专利名称：多发性硬化和/或类风湿性关节炎的治疗的制作方法
多发性硬化和/或类风湿性关节炎的治疗
本发明涉及借助于抗体来治疗多发性硬化和/或类风湿性关节炎。 多发性硬化是一种神经纤维的髓鞘被破坏的中枢神经系统疾病， 即神经纤维被脱髄鞘。至今人们对其起因和病理生理学的了解仍很少。 人们猜测它大约是一种外源性和内源性调节的免疫学过程。多发性硬 化的症状较为不特定，例如包括痉挛性麻疾和其它运动方面和感官方 面的缺陷。
至今还未获得令人满意的针对多发性硬化的疗法。至今所实施的
疗法为，例如高剂量地给药类固醇、以及给药硫唑嘌呤(Azathrioprin )、 醋酸格拉替雷(Glatirameracetat)、曱氨喋呤(Methotrexat)、米托 蒽醌(Mitoxantron),或者4吏用免疫调节疗法，例如4吏用干扰素的免 疫调节疗法。然而，这些方法仅能够使疾病急性期的频率和强度减小。 除此之外，这些疗法着眼于緩解症状。
Schneider等人提出，消耗那些表达趋化因子受体CCR2的细胞是 治疗炎症性疾病的一种可4亍的策略(Schneider, M.A.， Brtihl， H. Wechselberger， A.， et al. (2005)， In vitro and in vivo properties of a dimeric bispecific single-chain antibody IgG-fusion protein for depletion of CCR2+ target cells in mice. European Journal of Immunology, vol. 35， p. 987-995 )。作者描述了通过使用双特异性抗体、 尤其是针对CCR2的双特异性抗体使小鼠CCR2 -阳性细胞解离。然 而，这才艮本未显示出治疗效果。
类风湿性关节炎是一种慢性炎症性系统性疾病，主要影响关节并导 致畸形和运动受限。症状例如肿胀、疼痛和运动受限。类风湿性关节炎 的起因仍未被阐明或讨论，其中应考虑到免疫发病机制和感染性起因以 及遗传因素。
通常，类风湿性关节炎的治疗使用所谓的抗风湿剂、即例如使用 DMARD (緩解疾病的抗风湿性药物)来进行，其中包括例如甲氨蝶呤 和来氟米特(Leflunomid)。另外也可使用类固醇。此外，还可使用生 物制品或免疫抑制剂，如TNF-a-阻断剂(例如针对TNF-a或Ethernac印t的单克隆抗体)或者IL - 1受体拮抗剂(例如阿那白滞素(Anakinra))。非甾类抗风湿药(NSAR)主要被用于治疗疼痛。但在许多种情况下仍不能令人满意地治疗疾病并避免能够导致瘫痪的关节损害。
Brtihl等人描述了向胶原诱导关节炎的小鼠模型给药一种针对趋化因子受体CCR2的单克隆抗体(MC - 21) (Brtihl H， Cihak J， SchneiderMA， Plachy J， Rupp T， Wenzel I， Shakarami M， Milz S， Ellwart JW，Stangassinger M， Schlondorff D， Mack M. (2004) Dual role of CCR2during initiation and progression of collagen-induced arthritis: evidencefor regulatory activity of CCR2+ T cells. J Immunol" vol. 172(2)， p.890-898)。作者描述了通过抗体法而达到的关节炎的緩解只在疾病的初始期(即用胶原免疫后而在关节发炎之前)期间CCR2阻断时获得，而不是在发展期。在发展期，CCR2的阻断甚至会引起关节炎的恶化和对胶原的免疫应答。由此可推断出，通过抗体法仅影响了模型体系中疾病的人工产生，即使用胶原使动物免疫。但是，以这种方式治疗疾病本身似乎并不可行。
Brodmerkel等人(2005 )描述了 一种小鼠CCR2受体的小分子拮抗剂INCB3344 ( Brodmerkel, C.M.， Huber， R. Covington, M.， Diamond, S.，Hall, L., et al. (2005). Discovery and Pharmacological Characterization ofa Novel Rodent-Active CCR2 Antagonist, INCB3344 )。该分子在实验性自身免疫性脑炎(EAE)的小鼠模型中研究，该模型是一个多发性硬化模型。然而，给药在一个仅有少数几个动物显示出疾病的临床征象的时间点(分别在免疫后0天和7天)已经开始。Brodmerkel等人(2005 )还描述了向佐剂诱发关节炎模型的大鼠给药INCB3344。给药再次在一个大鼠未显示出任何疾病临床征象或仅显示出轻微的疾病临床征象的时间点(免疫后9天)开始。
总之，可推断出针对多发性硬化和/或类风湿性关节炎目前还未有令人满意的疗法。
针对此技术背景，本发明的目的在于为多发性硬化和/或类风湿性关节炎提供一种新的可能的疗法。
该目标通过一种用于治疗受试者的多发性硬化和/或类风湿性关节炎的含有能够与趋化因子受体CCR2特异性结合的抗体的药剂解决，或
6者将所述抗体用于制备治疗受试者的多发性硬化和/或类风湿性关节炎的药剂而解决。
令人惊奇的是，已发现本发明的情况下，给药针对CCR2的抗体可使多发性硬化和/或类风湿性关节炎在临床上获得改善，这与至今为止文献中的观点是相反的(尤其参见上文中引用的Briihl等人(2004))。换言之，已发现通过给药针对CCR2的抗体，可以非常好地获得类风湿性关节炎的临床改善，优选使用低于Brtthl等人(2004)选择的剂量。类似地，可知能够获得多发性硬化的临床改善。
此外，还惊奇地发现治疗不仅可在动物模型中疾病的初始阶段进行，还可以在疾病的临床症状已经明确存在时进行。这使得相对较晚的干预治疗，尤其是人类临床实践中的干预治疗成为可能。
趋化因子受体CCR2是本领域技术人员已知的(例如，参见在线人类孟德尔遗传数据库，编目号为601267 (参见美国国立卫生研究院网站中的OMIM: http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/))。该受体为一种CC型的趋化因子受体，人类存在两种不同的剪接变体CCR2A和CCR2B( Wong，L.國M.， Myers， S.J.， Tsou， C.-L， et al. (1997) Organization and DifferentialExpression of the Human Monocyte Chemoattractant Protein 1 receptorgene: Evidence for the role of the Carboxyl-Terminal Tail in ReceptorTrafficking. J. Biol. Chem.， vol. 272， p. 1038-1045 )。该分子的另外一个已知名为乂类卓裙勿應趟必蛋冷-/憂沐差厉(human monocytechemoattractant protdn-I receptor gene )。它是一个7 -跨膜结构域- G蛋白偶联的受体。来源于多种其他物种的相应的CCR2的直系同源基因也是已知的，并且可由本领域技术人员简单地确定，例如通过从人类CCR2开始进行的序列搜索。
术语抗体是本领技术人员已知的。本发明中，术语抗体应以广义的范围被理解，尤其包括多克隆抗体、单克隆抗体和重组产生的抗体以及它们的片段，例如Fv-、 Fab-和F(ab)2-片断，它们可以是单链的。优选地为同种型IgG抗体。优选地该抗体是能够诱导效应物机制、如ADCC(抗体依赖的细胞毒性)或补体激活的同种型。它们可为，例如人IgGl或鼠IgG2a。优选地，该抗体是这样的抗体，即如果可能它不会被受试者的免疫系统排斥或者仅以非常低的程度被受试者的免疫系统排斥。这
7可通过使识别抗原(本文中为CCR2受体)所不需要的区域(例如Fc区域)由受试者物种的抗体序列构成而实现。例如，本领域技术人员已知的特别适用于人类的所谓人源化抗体。以其它方式修饰的抗体也是本发明中所提及的抗体，例如双特异性抗体(例如参见上文中已引用的Schneider等人(2005)),双体以及所谓的连接体(binder)或适体，它们可通过例如肽骨架或核酸骨架、如RNA来制备。优选地，本发明中的抗体的分子量小于600kDa，更优选地小于300kDa,进一步更优选地小于200kDa，最优选地约为150kDa。合适的多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体的制备，包括连接体和适体的制备是本领域技术人员已知的(例如参见J6rg KMblein (主编)，Modern Biopharmaceuticals， vol. 2， p.635)，也可参见实施例。例如，免疫可通过注射表达CCR2受体的细胞而实施。其优点为天然折叠形式的受体可作为抗原使用。此外，用抗原的肽片段进行免疫是可行的。优选地，相应的肽选自CCR2的细胞外结构域，尤其选自起始的两个环。合适抗体(包括连接体和适体)的鉴定还可通过使用相应的分子或表达这些分子的细胞进行文库筛选进行，例如通过噬菌体展示。鉴定后，抗体(包括连接体和适体)可通过本领域技术人员已知的方法制备。
优选地，本发明的抗体被偶联至增强抗体的消耗作用(depletingeffect)的结构域上。这种结构域是本领域技术人员已知的。 一个实例是一种诱导ADCC或补体激活的Fc-结构域。另 一种可能性是将抗体偶联至毒素上。该抗体也可为一种双特异性抗体，如MC-21的双特异性变体，该变体被描述在Schneider等人(2005)中，它作为第二抗原识别小鼠CD3-s (上文中已引证的Schneider等人(2005))。
本发明的抗体可与趋化因子受体CCR2结合。优选地，所述抗体结合至细胞外CCR2结构域的环1和环2上。优选地，所述抗体结合的解离常数Kd为1(^M或更大、更优选108]\1或更大、甚至更优选1091\1或更大，最优选10"M或更大。优选地，结合是特异性的。本发明中的特异性结合是指在生理学条件下(即，例如在生理盐溶液、细胞培养液或体内，优选在对应受试者的血液或组织中)，抗体与CCR2结合的亲合性是与其它蛋白质结合的亲合性的至少10倍、优选20倍、更优选50倍、最优选100倍，所述其它蛋白质尤其为相似蛋白质(例如CCR5、
8CCR1、 CCR3或其它趋化因子受体和具有7个跨膜结构域的G蛋白质偶联受体，优选CCR5)。然而，只要不干扰抗体的治疗效果，可容许结合至其它蛋白质上。但是，可能发生与其它物种的正向同源的CCR2受体的交叉反应性，甚至有利于将抗体用于多个物种。这种交叉反应性不是不同寻常的，并且本领域技术人员已知如何确定交叉反应性。关于这一点的进一步描述可参照实施例。
优选地，按照本发明所使用的抗体可抑制趋化因子受体CCR2。抗体是否抑制趋化因子受体CCR2容易确定。例如，这种抗体借助于CCR2以趋化的方式反应，降低MCP - 1 -和MCP - 3 -诱导的细胞趋化性，例如单核细胞的趋化性。鼠或人的相应细胞的实例分别为Monomac6-细胞或人外周血单核细胞(PBMC)。相应的测定描述于实施例中。
此夕卜，趋化因子受体CCR2的抑制可通过对MCP - 1结合的抑制和对MCP - 1诱导的钾内流的抑制这些现象来确定。相应的测定描述于实施例中。
合适的抗体或可用作制备经修饰抗体的原料的抗体的实例为选自如下的抗体DOC國l、 DOC画2、 DOC-3和MC-21。抗体DOC-l、 DOC-2、DOC-3的制备及它们的表征描述于实施例中。
本发明的药剂含有所述抗体。此外，所述药剂还可含有本领域技术人员认为合适的任何类型的助剂。例如，这样的助剂可为载体物质，如淀粉、乳糖、脂肪、硬脂酸、醇、生理盐水溶液或其它添加剂。特别考虑的是能够稳定和保存抗体的助剂。
药剂的给药可以任何已知的能够将药剂中包含的抗体插入体外或体内的靶细胞、尤其是单核细胞中的方法实施。例如，所述药剂可以溶液或浸剂的形式通过注射给药，例如静脉注射(i.v.)、皮下注射(s.c.)或腹膜内注射Up.)。然而，也可以考虑其它的给药形式，例如以微胶嚢的形式或植入物的形式。优选地，进行药剂的给药以使抗体能够进入循环系统或进入各个靶向区域。还可考虑直接向靶向区域给药，例如在多发性硬化的情况下给药至中枢神经系统，如脊髓液，或者在类风湿性关节炎的情况下给药至受影响的关节。
疾病多发性硬化和类风湿性关节炎是本领域技术人员已知的，并且已在背景技术部分进行了描述。
9术语治疗也是本领域技术人员已知的。在本发明中，治疗包括4吏受试者的多发性硬化和/或类风湿性关节炎在临床上获得改善的任何类型的干预措施。对于多发性硬化的临床改善的确定例如可通过测量神经缺陷、如中风的减少进行。对于类风湿性关节炎的临床改善可通过例如症状——如肺胀、炎症或疼痛——的减少来确定。优选地，改善可以通过
临床症状的緩解而表现出来，例如实施例中EAE记分至少增加(K25单位，优选0,5单位，更优选至少0.75单位，最优选至少1.0单位。优选地，改善可通过临床症状的緩解表现出来，例如实施例中关节炎记分增加至少0.25单位，优选至少0.5单位，更优选至少0.75单位，更优选至少1.0单位，最优选至少1.25单位。对于人的临床改善估算，许多参数都是已知的，例如针对多发性硬化的EDSS记分(扩展残疾状态评分，参见Kurtzke， JF (1983). Rating neurologic impairment in multiplesclerosis: an expanded disability status scale (EDSS). Neurology, vol.33(11)， p. 1444-1452))。通过这种方式，临床改善可通过症状的緩解表现出来，例如对应于EDSS记分增加了至少0.5、优选至少l.O、更优选至少1.5单位、更优选至少2.0单位、最优选至少2.5单位。此外，针对类风湿性关节炎的ACR(美国风湿病学会)-记分也是用于估算人类临床改善的已知的方法。
优选地，治疗涉及一个患有多发性硬化和/或类风湿性关节炎的受试者。具体而言，治疗涉及患病期间的多发性硬化和/或类风湿性关节炎，尤其是在出现疾病的临床征象时的治疗。疾病的临床征象例如对应于EAE -记分(见实施例)为1.0或更大、优选1.5或更大、更优选2.0或更大、甚至更优选2.5或更大，尤其是3.0或更大。疾病的临床征象还对应于例如关节炎记分(见实施例)为每个肢体1.0或更大、优选2或更大、甚至更优选3或更大，甚至更优选4。还已知其它许多用于估算人的临床征象的参数，例如EDSS记分(扩展残疾状态评分，参见Kurtzke，JF (1983). Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: anexpanded disability status scale (EDSS). Neurology, vol. 33(11)， p.1444-1452))，以及用于类风湿性关节炎的ACR (美国风湿病学会)-记分。
此外，治疗还可针对一种难于治疗的多发性硬化和/或类风湿性关节
10炎进行，它们是每种疾病的一种通过至今已知的药剂不能得到临床改善 的形式。大量的受试者中用至今已知的药剂已不能在临床上改善病程。 此外，治疗还可针对各种这样的疾病，即使用至今存在的治疗方法会得 到无法忍受的不想要的副作用的疾病。治疗还可分别针对每种疾病的晚 期。
本发明中的受试者是脊推动物，优选是一种哺乳动物。哺乳动物可 为例如啮齿类(如小鼠、大鼠或兔)、猪、狗、猫或灵长类动物。优选 地，哺乳动物是一种灵长类动物(例如猕猴或普通狨猴或人)。尤其优 选的受试者是人。
为了将药剂给药，通常需确定有效剂量。术语有效剂量和有效剂量 的确定是本领域技术人员已知的，另外，本领域技术人员可参考本文中 提供的信息来确定有效剂量。剂量应被理解为有效地使受治疗的疾病在 临床上得以改善。具体而言，在本发明中，能够使受试者的多发性硬化 和/或类风湿性关节炎的症状得到緩解的药剂剂量应被理解为有效剂量。
例如，有效剂量是这样选择的，即外周血中至少20%、优选至少30%、 更优选至少40%、最优选至少50。/o的表达CCR2的单核细胞被消耗。本 文中，单核细胞的消耗应被理解为细胞的破坏。
优选地，药剂的有效剂量应如此选择，即能够确保多发性硬化和/或 类风湿性关节炎得到令人满意的治疗的最小剂量。特别合适的有效剂量 可这样确定，即在测试系列中剂量持续增加剂量直至达到所需的有效作 用与不想要副作用的比例时为止。本发明中为例如受治疗的疾病不再随 剂量的进一步增加而进一步改善(或者甚至恶化)和/或当不想要的副作
用相对疗效果来说已不可接受。
例如，应考虑到剂量不超过外周血中表达CCR2的单核细胞消耗 99%、优选98%、更优选95%、更优选卯％、更优选80%、更优选70%、 甚至更优选50%时所需的剂量。在本发明中示出了使得临床改善显著并 未使疾病恶化的剂量，尽管单核细胞大量消耗，但也不应认为该剂量过 高。特别是针对类风湿性关节炎。
或者，可根据是否引起白介素-6 (IL-6)和/或白介素-4 (IL-4)释放 来估算剂量。具体而言，剂量的估算可根据IL-6的释放进行。这样，可 优选地选择足够低的剂量以使其不会引起IL-6和/或IL-4的过量释放。
ii例如，应选择剂量以使其不会引起血浆中IL-6和/或IL-4的水平增加高 于20倍、优选不高于10倍、更优选不高于5倍、最优选不高于2倍。 本文中，增加是相对于受试者血浆中正常水平的IL-6和/或IL-4计算的。 本文中，在给药所述药剂之前，个体中IL-6和/或IL-4的水平优选地被 认为是"正常的"水平。本领域技术人员已知，何时IL-6和/或IL-4的释 放应被认为受到给药所述药剂的影响。可认为在腹膜内注射抗体后两至 六小时后的IL-6和/或IL-4水平的增加是由药剂影响的。
此外，剂量应为合适的剂量，其下限任选地为每千克受试者体重每 天O.Ol、 0.02、 0.03、 0.05、 0.07、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5或3.0mg抗体，且 其上限任选地为每千克受试者体重每天1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 4.0、 5.0、 7.0、 10、 12、 14、 17或20mg抗体，其中所述的限定值可以任何 方式组合，但应使其包括限定值的有效范围(positive range)。这种范围的 实例为每千克受试者体重每天0.01-20或0.01 - 2或2.5 - 20mg抗体。
此外，本发明涉及一种含有能够与患有多发性硬化和/或类风湿性关 节炎的受试者的趋化因子受体CCR2结合的抗体的药剂，或者所述抗体 在制备用于消耗患有多发性硬化和/或类风湿性关节炎的受试者中单核 细胞的药剂中的用途。
此外，本发明涉及一种含有抗体的药剂，其能够消耗受试者中多发 性硬化和/或类风湿性关节炎的单核细胞，以及所述抗体在制备用于治疗 受试者的多发性硬化和/或类风湿性关节炎的药剂中的用途。
本发明的所有优选的实施方案和变化方案，以及"i兌明书中的自明的 定义也相应地涉及前述两种药剂和用途。
本发明中，已发现给药一种能够抑制趋化因子受体CCR2的抗体可 使表达CCR2的单核细胞消耗。
本发明人假设多发性硬化和/或类风湿性关节炎的治疗优选地通过 消耗表达CCR2的炎症性单核细胞而进行。
本发明中，单核细胞的消耗应被理解为是相应的单核细胞被破坏。 可通过设计抗体来影响消耗的机理。优选地，消耗通过基于ADCC (抗体依赖性细胞毒性)和/或补体激活的细胞裂解机理而实现。但是， 如果是补体激活机理，应注意到未出现炎症反应的增加，例如通过补体 分子C3a和C5a。例如，基于ADCC的消耗可通过CD16/32或CD64
12来调节。ADCC使单核细胞互相消耗成为可能。
在本发明抗体的协助下进行的消耗可在多个物种中进行。例如，小 鼠和人的单核细胞群相似。例如，还已知在小鼠中可观察到血液中的单 核细胞可分为炎症性单核细胞(CDllb+、 CCR2+、 GRl+、 CD62L+、 CXsCRi 低)和非炎症性单核细胞(CDllb+、 CCRT、 GRr、 CD62IZ、 CXsCRi高) (Geissmann F， Jung S， Littman DR. (2003). Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity, vol. 19(1)， p. 71-82.)。人体中，这两种单核细胞群早已是公知的并且主要通 过表面标记CD14和CD16的表达水平来确定(Ziegler-Heitbrock HW (2000). Definition of human blood monocytes. J Leukoc Biol" vol. 67(5)， p. 603-6.)。
另一个实施方案中，除了抗体针对CCR2之外，还可使用至少一种 对单核细胞具有特异性的抗体用于治疗，优选地选自CD14、 CD33、 CD64、 CD68、 CD91、 CD115和CD163。尤其优选的是CD14。这种实 施方式在受试者为灵长类、特别是人时可以是尤其有利的。
另一个实施方案中，本发明涉及一种用于消耗单核细胞的方法，包 括将单核细胞与一种能够与趋化因子受体CCR2特异性结合的抗体接 触。本发明排除了代表一种用于人体或动物体的外科手术方法或治疗方 法。优选地，接触在体外进行。术语"体外"应以其在上下文中可能的 最广泛的形式理解。其涉及任何发生在活体之外的方法，尤其是细胞培 养、组织培养或器官培养中的方法。术语"体外"尤其应被理解为包括 一种涉及处理受试者体外的血液的方法。
本发明还涉及一种用于治疗受试者的多发性硬化和/或类风湿性关 节炎的方法，包括一个给药一种能够与趋化因子受体CCR2特异性结合 的抗体的步骤。
本发明还涉及一种用于消耗受试者的特定单核细胞的方法，包括一 个给药一种能够与趋化因子受体CCR2特异性结合的抗体的步骤。
前文已给出的所有本发明的优选实施方案和变型以及定义也相应地 涉及前述两种方法。
图1单核细胞消耗动力学。分别向小鼠每曰注射10jigMC-21或者同种 型的对照抗体，导致小鼠的外周血中GRl +单核细胞的消耗，持续至少 5天。每组5只小鼠进行实验。抽血在抗体注射后大约7小时进行。基 于GR1 +单核细胞与CD19 + B细胞(其未被抗体处理实质性地影响) 的比例，人们可以认识到GR1 +单核细胞被MC - 21抗体的消耗，持续 至少5天。天Day
图2
在高浓度下，MC-21诱导IL-6的释放。用lOOjig或10jig的MC -21抗体腹膜下处理C57BL/6-小鼠。注射后2小时，血浆中的IL-6 水平通过ELISA (酶联免疫吸附测定)法测定。只有在高剂量下，MC -21抗体导致了 IL-6的释放。抗-CCR2: MC - 21抗体；i.p.:腹膜内 图3
A. 不同的MC - 21浓度差异性地调节了关节炎的过程。在胶原诱导 的关节炎模型中(每只DBA/1小鼠在第1天用100照胶原和弗氏完全佐 剂免疫，在第21天用100照胶原和弗氏不完全佐剂免疫)，每日给药(从 第21天至32天)高剂量的MC - 21抗体(50照)使得关节炎明显恶化， 而每日给药低剂量(IO吗)的MC-21抗体使得关节炎明显得到改善。
B. 当关节炎已经非常显著时，每天以低剂量给药(10-20照/天， 腹膜内)MC - 21抗体(抗-CCR2 )在胶原诱导的关节炎模型中也是治 疗有效的。将等剂量的抗体MC-67用作同种型对照。小鼠以3周的间隔 用胶原(各20(Hig分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)免疫两次。 直到出现明显的关节炎征象(记分3)才开始抗体治疗(第0天)。给 药MC-21引起疾病的停滞，而对照組(给药MC-67)中疾病明显在继 续。MC - 21组和MC - 67组的区别很显著(第1 - 6天p<0.05 )。在 MC-67组中，从第0天开始计算的关节炎的增加很显著。而在MC组中， 关节炎的改变不显著。
图4
炎症性单核细胞的消耗改进了实验性自身免疫性脑脊號炎 (EAE )——多发性硬化的一种动物模型——的进程。施用20jig的MC -21而非其同种型对照(IgG2b)显著地改善了病程。MC-21抗体或 其同种型对照从第17天(疾病的峰值)开始每日给药直至免疫后第34天。临床上的严重程度(记分)为2.5时对应于后腿的明显无力并伴有 后腿的单侧麻痹。记分1.0对应于保持后腿力量/运动功能时的尾部麻瘠。 每天Daily;临床EAE i己分(clinical EAE score, klinischer EAE画Score ); 免疫后天数(days after immunization, Tage nach Immunisierung ) 图5
免疫35天后，用MC-25治疗的小鼠EAE期间的髓鞘损伤较小。 脱髓鞘的定量。MC-21治疗的动物具有明显更多保留的髄鞘。IgG2b: 同种型对照；脱髄鞘(demyelination、 demyelinisierung )。
图6
与注射同种型对照抗体(各5mg/kg体重)相反，注射抗体DOC - 2 和DOC-3引起CCR2-阳性单核细胞在狨猴外周血中的数量减少。图 中描绘了 CCR2-阳性的单核细胞与白细胞总数的相对比例，其中该值 在各个同种型对照抗体治疗组中在相应的天数被标准化为100%。 CCR2 +夕卜周血单核细胞CCR2+peripheral blood monocytes; 0h注射抗体 injected antibody at 0 h; 同种型对照isotype-control 图7
非人类的灵长类中炎症性单核细胞的消耗导致体重的稳定(A.)以 及神经缺陷的减少(B.)。分别用抗人CCR2抗体DOC-2和同种型抗 体(IgGl) (5 mg/kg，腹膜内)处理成年雌性的狨猴(Oi///Afi\:>cc^i )。 抗体的使用在动物初次显现出明确的神经学症状时即使用。随后，每两 天对狨猴进行处理。
图8
当处理在疾病的峰值开始进行时，抗人CCR2抗体的治疗性给药引 起寿命的显著延长。从疾病的峰值开始，每两天用抗人CCR2抗体DOC -2 (抗CCR2， 5mg/kg，腹膜内，n=2 )和PBS ( n=2 )分别处理成年 雌性狨猴(CW///A/^7'"ccAws)直到死亡。
以下实施例中更详细地描述了本发明，但它们不应被认为是对本发 明保护范围的限制。 实施例
MC - 21抗体作为体内消耗炎症性单核细胞的一种方法单克隆抗体MC - 21 ( Mack, M， Cihak J， Simonis C， et al.. Expression and characterization of the chemokine receptors CCR2 and CCR5 in mice. J Immunol. 2001 vol. 166(7)， pp. 4697-704 )特异性地与鼠CCR2结合并且 未显示出与密切相关的鼠CCR5受体的交叉反应。它显示出与单核细胞 的强结合，其中小鼠GRl +单核细胞亚群被抗体识别。
MC - 21抗体在体内的作用和动力学向C57BL/6小鼠中单一地腹 膜内注射MC - 21抗体引起炎症性单核细胞亚群(CCR2+ GR1+单核细 胞)在血液和脾中几乎完全消耗(图1)。根据MC-21的注射剂量， 单核细胞的消耗持续了不同的时间。当注射了5-10ng时，24小时后我 们还观察到GRl +单核细胞的完全消耗，而48小时后，已发现GR1十 单核细胞再次出现。在注射更高剂量的MC-21(100或500照)后，单核细 胞的消耗持续2-3天(对应于抗体在血浆中更长的存在时间)。通过重 复注射MC-21抗体，单核细胞的消耗可持续约一周(图1 )。之后，MC-21 抗体的CCR2结合能力丧失，这是因为发生了小鼠抗大鼠抗体被抑制。 MC-21介导的GRl+单核细胞的消耗主要由Fc受体调节，这是因为通过 抗CD16/32 (克隆2.4G2 ATCC HB197 )同时注射针对Fc受体FcgRIII 和FcgRII的抗体减少了血液和脾中MC-21介导的消耗。认为MC-21介 导的单核细胞消耗中的不能被CD16/32抗体抑制的部分是基于补体依赖 性机理或基于取决于CD64的ADCC机理。
MC-21抗体还显示出对表达CCR2嗜碱粒细胞的作用。将完整的鼠 骨髓与MC-21抗体一起培养引起IL-6的大量释放。这种IL-6的释放依 赖于嗜碱粒细胞，因为嗜碱粒细胞在完整骨髓中的消耗引起MC-21诱导 的IL-6释放的大量降低。同样，分离的嗜碱粒细胞(通过针对DX-5的 磁珠和随后的通过CD45和DX-5表达的FACS-分选而分离)通过与 MC-21 —起培养会激发IL-6的释放。缺乏CCR2的小鼠的嗜碱粒细胞 未被MC-21激发而释放IL-6。这些数据显示，MC-21诱导嗜碱粒细胞 的活化，并且这种活化通过MC-21与CCR2的结合发生。由于嗜碱粒细 胞还显示出免疫球蛋白Fc受体(尤其是CD16/32 )的强表达，我们认为 这些受体对于MC-21的固定是重要的，并且也可能是嗜碱粒细胞活化的 原因。体内嗜碱粒细胞的活化取决于MC-21的给药剂量。注射10將 MC-21后，我们观察到体内没有IL-6的释放，而注射100-500fig时，明显的IL-6的释放被诱导(图2 )。
由于单核细胞的消耗可能已经通过低剂量的MC-21 (例如5-10jig ) 获得，并且由于IL-6对于关节炎的发展具有不利的作用，因此，通过重 复注射低剂量的MC-21可能导致单核细胞消耗的同时不发生嗜碱粒细 胞的活化。
为便于分析使用雄性DBA/1-小鼠的胶原诱导的关节炎(CIA)模 型，其在多个方面与人类类风湿性关节炎(RA)相似，并被用于目前临 床实践中重要疗法的临床前开发。在胶原诱导的关节炎模型中，关节炎 通过主要使用小牛胶原进行单次免疫(第1天)或两次免疫(第1天和 第21天)而被诱导。
从疾病模型的第1天开始使用针对CCR2的抗体进行的治疗与使用 胶原进行的免疫相干扰，因此关节发炎情况较不严重。
与抗CCR2抗体的抑制作用相反，在用胶原进行初次免疫时，在之 后(从第4天、第9天或第21天起)以高浓度(每三天500照/鼠)使用 阻断型CCR2抗体MC-21使得疾病的严重程度在临床上和组织学上产生 恶化。这种作用伴随着体液对胶原的免疫应答增加(显著高于抗胶原抗 体滴度)。另外，缺乏CCR2的小鼠——其回交至CIA-易感的DBA/1 系——显示出加强的关节炎(Quinones MP， Ahuja SK， Jimenez F， Schaefer J， Garavito E, Rao A， Chenaux G， Reddick RL， Kuziel WA， Ahuja SS (2004). Experimental arthritis in CC chemokine receptor 2-null mice closely mimics severe human rheumatoid arthritis. J Clin Invest" vol. 113(6)， p. 856-66.)。这些数据表明在关节炎被诱导后抑制CCR2或 在疾病的整个过程中缺乏CCR2会引起关节炎的严重恶化。根据文献中 提供的现有技术，CCR2因此被评估为是治疗炎症性风湿性疾病的不恰 当的目标。
令人惊奇的是，本发明中(图3A)显示出使用较低剂量的MC-21 抗体(此处为每天腹膜内注射10照)引起了关节炎的明显改善，在胶原 诱导的关节炎中的发展阶段也是一样。只从第21天开始给药MC-21抗 体。与此相比，从第21天开始使用更高剂量的MC-21 (50將/天)进行 每曰处理使得关节炎显著恶化。给药针对IgE的抗体(从第21天开始) 同样也导致关节炎的明显恶化，所述抗体引起嗜碱粒细胞的活化。
17MS模型中单核细胞的消耗:在MS动物模型——实验性自身免疫性 脑炎(EAE)——中，该疾病可能会被多种髓鞘成分(例如MOG35.55) 诱导，或者被针对这些成分的自身反应性T细胞的继承性转移诱导。
其它研究显示了，如果在症状变强之前给药，选择性小分子CCR2 拮抗剂则会正向影响EAE的进程(Brodmerkel CM， Huber R， Covington M， Diamond S， Hall L， Collins R， Leffet L， Gallagher K， Feldman P， Collier P， Stow M， Gu X， Baribaud F， Shin N， Thomas B， B訓T， Hollis G， Yeleswaram S， Solomon K， Friedman S， Wang A, Xue CB， Newton RC， Scherle P， Vaddi K (2005). Discovery and pharmacological characterization of a novel rodent-active CCR2 antagonist, INCB3344. J Immunol., vol. 175(8)， p. 5370-8.)在Brodmerkel等人的文章中，潜在的 机理可能是单核细胞向脑的迁移降低。但是，当在疾病的晚期，大量的 单核细胞已存在于脑中时，单核细胞向脑的迁移受抑制是否仍是治疗有 效的是值得怀疑的。因此，Brodmerkel的结果似乎是基于模型系统中的 疾病受到人工引发。令人惊奇的是，本发明基于CCR2的治疗规划 (treatment regime )在进程的EAE阶段或效应期(即疾病时)显示出 治疗有效性。
从初次免疫后的第17天(疾病的峰值)至第34天，每日通过腹膜 内注射(给药)20照的单克隆抗CCR2抗体MC-21或各自的同种型对 照(IgG2b)，也即始于疾病的最高峰(EAE记分2.5，即后腿无力并伴 有单侧腿麻痹)。可观察到病程的明显减緩和统计学上显著的降低(图 4)。临床上的严重程度为l.O表示尾部麻痹。有趣的是，与关节炎模型 相反，较高剂量的MC-21 Ab ( 250jig )引起临床发病病程(clinical course ) 的改善。MC-21引发的功能上相关的嗜碱粒细胞活化在EAE模型中既 不能通过IL-6在受治疗动物的血清中的增加而检测，也不能通过给药抗 IgE来调节疾病的进程而检测。
临床上严重程度的非常明显的、统计学上显著的改善伴随着中枢神 经系统中渗入的单核细胞的明显减少，这可由实施例中经MC-21治疗的 动物中CD3+T细胞和MAC-3+巨噬细胞在免疫后35天时的减少示出。
类似地，在受治疗的动物体内的组织损伤也明显减少。例如，在 MC-21治疗的动物体内脱髄鞘的程度明显地比同种型对照组中要少。
18为确定何种细胞因子和趋4匕因子局部地形成于用MC-21治疗的动 物的CNS中并因此消耗单核细胞，进行了定量PCR。在免疫后第35天， 将受治疗的动物的骨髄取出，并提取RNA，进行反转录并通过定量实时 (RT)PCR定量。在MC-21治疗的动物的CNS中发现产生明显更低的趋 化因子和毒性蛋白质，如IP-IO、 MCP-1和MIP-la。
下一步中，检测了灵长类(普通狨猴(0|///幼1^>"/^5))是否与针
对人CCR2的抗体具有交叉反应。因此，我们分析了作为针对人CCR2 的抗体的根据本发明制备的DOC-l、 DOC-2和DOC-3。
为制备DOC抗体，至少6周龄的BALB/c -小鼠以至少3周的间隔 被以腹膜内的方式免疫6-8次，其有至少1千万个CHO细胞稳定地转染 了全长CCR2b。最后一次免疫后的第四天，将脾细胞与X63.Ag8.653骨 髓瘤细胞融合，并在选择性培养基中培养。所产生的杂交瘤的上清液通 过FACS分析，以分别测定与CCR2b转染的CHO细胞的结合，或者与 CXCR4转染的CHO细胞的结合以作为对照。在阳性培养物被重复克隆 2次后，获得几种单克隆抗体(DOC-l、 DOC-2和DOC-3)，它们特异 性地与人CCR2结合，并不会显示出与鼠CCR2或CCR5的交叉反应， 或者与人CCR1、 CCR3、 CCR5或CXCR4的交叉反应。在人外周血中， DOC抗体结合至T细胞亚群(约20-30% )上，也结合于大量的CD14+ 单核细胞(>95%)上。通过将人的细胞与MCP-1 (lng/ml)在37t:下 预培养30分钟，CCR2抗体与上述白细胞亚群的结合实际上可被完全抑 制，这可由MCP-1诱导的CCR2内在化解释。这也另外说明了 DOC抗 体的特异性。
DOC抗体的功能特点已被全面的表征。下面是其概述 Doc 1:
具有同种型IgG3;
与细胞外CCR2结构域的环1、 2和3结合；
在37。C下，不诱导人的外周血单核细胞(PBMC )中的CCR2下调； 阻断MCP - 1诱导的人PBMC中的CCR2下调； 阻断Monomac6细胞和人PBMC中的MCP-1和MCP-3诱导的趋 化性；
显示出对MCP-1结合和MCP-1诱导的钾内流的部分抑制。
19Doc2二
具有同种型IgGl;
与细胞外CCR2结构域的环1 +环2的前一半结合
在37。C下，以浓度依赖的方式在人PMBC中诱导强的CCR2下调；
阻断Monomac6细胞和人PBMC中MCP-1和MCP-3谦导的趋化
性；
显示出对MCP-1结合和MCP-1诱导的钙内流的非常有效的抑制。 Doc3:
具有同种型IgGl;
与细胞外CCR2结构域的环1 +环2的后一半结合；
以浓度依赖的方式诱导人PBMC中弱的CCR2下调；
阻断Monomac6细胞和人PBMC的MCP-1和MCP-3 i秀导的趋化
性；
显示出对MCP-1结合和MCP-1诱导的钩内流的非常有效的抑制。
本文中，趋化性通过Transwell滤膜(对于PBMC的孔径为3jim， 对于Monomac6的孔径为5nm )测定，其中将细胞(分别为PMBC和 Monomac6)放置在上层孔中，并将趋化因子(20-200ng/ml)放置在下 层孔中。温育约60分钟，测定迁移至下层孔中的细胞的数量。
本文中，钩内流通过基于水母发光蛋白和发光的检测而测定(参见 Bla叩ain et al， Molecular Biology of the Cell, vol. 13, 723—737, 2002 )。 DOC抗体与CCR2的结合通过流式细胞计测定，而染料标记的兔抗鼠 Ig抗体被用作第二抗体。
为确定抗体的结合表位，测定与表达由CCR2和CCR5组成的嵌合 受体的细胞的结合性。CCR2的内在化(下调)也通过流式细胞计测定。
抗体DOC-l、 DOC-2和DOC-3与普通狨猴(Oz/////^^""/^"的 白细胞CCR2的交叉反应通过FACS分析进行检测。为此目的，将普通 狨猴的全血与5ng/ml的CCR2抗体或与同样浓度的同种型对照抗体 (IgGl和IgG3 )进行温育，随后与一种PE (藻红蛋白)-标记的第二 抗体(兔F(ab)2片段抗鼠Ig， R0439, DakoCytomation )温育。红细胞 裂解后进行FACS分析。为了补充证明DOC抗体与普通狨猴CCR2的
20特异性结合，使用全血的一部分在与DOC抗体温育之前用人MCP-1谦 导CCR2的内在化。为此，将全血与ljig/ml的MCP-1在371C下预温育 30分钟，然后检测其与上述DOC抗体的结合。单核细胞群中显示出强的 与抗体DOC-2和DOC-3的结合和稍弱的与抗体D0C-1的结合，这会被描 绘在FACS散点图的正向侧向散射中。如此描绘出的单核细胞中约50%与 DOC-2、 DOC-3和DOC-1结合。这种结合在使用MCP-1预温育的白细胞时 完全消失。同种型对照抗体不会显示出任何与单核细胞的结合。除了单 核细胞亚群之外，DOC抗体的结合仅出现在一个非常小的另外的白细胞 亚群中，该白细胞亚群由于其正向侧向散射而应被归类于嗜碱粒细胞。 被DOC抗体识别的单核细胞群为均质CDllb阳性的，这可由使用抗体克 隆(M1/70，大鼠抗小鼠CDllb)的染色揭示。这种CDllb抗体显示出与 人的CDllb的交叉反应性，以及与普通狨猴的CDllb的交叉反应性。
此外，检测了 DOC抗体的药物代谢动力学特性。在注射抗体DOC-2 和DOC-3 ( 5mg/kg体重)的24、 48和96小时后测定血浆中抗体的浓度。 为此，将猴的血浆在具有hCCR2b-转染的CHO细胞的不同稀释液中温育， 并通过标准曲线计算DOC抗体的血浆浓度，所述标准曲线由抗体DOC-2 和DOC-3的不同稀释剂组成
血浆浓度(照/ml)注射后24 h注射后48 h注射后96 h
DOC-2159853.3
DOC-3206.30.9
此外，CCR2阳性的单核细胞是否被消耗也分别在注射DOC-2或 DOC-3抗体之后测定。为此，在分别注射抗体DOC-2和DOC-3以及同 种型对照抗体(各5mg/kg体重，每組2只猴)后的24小时、48小时和 96小时后采血，并且通过FACS分析确定CCR2-阳性的单核细胞与白细 胞总数的比值。为此目的，分别用抗体DOC-2或DOC-3将全血染色 (stain)然后用上述藻红蛋白标记的第二抗体进行染色，并与正向-侧 向散射一起用来确定CCR2-P日性的单核细胞。图7显示出，在注射后的 第一天，在用DOC-2或DOC-3处理后的动物中CCR2-阳性的单核细胞 与白细胞总数的比例降低(至约50%)。在用同种型对照抗体处理的组 中，CCR2-阳性的单核细胞与白细胞总数的比例在各个天数时均被设定 为100%。
21在抗人DOC - 2抗体的效率被普通狨猴的外周血中炎症性单核细胞 的高度消耗示出后，我们想要测定这种消耗性抗体在灵长类的EAE疾病 模型中的功效。为此目的，用混于完全弗氏佐剂(CFA)中的重组的大 鼠MOG蛋白(50將MOG混于600jil CFA中)免疫成年(约3岁)雌 性普通狨猴(C"//i7/^^/Vi"/i"s) 。 3-4周后，动物开始显示出最初的神 经学症状及食欲不振。第一次明确地出现疾病的神经学症状时，我们开 始使用抗人CCR2抗体DOC-2或其相应的同种型对照(IgGl)进行治 疗。之后，每两天用DOC-2抗体或同种型抗体(5mg/kg,腹膜内)处 理普通狨猴。在治疗期间，与用对照处理的灵长类不同，用DOC-2抗体 处理的灵长类显示出体重稳定并且神经上的缺陷减少。在进一步的实验 中，我们在疾病的高峰期开始使用抗体，证明了相对于对照动物，该实 验中的动物对于致命的进行性EAE具有显著更长的存活时间。
总的说来，本发明中确定的数据首次显示出消耗体内的CCR2+、 GRl+炎症性单核细胞的抗体在MS的小鼠模型和灵长类模型以及关节 炎的小鼠模型中具有明显的治疗效果。
FACS分析将用EDTA抗凝的全血或脾细胞分别与直接标记的或 未直接标记的抗体一起在水上温育45分钟，之后洗涤3遍除去。以下抗 体被用作直接标记的针对鼠细胞的抗体(用染料FITC、 PE、 PE-Cy5、 APC标记)针对CDllb、 GR1、 CD4、 CD19、 CD45、 DX5、 IgE (全 部来自BD-Pharmingen)的抗体。单核细胞基于它们的正向和侧向光散 射以及基于它们表达CDllb而确定，并按照Grl的表达分类为Grl+和 GR1单核细胞。
使用CCR2抗体MC-21 ( 5照/ml)或大鼠-IgG2b -同种型对照抗 体(5ng/ml， BD-Pharmingen)分别作为未直接标记的抗体，之后使用 生物素酰化的小鼠抗大鼠IgG2b (5ng/ml， BD-Pharmingen)，之后使 用10%大鼠血清，之后分别使用链霉亲和素-PE或链霉亲和素-PE-Cy5 (DakoCytomation)，以及如果合适，再使用直接标记的抗体。未 标记的抗体DOC-l、 DOC-2和DOC-3或各自的同种型对照 (Sigma-Aldrich )之后使用PE-标记的多克隆兔抗小鼠F(ab)2片段 (DakoCytomation, R0439 )。
染色后，红细胞的裂解通过FACS裂解液(BD-Pharmingen)实施。FACS分析在BD誦Pharmingen 乂>司的FacsCalibur i殳备上运4亍。
ELISA:分别将培养物的上清液中或EDTA血浆中的IL-6使用
BD國Pharmingen公司的市售ELISA ( OptEIA )进行测量。
细胞分离/细胞消耗通过将DX-5-阳性细胞从小鼠的脾和骨髓中使
用DX-5-磁珠(Miltenyi，按照手册进4亍分离)富集而分离初生的(naiVe )
嗜碱细胞。之后，使用DX-5-APC和CD45-FITC染色，这样嗜碱粒细
胞(DX5+， CD45 low)即可通过FACS國Sort ( BD， FACS ARIA)分离。
所得的嗜碱粒细胞的纯度高于95%。
为将嗜碱粒细胞消耗，将原料细胞与抗IgE - FITC抗体一起温育，
洗涤，然后与抗FITC珠一起温育，并通过磁选(Miltenyi)消耗。消耗
量高于95%。
胶原诱导的关节炎至少8周龄的雄性DBA/l-小鼠如下在尾基处进 行皮下免疫第一天，用混于完全弗氏佐剂中的IOO叫小牛胶原(Sigma, C1188)免疫，在第21天用混于不完全弗氏佐剂中的100ng胶原免疫。 通过收集每个腿的记分来确定临床的关节炎记分，即全部四个腿的记分 加和每个腿的记分l分为一个关节肿胀，2分为至少两个关节肿胀， 3分为整个腿肿胀，4分为腿畸形。使用抗体进行的处理如图中所示。
C57BL/6小鼠的实验性自身免疫性脑炎(EAE):为用于主动免疫 法，将6-8周龄的小鼠皮下注射用CFA (完全弗氏佐剂)乳化的200叫 MOG35-55肽(用lmg/ml结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Difco ) 富集)；同一天以及2天后静脉注射250ng百日咳毒素。EAE的临床表 现通常在免疫后的第13天和第18天之间开始。每周对该小鼠进行四次 神经学评估，标准如下0,无可见的神经学症状；0.5,尾部末梢无力； 1，整个尾部无力；1.5，整个尾部无力并且后腿虚弱；2,后腿的单侧局 部麻瘠；2.5，后腿的双侧局部麻痹；3,后腿的完全麻痹；3.5，后腿完 全麻瘠并且前腿单侧麻痹；4，全部四肢完全麻痹；5，死亡。
为用于普通狨猴(O1/份/^/A7V1cc/^s)的EAE,将重组的大鼠MOG于 完全弗氏佐剂(CFA) (600jdCFA中50叫MOG)中乳化。每份150jd 中，将乳液在四个位点皮下施用至背部。两个施用位点在肩部区域，另 外两个施用在骨盆部位。施用前，将相应的部位刮毛处理并对皮肤消毒。
我们4吏用低剂量的(lmg/ml的CFA ) CFA乳酪分枝杆菌
23(Mycobacterium butyricum )而非结核軒菌(M. tuberculosis )。 通过这种改变，通常强效的CFA被弱化，但不会失去其效力。这种"启动"免疫刺激作用对于引发自身免疫反应是必须的。
实时PCR (RT-PCR):为用于该实验，将动物杀死，将骨髄立即移出并在短时间内用无菌PBS冲洗。使用trizol试剂按照制造商提供的实验步骤提取总RNA，将其转录成cDNA，并进行RT-PCR。
组织学用C02杀死小鼠。将脊柱取出并放入10%的福尔马林緩沖液中。固定后，取出骨髓，将其包埋，用H&E染色以估测白细胞渗入或者用勒克司坚牢蓝(Luxol fast blue, LFB)染色以显示出有髄鞘神经纤维。其它免疫组织化学染色包括多种血细胞类型(巨噬细胞的MAC-3:BD Pharmingen; T细胞的CD3: Serotec， Dttsseldorf)。
权利要求
1. 一种药剂，含有一种能够与趋化因子受体CCR2特异性结合的抗体，所述药剂用于治疗受试者的多发性硬化和/或类风湿性关节炎。
2. 权利要求1所述的药剂，其中所述受试者为灵长类，优选为人。
3. 权利要求1至2之一所述的药剂，用于治疗难于治疗的多发性硬 化和/或晚期多发性硬化。
4. 权利要求1至2之一所述的药剂，用于治疗难于治疗的类风湿性 关节炎和/或晚期类风湿性关节炎。
5. 权利要求1至4之一所述的药剂，其中所述抗体选自Doc-l、Doc-2、 Doc-3和MC-21 。
6. 权利要求1至5之一所述的药剂，其中所述治疗使用有效剂量的 该药剂进行，所述有效剂量应选择为不超过为使外周血中表达CCR2的 单核细胞消耗达95°/。、优选卯％、更优选80%所需的量。
7. 权利要求6所述的药剂，其中所述治疗使用有效剂量的该药剂进 行，应选择所述有效剂量以使外周血中至少20%、优选至少30%的表达 CCR2的单核细胞^皮消耗。
8. 权利要求1至5之一所述的药剂，其中所述治疗使用有效剂量的 该药剂进行，选择所述有效剂量以使血浆中白介素-6(IL-6)和/或白介素 -4(IL-4)水平的增加不超过20倍、优选不超过10倍。
9. 权利要求1至5之一所述的药剂，其中所述治疗使用有效剂量的 该药剂进行，选择所述有效剂量以使其对应于每千克受试者体重每曰为 0.01 -20mg抗体。
10. —种含有一种能够消耗单核细胞的抗体的药剂，用于治疗受试者 的多发性硬化。
11. 权利要求10的药剂，其中所述药剂还如权利要求2至3和5-9中 的一项或多项所限定。
12. —种含有一种能够消耗单核细胞的抗体的药剂，用于治疗受试者 的类风湿性关节炎。
13. 权利要求12的药剂，其中所述药剂还如权利要求2和4至9中 的一项或多项所限定。
14. 一种用于消耗单核细胞的方法，包括将所述单核细胞与一种能够与趋化因子受体CCR2结合的抗体接触，具体排除构成了用于人体或动 物体的外科手术方法或治疗方法的方法。
15. —种用于治疗受试者的多发性硬化和/或类风湿性关节炎的方法， 包括一种给药能够与趋化因子受体CCR2特异性结合的抗体的步骤。
16. 权利要求15所述的方法，其中所述受试者为灵长类，优选为人。
17. 权利要求15至16之一所述的方法，其中所述多发性硬化为一种 难于治疗的多发性硬化和/或一种晚期多发性硬化。
18. 权利要求15至16之一所述的方法，其中所述类风湿性关节炎为 一种难于治疗的类风湿性关节炎和/或晚期类风湿性关节炎。
19. 权利要求15至18之一所述的方法，其中所述抗体选自Doc-l、 Doc-2、 Doc-3和MC-21。
20. 权利要求15至19之一所述的方法，其中所述治疗使用有效剂量 进行，所述有效剂量应选择为不超过为使外周血中的单核细胞消耗达 95%、优选90%、更优选80%所需的量。
21. 权利要求20所述的方法，其中所述治疗使用有效剂量进行，应 选择所述有效剂量以使外周血中至少20%、优选至少30%的单核细胞净皮 消耗。
22. 权利要求15至19之一所述的方法，其中所述治疗使用有效剂 量进行，选择所述有效剂量以使血浆中白介素-6(IL-6)和/或白介素-4(IL-4) 水平的增加不超过20倍、优选不超过10倍。
23. 权利要求15至19之一所述的方法，其中所述治疗使用有效剂 量进行，选择所述有效剂量以使其对应于每千克受试者体重每日为0.01 - 20mg抗体。
24. —种用于消耗受试者中单核细胞的方法，包括一个给药 一种能够 与趋化因子受体CCR2特异性结合的抗体的步骤。
25. 权利要求24所述的方法，其中使用所述方法治疗受试者的多发 性硬化和/或类风湿性关节炎。
26. —种能够与趋化因子受体CCR2特异性结合的抗体在制备一种药 剂中的用途，所述药剂用于治疗受试者的多发性硬化和/或类风湿性关节 炎，其中所述药剂优选如权利要求1至9之一所限定。
27. —种能够消耗单核细胞的抗体在制备一种药剂中的用途，所述药剂用于治疗受试者的多发性硬化和/或类风湿性关节炎，其中所述药剂优选如权利要求10至13之一所限定。
全文摘要
本发明涉及一种能够与趋化因子受体CCR2特异性结合的抗体在制备一种药剂中的用途，所述药剂用于治疗受试者、优选为灵长类或人的多发性硬化和/或类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，本发明涉及一种能够与趋化因子受体CCR2特异性结合的抗体在制备一种药剂中的用途，所述药剂用于消耗患有多发性硬化和/或类风湿性关节炎的受试者中的单核细胞。本发明还涉及相应的体外方法和治疗方法。除能够与CCR2结合的抗体之外，还可使用例如一种与CD14结合的抗体。
文档编号C07K16/18GK101466735SQ200780020307
公开日2009年6月24日 申请日期2007年4月2日 优先权日2006年4月3日
发明者A·米尔德纳, M·普林茨, M·马克, W·布鲁克 申请人:乔治-奥古斯特-哥廷根大学公共利益基金会;雷根斯堡大学临床中心公法人机构