耐氧化的指示剂分子的制作方法

专利名称：：耐氧化的指示剂分子的制作方法
技术领域：
：本发明涉及耐氧化增强的可检测的指示剂，包括荧光指示剂。
背景技术：
：荧光分子被用于各种应用，包括织物和增白剂、招牌、各种印刷油墨、当与抗体或其他分子连接时作为标记(tag)和探针(probe)的诊断学，并可以在分子水平下构造，以用作化学和生物化学活性指示剂，具体被设计用于检测某些分析物，例如葡萄糖。碳水化合物(包括葡萄糖)与苯基硼酸的络合已知己久，并且这种相互作用的可逆性已经用作糖的色谱分离的基础。具体而言，在1959年，Lorand和Edwards报道了苯基硼酸与许多饱和多元醇的水缔合的缔合常数结合相互作用的范围从极弱(例如，乙二醇，Kd二360mM)至中等强度(例如，葡萄糖，Kd=9.1mM)。参见J.Yoon等人，所oorg朋/c朋dMe^"'"a/C/zew'Wo;1(4):267-71(1993)。据认为，结合机理是通过用葡萄糖上的相邻羟基置换硼酸根部分上的羟基而发生的。美国专利5,503,770(James等人)描述了一种含有硼酸的荧光化合物，该化合物经与糖类(包括葡萄糖)结合发射高强度荧光。荧光化合物的分子结构包括荧光团、至少一个苯基硼酸部分和至少一个提供胺的氮原子，其中氮原子位于苯基硼酸部分附近，从而与硼酸发生分子内相互作用。因此这种相互作用导致化合物与糖结合而发射荧光。参见T.James等人J.C/ze肌Soc.117(35):8982-87(1995)。此外，使用含有蒽基硼酸的化合物检测血糖的荧光传感器在本领域中是已知的。例如，J.Yoon等人，■/C77e附.5bc114:5874-5875(1992)描述了蒽基硼酸可以用作碳水化合物结合(包括葡萄糖和果糖结合)的信号的荧光化学传感器。荧光分子易于分解，从而由于氧化速率经常变化而随着时间推移失去其荧光强度(或亮度)。氧化通常与光致褪色相关，技术上也被称作"光氧化"，或者可以在荧光分子的局部环境内被各种活性氧物质氧化。环境和大气如臭氧中存在着多种潜在的氧化剂，或者可以存在于从人类到细菌范围的活体内部。在活体内部，常见的活性氧物质(ROS)可以包括典型的健康复原反应中涉及到的那些，如过氧化物、羟基自由基、过氧亚硝酸盐、超氧化物等。在活体体系内部，也被称作加氧酶的特异性酶用于分子分解时的特定氧化目的。活性氧物质或加氧酶活性对荧光分子的不利结果通常是损失荧光。在指示剂分子或无源标记(passivetag)、探针或标记的情况下，装置的使用寿命和灵敏度或者诊断结果受到限制，或者由于荧光信号的氧化分解而完全无效。因此，仍然需要耐氧化增强的荧光分子。
发明内容在一个方面中，本发明涉及一种在氧化性条件下使用分子的方法，所述方法包括a)得到具有芳基硼酸残基的分子，其中所述残基在含有硼酸残基的芳香族部分上具有一种或多种吸电子基，使得与没有一种或多种吸电子基的相应分子相比，所述分子具有增强的耐氧化性；和b)使所述具有一种或多种吸电子基的分子经历氧化性条件。在另一个方面中，本发明涉及一种在氧化性环境中检测样品中的分析物的存在或浓度的方法，所述方法包括a)使样品接触具有可检测性质的指示剂分子，所述可检测性质在所述指示剂分子接触分析物时变化，所述分子包括芳基硼酸残基，所述残基在含有硼酸残基的芳香族部分上具有一种或多种吸电子基，使得与没有一种或多种吸电子基的相应分子相比，所述指示剂分子具有增强的耐氧化性；和b)测量所述可检测性质的任何变化，从而测定所述样品中所述分析物的存在或浓度。在另一个方面中，本发明涉及一种具有以下结构的化合物其中-每一个Ar是芳基基团；-每一个R,和R2相同或不同并且是吸电子基；-m和n每一个独立地是1~10的整数；-R4是可检测部分；和-每一个R独立地是具有010个相邻或枝化的碳原子和/或杂原子的连接基团，至少一个R还含有聚合性单体单元；和与没有一种或多种吸电子基的相应化合物相比，其中所述化合物具有增强的耐氧化性。在另一个方面中，本发明涉及一种具有以下结构的化合物其中-每一个Ar是除苯基之外的芳基基团；-每一个Ri和112相同或不同并且是吸电子基;-m和n每一个独立地是110的整数；-^是可检测部分；和-每一个R独立地是具有0~10个相邻或枝化的碳原子和/或杂原子的连接基团，至少一个R包含能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团；和与没有一种或多种吸电子基的相应化合物相比，其中所述化合物具有增强的耐氧化性。在另一个方面中，本发明涉及一种制备用于在氧化性环境中检测分析物的存在或浓度的指示剂大分子的方法，所述方法包括将a)—种或多种指示剂组分单体，各自单体的水溶性不足以允许其在用于检测所述分析物的存在或浓度的水性环境中使用，其中所述指示剂组分单体包括具有以下结构的化合物其中-每一个Ar是芳基基团；-每一个R,和R2相同或不同并且是吸电子基；-m和n每一个独立地是1~10的整数；-R4是可检测部分；和-每一个R独立地是具有0~10个相邻或枝化的碳原子和/或杂原子的连接基团，至少一个R还含有聚合性单体单元；和b)—种或多种亲水性单体进行共聚；使得生成的大分子能够在水性环境中检测所述分析物的存在或浓度，并且与没有一种或多种吸电子基的相应化合物相比，其中所述化合物具有增强的耐氧化性。在另一个方面中，本发明涉及一种具有以下结构的化合物其中-Ar是芳基基团；-每一个R,相同或不同并且是吸电子基；-n是110的整数；和-R是具有0~10个相邻或枝化的碳原子和/或杂原子的连接基团，所述连接基团还含有聚合性单体单元和可检测部分；和与没有吸电子基的相应化合物相比，其中所述化合物具有增强的耐氧化性。在另一个方面中，本发明涉及一种具有以下结构的化合物其中-Ar是芳基基团；-每一个Ri相同或不同并且是吸电子基；-n是l10的整数；和-R是针对色谱载体的连接基团，所述连接基团具有0~10个相邻或枝化的碳原子和/或杂原子；和与没有吸电子基的相应化合物相比，其中所述化合物具有增强的耐氧化性。图1示出实施例1中的实验的结果。图2示出实施例2中的一个实验的结果。图3示出实施例1中的一个实验的结果。图4示出实施例3中的实验的结果。图5A和B示出本发明的几个优选的化合物。图6示出实施例4中的一个实验的结果。图7示出实施例4中的另一个实验的结果。图8示出实施例4中的另一个实验的结果。具体实施例方式在本发明人持续研究基于荧光指示剂分子的可植入的葡萄糖传感器的工作中，观察到除了作为定量的累积曝光的直接和可预测作用的光氧化之外，对于体内试验的一系列荧光指示剂分子而言，存在在体内发生但在体外不明显发生的额外的、严重的快速荧光信号损失。将荧光指示剂的样品植入，然后在几周后植出。然后，在信号严重损失之后化学分析样品。分析表明了指示剂体系的硼酸根识别成分被特定氧化成羟基基团的特定反应，从而使分子的活性(具体而言，荧光调节)完全损失。这种体内氧化反应如下所示标准指示剂分子体内改变的指示剂分子键能C-C=358kJ/molC-B=323kJ/molB-0=519kJ/mo1破坏性的体内氧化反应表明极特异性地仅氧化硼酸根，在其位置留下羟基基团。通过用l、5和10pM过氧化氢处理在体外重复氧化。在体外和体内，均发现仅有硼酸根部分被氧化成羟基。这是出乎意料的，因为据认为ROS是更普遍和不加区分地可以氧化并破坏分子。根据本发明，通过将一种或多种吸电子基加到含有硼酸残基的芳香族部分上，可以使含有芳基硼酸残基的指示剂分子更耐氧化，从而稳定硼酸根部分。应该理解，术语"芳基"包括大范围的芳香族基团，如苯基、多核芳香物、杂芳香物、多核杂芳香物等。非限制性例子包括苯基、萘基、蒽基、吡啶基等。大范围的吸电子基在本发明的范围内，包括但不限于卤素、氰基、硝基、卤素取代的烷基、羧酸、酉旨、磺酸、酮、醛、磺酰胺、砜、磺酰基、亚砜、卤素取代的砜、卤素取代的烷氧基、卤素取代的酮、酰胺或它们的组合。关于上述结构I和n，R,和R2优选是先前段落中所述的吸电子基。最优选地，每一个R,和R2是三氟甲基。此外，如上所述，在某些实施方案中，至少一个R基团含有允许将结构(I)并入聚合物中的聚合性单体单元。这种聚合性单元是公知的，包括但不限于乙烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺等。本发明的指示剂化合物具有可检测性质(如结构I中的成分R4所示)，该性质在该化合物与含有葡萄糖的样品接触时以浓度依赖性的方式变化。许多这种性质是已知的，并可以用于本发明。例如，指示剂化合物可以包括发光(荧光或磷光)或化学发光部分、基于吸光的部分等。指示剂化合物可以包括能量供体部分和能量受体部分，每个部分是间隔的，使得在指示剂化合物与葡萄糖相互作用时发生可检测的变化。指示剂化合物可以包括荧光团和猝灭剂，可以将荧光团和猝灭剂构造为使得在葡萄糖不存在的情况下荧光团被猝灭剂猝灭。在这种情况下，当葡萄糖存在时，指示剂经历构型变化，该构型变化导致猝灭剂移动离荧光团充分远的距离，从而发射荧光。相反地，可以将荧光团和猝灭剂构造为使得在葡萄糖不存在的情况下它们充分分离并使荧光团发射荧光；经与葡萄糖相互作用，荧光团和猝灭剂移动至足够接近以导致猝灭。在美国公开的申请2002/0119581中更为详细地描述了构型变化概念，在此引入该申请作为参考。在另一个实施方案中，猝灭剂含有芳香族硼酸，硼酸与目标分子(例如，葡萄糖)的结合改变猝灭剂效率，从而导致可检测变化。这些内容记载在美国专利申请公开2006/0083688中，在此引入其内容作为参考。可选择地，指示剂可以包括能够与识别成分或相对于该识别成分空间上放置的另一部分相互作用的诸如荧光团的部分，使得在葡萄糖不存在的情况下荧光团发射荧光。经加入葡萄糖，葡萄糖与荧光团和识别成分之间的相互作用竞争，或者与荧光团和相对于识别成分空间上放置的另一部分之间的相互作用竞争，导致荧光减少。还将认识到，可以选择指示剂，使得在葡萄糖不存在的情况下，当荧光团与识别成分或相对于识别成分空间上放置的另一部分相互作用时，荧光团不发射荧光，或者发射相对低水平的荧光。经加入葡萄糖，葡萄糖与荧光团和识别成分之间的相互作用竞争，或与荧光团和相对于识别成分空间上放置的另一部分之间的相互作用竞争，导致荧光增加。其他可检测部分包括通过光致电子转移或诱导效应而使葡萄糖相互作用影响可检测部分的荧光的部分。这些包括在此引入作为参考的美国专利6,344,360中公开的镧系元素螯合物；聚芳烃和它们的衍生物；香豆素；BoDiPy;丹磺酰；儿茶酚等。另一类部分包括在该指示剂化合物与葡萄糖相互作用时其吸收光谱发生变化的部分，包括茜素红等。另一类部分包括其荧光受邻近效应调节的部分，例如能量供体/受体对，如丹磺酰/dabsyl等。优选地，可检测性质是可检测的光谱变化，如吸收特征(例如，吸光系数和/或光谱迁移)、荧光衰减时间(通过时域(timedomain)或频域(frequencydomain)测量而确定)、荧光强度、荧光各向异性或偏振的变化；发射光谱的光谱迁移；时间分辨的各向异性衰减(通过时域或频域测量而确定)的变化等。应该理解，在使用前可以用保护基封闭硼酸识别成分。这些基团是公知的，包括新戊二醇、频哪醇等。在某些实施方案中，在化合物将要使用的介质中将封闭的识别成分去封闭。本发明也包括耐氧化改善但不必须含有可检测基团的化合物。这种化合物可以用在例如用于分离糖类的色谱树脂中。在这种情况下，本发明的化合物将通过能够承受树脂或载体所经历条件的连接剂与树脂或其他固体载体连接。本发明的指示剂化合物如果是可溶的话，在需要时可以直接用于溶液中。另一方面，如果期望的应用这样要求，指示剂化合物可以固定(如通过机械夹带或者共价或离子结合)在不溶性表面或基质(如玻璃、塑料、聚合材料等)上或其内部。当在例如另一种聚合物中夹带指示剂化合物时，夹带的材料优选应该对葡萄糖具有充分的渗透性，以使葡萄糖和指示剂化合物之间发生适宜的相互作用。如果指示剂化合物在水中难溶或不溶，但仍期望进行水性介质中的检测，则指示剂化合物可以与亲水性单体共聚形成亲水性大分子，例如在美国专利6,794,195中所述，在此引入其内容作为参考。针对聚合物或载体的适宜的连接基团可以包括约1~约20个相邻原子的基团，所述基团可以是枝化或被取代的，且其可以包括一种或多种杂原子，其用能够与聚合物或载体进一步反应或结合的官能团终止。适宜的连接基团的例子包括垸基、芳基、酰基、聚酰胺、聚醚及其组合，所有这些基团任选地被取代。由以上定义还可以理解，本发明的化合物和检测系统可以是聚合物形式。因此，完整化合物(含有识别成分和可检测部分)可以与现有聚合物连接，或者单体形式的完整化合物可以聚合或与另一种适宜的单体共聚，形成聚合物。可选择地，两种单独的单体组分(例如，一种含有识别成分，一种含有可检测部分)可以共聚，从而使生成的聚合物含有体系所有必需的成分。本发明的指示剂化合物有多种用途，包括用作能源、医学和农业领域的指示剂。例如，指示剂化合物可以用于检测生理缓冲液或液体如血液、血浆、血清、间质流体、脑脊髓液、尿液、唾液、眼内液、淋巴液、泪液或汗液中的亚水平或超水平的葡萄糖，从而提供用于诊断或监测诸如糖尿病和肾上腺功能不全等疾病的有价值的信息。用于人类治疗应用的葡萄糖的医学/药物生产需要监测和控制。本发明在农业中的用途包括检测大豆和其他农产品中葡萄糖的水平。对于高价值产品如葡萄酒用葡萄而言，在重要的收割决定中必须仔细地监测葡萄糖。由于葡萄糖是发酵工艺中最昂贵的碳源和原料，因此用于最佳反应器进料速率控制的葡萄糖监测在动力醇生产中是重要的。反应器混合和控制葡萄糖浓度对软饮料和发酵饮料的生产过程中的质量控制也是至关重要的，所述生产在国际上消耗最大量的葡萄糖和可发酵的(邻二醇)糖类。当指示剂化合物引入荧光指示剂取代基时，各种检测技术在本领域中也是已知的。例如，本发明的化合物可以用于荧光传感装置(例如，美国专利No.5，517,313)或者可以与聚合物材料如试纸结合以用于目测。例如，后一种技术允许类似于用石蕊试纸条测定pH的方式测定葡萄糖。本文所述的化合物还可以作为简单的试剂与标准台式分析仪器一起使用，如由Shimadzu、Hitachi、Jasco、Beckman等制造的分光荧光光度计或临床分析仪。这些分子还提供用于由OceanOptics(Dunedin，Florida)或OrielOptics制造的基于光纤的传感器和分析荧光计的分析物特异性的化学/光学信号转导。美国专利5,517,313，在此引入其内容作为参考，描述了一种荧光传感装置，其中本发明的化合物可以用于测定液体介质中葡萄糖的存在或浓度。该传感装置包括含有荧光指示剂分子的基质(下文称为"荧光基质")、高通过滤波器(high-passfilter)和光电检测器的分层排列。在该装置中，光源优选为发光二极管("LED")，至少部分位于指示剂材料内或指示剂基质所处的波导管内，从而使来自光源的入射光导致指示剂分子发荧光。高通过滤波器允许发射的光到达光电检测器，同时滤掉来自光源的散射的入射光。在美国专利5，517，313所述的装置中采用的指示剂分子的荧光由局部存在的葡萄糖调节，例如削弱或增强。在美国专利5,517,313所述的传感器中，含有指示剂分子的材料对分析物而言是可渗透的。因此，分析物可以从周围试验介质中扩散到该材料中，从而影响由指示剂化合物发射的荧光。光源、含有指示剂化合物的材料、高通过滤波器和光电检测器的结构使得至少一部分由指示剂化合物发射的荧光影响光电检测器，从而产生指示周围介质中葡萄糖浓度的电信号。根据使用本发明的指示剂化合物的其他可能的实施方案，传感装置还在美国专利No.5,910,561、5,917,605禾卩5，894，351中描述，在此引入它们作为参考。本发明的化合物还可以用于可植入的装置，例如用于在体内连续监测血糖水平。例如，适宜的装置在美国专利美国专利No.6，330，464、5，833，603、6,002,954禾[l6,011,984中描述，在此引入它们作为参考。特别优选的化合物包括图5A和B中示出的化合物(被称为"未取代的"和"2-甲基"的化合物不含有吸电子基，但为说明目的而列出)。各化合物以羧酸形式示出，硼酸基团是未保护的。然而，可以理解，例如，具有羧酸盐形式和/或封闭的硼酸基团的化合物也在本发明的范围内。本发明的化合物可以由本领域技术人员在不用进行过度量实验的情况下，使用已知的反应机理和试剂，例如包括与下述的一般过程一致的反应机理来制备方案1从市售苯基硼酸酯合成葡萄糖指示剂<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>方案2从市售苯基硼酸合成葡萄糖指示剂<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>方案6从市售取代的苯基硼酸合成葡萄糖指示剂<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>可以根据以下一般合成路线制备方案1中的原料化合物2C:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>应该理解，尽管上示合成可以用于合成方案1的化合物2c，但本领域技术人员容易理解怎样来制备化合物2a-2b和2d-2i，所有这些都在本发明的范围内。实施例1测定通过改变葡萄糖的浓度对各分子(图5所示)的荧光的调节。结果示于图1，表明大多数试验分子能很好地调节。两种分子(4-硝基和2-甲基取代的化合物)调节不好，但仍可用作耐氧化标记。在进一步实验中，用1mM过氧化氢对未取代的对照和本发明的两种化合物(4-三氟甲基和3，4-二氟)进行氧化处理，并测量荧光强度损失。数据示于图3。实施例2使含有本发明的化合物(4-三氟甲基、3,4-二氟和4-氟)和对照(未取代的)的几种凝胶(按实施例3制备)长期接触37°C的10pM过氧化氢和4mM葡萄糖/PBS，并测量荧光强度损失。数据示于图2。此外，三种化合物的体外半衰期数据示于下表l。表中数据表明，与标准未取代的单体相比，在10pM过氧化氢存在下，3,4-二氟和4-三氟甲基类似物分别具有大约33和26倍的更长的半衰期。为比较，文献报道了典型的生理过氧化氢水平最大大约为0.5pM。从表中还值得注意的是平均荧光强度差异。两种类似物均表现出较低的总调节，但基本上更大的荧光(更亮)，因而提供更强的信号，从而增大了信号的信噪比，因此传感器产品的附带优点是分辨率更大。对于4-三氟甲基指示剂测量的较低Kd优于人葡萄糖传感用的标准对照，因为其在生理范围内对葡萄糖具有更大的灵敏度。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实施例3根据本发明的两种化合物(4-三氟甲基和3，4-二氟)和未取代的对照分别与甲基丙烯酸羟基乙基酯(HEMA)和丙烯酸共聚，并与二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)交联，形成水不溶性的聚合物接枝，然后植入大鼠中，进行体内氧化22天或43天。经植出，测量各化合物的荧光，数据示于图4。与对照相比，本发明的化合物保持更大的荧光。实施例4按实施例3所述，将本发明的几种化合物分别与甲基丙烯酸羟基乙基酉旨(HEMA)、丙烯酸和二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)共聚，形成水不溶性的聚合物凝胶。通过使凝胶在37°C的PBS中接触1mM过氧化氢，分析它们对氧化剂的稳定性。数据示于图6。在进一步实验中，在37。C的PBS中的4mM葡萄糖存在下，使两种指示剂凝胶(4-三氟甲基和4-三氟甲基砜凝胶)接触lmM过氧化氢。数据示于图7。从上面两个稳定性实验计算出的半衰期示于表2。在进一步实验中，测量各种指示剂凝胶的020mM葡萄糖的荧光变化(调节％)，结果示于图8。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*在4mM葡萄糖溶液中实施例5合成3，4-二氟指示剂9-[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-2,3-二氟节基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[]^[6-(4,4,5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼垸基)-2，3-二氟苄基]-N-[2-(羧乙基)氨蜀甲基]蒽钠盐(4b)。步骤1:9-[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-2,3-二氟苄基]_^[3_(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4，4,5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2，3-二氟苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3b):将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，2.40g，4.91mmol)放入150mL圆底烧瓶中，并在19mL二甲基甲酰胺中搅拌，直到溶解。在氩气流中加入2-(溴甲基)-3，4-二氟苯基硼酸频哪醇酯(2b，4.90，14.7mmol，3当量)和DIEA(6.8mL，39mmol，8.0eq)并搅拌，直到全部溶解，然后在油浴中并在氩气流中加热到80。C保持3小时。真空除去DMF，加入醚(200mL)，用磷酸盐缓冲液(IOOmL0.1M，pH7.0)洗涤。水溶液用醚(2xl00mL)逆流洗涤，合并醚溶液，用Na2S04干燥。真空除去醚，用己垸(100mL)研磨得到的黄色粉末15分钟。用沸腾的80/20的乙酸乙酯/IPA研磨粗产物(2.60g)得到灰白色粉末，HPLC纯度为~98%。合并粗样品，通过在沸腾的80/20的乙酸乙酯/IPA中悬浮并加入乙酸乙酯直到所有固体溶解来重结晶。经冷却，结晶出纯产物，灰白色粉末(1.54g，32%产率)。RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环(injectionloop),254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间16.4min。步骤2:9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2，3-二氟苄基]^-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4，4，5,5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2,3-二氟苄基]-N-[2-(羧乙基廣基]甲基]蒽钠盐(4b)将9-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2,3-二氟苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[1^[6-(4,4，5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-2,3-二氟苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3b，1.50g，1.51mmol)放入100mL圆底烧瓶中，并溶解在10mL60:40的CH2C12:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌达到2天或直到HPLC分析表明少于1%的原料剩余。真空除去溶剂。残余产物溶解在30mLCH2Cl2t，然后真空除去溶剂。重复二氯甲烷溶解/蒸发处理，直到产物变为黄色粉末。粉末溶解在60mL二氯甲垸中，并以使得温度保持在低于5°C的速率下滴加到250mL冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在<5°C下再搅拌5min，然后分配各层。有机层用无水Na2S04干燥，过滤和浓缩，得到1.21g黄色粉末。粗产物溶解在30mL无水CH2Cl2中，并转移到100mL圆底烧瓶中。PS-DEAM珠(0.38g)加到烧瓶中，反应混合物在环境温度下摇动16h。过滤珠，用5mL二氯甲院洗涤。合并有机溶液，真空浓缩。得到纯产物(0.979g，68%)，黄色粉末。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0,010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间14.1min。iH丽R(400MHz，CDC13):S1.32(s，12H)，1.33(s，12H)，1.50(m，5H，0=C-C(CH2)CS3)，N-CH2Cg2CH2-N)，2.33(t，2H)，2.38(t，2H)，2.78(m，2H)，2,83(m，2H)，4,21(s，2H)，4.41(s，4H)，4.60(s，2H)，4,90(t，1H，C=Cg2)，4.95(s，1H，C《压)，5.25(br，1H，NH)，7.15-7.25(m，1H，Arg)，7.28-7.32(m，1H)，7.35(m，4H，Aiii)，7.68(dd，1H，Arg)，7.82(dd，1H，A坦)，7.8(d，2H，ArH)，8.20(d，2H，Arg)。ESI-MS(TFA/乙腈/水)720.3(M-3H20+H)+，738.3(M-2H20+H)+，756.4(M-H20+H)+，794.2(M+Na)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。实施例6合成4-三氟甲基指示剂9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基)苄基]-N-p-(羧乙基)氨萄甲基]蒽钠盐(40)步骤1:9-[N-[6-(4,4，5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6陽(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷萄-3-(三氟甲基)苄基]->^[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3c)将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，2.10g，4.29mmol)放入250mL圆底烧瓶中。将其溶解在5mL脱气的二甲基甲酰胺中。2-(溴甲基)-4-(三氟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(2c，3.80，10.4mmol，2.4当量)溶解在4mL氮气喷射的DMF中，并加到反应烧瓶中。搅拌溶液并用氮气冲洗5分钟。DIEA(6.0mL，34mmo1，8.0当量)加到反应混合物中，溶液在温和氮气流下和在黑暗中在环境温度下搅拌2晚。48h后，真空蒸发溶剂。残余产物溶解在100mL二氯甲烷中，用2x50mL份磷酸盐缓冲液(O.lM，pH7.0)萃取。真空干燥和蒸发二氯甲烷溶液，得到金色油状残余物。粗产物用10mL己垸搅拌15-30分钟，直到黄色沉淀出现。过滤，测定产物重量(3.5g黄色粉末)。通过多次结晶从热2-丙醇来纯化粗产物(<2mLIPA/克化合物)。收集纯产物(3c)(~1.5g)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间17.8min。，HNMR(400MHz，CDC13):51.25(s，9H，C(QJ3)3)，1.32(s，12H，O-C(CH3)2C(Cg3)2，C-O)，1.35(s，12H，0-C(Cg3)2C(CH3)2，C-O)，1.46(s，3H,0=C-C(CH2)CH3)，1.65(m，2H，N-CH2CH2CH2-N)，2.43(t,2H)，2.52(t，2H)，2.88(t，2H)，3.04(m，2H)，3.98(s，2H)，4.05(s，2H)，4.42(s，2H)，4.45(s，2H)，4.82(s，1H)，4.88-4.90(br，2H，与CJL重叠的NH)，7.38-7.42(m，5H，Arg)，7.50(d，1H，ArH)，7.63(s，1H，Arg)，7.80(m，2H，A邸，7.89(d，1H，A坦)，8.32(m，4H，A邸。ESI-MS(TFA/乙腈/水)858.4(M-2H20+H)+，876.3(M-H20+H)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。步骤2:9-[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基)苄基]_N_[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基)苄基]->^[2-潔乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(4c)将9-[N-[6-(4A5,5-四甲基-l,3;二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基)苄基]-N—[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]—10-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟-甲基)苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨萄甲基]蒽(3c，1.037g，0.980mmol)放入250mL圆底烧瓶中，并溶解在10mL的60:40脱气的CH2Cl2:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌24-48h或直到HPLC分析表明少于1%的原料剩余。残余产物用30mLCH2Cl2洗涤，然后真空除去溶剂。重复二氯甲垸洗涤，直到产物变为黄色粉末。粉末溶解在60mL二氯甲垸中，并以使得温度保持在低于5。C的速率下滴加到240mL冷的饱和NaHC03水溶液。溶液在<5°C下再搅拌5min，然后分配各层。有机萃取物用无水Na2S04干燥，过滤和浓缩，得到lg黄色粉末。粗产物溶解在10mL无水CH2Cl2中，并转移到100mL圆底烧瓶中。将PS-DEAM珠(0.55g，1mmol，1eq)加到烧瓶中，反应混合物用氮气冲洗2分钟。溶液在环境温度下摇动16h。过滤珠，用2xl0mL二氯甲烷洗涤。合并有机溶液，真空浓缩。得到纯产物(4c)(0.603g，60%指示剂)。结构确定mp:91-95。C(未校正)RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters4.6x100mmSymmetry3.5(iC18柱(带有SentryC18保护柱)，0.010mL注射(样品溶解在含有1%v/vTFA的70/30水/MeCN中)，0.100mL注射环，0.75mL/min，254nm检测，A=水(0.1%TFA)禾口B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min,18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间14.9min。H丽R(400MHz，CDC13):S1.34(s，12H)，1.38(s，12H)，1.58-1.60(m，5H，0=C-C(CH2)Cg3)，N-CH2CH2CH2-N)，2.31(t，2H)，2.44(t，2H)，2.87(m，2H)，2.92(m，2H)，4.05(s，2H)，4.35(s，2H)，4.44(s，2H)，4.55(s，2H)，4.95(t，1H，C=Qi2)，5,05(s，1H，C=CH2)，5.3-5.4(br，1H，NH)，7.38-7.42(m，4H，A邸，7.52(d，1H，A坦)，7.68(d，1H，A坦)，7.80(brs，1H，A坦)，7,85-7.90(m，3H，A坦)，7.91(d，1H，A邸，8.12(d，1H，A邸，8.28(d，2H，A邸。ESI隱MS(TFA/乙腈/水)802.4(M-2H20+H)+，820.3(M-H20+H)+，838.4(M+H)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。实施例7合成4-氟指示剂9-[^[6-(4，4，5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氟苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-氟苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(4d)步骤1:9-[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-氟苄基]_1^_[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4,4,5，5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氟苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨萄甲基]蒽(3d):在5mL二甲基甲酰胺中搅拌9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(1，718g，1.47mmol)，直到溶解。加入2-(溴甲基)-4-氟苯基硼酸频哪醇酯(2d，1.85g，5.87mmol，4叫)和DIEA(1.52g，12mmol，8.0eq)并加热到80°C保持18小时。然后加入醚(100mL)，溶液用磷酸盐缓冲液(3xl00mL0.1M，pH7.0)洗涤。有机溶液用Na2S04干燥，然后真空除去。粗产物用己垸(2x50mL)研磨，然后从25mL沸腾的80/20的乙酸乙酯/IPA重结晶，得到灰白色粉末(0.52g，37%)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间15.7min。NMR(400MHz，CDC13):51.3(两个重叠的单峰，24H，0-C(CH3)2C(qa3)2，C-O)，1.33(s，9H，C(CH3)3)，1.52(s，3H)，1.55(s，1H)，1.70(t，1H)，2.48(t，2H)，2.55(m，2H)，2.82(t，2H)，3.08(m，2H)，3.85(s，2H)，4.05(s，2H)，4.45(s，2H)，4.55(s，2H)，4.82(d，2H)，5.05(br，1H)，6.83(t，1H)，6.84(t，1H)，7.08(dd，1H)，7.20(dd，1H)，7.44(m，4H)，7.68(dd，1H)，7.78(dd，1H)，8.36(m，2H)，8.45(m，2H)。ESI-MS:957(M+H)+，874.4(M+H)+，对于单硼酸酯一元酸，792.3(M+H)+和774.2(M-H20+H)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下观察到硼酸酯和酸。步骤2:9-[N-[6-(4,4，5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氟苄基]_^[3_(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]_10_[^[6_(4,4,5，5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-氟苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(4d)将9-[N-[6一(4，4,5,5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氟苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氟苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3d，0.450g，0.47mmol)溶解在10mL的60:40CH2C12:TFA溶液中，在环境温度下搅拌16小时。反应溶液用二氯甲烷(30mL)稀释，然后分3次加到快速搅拌的冰冷的饱和NaHC03水溶液中。分离有机层，用无水Na2S04干燥，过滤和真空浓縮，得到0.32g黄色粉末。粗产物溶解在无水CH2C12中，用PS-DEAM珠摇动过夜。过滤珠，真空除去有机溶剂。得到纯产物(0.235g，55%)，黄色粉末。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0,1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间13.7min。'H應R(400MHz，CDC13):31.33(s，12H)，1.35(s，12H)，1.62(m，5H，0=C-C(CH2)CH3)，N-CH2CH2CH2-N)，2.33(t，2H)，2.48(t，2H)，2.88(m，2H)，2.95(m，2H)，4.04(s，2H)，4.32(s，2H)，4.48(s，2H)，4.62(s，2H)，5.00(t，1H，C=CH2)，5,12(s，1H，C=Cg2)，5.48(br，1H，NH)，6.95(dt，1H)，7.15(dt，1H)，7.22(br，1H)，7.30(dd，1H)，7.48(m，4H)，7.80(dd，1H)，7.90(m，2H)，8.05(dd，1H)，8.37(m，2H)。实施例8合成2,5-二氟指示剂9-[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-2,5-二氟苄基]->^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4,4,5，5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2，5-(二氟)苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(4e)步骤1:9-[N-[6-(4,4,5，5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2,5-二氟苄基]-N—[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2,5-二氟苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3e):将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，0.872g，1.78mmol)放入100mL圆底烧瓶中，并在7mL二甲基甲酰胺中搅拌，直到溶解。在氩气流中加入6-(溴甲基)-2,5-二氟苯基硼酸频哪醇酯(2e，1.49,4.47mmo1，2.5当量)和DIEA(1.86g，14.4mmol，8.0当量)并搅拌，直到全部溶解，然后在油浴中并在氩气流中加热到80°C过夜。加入更多的6-(溴甲基)-2,5-二氟苯基硼酸频哪醇酯(0.300g，0.5当量)，第二晚继续加热。将醚(100mL)加到反应溶液中，用pH7.0，O.IM磷酸盐缓冲液洗涤。有机溶液用Na2S04干燥，真空除去溶剂，残余物用己垸(2x50mL)研磨。用沸腾己烷(50mL)处理得到的红棕色固体，倾析，从冷却的己烷中收集所需的产物(0.49g)，白色晶体。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B,100%B2min，保留时间15.0min。步骤2:9-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2，5-二氟苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4，4，5，5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2，5-二氟苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(4e)将9画[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-2,5-二氟苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2，5-二氟苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3e，0.49)在10mL60:40中搅拌过夜，直到HPLC显示没有原料剩余。真空除去溶剂，残余物溶解在二氯甲烷(3mL)中，滴加到快速搅拌的戊烷(100mL)中。过滤分离出产物三氟乙酸盐，黄色粉末(0.40g)，用质谱表征。按下述得到游离碱指示剂。粉末(0.20g)溶解在10mL二氯甲烷中，并以使得温度保持在低于5°C的速率下滴加到100mL冷的饱和NaHC03水溶液中。分离有机层，然后用无水Na2S04干燥。将PS-DEAM珠(0.5g)加到烧瓶中，悬浮液在环境温度下摇动过夜。过滤，真空除去溶剂，得到产物(95mg)，黄色粉末。结构确定RP-HPLC条件RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾卩B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间12.9min。ESI-MS(TFA/乙腈/水)720.3(M-3H20+H)+，738.3(M-2H20+H)+，756.4(M-H20+H)+，778.3(M-H20+Na)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。实施例9合成3,4-二氯指示剂9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-2,3-二氯苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6《4，4，5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2,3-二氯苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(4f)步骤1:9-[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2,3-二氯苄基]_]^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4,4，5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2,3-二氯苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3f):将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-P-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，0.25g，0.51mmol)放入100mL圆底烧瓶中，在5mL二甲基甲酰胺中搅拌，直到溶解。加入2-(溴甲基)-3，4-二氯苯基硼酸频哪醇酯(2f，0.56，1.5mmo1，3.0当量)禾口DIEA(0.7mL，4.1mmol，8.0eq)，并在黑暗中在氮气中在室温下搅拌48h。真空除去DMF;加入二氯甲垸(20mL)，用磷酸盐缓冲液(40mL0.1M，pH7.0)洗涤。收集二氯甲烷溶液，用Na2S04干燥。真空除去二氯甲烷，在氮气缓慢流动下将得到的黄色残余物用己烷(IOmL)研磨15分钟。用冷的IPA研磨粗产物(0.41g)得到黄色粉末，HPLC纯度为89%(0.29g，54%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A:水(0.1。/。v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间16.4min。^薩R(400MHz，CDC13):S1.22(s，9H)，1.32(s，12H)，1.38(s，12H)，1.56(bs，5H)，2.35(t，2H)，2.50(t，2H)，2.78(t，2H)，2.91(q，2H)，4.20(s，2H)，4.28(s，2H)，4.38(s，2H)，4.91(s，2H)，4.50(bs，1H)，4.65(s，1H)，4.79(s，1H)，7.36(m，4H)，7.45(m,2H)，7.69(d，2H)，8.16(m，4H)。步骤2:9-[N-[6-(4,4，5，5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-2,3-二氯苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(M，5,5-四甲基-l，3,^二氧杂环戊硼垸基)-2，3-二氯苄基]-N-[2-(羧乙基嵐基]甲基]蒽钠盐(4f)将9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼垸基)-2，3-二氯苄基]-1^-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4，4，5，5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2,3-二氯苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3f，0.29g，0.27mmol)放入100mL圆底烧瓶中，并溶解在6mL的60:40CH2C12:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌17h或直到HPLC分析表明少于0.1%原料剩余。真空除去溶剂。残余产物溶解在10mLCH2Cl2中，然后真空除去溶剂。重复二氯甲烷溶解/蒸发处理，直到产物变为黄色粉末。粉末溶解在10mL二氯甲烷中，并以使得温度保持在低于5°C的速率下滴加到70mL冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在<5°C下再搅拌5min，然后分配各层。有机层用无水Na2S04干燥，过滤和浓縮，得到0.23g黄色粉末。粗产物溶解在10mL无水CH2C12中，并转移到100mL圆底烧瓶中。PS-DEAM珠(0.13g，leq)加到烧瓶中，反应混合物在环境温度下摇动16h。过滤珠，用5mL二氯甲垸洗涤。合并有机溶液，真空浓縮。得到纯产物(0.2g，71%)，黄色粉末。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间14.1min。'H固R(400固z，CDC13):51.35(s，12H)，1.38(s，12H)，1.58(m，5H)，2.28(t，2H)，2.42(t，2H)，2.70(q，2H)，2.89(t，2H)，4.28(s，2H)，4.42(s，2H)，4.48(s，2H)，4.60(s，2H)，4.92(s，1H)，4.05(m，1H)，5.30(s，1H)，7.38(m，3H)，7.49(m，4H)，7.58(d，1H)，7.72(m，1H)，7.88(d，1H)，7.91(d，1H)，8.17(m，1H)。ESI國MS(TFA/乙腈/水)822.3(M-H20+H)+，804.4(M-2H20+H)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。实施例10合成4-三氟甲氧基指示剂9-[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼垸基K3-(三氟甲氧基)苄基]-N-IX甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4，5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲氧基)苄萄-N-p-(羧乙基)氨基]甲基]-蒽钠盐(化)步骤1:9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲氧基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲氧基)苄基]咎[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3g)将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨萄甲基]-蒽(l，0.2g，0.41mmol)放入150mL圆底烧瓶中。将其溶解在5mL脱气的二甲基甲酰胺中。将2-(溴甲基)-4-(三氟甲氧基)苯基硼酸频哪醇酯(2g，0.37，0.97mmol，2.4当量)溶解在4mL氮气喷射的DMF中，并加到反应烧瓶中。搅拌溶液并用氮气冲洗5分钟。D正A(0.6mL，3.5mmol，8.0当量)加到反应混合物中，溶液在温和氮气流下和在黑暗中在环境温度下搅拌过夜。24h后，真空蒸发溶剂。残余产物溶解在10mL二氯甲垸中，用3xl5mL分批次的磷酸盐缓冲液(O.lM，pH7.0)萃取。真空干燥和蒸发二氯甲烷溶液，得到金色油状残余物。粗产物用5mL醚搅拌15分钟，然后除去溶剂。黄色油状残余物在真空下保持30min，得到泡沫状粉末(3g，0.41g，91%产率)。RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾口B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间15.0min。步骤2:9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲氧基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,^-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲氧基)苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(4g)将9-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲氧基)苄基]-:^-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4,4，5，5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲氧基)节基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3g，0.4g，0.37mmol)放入100mL圆底烧瓶中，并溶解在5mL的60:40脱气的CH2C12:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌21h或直到HPLC分析表明少于0.1%原料剩余。残余产物用10mLCH2Cl2洗漆，然后真空除去溶剂。重复二氯甲烷洗涤几次。粉末溶解在IOmL二氯甲垸中，并以使得温度保持在低于5°C的速率下滴加到80mL冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在<5°C下再搅拌5min，然后分配各层。有机萃取物用无水Na2S04干燥，过滤和浓縮，得到0.18g黄色粉末(4g，46%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters4.6x100mmSymmetry3.5(iC18柱(带有SentryC18保护柱)，0.010mL注射(样品溶解在含有1%v/vTFA的70/30的水/MeCN中)，0.100mL注射环，0.75mL/min，254nm检测，A=水(0.1%TFA)禾卩B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间12.9min。JHNMR(400MHz,CDC13):S1.32(s，12H)，1.33(s，12H)，1.51(s，6H)，2.31(bm，2H)，2.40(bt，2H)，2.82(bt，2H)，2.89(bm，2H)，3.85(s，2H)，4.22(s，2H)，4.43(s，2H)，4.56(s，2H)，4.86(d，2H)，4.88(bs，IH)，7.32(d，IH)，7.40(m，5H),7.82(d，IH)，7.92(d，IH)，7.96(m，2H)，8.40(d，2H)，8.27(m，2H)。实施例11合成4-磺酰胺指示剂9-[N-[6-(4，4,5,5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(N,N-二甲基磺酰氨基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(N,N-二甲基磺酰氨基)苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲萄蒽钠盐(4h)步骤1:9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(N,N-二甲基磺酰氨基)节基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4,4,5,5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(N,N-二甲基磺酰氨基)苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3h)在25mL圆底烧瓶中，将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙塞氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(1，0.27g，0.55mmol)溶解在无水DMF(2mL)中。加入2-(溴甲基)-4-(N,N-二甲基磺酰氨基)苯基硼酸频哪醇酯(2h，0.595g，1.47mmol，2.7当量)和DIEA(0.765mL，4.4mmol，8eq)，在氮气下在黑暗中在室温下搅拌19小时。真空除去DMF，加入二氯甲烷(10mL),用磷酸盐缓冲液(2xl0mL0.1M，pH7.0)洗涤。二氯甲烷溶液用Na2S04干燥，真空过滤并除去。用己烷(2x5mL)研磨粗产物，得到黄色粉末，纯度为90。/。HPLC(0.59g，94%产率)。RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾卩B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间14.6min。步骤2:9-[N-[6-(4,4，5，5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(N，N-二甲基磺酰氨基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(N，N-二甲基磺酰氨基)节基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(4h)将9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(N,N-二甲基磺酰氨基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(N,N-二甲基磺酰氨基)苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3h，0.44g，039mmol)放入100mL圆底烧瓶中，并溶解在从氮气喷射的试剂制备的10mL的60:40CH2C12:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌28h。真空除去溶剂。残余产物溶解在20mLCH2Cl2中，然后真空除去溶剂。重复二氯甲烷溶解/蒸发处理4次以上，直到产物变为黄色粉末。粉末溶解在20mL二氯甲垸中，并以使得温度保持在低于5°C的速率下滴加到40mL冰冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在<5。C下再搅拌5min，然后分配各层。有机层用无水Na2S04干燥，过滤和浓縮，得到0.24g(57y。)产物，黄色粉末。结构确定RP誦HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters4.6x100mmSymmetry3.5pC18柱(带有SentryC18保护柱)，0.010mL注射(样品溶解在含有1%v/vTFA的70/30的水/MeCN中)，0.100mL注射环，0.75mL/min，254nm检测，A=水(0.1%TFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间12.7min。ESI-MS(TFA/乙腈/水)920.3(M-H20+Na)+，898.2(M-H20+H)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。实施例12合成2-甲基指示剂9-[N-[2-(4，4,5，5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-甲基苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(4，4，5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-甲基苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽(8)步骤l:2-(溴甲萄-6-甲基苯基硼酸(6):在回流CCl4中将2,6-二甲基苯基硼酸(2.22g，14.8mmo1)、NBS(1.31g，7.36mmol，0.5eq)和AIBN(0.17g，1.0mmol，0.07eq)加热2小日寸。溶液冷却，然后过滤。然后用水(50mL)洗涤溶液，用Na2S04干燥，真空蒸发溶剂。得到的白色粉末(1.66g)HPLC纯度为84%，其含有原料和一些二溴化产物。硅胶60柱色谱(洗脱条件，二氯甲烷中的0%-2%甲醇)不能改善纯度，粗材料用于下一步。步骤2:9-[N-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-甲基苄基]^-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[2-(4,4,5，5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-甲基苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(7):将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，0.85g，0.17mmol)放入50mL圆底烧瓶中，在2mL二甲基甲酰胺中搅拌，直到溶解。加入2-(溴甲基)-6-甲基苯基硼斷6，389mg，1.7mmol)和D正A(0.24mL，1.4mmol，8eq)并在油浴中在充入氩气的球形瓶(ballon)中加热到80°C过夜。真空除去DMF，加入二氯甲烷(20mL)，用磷酸盐缓冲液(3x10mL0.1M，pH7.0)洗涤。有机溶剂用Na2S04干燥，真空除去溶剂，得到的黄色固体用己垸(2x10mL)研磨。在硅胶60上通过快速柱色谱纯化粗产物，用二氯甲垸中的1-5%甲醇洗脱，得到93%纯材料(55mg，41%)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=zK(0.1°/。v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间15.8min。步骤3:9-[N-[2-(4,4,5，5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-甲基苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[]^[2-(4，4，5,5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-甲基苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽三氟乙酸盐(8)将9-[N-[2-(4,4,5,5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-甲基苄基]->1-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[2-(4,4，5，5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-甲基苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(7，55mg，0.070mmol)溶解在2mL的60:40CH2C12:TFA溶液中并在充入氩气的球形瓶中搅拌过夜。加入额外的10mL二氯甲烷，真空除去溶剂。加入二氯甲烷(10mL)，再次真空除去溶剂。重复溶解/蒸发步骤3次以上。粗产物用醚(10mL)然后用庚烷(3mL)研磨，得到~卯％纯产物，三氟乙酸盐(59mg，88%)，黄色粉末。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾口B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B,100%B2min，保留时间14.2min。ESI-MS(TFA/乙腈/水)694.4(M-2H20+H)+，712.4(M-H20+H)+，730.4(M+H)+。实施例13合成4-氰基指示剂9-[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氰基苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基)]甲基]-10-[^[6-(4，4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-氰基苄基]-N-[2-(羧乙基廣基]甲基]蒽钠盐(14a)步骤1:3-甲基-4-(4，4,5，5-四甲基-[l,2,3]二氧杂环戊硼烷-2-基)-苄腈(lla)将4-溴-3-甲基苄腈(9a，5.0g，0.0255mol，1.0当量)放入含有153mL无水二甲基甲酰胺的250mL圆底烧瓶中。醋酸钾(7.5g，0.076mol，3当量)，4,4，4'，4',5,5,5'，5'-八甲基-2,2'-双-1，3，2-二氧杂环戊硼垸(10，7.12g，0.028mol，U当量)和[U'-双(二苯基膦基)-二茂铁]二氯化钯(II)(0.56g，0.00076mol，0.03当量)加到烧瓶中，反应混合物加热到80°C保持24h。将溶液冷却到环境温度，热过滤悬浮液。真空除去收集的溶剂。得到的油状深棕色产物溶解在200mL乙酸乙酯中并转移到分液漏斗中。加入250mL水，萃取溶液。收集有机层，用无水Na2S04干燥。真空除去溶剂。在硅胶60上通过快速柱色谱纯化粗产物(洗脱条件2。/。-20。/。EtOAc/己垸)。收集大约5g材料。通过结晶从热己烷进一步纯化产物。得到纯产物(lla)(3.7g，产率60%)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，3.9x150mmSymmetryColumnHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%TFA)禾口B=MeCN(0.1%TFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间10.7min。]HNMR(400MHz，CDC13):51.35(s，12H，C(Qi3)3)，2.55(s，3H，Qi3)，7.41(m，2H，A邸，7.81(m，1H，A坦)。步骤2:3-溴甲基-4-(4,4,5，5-四甲基-[l，2，3]二氧杂环戊硼垸-2-基)-苄腈(12a)将3-甲基-4-(4，4,5，5-四甲基-[l，2，3]二氧杂环戊硼烷-2-基)-苄腈(lla，3.3g，0.0136mol，1.0eq)放入含有50mL四氯化碳的250mL圆底烧瓶中。加入NBS(2.5g，0.0142mol，1.05当量)和催化量的2，2'-偶氮二异丁腈(0.03g，0.00018mol，0.014当量)，反应混合物回流53h。热过滤得到的溶液，然后42真空除去溶剂。通过结晶从热己垸纯化粗产物。得到含有一些lla的产物(12a)(3.08g，70%)。结构确定，RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，3.9x150mmSymmetryColumnHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%TFA)禾口B=MeCN(0.1%TFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间13.4min。^NMR(400MHz，CDC13):51.38(s，12H，C(CH3)3)，4.85(s，2H，CHjBr),7.55(d,1H，A但)，7.68(s，1H，A坦)，7.92(d，1H，Arg)。步骤3:9-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氰基苄基]->^-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4，4,5，5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)各氰基苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]葸(13a)将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，0.3g，0.00061mol，1.0eq)放入25mL圆底烧瓶中，并溶解在4.5mL脱气的二甲基甲酰胺中。将3-溴甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-[1,2,3]二氧杂环戊硼烷-2-基)-苄腈(12a，0.53，0.0016mol,2.7eq)溶解在2mL氮气喷射的DMF中，并加到反应烧瓶中。搅拌溶液并用氮气冲洗5分钟。将DIEA(0.85mL，0.0049mol，8.0当量)加到反应混合物中，溶液在温和氮气流下和在黑暗中在环境温度下搅拌26h。真空蒸发反应溶剂。残余产物溶解在20mL二氯甲烷中，用2x10mL分批次的磷酸盐缓冲液(O.lM，pH7.0)萃取。合并二氯甲垸萃取物，真空干燥和蒸发，得到金色油状残余物。粗产物用5mL己烷搅拌15-30分钟，直到黄色沉淀出现。过滤，测定产物重量(~0.9g黄色粉末)。通过多次结晶从热2-丙醇(~3mLIPA)来进一步纯化粗产物。收集纯产物(13a)(0.07g，HPLC纯度为98.8%)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters3.9x150mmSymmetryColumnHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1,500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间15.2min。'H丽R(400MHz，CDC13):S1.31(s，12H，0-C(CH3)2C(QJ3)2，C-O)，1.34(s，12H，0-C(CSb)2C(CH3)2，C-O)，1.35(s，9H，C(Q33)3)，1.63(m，3H，N-CH2Qi2CH2-N+NIi重叠)，2.51(m，4H)，2.59(t，2H)，3.10(q，2H)，3.89(s，2H)，3.99(s，2H)，4.45(s，2H)，4.53(s，2H)，5.09(m，1H)，5.13(s，1H)，5.22(t，1H)，7.29(d，1H，A邸，7.42(d，1H，A邸，7.50(m，5H，A但)，7.62(d，1H，A邸，7.70(s，1H，A邸，7.78(d，1H，A坦)，8.35(m，2H，ArH)，8.41(d，2H，Ar出。ESI-MS:m/z7卯.4(M+，100%)。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。步骤4:9-[N-[6-(4,4，5，5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-氰基苄基〗-^[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基]-10-|>46-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-氰基苄基]-N-[2-(羧乙基嵐基]甲基]蒽钠盐(14a)将9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氰基苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基]-10-1^-[6-(4，4，5，5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-氰基苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(13a，0.064g，0.066mmol，1.0eq)放入25mL圆底烧瓶中，并溶解在2.5mL的60:40脱气的CH2C12:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌24h。残余产物用5mLCH2Cl2洗涤，然后真空除去溶剂。重复二氯甲烷洗涤，直到产物变为黄色粉末。粉末溶解在IOmL二氯甲烷中，并以使得温度保持在低于5°C的速率下滴加到20mL冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在<5°C下再搅拌5min，然后分配各层。有机萃取物用无水Na2S04干燥，过滤和浓縮，得到0.042g黄色粉末。粗产物溶解在3mL无水CH2C12中，并转移到25mL圆底烧瓶中。PS-DEAM珠(0.039g，1mmol，1eq)加到烧瓶中，反应^^合物用氮气冲洗2分钟。溶液在环境温度下摇动16h。过滤珠，用2xl0mL二氯甲垸洗涤。合并有机溶液，真空浓縮。得到纯产物(14a)(34mg指示剂)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters4.6x100mmSymmetry3.5jnC18柱，0.010mL注射(样品溶解在含有1%v/vTFA的70/30水/MeCN中)，0.100mL注射环，0.75mL/min，254nm检测，A=水(0.1%TFA)禾卩B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间12.9min。JH丽R(柳MHz，CDC13):51,33(s，12H)，1.36(s，12H)，1.65(m，2H)，1.71(bs，3H)，2'35(t，2H)，2.48(t,2H)，2.88(t，2H)，2.98(q，2H)，4.01(s，2H)，4.25(s,2H)，4.48(s，2H)，4.58(s,2H)，5.10(s，IH)，5.28(s，IH)，5.61(bs，IH)，7.45(m，5H)，7.65(d，IH)，7.72(d，2H)，7郡，IH)，7.92(d，2H)，8.05(d，IH)，8.30(d，2H)。实施例14合成4-硝基指示剂9-[N-[6-(4,4，5，5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-硝基苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-硝基苄蜀-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(14b).步骤1:3-硝基-6-(4,4,5，5-四甲基-[l,2，3]二氧杂环戊硼烷-2-基)-甲苯(lib)将2-溴-5-硝基甲苯(9b，10.2g，47.2mmol)放入含有醋酸钾(7.14g，72.7mmol)、4，4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-双-1，3,2-二氧杂环戊硼烷(10,13.3g，52.3mmol)、[l，l'-双(二苯基膦基)-二茂铁]二氯化钯(n)(413mg，0.506mmol)和DMSO(50mL)的100mL圆底烧瓶中，反应混合物加热到80°C保持4天。溶液冷却到环境温度，加入冰水(125mL)，用乙酸乙酯(3xl00mL)萃取黑色悬浮液。真空除去溶剂，在硅胶60上通过快速柱色谱纯化粗产物，用己烷然后用5。/。EtOAc/己烷洗脱。从最纯馏分得到大约95%纯产物(2.09g，17%)。结构确定-RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间10.48min。'HNMR(400MHz，CDC13):51.36(s，12H，C(Cg3)3)，2.62(s，3H，Qi3)，7.89(d，2H，A坦)，7.92(dd，1H，A邸，7.97(d，1H)。步骤2:3-溴甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-[l，2,3]二氧杂环戊硼烷-2-基)-硝基苯(12b)将3-硝基-6-(4，4，5，5-四甲基-[l，2，3]二氧杂环戊硼垸-2-基)-甲苯(llb，3.59g，13.6mmol)放入含有50mL苯的500mL圆底烧瓶中。加入NBS(2.68g，15.0mmol，1.1当量)和催化量的2，2'-偶氮二异丁腈(AIBN，84mg，0.5mmol)，反应混合物在氩气流中回流3.5h。加入额外的NBS(0.27g，1.5mmol，0.1eq)，继续回流2小时以上。过滤冷却的悬浮液，真空除去溶剂。通过结晶从热己垸来纯化粗产物。得到产物(12b)(2.12g，46%)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间12.5min。'H画R(400画z，CDC13):S1.40(s，12H，C(C貼)，4.92(s，2H，C腿r)，7,98(d，1H，A邸，8.08(dd，1H，A坦)，8.22(d，1H，A坦)。步骤3:9-[N-[6-(4,4,5，5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-硝基苄基]—N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-lO-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-硝基苄萄-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(13b):将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，0.509g，1.04mmol)放入100mL圆底烧瓶中，在5mL二甲基甲酰胺中搅拌，直到溶解。加入4-硝基-2-(溴甲基)苯基硼酸频哪醇酯(12b，1.09，3.19mmol，3当量)和DIEA(1.45mL，8.38mmol，8叫)，溶液在油浴中并在充入氩气的球形瓶中加热到80°C保持2小时。真空除去DMF，加入二氯甲烷(50mL)，用磷酸盐缓冲液(2x50mL0.1M，pH7.0)洗涤。水溶液用二氯甲垸(25mL)逆流洗涤，合并有机溶液，用Na2S04干燥。真空除去有机物，用沸腾己垸研磨得到的红黄色油两次(每次50mL)，得到棕褐色粉末。用沸腾的80/20乙酸乙酯/IPA研磨，得到145mg纯产物，棕褐色粉末。从冷却的乙酸乙酯/IPA中析出更多的纯产物(400mg)，合并纯的固体。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾BB=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间16.0min。^NMR(400MHz，CDC13):51.32(s，12H，0-C(Cii3)2C(QJ3)2，C-O)，1.36(s，21H，0-C(Cg3)2C(CH3)2，C-0+叔丁基)，1.65(s，3H，0=C-C(CH2)CH3)，1.75(m，2H，N-CH2CH2CH2-N)，2.55(t，2H)，2.59(t，2H)，3.0(t，2H)，3.15(m，2H)，3.96(s，2H)，4.05(s，2H)，4.48(s，2H)，4.55(s，2H)，5,04(s，1H)，5.08(s，1H)，5.25(br，1H)，7.44-7.52(m，4H，A坦)，7.64(d，1H)，7.76(dd，1H，A坦)，7.80(d，1H)，7.92(dd，1H)，7.96(d，1H，A邸，8.25(d，1H，輔)，8.36-8.44(m，4H，A邸。步骤4:9-[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-硝基苄基]—N—[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]_10_[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3_硝基苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(14b)将9_[N-[6-(4，4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-硝基苄基]—N-[3—(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-l0-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-硝基苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(13b，0.499g，0.493mmol)溶解在10mL60:40的CH2C12:TFA溶液中，搅拌过夜。真空除去溶剂，残余产物溶解在20mLCH2C12中，然后真空除去溶剂。重复二氯甲烷溶解/蒸发处理4次以上，直到产物变为黄色粉末。粉末溶解在20mL二氯甲烷中，并以使得温度保持在低于5°C的速率下滴加到80mL冷的饱和NaHCO3水溶液中。溶液在<5°C下再搅拌5min。加入额外的二氯甲烷(50mL)以辅助分配各层。有机萃取物用无水Na^04干燥，过滤和浓縮，得到157mg黄色粉末。粗产物溶解在10mL无水CH2Cl2中，并转移到100mL圆底烧瓶中。加入PS-DEAM珠(0.10g)，用隔膜密封烧瓶并用氩气冲洗，反应混合物在环境温度下摇动16h。过滤珠，用二氯甲烷洗涤(2x10mL)。合并有机溶液，真空浓縮。得到纯产物(0.125mg，26%),黄色粉末。47结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，0.75mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0,1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B，2min内80-100%B,100%B2min，保留时间13.7min。实施例15合成4-三氟甲基砜指示剂9-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(21)步骤l:4-溴-3-甲基苯磺酰氟(16)将4-溴-3-甲基苯磺酰氯(15，9.87g，36.6mmo1)、无水氯化钾(8.50g，146mmol，4eq)和18-冠-6(0.299g，1.13mmol，0.03eq)在无水乙腈(20mL)中搅拌过夜，直到HPLC表明原料完全转化成产物。将水(100mL)加到反应混合物中，分离出产物，油状。倾析水溶液，然后用己垸(50mL)萃取。油溶解在己垸萃取物中，用Na2S04干燥，真空除去溶剂。分离出蜡状白色固体(8.08g，87%)。M.p.=47-48。C.结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters4.6x100mmSymmetry3.5pC18柱(带有SentryC18保护柱)，0.010mL注射(样品溶解在含有1%v/vTFA的60/40的水/MeCN中)，0.100mL注射环，1.50mL/min，254腿检测，A=水(0.1%TFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10o/oBlmin，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间10.5mm.NMR(400MHz，CDC13):S2.5(s，3H)，7.68(dd，1H)，7.80(d，1H)，7.86(d，1H)。歩骤2:6_溴-3-(三氟甲基磺酰基)甲苯(17)在备配有滴液漏斗的烘箱干燥的2颈烧瓶中使TASF(0.61g，2.2mmol)悬浮在无水戊烷(40mL)中，并冷却到5。C。加入溶解在戊烷(40mL)中的4-溴-3-甲基苯磺酰氟(16，5.00g，19.8mmol)，将温度计插入悬浮液中。将溶解在戊烷(20mL)中的三甲基三氟甲基硅烷(TFM-TMS，6.4mL，41mmol，2.1eq)通过滴液漏斗滴加到悬浮液中，使得反应温度保持在4-5。C。搅拌继续5小时，同时使悬浮液升温。从棕色固体倾析出透明溶液，用水(100mL)洗涤，用Na2S04干燥，真空过滤并除去溶剂。分离出黄色油(5.35g，89%),然后放置结晶(针状)。结构确定RP画HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters4.6x100mmSymmetry3.5^C18柱(带有SentryC18保护柱)，0.010mL注射(样品溶解在含有1%v/vTFA的60/40的水/MeCN中)，0.100mL注射环，1.50mL/min，254nm检测，A=水(0.1%TFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间11.0min。'HNMR(400MHz，CDC13):S2,55(s，3H)，7.70(dd，1H)，7.85(d，1H)，7.7(d，1H)。步骤3:2-甲基-4-(三氟甲基磺酰基)苯基硼酸频哪醇酯(18)在250mL圆底烧瓶中加入醋酸钾(5.0g，50mmol)、[l,l'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(0.373g，0.51mmol)和双联(频哪醇基pinacolato)二硼(5.2g，20mmol)并用氮气冲洗。加入将6-溴-3-(三氟甲基磺酰基)甲苯(17，5.0g，16mmol)的无水DMF(100mL)溶液，悬浮液在氮气中加热到80。C保持24小时。真空除去溶剂，得到的浆料在硅胶60(60g)上用95/5的己烷/乙酸乙酯(500mL)洗脱。除去溶剂，得到6.1g粗产物，白色蜡状固体。重结晶从己垸得到3.78g(68。/。)白色晶体；第二次收集分离得到0.44g。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters4.6x100mmSymmetry3.5(iC18柱(带有SentryC18保护柱)，0.010mL注射(样品溶解在含有1%v/vTFA的60/40水/MeCN中)，0.100mL注射环，1.50mL/min，254nm检测，A=水(0.1%TFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min,保留时间8.0min。'HNMR(400MHz,CDC13):3L37(s，12H)，2.62(s，3H)，7,80(m，2H)，8.00(d，m)。FABMS(mNBA):351(M+H)+，335(M-15)十。步骤4:2-溴甲基-4-(三氟甲基磺酰基)苯基硼酸频哪醇酯(19)在回流CC14(70mL)中加热2-甲基-4-(三氟甲基磺酰基)苯基硼酸频哪醇酯(18，3.60g，10.3mmo1)、N-溴琥拍酰亚胺(1.92g，10,8mmol，1.04eq)和AIBN(25mg，0.15mmol，0.015eq)，同时用75瓦白炽灯泡照射5小时。然后溶液到达室温，重力过滤和真空除去溶剂。在硅胶上纯化粗产物，用己垸中的0、5%和然后用10%的乙酸乙酯洗脱，分离出混有一些二溴化物19和18，黄色油(2.65g，60%)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters4.6x100mmSymmetry3.5|iC18柱(带有SentryC18保护柱)，0.010mL注射(样品溶解在含有1%v/vTFA的60/40水/MeCN中)，0.100mL注射环，1.50mL/min，254nm检测，A=水(0.1%TFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间8.7min。!H丽R(400MHz,CDC13):S1.37(s，12H)，4.92(s，2H)，7.96(dd，IH)，8.02(d，IH)，8.08(d，IH)。步骤5:9-[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(20)将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，(X706g，1.44mmol)、2-溴甲基-4-(三氟甲基磺酰基)苯基硼酸频哪醇酯(19，2.11g)和DIEA(4.5mL，26mmol)溶解在无水DMF(12mL)中，在室温下在氮气流中搅拌。26小时后，真空蒸发溶剂。残余产物溶解在30mL二氯甲烷中，用2x30mL分批次的磷酸盐缓冲液(O.lM，pH7.0)洗涤。用Na2S04干燥二氯甲垸溶液，过滤和真空蒸发，得到橙色油。粗产物用己烷(10mL)研磨，然后溶解在最小量的IPA中，加入己烷，直到溶液变浑浊。真空除去溶剂，留下黄色粉末(1.93g，95%)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters4.6x100mmSymmetry3.5[iC18柱(带有SentryC18保护柱)，0.010mL注射(样品溶解在含有1%v/vTFA的70/30水/MeCN中)，0.100mL注射环，0.75mL/min，254nm检测，A=水(0.1%TFA)禾口B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80°/。B，2min内80-100%B，100%B2min，保留时间17.4min。'H丽R(400MHz，CDC13):5L30(s，12H)，1.32(s，12H)，1.34(s，9H)，1.63(s，3H)，1.78-1.81(m，2H)，2.55-2,61(m，4H)，2.96(t，2H)，3.15(m，2H)，3.98(s，2H)，4.05(s，2H)，4.54(s，2H)，4.56(s,2H)，5.10(bs，IH)，5.12(s，IH)，5.30(bt，IH)，7.49-7.52(m，4H)，7.68(dd，IH)，7.80(m，2H)，7.84(d，IH)，7.94(s，IH)，8,18(s，IH)，8.40-8.42(m，4H)。ESI-MS(TFA/乙腈/水)1004.2(M-H20+H)+，1006.2(M-H20+Na)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。步骤6:9-[N-[6-(4，4，5，5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺萄丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基磺酰基)节基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(21)'9-[N-[6-(4，4,5,5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基磺酰基)节萄-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(20，1.00g，843mmol)溶解在从氮气喷射的试剂制备的30mL60:40CH2C12:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌22h，然后真空除去溶剂。残余产物溶解在30mLCH2Cl2中，然后真空除去溶剂。重复二氯甲烷溶解/蒸发处理4次以上，直到产物变为黄色粉末。粉末溶解在30mL二氯甲烷中，并以使得温度保持在低于5。C的速率下滴加到60mL冰冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在<5°C下再搅拌5min，然后分配各层。有机层用无水Na2S04干燥，过滤和浓缩，得到0.58g(60%)产物，黄色粉末。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，Waters4.6x100mmSymmetry3.5pC18柱(带有SentryC18保护柱)，0.010mL注射(样品溶解在含有1%v/vTFA的70/30水/MeCN中)，0.100mL注射环，0.75mL/min，254nm检测，A=水(0.1。/oTFA)禾口B:MeCN(0.10/0v/vTFA)，梯度10%B2min，18min内10-80%B,2min内80-100%B，100%B2min，保留时间15.5min。'H丽R(400MHz，CDC13):S1.32(s，12H)，1,35(s，12H)，1.69-1.72(m，5H)，2.41(t，2H)，2.53(t，2H)，2.89(t，2H)，3.03(dd，2H)，4.07(s，2H)，4.23(s，2H)，4.54(s，2H)，4.60(s，2H)，5.09(s，1H)，5.26(s，1H)，5.56(m，1H)，7.45-7.49(m，4H)，7.82(m，2H)，7.91(m，1H)，7.98(d，1H)，8.10-8.16(m，4H)，8.39(m，2H)。ESI-MS(TFA/乙腈/水)948.0(M-H20+H)+，970.0(M-H20+Na)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。实施例16合成3,5-二氯-指示剂9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-2,4-(二氯)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基〗甲基]-10-[N-[6-(4,4,5，5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2，4-(二氯)苄基]-N-[2-(羧乙萄氨基]-甲萄蒽钠盐(4i)步骤1:9-[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2，4-(二氯)节基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼烷基)^，4-(Zl氯)苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲萄蒽(3i):将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，0.4g，0.82mmol)放入100mL圆底烧瓶中，并在10mL二甲基甲酰胺中搅拌，直到溶解。在氮气中加入6-(溴甲基)-3,5-二氯苯基硼酸频哪醇酯(2i，0.83g，2.3mmo1，2.4当量)和DIEA(1.14mL，6.6mmo1，8.0eq)，在黑暗中在室温下搅拌24h。真空除去DMF，加入二氯甲烷(30mL)，用磷酸盐缓冲液(50mL0.1M，pH7.0)洗涤。收集二氯甲烷溶液，用Na2S04干燥。真空除去二氯甲垸，得到的黄色泡沫状残余物，在氮气缓f曼流动下用己烷(IOmL)研磨15分钟。从热IPA结晶粗产物(1.02g)，得到黄色粉末(3i，0.38g，44%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/mm，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间8.7min。^丽R(400MHz，CDC13):S1.23(s，9H)，1.32(s，12H)，1.37(s，12H)，1.41(bs，3H)，1,52(m，2H)，2.36(t，2H)，2.48(t，2H)，2.76(t，2H)，2.89(q，2H)，4.12(s，2H)，4.16(s，2H)，4.37(s，2H)，4.43(s，2H)，4.56(t，IH)，4.67(s，IH)，4.82(t，IH)，7.36(m，4H)，7.48(d，IH)，7.56(d，IH)，7.76(t，2H)，8.17(m，2H)，8.24(m,2H)。步骤2:9-[N-[6-(4,4，5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼垸基)-2，4-(二氯)苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[1^[6-(4,4,5,5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2,4-(:i氯)节基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(4i)将9-[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2，4-(二氯)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2,4-(二氯)苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(3i，0.38g,0.36mmol)放入50mL圆底烧瓶中，并溶解在10mL的60:40CH2C12:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌过夜。20h后，真空除去溶剂。残余产物溶解在10mLCH2Cl2中，然后真空除去溶剂。重复二氯甲垸溶解/蒸发处理，直到产物变为黄色粉末。粉末溶解在30mL二氯甲烷中，并以使得温度保持在低于5°C的速率下滴加到50mL冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在<5°C下再搅拌5min，然后分配各层。有机层用无水Na2S04干燥，过滤和浓縮，得到黄色粉末。粗产物溶解在15mL无水CH2C12中，并转移到100mL圆底烧瓶中。PS-DEAM珠(0.2g，leq)加到烧瓶中，反应混合物在环境温度下摇动16h。过滤珠，用10mL二氯甲烷洗涤。合并有机溶液，真空浓縮。得到纯产物(0.19g，52%产率)，黄色粉末。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间7.9min。ESI-MS(TFA/乙腈/水)822.11(M-H20+H)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。实施例17合成3,5-双(三氟甲基)指示剂9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-2，4-双(三氟甲基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4，4，5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼垸基)-2,4-双(三氟甲基)苄基]-N-[2-(羧乙基廣基]-甲基]蒽钠盐(273)步骤l:2-溴-4,6-双(三氟甲基)甲苯(23a)将2，4-双(三氟甲基)甲苯(22a，12.7g，56mmol)放入圆底烧瓶中。然后加入28mlTFA和7.8mlH2S04(TFA的量为28%)。以少量将NBS(10.0g，56mmol，1eq)加到反应混合物中。反应在环境温度下进行2天。48h后，处理反应。反应混合物倒在冰冷水(200ml)上，通过用Et20萃取从水层分离有机层(油状残余物)。用饱和的NaHC03水溶液洗涤醚层，然后分离各层。收集有机层，用Na2S04干燥，除去溶剂。收集纯产物(13.1g，77%产率)，微黄色油。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间12.3min。'H薩R(400顧z，CDC13):52.54(s，3H)，7.64(s，1H)，8.00(s，1H)。步骤2:2-M乙基-3，5-双(三氟甲萄苯基硼酸频哪醇酯(24a)将2-溴-4,6-双(三氟甲基)甲苯(23a，10.0g，30mmol)放入圆底烧瓶中，并溶解在200mlDMF中。然后一次将KOAc(8.8g，90mmol，3eq)加到反应混合物中，然后加入PdCl2(dppf)(0.66g，0.9mmol，0.03eq)和双联(频哪醇基)二硼(bis(pinacolato)diboron)(10.2g，45mmo1，1.5eq)。溶液在80。C下搅拌24h。然后除去溶剂，对黑色残余物进行塞柱色谱(plugcolumnchromatography,DCM)，得到深绿色油状残余物。通过二次柱色谱进一步纯化化合物(2。/。MeOH/DCM)。收集纯产物(8.7g，76%)，微绿色油。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min,9min内10-80%B,1min内80-100%B，100%B1min，保留时间9.1min(对于硼酸)和12.8min(对于频哪醇酯)。'H丽R(400MHz，CDC13):S1.36(s，12H)，2.75(s，3H)，7,90(s，1H)，8.16(s，1H)。步骤3:2-(溴甲基)-3，5-双(三氟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(25a)将2-甲基-3，5-双(三氟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(24a，2.0g，5.6mmol)和50mlCCU放入250ml圆底烧瓶中。加入NBS(1.05,5.88mmol，1.05eq)和AIBN(0.013g，0.078mmol，0.014eq)，反应混合物在75W白炽灯泡存在下回流3h。3h后，将溶液冷却到室温，使琥珀酰亚胺沉淀析出。过滤出固体。除去溶剂，收集油状产物。通过用己垸研磨来纯化粗产物，得到90%纯产物(25a，2.2g，90%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254歸检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间9.7min(对于硼酸)和12.9min(对于频哪醇酯)。H薩R(400MHz，CDC13):51.41(s，12H)，5.08(s，2H)，7.94(s，1H)，8.24(s，1H)。步骤4:9-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2,4-双(三氟甲基)苄基]—N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼垸基)-2，4-双(三氟甲基)苄蜀-^[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(26a)将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，0.8g，1.6mmol)放入250mL圆底烧瓶中。溶解在15mL脱气的二甲基甲酰胺中。将2-(溴甲基)-3，5-双(三氟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(25a，1.66g，3.8mmo1，2,4eq)溶解在5mL氮气喷射的DMF中并加到反应烧瓶中。搅拌溶液并用氮气冲洗5分钟。D正A(2.2mL，12.8mmol，8.0当量)加到反应混合物中，溶液在温和氮气流下并在黑暗中在环境温度下搅拌4晚。96h后，反应在60°C下持续4.5h。然后冷却反应，真空蒸发溶剂。残余产物溶解在50mL二氯甲烷中，用2x70mL分批次的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.0傳取。真空干燥和蒸发二氯甲烷溶液，得到棕色油状残余物。用己烷(15ml)研磨粗产物30分钟。收集黄色粉末，从热IPA结晶，得到纯产物(26a，1.2g,59%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾口B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间10.8min。'H雇R(400MHz，CDC13):51.23(s，9H)，1.32(s，12H)，1.36(s，12H)，1.74(s，5H)，2.31(t，2H)，2.8(m，5H)，2.88(t，2H)，4.08(s，2H)，4.16(s，2H)，4.47(s，2H)，4.76(s，2H)，5.12(s，1H)，5.32(s，1H)，7.44(m，4H)，7.88(s，1H)，7.96(s，1H)，8.08(m，2H)，8.14(m，2H)，8.20(s，1H)，8.29(s，1H)。步骤5:9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-2，4-双(三氟甲基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2,4-双(三氟甲基)苄基]-N-[2(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(27a)将9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2,4-双(三氟甲基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-l0-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2，4-双(三氟甲基)苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(26a，0.013g，0.011mmol)放入50mL圆底烧瓶中，并溶解在5mL的60:40脱气的CH2Cl2:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌19h。残余产物用10mLCH2Cl2洗涤，然后真空除去溶剂。重复二氯甲烷洗漆几次。得到的油状产物溶解在5mL二氯甲烷中，并以使得温度保持在低于5。C的速率下滴加到25mL冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在〈5。C下再搅拌5min，然后分配各层。有机萃取物用无水Na2S04干燥，过滤和浓缩，得到0.012g黄色粉末(27a)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0,010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾QB=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间9.6min。ESI-MS(TFA/乙腈/水)956.0(M-H20+H)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。实施例18合成5-三氟甲基指示剂9-[N-[2-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-4-(三氟甲基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氮基]甲基]-10-[N-[2-(4,4，5,5-四-甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-4-(三氟甲基)苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]-蒽钠盐(27b)步骤l:l溴-4-三氟甲基甲苯("b)将4-(三氟甲基)甲苯(22b，9.0g，56mmol)放入圆底烧瓶中。然后加入20mlTFA和5.6mlH2S04(TFA的量为28%)。分少量将NBS(10.0g，56mmol，1叫)加到反应混合物中。反应在环境温度下进行过夜。20h后，处理反应。反应混合物倒在冰冷水(100ml)上，通过用Et20萃取从水层分离有机层(油状残余物)。收集醚层，用Na2S04干燥，除去溶剂。收集纯产物(7.86g，59%产率)，微黄色油。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检领U，A=水(0,1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间11.7min。'HNMR(400MHz，CDC13):52.45(s，3H)，7.34(d，1H)，7.50(d，1H)，7,80(s，1H)。步骤2:6-甲基-3-(三氟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(24b)将2-溴-4-(三氟甲基)甲苯(23b，5g，21mmol)放入圆底烧瓶中，并溶解在150mlDMF中。然后一次将KOAc(6.2g，63mmol，3eq)加到反应混合物中，然后加入PdCl2(dppf)(0.46g，0.63mmol，0.03eq)和双联(频哪醇基)二硼(5.9g，23.1mmol，Ueq)。溶液在80°C下搅拌48h。除去溶剂，对黑色残余物进行塞柱色谱(EtOAc)，得到深绿色油状残余物。通过二次柱色谱进一步纯化化合物(2。/。MeOH/DCM)。收集纯产物(3.5g，58%)，微绿色油。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1°/。v/vTFA)禾卩B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间7.9min(对于硼酸)和12.6min(对于频哪醇酯)。JHNMR(400MHz，CDC丄3):31.35(s，認)，2.58(s，3H)，7.26(d，1H)，7.55(d，1H)，8.00(s，1H)。步骤3:6-(溴甲基)-3-(三氟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(25b)将6-甲基-3-(三氟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(24b，3.0g，10mmol)和60mlCCl4放入500ml圆底烧瓶中。加入NBS(1.9，10.5mmol，1.05eq)和AIBN(0.02g，0.14mmol，0.014eq)，反应混合物在75W白炽灯泡存在下回流4.5h。4.5h后，溶液冷却到室温，使琥珀酰亚胺沉淀析出。过滤出固体。除去溶剂，收集油状产物。用己烷研磨来纯化粗产物，得到80。/。纯产物(25b，3.6g，95%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254■检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾口B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间8.7min(对于硼酸)和12.4min(对于频哪醇酯)。'H丽R(400MHz，CDC13):51.38(s，12H)，4.91(s，2H)，7.50(d，1H)，7.64(d，IH)，8.06(s，1H)。步骤4:9-[N-[2-(4,4,5,5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷萄4-(三氟甲基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-l0-[N-[2-(4,4,5,5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-4-(三氟甲基)节基]->1-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(26b)将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，l.Og，2.0mmol)放入150mL圆底烧瓶中。将其溶解在15mL脱气的二甲基甲酰胺中。将6-(溴甲基)-3-(三氟甲基)苯基硼酸频哪醇酯(25b，1.75g，4.8mmol，2.4当量)溶解在5mL氮气喷射的DMF中，并加到反应烧瓶中。搅拌溶液并用氮气冲洗5分钟。DIEA(2.8mL，16mmol，8.0当量)加到反应混合物中，溶液在温和氮气流下并在黑暗中在环境温度下搅拌过夜。24h后，真空蒸发溶剂。残余产物溶解在lOmL二氯甲垸中，用3xl5mL分批次的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.0)萃取。真空干燥和蒸发二氯甲烷溶液，得到金色油状残余物。粗产物用10mL己烷搅拌15分钟，然后除去溶剂。收集黄色粉末，从热IPA结晶，得到纯产物(26b，1.2g，55%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾口B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间8.1min。'H画R(400MHz,CDC13):S1.29(s，9H)，1.31(s，12H)，1.35(s，12H)，1.55(bs，3H)，1.73(m，2H)，2.52(m，4H)，2.91(t，2H)，3.10(q，2H)，3.95(s，2H)，4.05(s，2H)，4.45(s，2H)，4.51(s，2H),4.97(s，2H)，5.05(t，1H)，7.42-7.47(m，6H)，7.54(d，1H)，7.60(d，1H)，7.91(s，1H)，8.01(s，1H)，8.34(m，2H)，8.39(m，2H)。步骤5:9-[N-[2-(4,4,5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-4-(三氟甲基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(4，4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-4-(三氟甲基)节基]-:^-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(27b)将9-[N-[2-(4,4，5，5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-4-(三氟甲基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基H(HN-[W,S，S-四甲基-l,3,〉二氧杂环戊硼垸基)-4-(三氟-甲基)苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(26b，0.39g，0.37mmol)放入100mL圆底烧瓶中，并溶解在20mL的60:40脱气的CH2Cl2:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌23h。残余产物用10mLCH2Cl2洗涤，然后真空除去溶剂。重复二氯甲烷洗涤几次。粉末溶解在IOmL二氯甲烷中，并以使得温度保持在低于5。C的速率下滴加到80mL冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在<5°C下再搅拌5min，然后分配各层。有机萃取物用无水Na2S04干燥，过滤和浓縮，得到0.33g黄色粉末。粗产物溶解在10mL无水CH2C12中，并转移到100mL圆底烧瓶中。PS-DEAM珠(0.19g，leq)加到烧瓶中，反应混合物在环境温度下摇动16h。过滤珠，用5mL二氯甲垸洗涤。合并有机溶液，真空浓縮。得到纯产物(27b，0.27g，72%)，黄色粉末。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间7.2min。HNMR(400MHz，CDC13):S1.33(s，12H)，1.39(s，12H)，1.60-1.63(m，5H)，2.33(t，2H)，2.47(t，2H)，2.85-2.96(m，4H)，4.05(s，2H)，4.33(s，2H)，4.46(s，2H)，4,60(s，2H)，5.03(s，1H)，5.18(s，1H)，5.52(bt，1H,)，7.35-7.43(m，4H)，7.55-7.66(m，2H)，7.68(d，1H)，7.77-7.88(m，3H)，8.03(s，1H)，8.24(s，1H)，8.30(m，2H)。ESI-MS(TFA/乙腈/水)820.12(M-H20+H)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。实施例19合成5-氟指示剂9-[N-[2-(4,4,5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-4-氟苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(4，4，5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-4-氟苄萄^-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(323)步骤l:3-氟-6-甲基苯基硼酸频哪醇酯(29a)将3-氟-6-甲基苯基硼酸(IOg，65mmol)和220mL乙醚放入圆底烧瓶中。然后加入频哪醇(7.68g，65mmol，leq)，得到的反应混合物搅拌几分钟，直到溶液透明。最后，加入MgS04(15,6g，130mmol，2eq)，溶液在氮气球形瓶中在环境温度下搅拌过夜。24h后，处理反应。过滤出MgS04,用Et20洗涤。收集有机层，然后除去溶剂。得到纯产物(15.2§，99%产率)，深黄色油状残余物。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1,5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间6.1min。'HNMR(400MHz，CDC13):51.34(s，12H)，2.48(s，3H)，6.97(ddd，1H)，7.09(dd，1H)，7.43(dd，1H)。步骤2:6-(溴甲基)-3-氟苯基硼酸频哪醇酯(30a)将3-氟-6-甲基苯基硼酸频哪醇酯(29a，5.01g，21.2mmol)和140mlCC14放入500ml圆底烧瓶中。加入NBS(3.97g，22.3mmol，1.05eq)和AIBN(0.054g，0.33mmol，0.016eq)，反应混合物在75W白炽灯泡存在下回流3.5h。3.5h后，溶液冷却到室温，使琥珀酰亚胺沉淀析出。过滤出固体。除去溶齐U，收集油状产物。用柱色谱(95/5己烷/乙酸乙酯)纯化，得到纯产物(30a，5.59g，84%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注身牙，1.5mL/min，1.500mL注身寸环，254nm检观lj，A=水(0.1%v/vTFA)禾口B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间7.2min(对于游离硼酸)和12.1min(对于频哪醇酯)。'HNMR(400MHz，CDC13):S1.36(s，12H)，4.88(s，2H)，7.04-7.09(ddd，1H)，7.33-7.37(dd，1H)，7.47-7.50(dd，1H)。步骤3:9-[N-[2-(4,4，5，5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-4-氟苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[2-(4，4,5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼垸基)-4-氟苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]葸(31a):将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰萄乙基氨基]甲基]-蒽(l，1.0g，2.04mmol)放入100mL圆底烧瓶中，在16mL二甲基甲酰胺中搅拌，直到溶解。加入6-(溴甲基)-3-氟苯基硼酸频哪醇酯(30a，1.96，6.22mmol，3.0当量)和DIEA(2.8mL，16mmol，8.0eq)，在氮气中在黑暗中在室温下搅拌24h。真空除去DMF;加入二氯甲烷(20mL)，用磷酸盐缓冲液(40mL0.1M，pH7.0)洗涤。收集二氯甲烷溶液，用Na2S04干燥。真空除去二氯甲烷，在氮气缓慢流动下将得到的黄色残余物用己烷(10mL)研磨15分钟。粗产物(1.6g)从热IPA结晶两次，得到黄色粉末，HPLC纯度为98.6。/。(31a，0.89g，45%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254腿检观ij，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间7.3min。'H雇R(400MHz，CDC13):Sl,29(s，9H)，1.31(s，12H)，1.35(s，12H),1.55(bs，3H)，1.72(m，2H)，2.54(m，4H)，2.92(t，2H)，3.09(q，2H)，3.95(s，2H)，4.03(s，2H)，4.47(s，2H)，4.51(s，2H)，4.96(s，2H)，5.05(t，1H)，7.42-7.46(m，6H)，7.54(d，1H)，7.60(d，1H)，7.90(s，1H)，8.01(s，1H)，8.32(m，2H)，8.38(m，2H)。步骤4:9-[N-[2-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-4-氟苄基]_^[3_(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]_10_[^[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼浣基)-4-氟苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽钠盐(32a)将9-[N-[2-(4,4,5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-4-氟苄蜀-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(4,4，5，5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-4-氟-苄基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(31a，0.79g，0.82mmol)放入100mL圆底烧瓶中，并溶解在30mL的60:40CH2C12:TFA溶液中。反应混合物在环境温度下搅拌过夜。24h后，真空除去溶剂。残余产物溶解在10mLCH2Cl2中，然后真空除去溶剂。重复二氯甲烷溶解/蒸发处理，直到产物变为黄色粉末。粉末溶解在30mL二氯甲烷中，并以使得温度保持在低于5°C的速率下滴加到50mL冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在〈5。C下再搅拌5min，然后分配各层。有机层用无水!^2804干燥，过滤和浓縮，得到0.7g黄色粉末。粗产物溶解在20mL无水CH2Cl2中，并转移到100mL圆底烧瓶中。PS-DEAM珠(0.44g，leq)加到烧瓶中，反应混合物在环境温度下摇动16h。过滤珠，用5mL二氯甲垸洗涤。合并有机溶液，真空浓縮。得到纯产物(0.55g，71%)，黄色粉末。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾口B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间6.4min。'H菌R(400應z，CDC13):51.33(s，12H)，1.37(s，12H),1.56(t，2H)，1.62(s，3H)，2.24(t，2H)，2.43(t，2H)，2.86(m，2H)，4.00(s，2H)，4.27(s，2H)，4.43(s，2H)，4.61(s，2H)，4.89(t，1H)，5.12(s，1H)，5.48(m，1H)，7.12(ddd，1H)，7.29(ddd，1H)，7.38(m，4H)，7.44-7.52(m，2H)，7.57(dd，1H)，7.69(dd，1H)，7.83(m，2H)，8.24(m，2H)。实施例20合成4-氯指示剂9-[1^-[6-(4，4，5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氯苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4，4，5，S-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氯苄基]-N-[2-(羧乙基)氨蜀甲基]蒽钠盐(32b)步骤l:4-氯-2-甲基苯基硼酸频哪醇酯(29b)63将4-氯-2-甲基苯基硼酸(5.0g，29mmol)和100mL乙醚放入圆底烧瓶中。然后加入频哪醇(3.43，29mmo1，l叫)，得到的反应混合物搅拌几分钟，直到溶液透明。最后，加入MgS04(6.98，58mmol，2eq)，溶液在氮气球形瓶中在环境温度下搅拌过夜。24h后，处理反应。过滤出MgS04，用Et20洗漆。收集有机层，然后除去溶剂。得到纯产物(7.2g，97%产率)，白色粉末。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0:1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间12.6min。'H丽R(400固z，CDC13):51.33(s，12H),2.50(s，3H)，7.14(m，2H)，7.68(d，1H)。步骤2:2-(溴甲基)-4-氯苯基硼酸频哪醇酯(30b)将4-氯-2-甲基苯基硼酸频哪醇酯(29b，7.2g，28.5mmol)和100mlCCl4放入500ml圆底烧瓶中。加入NBS(5.3g，29.9mmol，1,05eq)和AIBN(0.066g，0.399mmol，0.014eq)，反应混合物在75W白炽灯泡存在下回流6h。6h后，溶液冷却到室温，使琥珀酰亚胺沉淀析出。过滤出固体。除去溶剂，收集产物(30b，9.3g，99%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRCI8柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检领lj，A^水(0.1。/。v/vTFA)和B-MeCN((U0/0v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间8.05min(对于游离硼酸)和12.4min(对于频哪醇酯)。'H丽R(400MHz，CDC13):M.36(s，12H)，4.85(s，2H)，7.24-7.28(m，IH)，7.58(d，IH)，7.74(d，IH)。步骤3:9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-氯苄基]-^[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基氨基]甲基]-10-|^-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氯节基]-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(31b):将9-[N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基胺]甲基]-10-[N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]-蒽(l，1.0g，2.04mmol)放入100mL圆底烧瓶中，在15mL二甲基甲酰胺中搅拌，直到溶解。加入2-(溴甲基)-4-氯苯基硼酸频哪醇酯(30b，1.8，4.89mmol，2.4当量)和DIEA(2.78mL，16.3mmol，8.0eq)，在氮气中在黑暗中在室温下搅拌24h。真空除去DMF;加入二氯甲烷(100mL)，用磷酸盐缓冲液(2xl00mL0.1M，pH7.0)洗涤。收集二氯甲烷溶液，用Na2S04干燥。真空除去二氯甲垸，在氮气缓慢流动下将得到的黄色残余物用己垸(10mL)研磨30分钟。从热IPA结晶粗产物(1.9g)，得到浅粉红色粉末(31b，1.6g，79%产率)。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)和B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间7.7min。'H固R(400MHz，CDC13):51.27(s，9H)，1.31(s，12H),1.35(s，12H)，1.^50(bs，3H)，1.66(m，2H)，2,44(t，2H)，2.53(t，2H)，2.88(t，2H)，3.06(q，2H)，3.93(s，2H)，4.02(s，2H)，4.43(s，2H)，4.47(s，2H)，4.87(s，1H)，4.92(bs，1H)，5.00(t，1H)，7,09-7.15(dd，1H)，7.22-7.26(dd，1H)，7.37(d,1H)，7.42-7.48(m，4H)，7.53(d，1H)，7.63(d，1H)，7.72(d，1H)，8.30-8.39(m，4H)。步骤4:9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氯苄基]_^[3_(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]_10_[^一[6_(4，4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氯苄基]-N-[2-(羧乙基嵐基]甲基]蒽钠盐(32b)将9-[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-氯苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4，4,5，5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-氯苄萄-N-[2-(叔丁氧基羰基)乙基氨基]甲基]蒽(Mb，1.0g，10.09mmol)放入100mL圆底烧瓶中，并溶解在20mL的60:40CH2C12:TFA溶液中。反应混合物在氮气球形瓶中在环境温度下搅拌过夜。20h后，真空除去溶剂。残余产物溶解在10mLCH2Cl2中，然后真空除去溶剂。重复二氯甲垸溶解/蒸发处理，直到产物变为黄色粉末。粉末溶解在30mL二氯甲烷中，并以使得温度保持在低于5°C的速率下滴加到80mL冷的饱和NaHC03水溶液中。溶液在<5。C下再搅拌5min，然后分配各层。有机层用无水Na2S04干燥，过滤和浓缩，得到0.7g黄色粉末。粗产物溶解在20mL无水CH2Cb中，并转移到100mL圆底烧瓶中。PS-DEAM珠(0.42g，leq)加到烧瓶中，反应混合物在环境温度下摇动16h。过滤珠，用5mL二氯甲垸洗涤。合并有机溶液，真空浓缩。纯产物(32b，0.55g，57%)得到，黄色粉末。结构确定RP-HPLC条件HP1100HPLC色谱，带有保护柱的Waters3.9x150mmNovaPakHRC18柱，0.010mL注射，1.5mL/min，1.500mL注射环，254nm检测，A=水(0.1%v/vTFA)禾口B=MeCN(0.1%v/vTFA)，梯度10%B1min，9min内10-80%B，1min内80-100%B，100%B1min，保留时间6.9min。'H丽R(400MHz，CDC13):S1.34(s，12H)，1.37(s，12H)，1.56(t，2H)，1.62(bs，3H)，2.32(t，2H)，2.46(t，2H)，2.86(t,2H)，2.91(q，2H)，4.03(s,2H)，4.29(s，2H),4.44(s，2H)，4.58(s，2H)，5.00(t，1H)，5.10(s，1H)，5,44(bt，1H)，7.24(m，1H)，7.40-7.46(m，5H)，7.53(d,1H),7.60(d，1H)，7.74(d，1H)，7.84(m，2H)，7.96(d，1H)，8.24-8.34(m，2H)。ESI-MS(TFA/乙腈/水)752.23(M-H20)+，对于双硼酸。在该分析的酸性条件下未观察到硼酸酯。6权利要求1.一种在氧化性条件下使用分子的方法，所述方法包括a)得到具有芳基硼酸残基的分子，所述残基在含有硼酸残基的芳香族部分上具有一种或多种吸电子基，使得与没有一种或多种吸电子基的相应分子相比，所述分子具有增强的耐氧化性；和b)使所述具有一种或多种吸电子基的分子经历氧化性条件。2.如权利要求l所述的方法，其中所述吸电子基包括选自以下的一种或多种卤素、氰基、硝基、卤素取代的垸基、羧酸、酯、磺酸、酮、醛、磺酰胺、砜、磺酰基、亚砜、卤素取代的砜、卤素取代的烷氧基、卤素取代的酮、酰胺或它们的组合。3.如权利要求1所述的方法，其中所述在芳香族部分上具有一种或多种吸电子基的分子还包含可检测基团。4.如权利要求3所述的方法，其中所述可检测基团包括蒽残基。5.如权利要求1所述的方法，其中所述在芳香族部分上具有一种或多种吸电子基的分子与植入哺乳动物中的装置相关联。6.如权利要求5所述的方法，其中所述装置在体内测定葡萄糖的存在或浓度。7.如权利要求1所述的方法，其中所述在芳香族部分上具有一种或多种吸电子基的分子包括9_[N-[6-(4,4，5，5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基)苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4,4，5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基)节基]-N-[2-羧基乙基腐基]甲基]蒽(4c);9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-l0-[N-[6-(4,4，5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽(21);9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2,4-双(三氟甲基)苄基]-1^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4，4，5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-2,4-双(三氟甲基)苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]-甲基]蒽(27a);或其残基或盐。8.—种在氧化性环境中检测样品中的分析物的存在或浓度的方法，所述方法包括a)使样品接触具有可检测性质的指示剂分子，所述可检测性质在所述指示剂分子接触分析物时变化，其中所述指示剂分子包括芳基硼酸残基，所述残基在含有硼酸残基的芳香族部分上具有一种或多种吸电子基，使得与没有一种或多种吸电子基的相应分子相比，所述指示剂分子具有增强的耐氧化性；和b)测量所述可检测性质的任何变化，从而测定所述样品中所述分析物的存在或浓度。9.如权利要求8所述的方法，其中所述吸电子基包括选自以下的一种或多种卤素、氰基、硝基、卤素取代的烷基、羧酸、酯、磺酸、酮、醛、磺酰胺、砜、磺酰基、亚砜、卤素取代的砜、卤素取代的烷氧基、卤素取代的酮、酰胺或它们的组合。10.如权利要求8所述的方法，其中所述可检测性质变化是光学变化。11.如权利要求8所述的方法，其中所述分析物是葡萄糖。12.如权利要求8所述的方法，其中所述在芳香族部分上具有一种或多种吸电子基的分子包括9-[N-[6-(4，4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基)苄基]_^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[1^[6-(4,4，5,5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基)苄基]-N-[2-羧基乙基)氨基]甲基]蒽(4c);9-[N-[6-(4，4,5,5-四甲基-l，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]_N_[3_(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]_10-[N-[6-(4,4，5，5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基磺酰基)节基]-N-[2-(羧乙基)氨基]甲基]蒽(21);9一[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l，3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2，4-双(三氟甲基)苄基]^-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-|^-[6-(4,4，5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2，4-双(三氟甲基)苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]-甲基]蒽(27a);或其残基或盐。13.—种具有以下结构的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中-每一个Ar是芳基基团；-每一个R}和R2相同或不同并且是吸电子基；-m和n每一个独立地是110的整数；-R4是可检测部分；和-每一个R独立地是具有0~10个相邻或枝化的碳原子和/或杂原子的连接基团，至少一个R还含有聚合性单体单元；和其中与没有一种或多种吸电子基的相应化合物相比，所述化合物具有增强的耐氧化性。14.如权利要求13所述的化合物，其中R,和R2每一个选自包括以下的一种或多种卤素、氰基、硝基、卤素取代的垸基、羧酸、酯、磺酸、酮、醛、磺酰胺、砜、磺酰基、亚砜、卤素取代的砜、卤素取代的烷氧基、卤素取代的酮、酰胺或它们的组合。15.如权利要求13所述的化合物，其中R4包括蒽残基。16.如权利要求13所述的化合物，其中所述化合物包括9-[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基)苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[>1-[6-(4，4,5,5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷萄-3-(三氟甲基)节基]-N-[2-羧基乙基)氨蜀甲基]蒽(4c);9-[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-l,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-l0-[N-[6-(4，4，5,5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]-1^-[2-(羧乙萄氨基]甲基]蒽(21);9-[N—[6-(4,4，5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2，4-双(三氟甲基)苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-|^-[6-(4,4，5，5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-2,4-双(三氟甲基)苄基]-N-[2-(羧乙基)氨基]-甲基]蒽(27a);或其残基或盐。17.—种具有以下结构的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中-每一个Ar是除苯基之外的芳基基团;-每一个R,和R2相同或不同并且是吸电子基；-m和n每一个独立地是110的整数；-R4是可检测部分；和-每一个R独立地是具有0~10个相邻或枝化的碳原子和/或杂原子的连接基团，至少一个R包含能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团；和其中与没有一种或多种吸电子基的相应化合物相比，所述化合物具有增强的耐氧化性。18.如权利要求17所述的化合物，其中Ri和R2每一个包括以下的一种或多种卤素、氰基、硝基、卤素取代的烷基、羧酸、酯、磺酸、酮、醛、磺酰胺、砜、磺酰基、亚砜、卤素取代的砜、卤素取代的烷氧基、卤素取代的酮、酰胺或它们的组合。19.如权利要求17所述的化合物，其中R4包括蒽残基。20.—种制备用于在氧化性环境中检测分析物的存在或浓度的指示剂大分子的方法，所述方法包括将a)—种或多种指示剂组分单体，各自单体的水溶性不足以允许其在用于检测所述分析物的存在或浓度的水性环境中使用，其中所述指示剂组分单体包括具有以下结构的化合物其中-每一个Ar是芳基基团；-每一个R,和R2相同或不同并且是吸电子基;-m和n每一个独立地是1~10的整数；-R4是可检测部分；和-每一个R独立地是具有0~10个相邻或枝化的碳原子和/或杂原子的连接基团，至少一个R还含有聚合性单体单元；和b)—种或多种亲水性单体进行共聚；使得生成的大分子能够在水性环境中检测所述分析物的存在或浓度，并且与没有一种或多种吸电子基的相应化合物相比，其中所述化合物具有增强的耐氧化性。21.如权利要求20所述的方法，其中R,和R2每一个包括以下的一种或多种卤素、氰基、硝基、卤素取代的烷基、羧酸、酉旨、磺酸、酮、醛、磺酰胺、砜、磺酰基、亚砜、卤素取代的砜、卤素取代的烷氧基、卤素取代的酮、酰胺或它们的组合。22.如权利要求20所述的方法，其中R4包括蒽残基。23.如权利要求20所述的方法，其中所述化合物包括9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼垸基)-3-(三氟甲基)苄基]-^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4,4，5，5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基)苄基]-N-[2-羧基乙基)氨基]甲基]蒽(4c);9_[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄基]_N-[3_(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[6-(4,4,5，5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷基)-3-(三氟甲基磺酰基)苄萄-:^-[2-(羧乙基)氨蜀甲基]蒽(21);9-[N-[6-(4,4,5,5-四甲基-l,3,2-二氧杂环戊硼垸基)-2,4-双(三氟甲基)苄基]_^[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[^[6-(4,4，5，5-四甲基-1,3，2-二氧杂环戊硼垸基)-2，4-双(三氟甲基)节基]-N-[2-(羧乙基)氨基]-甲基]蒽(27a);或其残基或盐。24.—种具有以下结构的化合物:其中-Ar是芳基基团；-每一个R,相同或不同并且是吸电子基；-n是l10的整数；和-R是具有0~10个相邻或枝化的碳原子和/或杂原子的连接基团，所述连接基团还含有聚合性单体单元和可检测部分；和其中与没有吸电子基的相应化合物相比，所述化合物具有增强的耐氧化性。25.如权利要求24所述的化合物，其中Ri包括以下的一种或多种卤素、氰基、硝基、卤素取代的垸基、羧酸、酉旨、磺酸、酮、醛、磺酰胺、砜、磺酰基、亚砜、卤素取代的砜、卤素取代的烷氧基、卤素取代的酮、酰胺或它们的组合。26.如权利要求24所述的化合物，其中所述可检测部分包括蒽残基。27.—种具有以下结构的化合物射-Ar是芳基基团；-每一个&相同或不同并且是吸电子基;-n是l10的整数；和-R是针对色谱载体的连接基团，所述连接基团具有010个相邻或枝化的碳原子和/或杂原子；禾口其中与没有吸电子基的相应化合物相比，所述化合物具有增强的耐氧化性。28.如权利要求27所述的化合物，其中R,包括以下的一种或多种卤素、氰基、硝基、卤素取代的垸基、羧酸、酯、磺酸、酮、醛、磺酰胺、砜、磺酰基、亚砜、卤素取代的砜、卤素取代的烷氧基、卤素取代的酮、酰胺或它们的组合。全文摘要本发明公开了一种具有增强的氧化稳定性的化合物。所述化合物具有芳基硼酸残基，其中所述残基在含有硼酸残基的芳香族部分上具有一种或多种吸电子基，使得与没有一种或多种吸电子基的相应分子相比，所述分子具有增强的耐氧化性。所述化合物优选是用于测定葡萄糖的存在或浓度的蒽基指示剂化合物。文档编号C07F5/02GK101541813SQ200780044236公开日2009年9月23日申请日期2007年11月30日优先权日2006年11月30日发明者A·E·科尔文,A·莫泽来夫斯卡,M·A·莫尔泰拉罗申请人:医药及科学传感器公司