。(w/w)的基因，例如，在诱导条件下的，或者其基因产物占细胞总蛋白的至少1%(w/w)的基因，或者，在分泌出的基因产物的情况下，可分泌至至少O.lg/l的水平(如EP357127所述)。大量优选的高度表达的真菌基因的例子是来自A^wp7//或7WcAocfemz的淀粉酶、葡糖淀粉酶、醇脱氢酶、木聚糖酶、磷酸甘油醛脱氢酶或纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)(cbh)基因。用于这些目的的最优选的高度表达的基因是葡糖淀粉酶基因(优选A"/gw葡糖淀粉酶基因)、Ao，wTAKA-淀粉酶基因、爿.mV/w/aw5gp^4基因、JWcAcxiermareese/cM基因(优选地，。载体系统可以是单种载体或质粒，或者两种或多种载体或质粒，它们一起含有将被引入有丝真菌细胞的总DNA或转座子。可向宿主细胞中插入编码多肽的核酸序列的超过一个拷贝，以增加基因产物的生产。这可以通过下述方法来进行，优选地，通过核苷酸序列整合进细胞染色体，更优选地，通过将核苷酸序列的整合靶向前文所列出的高度表达的基因座之一来进行。可通过重组酶来增强整合。或者，这可以通过将可扩增的选择标记基因加入核苷酸序列来进行，其中可通过在合适的选择试剂存在的情况下培养所述细胞来选出含有选择标记基因的扩增拷贝、以及由此的核酸序列的额外拷贝的细胞。为进一步增多将被过量表达的DNA序列的拷贝数，可以使用W098/46772所述的基因转化技术。或者，可在体外转录和翻译重组表达载体，例如，使用T7启动子调控序列和T7聚合酶来进行。DNA插入应当被可操作地连接到合适的启动子上，启动子可以是组成型启动子或可诱导的启动子，例如，噬菌体lambdaPL启动子，E.colilac、tip和tac启动子，SV40早期和晚期启动子以及逆病毒LTRs的启动子。技术人员知道如何选择合适的启动子。表达构建体可以含有用于转录起始、终止的位点，还可在转录区域含有核糖体结合位点，以用于翻译。由构建体表达的成熟转录本的编码部分可优选包括处于起点的起始密码子，以及恰当地定位于待翻译的多肽末尾的终止密码子。优选地，启动子可从高度表达的基因(在本文中被定义为mRNA浓度占总细胞mRNA的至少0.5。/。(w/w))获得。在另一优选的实施方式中，启动子可从中等表达的基因(在本文中被定义为mRNA浓度占总细胞mRNA的至少0.01%至0.5%(w/w))获得。在另一优选的实施方式中，启动子可从低表达的基因(在本文中被定义为mRNA浓度占总细胞mRNA的小于0.01%(w/w))获得。更优选地，用微阵列数据来选择具有一定转录水平和调控的基因，以及由此选择这些基因的启动子。以这种方式，我们可以针对其要发挥功能的条件对基因表达盒进行最优化改造。这些启动子片段可从很多来源(即，不同物种)以PCR扩增、合成等手段获得。控制序列还可包括合适的转录终止序列，这是能被真核细胞识别用来终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地相连。在细胞中具有功能的任何终止子可用于本发明。用于有丝真菌细胞的优选终止子从编码^^er^7/woo^eTAKA-淀粉酉每；尸em'c/〃/wmc/^ywgewwmpc^45、j:c6C禾口pe"Z)五终止子；爿5/erg/〃ws葡半唐淀粉、酶；^sperg7'〃wmWw/a^邻氨基苯甲酸盐合酶；A/erg7'〃wsm'geralpha葡糖苷酶；A/erg7'〃wsw油/aws印C基因；胰蛋白酶类似蛋白酶的基因获得。控制序列还可以是合适的引导序列，这是mRNA的非翻译区域，其对于通过细胞的翻译来说是重要的。引导序列与编码多肽的核苷酸序列的5'末端可操作地相连。在细胞中具有功能的任何引导序列都可用于本发明。用于有丝真核细胞的优选引导序列从编码A^wg///^TAKA-淀粉酶和j^erg/〃wsmV/w/朋s丙糖磷酸酉旨异构酶禾卩^^ergz'〃z^m'gerg/aA的基因获得。控制序列还可以是聚腺苷化序列，这是与核苷酸序列3'末端可操作地相连，并且当被转录时能被有丝真菌细胞作为信号识别以向经转录mRNA加上聚腺苷残基的序列。在细胞中具有功能的任何聚腺苷化序列都可用于本发明。用于有丝真菌细胞的优选聚腺苷化序列从编码J^wgz7/wTAKA-淀粉酉每、y^erg7'〃wsw'ger葡糖淀粉酶、Apergz'〃t^w油/a似令卩氨基苯甲酸盐合酶、Fwran'ww7ox"porwm胰蛋白酶类4以蛋白酶禾卩^sperg/〃wsalpha葡糖苷酶的基因获得。控制序列可以是Kozak序列、编码翻译起始序列和终止序列，例如WO2006/077258所述。可通过传统的转化或转染技术将载体DNA引入合适的宿主细胞。本文中使用的术语"转化"、"转桥联(transconjugation)"和"转染"意指本领域内己知的、用于将外源核酸(例如DNA)引入到宿主细胞中的多种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂介导的转染或电穿孔。用于对宿主细胞进行转化和转染的合适方法可在Sambrook,etal.(上文所述的)，Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)及其它实验手册中找到。对A.niger的转化方法是技术人员已知的(BiotechnologyofFilamentousfungi:TechnologyandProducts.(1992)ReedPublishing(USA);Chapter6:Transformationpages113-156)。技术人员将认识到，对A.niger的成功转化不限于使用本文示例出的载体、选择标记系统、启动子和转化方案。关于A.niger的特别的转化方案见，例如WO99/32617或WO98/46772所述。载体优选含有一种或多种选择标记，其允许对经转化的细胞进行容易的选择。选择标记是其产物提供杀生物性或病毒抗性、对重金属的抗性、针对营养缺陷型的原营养型等的基因。用于有丝真菌细胞的选择标记可选自下述组，所述组包括但不限于画JS(乙酰胺酶)、wgB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、(草丁膦转移酶)、WeA(脉霉素结合)、—gB(潮霉素磷酸转移酶)、"&D(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、(硫酸腺苷转移酶)和frpC(邻氨基苯甲酸盐/酯合酶)以及来自其它物种的等同物。用于^^wgz'〃M和尸em'c/肌wn细胞的优选者是AmWwAms或Aoo^ae的amofS(EP635574Bl、WO97/06261)和pyrG基因，以及S&印tom少c^/y;gra"c^ci^的基因。更优选i也，使用awJS基因，进一步更优选地，使用来自AmVMa"s或A的ww/S基因。最优选的选择标记基因是与A"/t/w/awsgpt/A启云力子融合的AamofS编码序列(见EP635574所公开的，其通过引用并入本文)。来自其它真菌的^w/S基因也可使用，例如WO97/06261所公开的那些。编码选择标记的核酸优选在与编码根据本发明的蛋白的载体相同的载体上引入宿主细胞，或者其可在单独的载体上引入，该载体例如是自杀性载体，其不能在宿主细胞中复制。可通过药物选择鉴定出经过引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已合并有选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞会死亡)。本发明还提供了经分离的多肽，其具有分别根据SEQIDNOs:2或7的氨基酸序列或可通过在合适的宿主中表达本发明的多核苷酸(例如，分别根据SEQIDNOs:l或6的多核苷酸序列)获得的氨基酸序列。在另一实施方式中，本发明提供了具有TS08或TS09蛋白活性的多肽，其中，所述多肽是具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列分别与SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少70%，例如，75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5%的同源性。根据本发明的多肽(术语"多肽"和"蛋白"在本文中可互换使用)可仅含对SEQIDNOs:2、7、11或17所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的保守取代，或对非关键氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非关键氨基酸是SEQIDNOs:2、7、11或17所示的氨基酸序列中可被改变、且不会对生物功能造成实质性影响的残基。例如，在本发明的蛋白质之间保守的氨基酸残基被预计为对改变特别不敏感。此外，在根据本发明的蛋白质和其它TS08、TS09、CS07禾口/或BS08蛋白之间保守的氨基酸也对改变不太敏感。术语"保守取代"用于表示下述取代，其中，氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。这些家族是本领域已知的，其包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带beta支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。如上所述，本发明的多核苷酸可用于对合适的宿主细胞进行遗传工程改造，使其在发酵中更好且更有效，例如，在对柠檬酸的发酵工艺中更好且更有效。根据本发明，提供了经遗传工程改造/重组产生的宿主细胞(也被称为重组细胞或经转化细胞)，其携带有此类经修饰的多核苷酸，其中，相连的蛋白的功能较之野生型细胞而言被显著修饰，使得对一种或多种发酵产物(例如柠檬酸)的生产的产率、产量和/或效率被提高。宿主细胞可选自能从碳水化合物生产一种或多种发酵产物(例如柠檬酸)的微生物，例如有丝真菌，特别是v^/wg/〃M，优选地，^y/erg/〃wsm'ger，更优选地，Am'，CBS513.88。"经转化细胞"或"重组细胞"是已通过重组DNA技术向其(或其祖先细胞)中引入了根据本发明的核酸的细胞，或者是其中TS08、TS09、CS07蛋白的活性已被增加和/或增强和/或BS08蛋白的活性已被减少或消失的细胞。合适的宿主细胞包括能生产给定发酵产物(例如，能将碳水化合物转化为柠檬酸)的微生物的细胞。特别地，其包括来自有丝真菌的组的菌株，优选地，选自J^ergz7/^，更优选地，选自Am'gw、Aa丽附o"'、Aacw/eato、A乂opom'CM、A、爿.va^ms7、、」.carZ)o打,'ws、A励z'wgms7's、A/ac&co,ato、AZms77/ms7、、爿，》m、、爿.cost鎖'cams7^或AybeZ油s，进一步更优选地，选自爿./be,油svar鎖V/ws或A/be/油swar/a〃油s，进一步更优选地，选自爿.m'gervara丽脂n'，进一步更优选地，选自AATCC1015，以及最优选地，选自ACBS513.88。还可通过修饰TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因获得提高的基因表达，例如，通过将一处或多处突变引入TS08、TS09和/或CS07基因来实现，其中，所述突变导致较之野生型蛋白而言功能显著提高的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白。因此，在另一种实施方式中，选自SEQIDNOs:1、6禾卩/或11的组的多核苷酸或其等同物获得携带至少一处突变的多核苷酸。本文中使用的突变可以是导致功能更强或更稳定的多肽(例如，功能更强或更稳定的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因产物)的任何突变。这可包括，例如，在微生物基因组中的下述改变其提高了TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白的合成，或者导致TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07蛋白以改变的氨基酸序列表达，该改变使得所述蛋白的功能较之具有未被改变的氨基酸序列的野生型副本而言被提高和/或增强。提高可在转录水平、翻译水平或翻译后水平上发生。微生物基因组中的改变可例如通过单交叉重组或多交叉重组用含有改变的DNA序列替换野生型DNA序列来进行。为了能方便地选择出基因组被改变的微生物转化子，该改变可以例如是编码抗生素抗性基因的DNA序列，或者编码补足微生物可能的营养缺陷型的基因的DNA序列。突变可包括但不限于缺失-插入突变。还可通过下述方法获得微生物基因组中导致功能更强的多肽的改变使用例如化学诱变剂、辐射或转座子对微生物基因组进行随机诱变，以及选择或筛选出是一种或多种发酵产物的更好的或更有效的生产菌株的突变体。用于筛选和选择的标准方法是技术人员已知的。在一种特定实施方式中，人们需要敲除或遏制本发明TS08、TS09和/或CS07基因的阻遏子(repressor)，即，其中，当引入合适的宿主细胞时，其阻遏子基因的表达被人工遏制，以提高对发酵产物生产的产率、生产能力和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供携带此类被遏制基因的微生物的方法是本领域公知的。可通过缺失掉阻遏子基因或其调控区域的至少一部分，来诱导对阻遏子基因的遏制。本文中使用的"对基因表达的遏制"包括完全和部分遏制，以及在特定条件下的遏制，还包括对两个等位基因中任何一个的表达的遏制。为提高其中TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07活性被增强或提高的重组宿主细胞对柠檬酸的产生，可在该生物中抑制BS08基因的表达，这例如通过靶向与BS08核苷酸序列的调控区域(例如，BS08启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，以形成三螺旋结构，阻止靶细胞中BS08基因的转录来实现。一般而言，见Helene,C.(1991)AnticancerDrugDes.6(6):569-84;Helene，C.etal.(1992)Ann.N.YAcadSci.660:27-36和Maher,L.J.(1992)Bioassays14(12):807-15。还可通过对BS08编码基因加以修饰来抑制或阻止基因表达，例如，通过向BS08编码基因中引入一处或多处突变来实现，其中所述突变导致产生较之野生型蛋白而言功能显著降低的BS08蛋白。因此，在另一种实施方式中，从编码BS08多肽的多核苷酸，例如，SEQIDNO:16所示的多核苷酸或其等同物获得携带至少一处突变的多核苷酸。本文中使用的突变可以是导致功能更弱或更不稳定的多肽(例如，功能更弱或更不稳定的BS08基因产物)的任何突变。这可包括，例如，在微生物基因组中的下述改变其干扰了BS08的合成，或者导致BS08蛋白以改变的氨基酸序列表达，该改变使得该蛋白的功能较之具有未被改变的氨基酸序列的野生型副本而言被完全或部分破坏。干扰可在转录水平、翻译水平或翻译后水平上发生。微生物基因组中的改变可例如通过单交叉重组或多交叉重组用含有改变的DNA序列替换野生型DNA序列来进行。为了能方便地选择出基因组被改变的微生物转化子，该改变可以例如是编码抗生素抗性基因的DNA序列，或者编码补足微生物可能的营养缺陷型的基因的DNA序列。突变可包括但不限于缺失-插入突变。还可通过下述方法获得微生物基因组中导致功能更弱或没有功能的多肽的改变使用例如化学诱变剂、辐射或转座子对微生物基因组进行随机诱变，以及选择或筛选出是一种或多种发酵产物的更好的或更有效的生产菌株的突变体。用于筛选和选择的标准方法是技术人员已知的。在一种特定实施方式中，需要敲除本发明的BS08基因，即，其中，当引入合适的宿主细胞时，其基因表达被人工遏制，以提高对发酵产物生产的产率、生产能力和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供携带此类被遏制基因的微生物的方法是本领域公知的。可通过缺失掉基因或其调控区域的至少一部分，来诱导对内源BS08基因的遏制。本文中使用的"对基因表达的遏制"包括完全遏制和部分遏制，以及在特定条件下的遏制，还包括对两个等位基因中任何一个的表达的遏制。为制造其中BS08基因的表达被人工遏制的敲除微生物，首先可克隆BS08基因，然后可使用该基因来构建用于同源重组的载体，以在靶标微生物中失活内源BS08基因。用于同源重组的载体含有设计来使靶标微生物中内源BS08基因失活的核酸序列。此核酸序列可以是例如，含有至少部分缺失突变的BS08基因或其调控区域(例如，将被失活的基因侧翼存在的区域(顺式情况下)或单独存在的(反式情况下))的核酸序列，或者其可以是含有其它基因的BS08基因或其调控区域。打断和基因置换公开于EP635574和WO98/46772和WO05/095624中。优选地，选择还可用作为标记发挥作用的基因作为将被插入进BS08基因或其调控区域的基因。将使用的插入基因包括，例如，前文定义的药物抗性基因。对于基因可插入到BS08基因中的位置没有特别限制，只要在该位置的插入能导致对靶标中内源BS08基因表达的遏制即可。为避免插入的极性作用，可通过使用例如sacB系统，或通过长侧翼同源性PCR，来引入同框沉默缺失。这些技术是本领域技术人员公知的。用于BS08蛋白的上述诱变策略可导致想要的化合物(特别是柠檬酸)的产率增加。这些策略的列出并不意味着限制；对这些诱变策略的变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。可通过这些机制，用本发明的核酸和蛋白质分子产生出微生物，例如表达经突变BS08核酸和蛋白分子的^^^&//^^^或真菌的相关菌株，使得对想要的化合物(例如柠檬酸)的生产的产率、生产能力和/或产量被提高。用于TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白的上述诱变策略可导致想要的化合物(特别是柠檬酸)的产率增加。这些策略的列出并不意味着限制；对这些诱变策略的变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。可通过这些机制，用本发明的核酸和蛋白质分子产生出微生物，例如表达经突变TS08、TS09、CS07和/或BS08核酸和蛋白分子的As^^'〃m或真菌的相关菌株，使得对想要的化合物(例如柠檬酸)的生产的产率、生产能力和/或产量被提咼°在本发明的一个方面，提供了能从合适的碳水化合物(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、玉米、木薯和多元醇)生产柠檬酸的微生物(特别是有丝真菌，例如」^wg///^)。对柠檬酸的测量通过简单的酸碱滴定来进行，其中用NaOH来进行，这种方式对所有酸进行测量。为在存在其它酸的情况下测量柠檬酸，使用HPLC(例如，使用Dionex的IonPacAS-ll阴离子交换柱，如其可公开获得的使用指导Dec.1998"Thedeterminationofinorganicanionsandorganicacidsinfermentationbroths"，DionexCorp.,Sunnyvale,California中n。123所述)。当例如通过HPLC或滴定进行测量时，我们发现，这些生物分别能从蔗糖以高达100g/l的水平来生产柠檬酸。在本发明的另一方面，提供了下述微生物，当从蔗糖开始深浸发酵生产时，所述微生物能以300g/l的量生产柠檬酸。这可通过增加TS禾口/或CS多肽，优选地，TS08、TS09禾口/或CS07多肽的活性来实现。从例如蔗糖生产的柠檬酸的产率甚至可高至1.5、2、4、10、20、50g/l，或者甚至超过400、600、1000g/l。这可通过增强或提高TS和/或CS多肽，优选地，TS08、TS09、CS07TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09禾nCS07多肽的活性，可选地，组合BS蛋白(优选地，BS08蛋白)活性的减少或消失来实现。从例如蔗糖生产的柠檬酸的产率甚至可高至1.5、2、4、10、20、50g/l，或者甚至超过400、600、1000g/l。使用携带有上文所述的经修饰的基因的微生物生产的柠檬酸的产率，较之野生型菌株，例如，Am'g^CBS513.88生产的柠檬酸的量而言，可增加至少1%、2%、3%、4%、8%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%、200%、500%或更高。可在合适条件下，补充有合适营养物的水性培养基中，培养携带有，例如，经修饰的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08基因，且能以显著更高的产率、生产能力和/或效率生产发酵产物的重组微生物。柠檬酸的生产可通过深浸发酵或表面发酵，从不同碳水化合物和/或原材料起始来进行。在一种实施方式中，通过深浸发酵，从碳水化合物原材料，例如木薯和/或玉米(其可被磨碎且与水混合)起始来生产柠檬酸。种子发酵可在单独的发酵罐中制备。对淀粉的液化可在淀粉分解酶，例如淀粉酶、纤维素酶、乳糖酶或麦芽糖酶的存在下进行，在发酵前或发酵期间可加入添加剂和营养物，例如消泡剂。就主发酵而言，混合物中，碳水化合物(例如淀粉)的浓度可以在150至200g/l的范围内，优选地，大约180g/1。在另一实施方式中，通过表面发酵，从碳水化合物原材料，例如甜菜和甘蔗糖蜜的混合物或蔗糖起始来生产柠檬酸。本文所述的核酸分子、多肽、载体、引物和重组微生物可用于下述方法中的一种或多种鉴定J^wg///^m'gw以及相关的生物；绘制与As^erp7/1^m'gw相关的生物的基因组图谱；对感兴趣的As;e/^7/Ry"/ger序列进行鉴定和定位；进化研究；测定功能所需的TS08、TS09、CS07禾口/或BS08蛋白区域；调节TS08、TS09、CS07禾口/或BS08蛋白活性或功能；调节TS途径的活性；以及调节对想要的化合物(例如，柠檬酸)的细胞内生产。本发明提供了筛选能调节TS08、TS09和/或CS07蛋白活性的分子的方法，这种调节或者通过与蛋白本身或底物或和/或蛋白的结合伴侣的相互作用来实现或者通过调节本发明的TS08、TS09、CS07和/或BS08核酸分子的转录或翻译来实现。在此类方法中，将表达本发明的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白的微生物与一种或多种测试化合物接触，并评估每种测试化合物对于TS08、TS09、CS07和/或BS08蛋白表达水平或活性的影响。可通过技术人员公知的方法来测定TS、CS和/或BS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如将含有TS08、TS09、CS07和/或BS08蛋白的膜级分与经放射性标记的、可被TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白主动转运的糖、糖醇或羧酸盐/酯一起温育。包括进细胞物质的放射性与转运蛋白的活性直接成正比。因此，例如，可在下述试验中测量转运蛋白的活性，所述试验中，在存在pH6的磷酸盐缓冲液以及经放射标记的碳源(例如葡萄糖)的情况下，温育含有特定转运蛋白的完整细胞。可通过技术人员己知的方法来测量放射性碳源(例如葡萄糖)被细胞吸收的速率，其与膜级分中存在的TS、CS和/或BS蛋白活性直接成正比。在一种备选试验中，可通过技术人员公知的方法来测量TS、CS和/或BS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如用编码本发明的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、TS08/BS08、TS09/BS08、CS07/BS08、TS08/TS09/BS08、TS08/CS07/BS08、TS09/CS07/BS08或TS08/TS09/CS07/BS08蛋白的AcDNA克隆补足针对相应(直向同源)转运蛋白基因的^cc/^ra，c^打断突变体。对转运蛋白(-)的表型的阳性补足是对转运蛋白活性的指示。从上述描述中可显而易见根据本发明的方法的发酵产物可不仅限于柠檬酸本身。本文中使用的"想要的化合物"或"发酵产物"可以是^wergi7/wsm'ger的任何天然或异源产物，其包括生物合成途径的终产物和中间产物，例如，初级和次级代谢产物，例如beta内酰胺、蛋白质或酶，特别是柠檬酸生物合成生产中的。因此，本发明涉及本文所述的多核苷酸、多肽、载体、引物和重组微生物在生产柠檬酸(即将碳源转化为柠檬酸)中的用途。在一种优选的实施方式中，本文所述的经修饰的多核苷酸、多肽、载体和重组微生物用于提高对柠檬酸生产的产率、生产能力和/或效率。术语"产量"或"生产能力"是本领域已知的，其包括给定的时间和给定的发酵体积中形成的发酵产物(例如柠檬酸)的浓度(例如，每升每小时的kg产物)。术语"生产效率"包括获得的特定水平的生产所需要的时间(例如，细胞达到发酵产物的特定速率输出所需时间有多长)。术语"产率"是本领域已知的，其包括碳源向产物(即柠檬酸)转化的效率。这通常写作，例如，kg产物/kg碳源。"增加"化合物的"产率和/或产量"或增加化合物的"生产表现"表示，给定的时间中给定量的培养物中回收的该化合物分子或回收的该化合物有用分子的量增加。术语"生物合成"或"生物合成途径"是本领域已知的，其包括通过细胞，以可能是多步骤且被高度调控的过程，从中间产物化合物对化合物(优选地，有机化合物)的合成。措辞"代谢"是本领域已知的，其包括对生物中发生的生化反应的总称。然后，特定化合物的代谢(例如，氨基酸(例如甘氨酸)的代谢)包含细胞中与该化合物相关的总的生物合成、修饰和降解途径。措辞"转运"或"运入"是本领域已知的，其包括一种或多种分子在协助下移动经过该分子本来不能经过或不能高效经过的细胞膜。本文中使用的柠檬酸可以是水溶液中发现的柠檬酸的任何化学形式，例如未离解的、以其游离酸形式存在的或离解为阴离子的。柠檬酸的溶解的盐形式的特征为在通常发现于发酵上清液中的任何种类的阳离子(例如，钾、钠、铵或钙)存在时的阴离子。还包括在内的可以有柠檬酸的游离酸形式的经过分离的晶体。另一方面，用其相应的盐的名称来命名柠檬酸的盐形式的经过分离的晶体，即柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钙等。在一种优选的实施方式中，本发明涉及生产柠檬酸的方法，其中，将根据本发明的核苷酸或上文所述的经修饰多核苷酸序列引入合适的微生物，在允许以高生产能力、产率和/或效率生产柠檬酸的条件下培养重组微生物，从培养基中分离产生的发酵产物，以及可选地，进一步纯化。在另一个方面，本发明的工艺可组合有将产生的柠檬酸与发酵培养液中含有的其它组分分离和/或纯化的额外步骤，即，所谓的下游加工步骤。这些步骤可包括技术人员己知的任何手段，例如，浓縮、结晶、沉淀、吸附、离子交换、电渗析、两极膜电渗析和/或反渗透。柠檬酸可作为游离酸形式或其已知的任何盐的形式被进一步纯化，这是通过下述操作手段来进行的，例如，用活性炭进行处理、离子交换、吸附和洗脱、浓縮、结晶、过滤和干燥。上述步骤的组合也可使用，例如，将电渗析和两极膜电渗析组合为一个步骤，以及使用模拟移动床色谱方法的多个离子交换步骤的组合。上述任何方案单独或组合就构成了用于分离和纯化产物(即柠檬酸)的方便的手段。由此获得的产物还可被进一步分离(例如，通过浓縮、结晶、沉淀、对晶体的洗涤和干燥的方式来进行)和/或进一步纯化(用活性炭处理、离子交换和/或重结晶)。下游加工方案可以包括，例如，通过用石灰沉淀、层析或溶剂萃取来分离柠檬酸。纯化可包括用活性炭处理、离子交换、结晶和/或过滤步骤。终产物形式是通过浓縮和结晶获得的，或者，对于盐形式而言，通过用想要的碱(例如NaOH、KOH、NH3等)中和柠檬酸获得的。这些晶体可被分离、洗涤和干燥。如果必要的话，晶体还可被重新溶解于水中，用活性炭和/或离子交换树脂对其进行处理，并重结晶。然后可对上述晶体进行分离、洗涤和干燥。柠檬酸可被转化为柠檬酸单钠、柠檬酸三钠、柠檬酸三钙、柠檬酸三钠二水合物、拧檬酸三钾、无水柠檬酸单钠或者结晶为柠檬酸酐或拧檬酸单水合物。通过本发明的方法生产的柠檬酸及其盐可进一步用作为例如食品(例如，烘焙制品、婴儿食品、脂肪和油、糖、奶酪制品、乳制品)、饮料(例如，碳酸软饮、糖浆、果汁和果饮、葡萄酒、即饮茶)、药物(例如，片剂、浆剂、悬浮液/溶液)、清洁剂和去垢剂(例如，除臭皂、餐洗液/粉)、个人护理产品(例如，洗发露、护肤霜和爽肤水、保健产品、牙膏)或其它工业应用(例如粘合剂、动物饲料、光化学产品等)的成分或添加剂。因此，在一种实施方式中，本发明涉及包含本文所述的工艺生产的柠檬酸的食品、饲料、饮料、药物、清洁剂、去垢剂或个人护理产品。将通过下述实施例进一步阐述本发明，所述实施例不应被理解为起限制作用。本文提到的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容都通过引用并入本文。实施例菌株WT1:该A菌株被用作为野生型菌株。该菌株被保藏于CBSInstitute,保藏号为CBS513.88。WT2:该Am'gw菌株是包含编码葡糖淀粉酶的基因(g/flA)缺失的WT1菌株。WT2是通过使用EP0635574Bl所述的"MARKER-GENEFREE"方案构建的，在该专利中描述了如何在CBS513.88基因组中缺失g/aA特定DNA序列的方法。该方案产生了不含标记基因的Ag/aA重组Am'gerCBS513.88菌株，该菌株不具有任何外源DNA序列。WT3:该Am'gw菌株是包含导致草酸盐/酯缺陷型Am'gw菌株的突变的WT2菌株。WT3是使用EP1590444所述的方法构建的。该专利申请公开了如何筛选草酸盐/酯缺陷型Am'gw菌株。菌株WT3是按照EP1590444中实施例1和2所述的方法构建的，WT3是EP1590444的突变体菌株22(在EP1590444中命名为FINAL)。实施例1制备染色体DNA以及通过PCR扩增DNA片段从具有100ml发酵培养液(MM-G)的500ml带挡板烧瓶中于30°C和150rpm培养了16-20小时的细胞制备A^w^7/mm'gerCBS513.88染色体DNA。MM-G培养基每升含有20gD-葡萄糖、6gNaN03、0.25gKC1、1.5gKH2P04、1.13ml4MKOH、0.5gMgS04.7H20、1ml痕量元素贮液(每升痕量元素贮液22gZnS(V7H20、11gH3B03、5gFeS047H20、1.7gCoCl2.6H20、1.6gCuS04.5H20、5gMnCl24H20、1.5gNa2Mo04'2H20、50gEDTA，用4MKOH将pH调节至6.5，过滤灭菌，并于4°Cfc藏于暗处)。摇瓶发酵和染色体DNA分离在WO98/46772中有更详细的描述。使用按照上文所述制备的染色体DNA以及一组引物——Pf(分别是SEQIDNOs:3、8、13和18)和Pr(分别是SEQIDNOs:4、9、14和19)，通过PCR来制备DNA片段。按照厂商说明书，用Platinum尸/x聚合酶(Invitrogen)禾B50ng染色体DNA以50/il的总体积来进行反应，获得了含有各DNA序列(SEQIDNOs:1、6、11禾B16)的PCR产物。从反应体系中回收PCR产物，并验证了其正确序列。构建过量表达载体和敲除载体按照已知原则和常规质粒分离技术(Sambrook，J.etal.,1989)来进行克隆技术和质粒DNA分离。用于打断的候选序列包含开放读码框(ORF)(具有内含子)和基因的大约1500bp的5，和3，序列。按照已知的原则来设计用于SB08基因的基因置换型载体，按照常规克隆流程来构建所述载体(见图l)。简言之，这些载体包含大约1500bp的SB08ORF侧翼区域，用于在预定的基因组SB08基因座处进行同源重组。此外，它们含有AmWM/a似双向amdS选择标记，处于正向重复之间。对这些缺失载体的一般性设计以前在EP635574B和WO98/46772中描述过。按照已知原则来设计针对TS08、TS09和CS07基因的过量表达载体，按照常规克隆流程来构建。对表达载体进行一般性设计以及使用表达载体进行基因过量表达的例子参见W0199932617、WO200121779和WO2005100573。简言之，表达载体至少包含启动子和终止子，用于正确表达基因。用例如表1所列出的基因组TS08、TS09和CS07DNA或cDNA来克隆和过量表达提到的基因。用于转化的选择标记，例如，AmWw/a似双向amdS选择标记可在载体上，或者作为单独的载体用于共转化。基于pGBTOP或基于pGBFIN的表达载体的例子可在图3或4中找到。所有的ATS08、TS09禾nCS07基因都被克隆于基于pGBFIN的过量表达载体中。pGBFINMNR-l载体是针对TS08蛋白的过量表达载体的基于pGBFIN的载体的例子(图5)。实施例2在AWT3中打断BS08基因用以前描述过的方法(BiotechnologyofFilamentousfungi:TechnologyandProducts.(1992)ReedPublishing(USA);Chapter6:Transformationpages113-156)，分离出经合适限制性酶消化过的缺失载体的线性DNA，例如pGBDEL-SODA(图3)，用其转化Am'gerWT3。该线性DNA可在同源基因座整合进基因组，由此用^m/S基因取代编码BS08多肽的内源BS08基因。对该事件的描述见图2所示。按照EP635574所述的标准流程，在乙酰胺培养基上选择转化子，纯化菌落。在氟乙酰胺培养基上涂布孢子，选择丢失了aw6/S标记的菌株。通过PCR来检査生长中的菌落是否整合进同源基因座，通过Southern分析针对内源BS08基因的缺失来检查候选菌株。可通过大约0.9kb大小的DNA片段(其覆盖了整个基因座，并且与合适的侧翼序列探针杂交)的减少来探测到BS08基因的缺失。大约100个最初转化子的库中，大约3个菌株显示出基因组BS08基因的去除。菌株deltaBS08被选作为内源sw/A基因失活的代表性菌株。实施例3在AWT3和deltaBS08中过量表达TS08、TS09和CS07基因将实施例中获得的TS08、TS09和CS07基因克隆进pGBFIN过量表达载体(W099/32617)。在用合适的限制性酶线性化之后，用线性DNA转化AWT3和deltaSB08(关于转化，见，例如，BiotechnologyofFilamentousfungi:TechnologyandProducts.(1992)ReedPublishing(USA);Chapter6:Transformationpages113-156)。线性DNA整合进基因组，按照EP635574所述的标准流程，在乙酰胺培养基上选择过量表达TS08、TS09和CS07的Am'gw转化子，纯化菌落。转化和随后的转化子选择公开于WO98/46772中。菌株WT3-TS08、WT3-TS09、WT3-CS07、deltaBS08-TS08、deltaBS08-TS09和deltaBS08-CS07被选用为分别具有过量表达的指定基因和失活的内源BS08基因的代表性菌株。通过用全部三种pGBFIN过量表达构建体(TS08、TS09和CS07)进行共转化，构建出具有多种过量表达构建体的菌株(deltaBS08-TS08/TS09、deltaBS08-TS08/CS07、deltaBS08-TS09/CS07和deltaBS08-TS08/TS09/CS07)。通过PCR，针对各感兴趣的基因中一种或多种的整合，对这些菌株加以检查和选择。表2所示的具有遗传补充的代表性菌株被选出来，用于进一步的实验。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>表2获得的^s:pergz7/^m'ger克隆的遗传补充实施例4使用打断和过量表达Am'gw菌株通过表面发酵生产柠檬酸用去矿物质水稀释甜菜和甘蔗糖蜜的混合物，以获得每升240g蔗糖。向该混合物中加入3ml磷酸5c/。、0.5gNa4Fe(CN)6.10H2O、0.45g粉末活性炭和1.0mgZn。用硫酸将pH调节为6.15，将混合物放在10cm深的盘中。在70。C对该盘进行巴氏灭菌，令其冷却到40°C。将实施例3中获得的Aw/gw转化菌株以及WT3和deltaBS08菌株加入到培养基中，在35。C的温度和至少70。/o的相对湿度下，在人工气候室对盘进行温育。培养菌丝体，从而在液体表面形成层，将来自液体的蔗糖转化为柠檬酸。当HPLC测量的蔗糖、葡萄糖和果糖浓度降低至低于4g/1时，停止发酵。巴氏灭菌终止酶活性之后，通过HPLC或滴定来测量液体中的柠檬酸浓度。多种菌株的生产表现被计算为较之WT3菌株产率(其被设定为100%)而言的柠檬酸生产产率。在同样条件下培养时，过量表达CS07基因、TS08基因或TS09基因的Am'gw菌株和过量表达这些基因的组合的Am'ger菌株，较之用Am'gw菌株WT3获得的柠檬酸而言，生产出的柠檬酸多至少大约3%至超过20%。这些结果示于图6中。在相同条件下，较之用Am'gw菌株WT3获得的拧檬酸而言，具有BS08打断背景的菌株生产出的柠檬酸多至少大约5%。在同样条件下培养时，在该BS08打断背景中，过量表达CS07基因、TS08基因或TS09基因的Am'gw菌株和过量表达这些基因的组合的Am'gw菌株，较之用菌株A.nigerdeltaBS08获得的柠檬酸而言，生产出的柠檬酸多至少大约1%至超过15%。这些结果示于图7中。这些结果证实在柠檬酸生产细胞中，TS08禾口/或TS09禾口/或CS07的过量表达对于表面发酵柠檬酸生产具有正面效果，这可能与BS08打断或降低的表达相组合。在较之野生型Am'gerCBS513.88而言具有提高的柠檬酸生产背景的菌株中发现了这种改进。使用打断和过量表达Am'gw菌株通过深浸发酵生产柠檬酸将碳水化合物原材料(例如木薯和/或玉米)磨碎并与水混合。在单独的发酵罐中开始种子发酵，其中含有玉米粉浆体作为碳水化合物，用淀粉分解酶在90°C的温度对其进行液化。冷却至37°C后，将Aw/ger菌株WT3、deltaSB08或按照实施例3构建的Am'gw转化子菌株放进发酵罐，以0.1至0.2vvm的空气流进行种子发酵，温度控制为37。C。大约20小时后，将种子发酵罐的内容物转移进主发酵罐。主发酵罐由玉米和/或木薯面粉混合物加入水、添加剂和营养物来准备，其中在混合物中碳水化合物的浓度优选为180g/l并且加入了淀粉分解酶和防沫剂。在加热到90。C来液化淀粉饼随后冷却到35°C之后，将种子发酵罐的内容物转移进主发酵罐。转移之后，通过在0.1wm的空气流速下冷却来控制发酵，当碳水化合物被耗尽时停止发酵，典型地，这需要60-100小时。通过HPLC或滴定来测量液体中的柠檬酸浓度。多种菌株的生产表现被计算为较之WT3菌株产率(其被设定为100%)而言的柠檬酸生产产率。当在同样条件下培养时，过量表达CS07基因、TS08基因或TS09基因的Am'gw菌株和过量表达这些基因的组合的Am'gw菌株较之用Am'gw菌株WT3获得的产物而言，通过转化葡萄糖获得的柠檬酸单水合物的产率高至少大约1%至超过8%。这些结果示于图8中。此外，在同样条件下，较之用A"/gw菌株WT3获得的柠檬酸而言，具有BS08打断背景的菌株生产的柠檬酸多至少5n/。。在同样条件下培养时，在该BS08打断背景中，过量表达CS07基因、TS08基因或TS09基因的Am'gw菌株和过量表达这些基因的组合的Am'gw菌株，较之用菌株A.nigerdeltaBS08获得的柠檬酸而言，多生产出的柠檬酸至少等于至超过15%。这些结果示于图9中。这些结果证实在柠檬酸生产细胞中，TS08和/或TS09和/或CS07的过量表达对于深浸发酵柠檬酸生产具有正面效果，这可能与BS08打断或降低的表达组合。在较之野生型ACBS513.88而言具有提高的柠檬酸生产背景的菌株中发现了这种改进。权利要求1.选自下述组的TS08和/或TS09多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述组由(a)编码分别包含选自SEQIDNO2或SEQIDNO7的氨基酸序列的TS08或TS09多肽的多核苷酸；(b)包含根据SEQIDNO1或SEQIDNO6的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并分别使用根据SEQIDNO3和SEQIDNO4或SEQIDNO8和SEQIDNO9的引物组，通过核酸扩增，例如聚合酶链式反应，来获得；(d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有TS08或TS09多肽的活性；(e)编码TS08或TS09多肽的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及(f)编码TS08或TS09的多核苷酸，且其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少70％同源，例如75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源；构成。2.含有权利要求1所述的TS08和/或TS09多核苷酸的载体。3.如权利要求2所述的载体，其中，所述TS08禾n/或TS09多核苷酸与允许在原核生物宿主细胞或真核生物宿主细胞中表达的表达控制序列可操作地相连。4.用权利要求1所述的TS08、TS09或TS08/TS09多核苷酸或用权利要求2或3所述的载体遗传工程改造过的微生物。5.如权利要求4所述的TS08、TS09或TS08/TS09微生物，额外被包含编码CS07多肽的多核苷酸遗传工程改造过。6.如权利要求4至5中任意一项所述的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07微生物，额外被下述多核苷酸遗传工程改造过，所述多核苷酸包含用于打断或下调BS08多核苷酸的多核苷酸。7.如权利要求4至6中任意一项所述的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07、TS08/TS09/CS07、deltaBS08陽TS08、deltaBS08-TS09、deltaBS08-CS07、deltaBS08-TS08/TS09、deltaBS08-TS08/CS07、deltaBS08-TS09/CS07或deltaBS08-TS08/TS09/CS07微生物，其中，额外地，通过对细胞中存在的、对于BS08多核苷酸的表达来说必要的核酸序列的修饰或失活来获得BS08多肽产量或活性的降低。8.如权利要求4至7中任意一项所述的微生物，其能以100g/l或更多的量从蔗糖生产柠檬酸。9.如权利要求1所述的多核苷酸编码的多肽。10.具有TS08或TS09蛋白活性的多肽，其中，所述多肽是具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列分别与SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少70%，例如，75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5%的同源性。11.用于生产能表达TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多肽的细胞的工艺，其包括下述步骤用-权利要求2的载体和/或-权利要求3的载体和/或-权利要求1所述的多核苷酸和/或-多核苷酸，其包含用于打断或下调BS08多核苷酸的多核苷酸-包含编码CS07多肽的多核苷酸的多核苷酸对细胞进行遗传工程改造。12.TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多核苷酸，优选地，权利要求1所述的多核苷酸，或用权利要求2和/或3所述的载体用于从碳水化合物生产柠檬酸的用途。13.如权利要求12所述的用途，其中额外使用下述多核苷酸，所述多核苷酸包含用于打断或下调BS08多核苷酸的多核苷酸。14.如权利要求12至13中任意一项所述的用途，其中所述TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07多核苷酸与表达控制序列可操作地连接，并被引入微生物。15.如权利要求14所述的用途，其中，所述表达控制序列包含调控序列和/或启动子序列和/或终止子序列，并且，这些序列中的至少一种被改变，所述改变以使得所述微生物从碳水化合物生产对柠檬酸的生产的产率和/或效率提高的方式进行。16.如权利要求15所述的用途，其中，所述表达控制序列包含调控序列和/或启动子序列和/或终止子序列，并且，这些序列中的至少一种被改变，所述改变以使得各被编码的S08、TS08禾P/或CS07多肽的活性增加和/或提高和/或使得BS08多肽的活性减少和/或消失的方式进行。17.如权利要求12至16中任意一项所述的用途，其中所述碳水化合'物选自葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、玉米、木薯和多元醇构成的组。18.在微生物中生产增强的内源TS08、TS09或TS08/TS09基因的工艺，所述微生物包含权利要求1的多核苷酸，所述工艺包括对所述多核苷酸进行改变的步骤，所述改变以使得所述微生物对从碳水化合物生产的柠檬酸的生产的产率和/或效率提高的方式来进行。19.如权利要求18所述的工艺，其中，额外地，在具有增强的内源TS08、TS09或TS08/TS09基因的所述微生物中，通过对所述微生物中含有的、包含编码CS07多肽的多核苷酸的多核苷酸进行改变来增强CS07基因。20.如权利要求18至19中任意一项所述的工艺，其中，额外地，在具有增强的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因的所述微生物中，内源BS08基因被打断和/或下调，这通过改变所述微生物中含有的、编码BS08多肽的多核苷酸来实现。21.如权利要求18至20中任意一项所述的工艺，其中，额外地，在具有增强的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因，或具有增强的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07基因以及打断或下调的BS08基因的组合的所述微生物中，通过修饰或失活BS08基因表达所需的多核苷酸序列，优选地，控制序列，来获得对内源BS08基因的降低的表达。22.在微生物中生产权利要求9至10中任意一项所述多肽的工艺，所述工艺包括改变所述微生物的步骤，使得所述微生物生产具有增加和/或提高的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07活性的所述多肽，可选地，组合有减少的或消失的BS08活性，使得所述微生物对从碳水化合物生产的柠檬酸的生产产率和/或效率提咼°23.生产能生产柠檬酸的微生物的工艺，所述工艺包括改变所述微生物的步骤，使得所述微生物生产具有增加和/或提高的TS08、TS09、CS07、TS08/TS09、TS08/CS07、TS09/CS07或TS08/TS09/CS07活性的多肽，可选地，组合有减少的或消失的BS08活性，使得所述微生物对从碳水化合物生产的柠檬酸的生产产率和/或效率提高。24.生产含有至少一种包含权利要求1的多核苷酸和/或编码CS07多肽的多核苷酸的内源基因的微生物的工艺，所述工艺包括改变所述微生物的步骤，使得所述至少一种内源基因过量表达，导致所述微生物对从碳水化合物生产的柠檬酸的产率和/或效率提高。25.如权利要求24所述的工艺，所述工艺额外包括下述改变微生物的步骤，使得包含编码BS08多肽的多核苷酸的内源基因被下调或打断。26.能通过权利要求18至25中任意一项的工艺获得的微生物。27.如权利要求26或权利要求4至8中任意一项所述的微生物，其选自有丝真菌的组，优选地，选自A^e^/〃w，更优选地，选自Aw/gw、Aa丽won.、Aacw/ea^s、A_/a/om'cw>s、A、j.vacfe願、、J.cw6owa"'w51、爿.励z'wge腿、、爿./ac"co,"to、」.Zra-s77/e肌's、A/—n's、Amsto"'cams7's或爿.ybe油s，进一步更优选地，选自A/o&油svorac油s或J./o"油svar戸〃油s，进一步更优选地，选自爿."/gervarmv画o"'，进一步更优选地，选自Am'gerATCC1015，以及最优选地，选自ACBS513.88。28.从碳水化合物生产柠檬酸的工艺，其中，在允许从所述碳水化合物生产柠檬酸的条件下，在水性营养培养基中培养如权利要求26、27或权利要求4至8中任意一项所述的微生物，并且，其中，柠檬酸作为发酵产物被分离。29.利用如权利要求26、27或权利要求4至8所述的微生物生产柠檬酸的工艺，其中，在允许从碳水化合物生产柠檬酸的条件下，在水性营养培养基中培养所述微生物，并且，其中，柠檬酸作为发酵产物被分离。30.如权利要求18至25或权利要求28或29中任意一项所述的工艺，其中，所述碳水化合物选自葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、玉米、木薯和多元醇构成的组。31.通过权利要求28至30中任意一项所述的工艺生产的或通过权利要求26或27中任意一项所述的微生物生产的柠檬酸作为食品、词料、饮料、药物、清洁剂、去垢剂或个人护理产品成分的用途。32.食品、词料、饮料、药物、清洁剂、去垢剂或个人护理产品，其中包含通过权利要求28至30中任意一项所述的工艺生产的或通过权利要求26或27中任意一项所述的微生物生产的柠檬酸。全文摘要本发明涉及新鉴定出的基因，其编码柠檬酸(生物)合成中涉及的蛋白质。本发明还涉及包含所述新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产柠檬酸中的用途，其中对所述多核苷酸和/或被编码的多肽的修饰对所述微生物中生产发酵产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影响。本发明还包括使用多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法/工艺。本发明还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于生产柠檬酸的用途。文档编号C07K14/38GK101400694SQ200680045375公开日2009年4月1日申请日期2006年12月1日优先权日2005年12月1日发明者多米尼奇·罗伯特·格洛森肯,胡戈·马克·卡雷尔·鲍威利尔斯,诺尔·尼古拉斯·玛丽亚·伊丽莎白·佩伊凡申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司