专利名称：结合hsp90的小分子组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合HSP90蛋白质家族的小分子，以及制备和使用这种小分子的方法。
背景技术：
已识别了哺乳动物细胞中HSP90蛋白质家族的4个成员Hsp90α和β，Grp94和Trap-1。Hsp90α和β与许多其他蛋白质结合存在于细胞溶质和核中。Hsp90是最丰富的细胞伴侣分子，在实验系统中已表明它为变性或“未折叠”蛋白质的ATP依赖性重折叠所需。因此已提出其作为抗应激细胞防御的一部分而发挥功能。当细胞受到热或其它环境应力的影响时，通过催化重折叠或降解途径防止了未折叠蛋白质的凝聚。此过程取决于未折叠蛋白质与多个伴侣分子(Hsp60，90和70和p23)以有序形式结合，形成“重折叠体”(“refoldosome”)，和最终伴侣分子从重折叠蛋白质中的ATP依赖性释放。
Hsp90在维持突变蛋白质的稳定性和功能中也起作用。要求表达突变的p53和V-Src的程度似乎比它们的野生型对应物要大得多。已提出此情况的发生是由于导致蛋白质去折叠的突变表型受到hsp90介导的抑制。
Hsp90也是几种参白与细胞对胞外因子的生长反应的关键蛋白质构象成熟所必需。
这些蛋白质包括类固醇受体以及某些跨膜激酶(即Raf丝氨酸激酶、V-Src和Her2)。hsp90影响这些蛋白质的机理没有完全了解，但似乎与其在蛋白质重折叠中的作用类似。就孕酮受体而言，已表明hsp90以环状形式结合受体和从受体中释放，与其它伴侣分子和亲免素的释放相协同，为类固醇与受体的高亲和力结合所需。因此，hsp90的功能可能是信号传递途径的一种生理调节剂，甚至在没有应激时也如此。
也已显示Hsp90在多种肿瘤类型有过度表达，并起致癌性转化作用。不知道它是否在维持转化中起着必需的作用，但在这方面它至少有三种功能。癌细胞能在缺氧、低PH和低营养浓度的环境中生长。它们还能迅速地适应或者经过选择变成对放射和细胞毒化疗剂产生抗性。因此，在应激下Hsp90维持蛋白质稳定性的一般作用是这些条件下细胞生存所必需的。第二，癌细胞具有突变的致癌蛋白质，其中某些是转化表型所必须的功能突变。hsp90可能是维持这些蛋白质的折叠、功能活性构象所需要的。第三，由类固醇受体、Raf和其它hsp90靶标介导的信号传递途径的激活，是许多肿瘤生长和存活所必需的，它们或许也需要功能性的hsp90。
hsp90的这些特征使它成为治疗剂开发的一个可行目标。HSP90家族成员在其N-末端区域具有一个独特的袋，在从细菌到哺乳动物所有的hsp90，此袋是特异的和保守的，但不存在于其它分子的伴侣分子中。此袋的内源性配体未知，但它以低亲和力结合ATP和ADP，且有弱的ATP酶活性。此外，安莎霉素(ansamycin)抗生素、格尔德霉素(geldnamycinGM)和除莠霉素(herbimycin HA)已显示能与此保守袋相结合。所有的HSP90家族成员都显示这种结合亲和力。本文纳入国际专利出版物No.WO98/51702作为参考，其公开了交联于一靶向部位的安莎霉素的用途，以提供安莎霉素的靶向传递导致蛋白质降解和靶细胞死亡。国际专利出版物No.WO00/61578涉及具有与伴侣分子蛋白hsp90相互作用的两个部分的双功能分子，尤其包括安莎霉素的同源二聚体和异源二聚体。这些双功能分子起促进降解和/或抑制HER-家族酪氨酸激酶的作用，且治疗过度表达Her-激酶的癌症有效。
虽然证明使用格尔德霉素和安莎霉素抗生素及其衍生物能有效降解许多激酶和其它信号传递蛋白，但它们通常缺乏显著的选择性，而是能有效地降解广谱蛋白质。这可能增加不良付作用的风险，而且，安莎霉素抗生素是不溶性的或者最好也不过在水性介质中溶解差。这使给药变得复杂化。因此，对通过与伴侣分子蛋白质Hsp90家族成员相互作用，导致激酶和其它信号传递蛋白的降解的治疗剂仍有改进的余地。
发明综述尽管HSP90蛋白质家族成员的特征在于独特的N-末端结合袋是高度保守的，但各种成员的袋之间有结构差异。现已发现可利用这些结构差异，通过使用设计的小分子获得对激酶和其它信号传递蛋白的差异性降解，这些小分子与N-末端结合袋相互作用的亲和力大于ADP，且不同于安莎霉素抗生素。此外，可以设计这些小分子溶于水性介质中，从而提供超过使用安莎霉素抗生素的又一个优点。
HSP90蛋白质家族的N-末端袋含有5个潜在的结合位点。就hsp90α而言，这些结合位点是a)顶部结合位点含有Lys112；b)第二个顶部结合位点含有Lys58，Asp54，phe138主链，Gly135和Asn106；c)底部结合位点含有Asp93，Ser52和Asn51；d)疏水性侧向结合位点含有Val150，Met98，Val186，Phe138，Leu107，Leu103，Val186和Trp162；和e)小的疏水性底部结合位点含有Thr184、Val186、Val150和Ile91。
本发明提供的药物组合物含有药学上可接受的载体和含有结合部分的分子，它与Hsp90蛋白质家族的至少一个成员的N-末端袋结合。对于HSP90家族中的至少一种特定蛋白质而言，此结合部分与N-末端袋相互作用，亲和力大于ADP，但低于格尔德霉素。结合部分有一骨架，当将其安排在HSP90蛋白质家族成员的N-末端袋内时，可获得折叠的C-构型。此结合部分在骨架上还有取代基，其朝向能与N-末端袋内的多个潜在结合位点相互作用。
发现本发明的结合部分对肿瘤细胞具有抗增殖活性，这依赖于其功能需要HSP90家族伴侣分子的蛋白质。然而，不同的化学物质有不同的活性，例如可选择降解Her2，而不降解Raf激酶的化合物。因此，本发明的结合部分具有固有的靶向能力。此外，可将这些小分子连接于靶向分子以将其活性导向特别类型的细胞。因此，本发明还提供给予这些组合物治疗疾病(包括癌症)的方法。也可采用这种结合部分的二聚体形式。
附图简要说明
图1显示对已知的HSP90伴侣分子蛋白家族成员Hsp90α(Seq.ID.No.1)，GRP94(Seq.ID.No.2)，Hsp90β(Seq.ID.No.3)和Trap1(Seq.ID.No.4)中N末端结合袋有贡献的氨基酸序列。
图2显示具有本发明袋的结合部分的三维图。
图3A和B显示通过制作分子模型测定的hsp90袋内部PU3构象及通过X光晶体图测定的袋外部PU3构象。
图4显示基于嘌呤核的示范性结合部分/化合物，表明各种取代基与HSP90家族成员的N-末端袋中结合位点的相互作用。
图5显示本发明化合物的结构。
图6A显示制备本发明化合物的合成步骤。
图6B显示本发明的示范性9-N烷化化合物。
图7A显示在X3部位引入与小的疏水结合位点相互作用的功能基团的合成图。
图7B显示在X3部位引入与小的疏水结合位点相互作用的功能基团的第二个合成图。
图8A和图8B显示在X2位点上引入变异的合成图。
图9显示产生本发明结合部分的合成图。
图10显示在PU家族化合物嘌呤和苯基之间的桥长度和特性中引入变异的合成图。
图11显示靶向部分的二聚化或加入。
图12显示评估结合部分的比较亲和性的图解方法。
图13显示PU1-PU4的特殊结构。
图14A-图14C显示PU3对乳腺癌细胞系的抗增殖作用。
图15显示在一个实施例中测试化合物的×1取代基。
图16A和图16B显示修饰PU3的方法和利用生物素化进行固定。
图17A和图17B显示用PU3和PU24FCl降解Akt蛋白；图18A和图18B显示生长停滞、Her2总蛋白降解和Hsp90结合效力之间的相关性；
图19显示用PU24FCl降解Her2。
发明详述本发明涉及优先与HSP90蛋白质家族的一个或多个成员(例如1个或多个hsp90α或β，Grp94和Trap-1)的N-末端袋结合或与具有类似袋的蛋质(如DNA回旋酶和MutL)结合、亲和力大于ADP，小于格尔德霉素的小分子。如本说明书和本申请的权利要求中所使用的那样，术语“HSP90的N-末端袋”指与格尔德霉素和其它安莎霉素抗生素结合，且被ATP/ADP占据的袋。
图1显示比较HSP90蛋白质家族各已知成员结构的序列对比，就hsp90α而言，5个潜在结合位点是a)顶部结合位点含有Lys112；b)第二个顶部结合位点含有Lys58、Asp54、phe138主链、Gly135和Asn106；c)底部结合位点含有Asp93、Ser52和Asn51；d)疏水性侧向结构位点含有Val150、Met98、Val186、Phe138、Leu107、Leu103、Val186和Trp162；和e)小的疏水性底部结合位点含有Thr184、Val186、Val150和Ile91。
如图1所示，尽管N-末端袋在HSP90蛋白质家族中高度保守，但各个成员之间有差异。本发明的结合部分利用这些差异以提供能差异性降解激酶和其它信号传递蛋白的组合物。如本说明书和本申请的权利要求中所使用的那样，术语“差异性降解”指一种激酶或信号传递蛋白的降解程度大于另一种激酶或信号传递蛋白，两者在格尔备霉素存在下均被降解，或者指激酶或信号传递蛋白降解形成的产物不同于格尔德霉素存在时获得的产物。
Stebbins等在“Hsp90-格尔德霉素复合物的晶体结构受抗肿瘤制剂所靶向的一种蛋白质伴侣分子”，Cell 89239-250(1 997)中描述了N-末端结合袋的大小和形状。观察到此袋可以被描述为一种平底的锥体；它约深15，直径12靠近其表面中间向下8，底部的宽度足以容纳3个水分子。将本发明的药物组合物中的结合部分设计成装在此袋内，且能与N-末端袋内的多个潜在结合位点相互作用。
图2显示具有图4所示类型结合部分的此袋的三维图，有助于想象分子设计过程。图3A和图3B显示基于hsp90袋内的嘌呤核(PU3)，如用X光晶体学图测定的那样，分别显示袋内和没有袋的设计的结合部分的构象。袋的开口部10安排在靠近图的底部。袋本身有4个臂，臂11最靠近开口部10，且包括底部结合位点。如图4所示，此臂的内部与嘌呤核的氨基取代基相互作用。
第二个臂13以约95-110°角与第一个臂连接。第三个臂12以约100-120°角与第一个臂11连接。这两个臂含有两个结合位点，在自然界中通常是亲水的。取代基X2(图4)装在此两个臂的一个臂内，结果使此结合部位弯曲成特有的C形。在选择起结合部分作用的分子时必须考虑采纳此C-形的能力。
如图2所示，臂11和13(9.5-11)之间的分隔大于臂11和12(8-9)之间的分隔。因此，选择较长的取代基(X2)有利于越过臂12将分子插入臂13中。第四个臂14含有侧向疏水性袋，接受取代基X3(图4)。此袋体积为≈1003，且性质一般是疏水的。因此，选择取代基X1(图4)装在此袋中，且与疏水性残基相互作用。
在本发明的第一个实施例中，此结合部分是一个完整的分子，图4显示基于嘌呤核的此类型分子的示范性结构，表明N-末端结合袋内取代基和结合位点之间的相互作用。在图4中，取代基X1可以是任何疏水链(直链，分支脂肪族、芳香族、无环或环链，含有C、H、N、O和/或S原子装在袋内)；X2是1到5氢接纳体官能度，例如OR、OCOR、NCOR等装在袋内，可任选地加上能增强这些基团(如卤素)的供电子基团，×3是装在袋内的小取代基，例如氟基团。在本发明的实施例中，本发明的分子和格尔德霉素及衍生物之间的结构差异是这些结合部分和疏水性侧向结合位点及小的疏水结合位点之间的相互作用。如Stebbins等观察到的那样，这些位点位于袋的底部，格尔德霉素没有装满这些部分。而是格尔德霉素的甲基仅部分地延伸到侧向袋中，在袋的底部为水分子留有空间。相反，在本发明的组合物中，可以选择取代基来至少充填袋中的疏水侧向结合位点。如本申请所使用的那样，术语“装满”指在一定程度上占据一个结合位点以致没有余留空间容纳一个水分子。
本发明范围内的结合部分的其他实施例，就图5所示的HSP90家族的至少一个成员而言，将其设计成装在HSP90蛋白质的N-末端袋内，与此袋相互作用，亲和力介于ADP和格尔德霉素之间。在这些组合物中，X1是疏水链(直链的、分支脂肪族、芳香族、无环或环链，含有C、H、N、O和/或S原子首先装在袋内)；或者COR，其中R是疏水链；X2是1到5氢接纳体/供体官能度，可以相同或不同；X3是小体积基团，如烷基(饱和、非饱和、环状或直链)，烷氧基(如甲氧基或乙氧基)，卤素SR(其中R是甲基或乙基)； X4是H或像X3；X5是H或像X1；X6是-NH2、-OR(R是H或烷基)，或者-CONH2或类似的氢供体官能度和R1是H或烷基。这些分子都能折叠成C形构型且能与至少3个潜在的结合位点(包括疏水性侧向位点)相互作用。应懂得可以同样的方法设计具有不同核，但有相当的总体积(～200-5003)和尺寸的其他化合物，这属于本发明的范围内。
可以使用图6A列出的步骤合成具有图5中PU家族所示结构的组合物。通过与吡啶/DCM中的氰尿氟化物反应将羧酸起始料材转化为酸性氟化物或者通过与SOCl2反应转化为酸性氯化物。此酸性卤化物与氨基取代的嘧啶(如DIEA/DMF中的4，5，6-三氨基嘧啶硫酸盐或含水NaOH中的2，4，5，6-四氨基嘧啶硫酸盐或DMF中的含有K2CO3的硫酸盐)反应产生中间产物(图1中的PY-A、PY-B和PY-C)，经历环闭合产生取代的8-苄基嘌呤衍生物(PU-A、PU-B和PU-C)，它们是本发明的有用组合物。如果需要的话，可进行烷化反应(如Mitsonobu烷化)在9位氮加入烷基R(具有或没有功能性取代基)。图6B中显示通过PU家族前体PU-C的9-N烷化制备的示范性化合物。
图7A和图7B显示在×3部位引入功能基团以便与小的疏水结合位点相互作用的合成图，图8A和图8B显示在×2位点引入变异的合成图。
图9显示合成图5RD类化合物的合成图。采用相当的合成方法可制备图5所示的其它类化合物。
可直接应用本发明组合物为治疗癌症和其它疾病提供治疗效益。如以下实施例所述，本发明的组合物已显示能诱导SKBr3、MCF-7和BT474乳腺癌细胞中Her2激酶的降解。此外，本发明的组合物已显示能有效引起RB-阳性SKBr3和MCF-7乳腺癌细胞系发生G1停滞，且对这些细胞系和BT474、MDA-MB468和前列腺癌细胞系TSUPr及LNCaP有抗增殖作用。
测试了PU家族化合物对Hsp90的结合，Her2总蛋白的降解和它们的抗增殖作用。表1概括了9-N链对此作用的影响。此表中未列出的PU家族的化合物(图6)不是无活性就是不溶性的。
采用图7B的反应方案加入氟基团作为取代基X3(C-2氟化)来修饰PU家族化合物。结果小结于表2中。
如所示那样，引入氟取代基增加了具有共同×1基团的组合物的活性，且提高了具有×1取代基的组合物的活性/溶解性，在表1中未报道此活性。
当采用图8B所示的反应图将额外的卤素取代基加到苯环中时，还观察到活性的变化。如表3所示，在一个部位引入卤化物但并非两个部位都没有被PU3的甲氧基占据导致了与PU3有关的活性的增加。
制备具有化合物PU3PhCl中那样的氯取代基和PU24F或PU29F中那样的氟取代基的化合物。如表4所示，这些化合物是迄今所测试的最有活性的化合物。
PU分子家族中潜在变异的另一部位是嘌呤和苯基之间的桥长度和特性。图10显示获得这种变异的合成图。测试了化合物69，发现其对hsp90-β具有弱的结合，对hsp90-α没有可检测的结合。观察到对化合物18这种结合选择性发生逆转。这在这两种蛋白质之间提供了选择性。
作为单个使用本发明化合物的另一方法，通过偶联于所选靶向部分与靶细胞群上发现的蛋白质、受体或标记物特异性结合，或可以二聚化，来衍生偶联的组合物，该组合物中hsp-结合核如图5的一般结构所示(见图11)。靶向分子可以是激素、激素类似物、蛋白质受体或标记物特异性抗体或能与感兴趣的靶特异性结合的其它配体。能与类固醇受体结合的特异性靶向分子，包括雌激素、雄激素和孕酮受体及跨膜酪氨酸激酶、Src相关的酪氨酸激酶、raf激酶和PI-3激酶。
特异性酪氨酸激酶包括HER-2受体和表皮生长因子(EGF)受体家族的其它成员，和胰岛素及胰岛素样生长因子受体。特异性靶向分子的例子包括雌激素、雌二醇、孕酮、睾酮、三苯氧胺和渥曼青霉素。靶向分子还可以是与受体特异地结合的抗体，例如国际专利出版物WO96/32480、WO96/40789和WO97/04801披露的与Her2受体结合的抗体，本文已纳入作为参考。
由于它们引起细胞功能所必需的蛋白质降解，因此延迟生长和/或促使细胞死亡的能力，具有或没有靶向部分的本发明的hsp结合化合物可用于治疗各种疾病状况。合适的治疗剂是能降解疾病相关细胞中数量增加或发生突变或细胞活力所依赖的激酶或蛋白质的制剂。HSP90蛋白质维持大多数癌细胞恶性的总体作用，指出这个靶子对开发抗癌制剂的重要性。因此，本发明的治疗性小分子为需要HSP90蛋白质或其促进的所有癌症的治疗提供了一种新的方式。例如，本发明的组合物可用于治疗各种形式的癌症，尤其是那些过度表达Her2或突变的或野生型类固醇受体或缺乏功能性RB蛋白的癌症。这种癌症可包括，但不限于乳腺癌和前列腺癌。此外，本发明的组合物可通过选择性降解与发病机制有关的靶蛋白用于治疗其它疾病。这种可作为靶子的蛋白的例子包括自身免疫疾病相关抗原和老年性痴呆相关致病蛋白质。
本发明的组合物适合用来降解与疾病状态或与病况有关的特异性蛋白质。因为可选择本发明的组合物来降解特异性激酶或信号传递蛋白，所以合适的治疗剂是能降解患病细胞中数量增加的激酶或蛋白质的制剂。因此，例如选择能降解Her2激酶而不是其它HER激酶或Raf激酶的结合分子，可能适合治疗Her2阳性乳腺癌。以下的例子根据体外观察到的特异性，对选择特异性化合物提供了指导。此外，以下描述的筛选技术有利于评价这些结构的结合亲和力和差异性降解。
对受试者(包括人患者)在需要治疗时给予有效量的本发明组合物以产生所需治疗结果。合适的给药途径是静脉内给药，这是目前在化学治疗中通常采用的。此外，因为本发明的组合物是可溶性小分子，所以它们适合口服。采用口服给药途径的能力尤为需要，它是提供经常性治疗，例如每日日程表所必需的。任何给定组合物的给药量和合适的给药计划可采用毒性试验和标准设计的临床试验确定，并且将代表风险利益分析得到的结论。这种分析是本领域熟练技术人员常规进行的，并且不包括过度的实验。
作为用作本发明结合分子的分子设计的替换物或附属物，我们开发了一种快速筛选试验可用来测试化合物与HSP90的N-末端袋的结合亲和力，或测试蛋白质是否存在HSP90型袋。如图12小结的那样，用N-氧琥珀酰亚胺基官能度将固体底物的表面(例如96孔微量滴定板的底部)功能化。这些异丙醇与氨基功能化的GM(或其它安莎霉素抗生素)反应，可用345nm分光光度吸收率测量来估计GM与孔结合的量。当结合的GM与兔网织红细胞裂解物温育时，用比色法检测到足够多的hsp90被捕获了，虽然更特异的检测方法是优选的，例如，采用标记的抗HRP抗体可检测到结合的hsp90。为了测定HSP90结合效力，将测试化合物加入含有兔网织红细胞裂解物(或其它hsp90来源)的孔中，注意捕获的hsp量的任何差异。如果测试化合物用比GM大的亲和力结合hsp，那么它将与固定的GM竞争，导致捕获的hsp90量减少。通过改变该试验中所用的HSP90成员，这些相同的板可用来评估测试化合物特异性的差异。这些板还可用来筛选蛋白质/肽文库中具有Hsp90类型结合袋的蛋白质。
还设计了一种试验以鉴别定能与Hsp90-α和Hsp90-β差异性相互作用的化合物。在此试验中，当必要时可修饰格尔德霉素(或其它强的非区别性hsp90结合物，如其它安莎霉素抗生素或根赤壳菌素)，将其固定到固相载体上，例如珠上。在待评估化合物存或不存在时，将含有α和β形式的Hsp90蛋白质制剂与载体一起温育。如果此化合物结合Hsp90蛋白质，那么它竞争性抑制Hsp90蛋白质与固相载体的结合。洗涤后，洗脱与载体结合的物质，在SDS/PAGE凝胶上分离洗脱液，并用抗Hsp90-α和抗Hsp90-β抗体作免疫印染显色以测定物质结合的量。或者，如果在第一例中使用定量的Hsp90蛋白质制剂或者已知Hsp90的α对β的比例，可以用类似技术分析未结合的物质。
还可采用Stockwell等基于细胞的试验方法(Chem Biol.671-83，1999)在一组癌细胞系中，评估本发明候选化合物消耗或诱导癌细胞中数量增加或癌细胞活性所依赖的(如Her2、Her3、Ref-1、ER、Rb、cdk-4、Hsp90、Trap-1和Grp94)蛋白质的能力。在此试验中，细胞在孔的底部生长，并固定。采用特异性第一抗体溶液检测固定的细胞是否存在特异性第一抗原(致癌蛋白质)。加入与辣根过氧化物酶共价连接的第二抗体，通过加入鲁米诺、过氧化氢和增强剂(如对位-碘酚)引起化学发光反应检测生成的复合物。在药物存在时，测到发光水平有差异表明该药物具有降解或诱导靶蛋白的活性。
也可以观察细胞形态非常特征性的变化来测定药物。MCF-7细胞接触PU3后变得更平，大小增加，且具有性质不同的细胞边界。大小的增加大多数是由于胞质丰富的缘故。这些形态学变化是成熟的上皮分化和转化逆转的特征。
作为第三种可采用的方法，免疫荧光(IF)以及苏木精和伊红染色(H&E)可用来评估药物的效果。接种细胞于8孔室载玻片(Fisher Scientific)上，接种24小时。加入药物或载体5天后，对于IF染色，用冰冷PBS洗涤载玻片两次，用甲醇和丙酮溶液(1∶1)固定15秒。用蒸馏水洗涤固定的单层，并用含5％BSA的PBS溶液封闭。封闭后，细胞与第一抗体(抗MFMG，Chemicon，以含5％BSA的PBS作1∶100稀释)37℃温育，用含1％BSA的PBS洗涤三次，接着与罗丹明标记的第二抗体37℃温育1小时。细胞核用1mg/ml的DAPI染色。对于H&E染色，用多聚甲醛(4％)固定细胞室温10分钟，并按照标准的H&E染色方法染色。由于各种操作导致G1停滞足以诱导一些乳状蛋白的表达。但是，只有安莎霉素、HDAC抑制剂SAHA和hsp90结合分子引起广泛的形态学和生物学变化。
就本发明的治疗方法而言，本发明的组合物以药学上可接受的载体配制。对于可注射的剂型，可以是无菌溶液(例如无菌盐水)或者可将化合物配制在一种脂质性载体中。对于口服剂型，本发明的组合物可以简便的剂量单位形式包装，例如具有合适赋形剂的片剂或胶囊，或者一种液体剂型。在后一例子中，液体药物将适当包括增强适口性的调味剂，也可包括着色剂和其它方便的添加剂。
实施例1根据图6A所示的图合成了具有通式1的组合物。为了产生酸性氟化物，在15mlCH2Cl2的苯乙酸衍生物(3mmol)溶液中加入1.5当量的氰尿酰氟和吡啶(3mmol)。室温搅拌混合物1.5小时后，加入多于30ml的CH2Cl2。生成的溶液用0.5ml水洗涤一次，将除去溶剂产生的粗酸性氟化物用于下一步。
采用酸性氟化物产生PY-A、PY-B和PY-C衍生物的步骤如下在1.5ml DMF中加入675mg(2.8mmol)的4，5，6-三氨基嘧啶硫酸盐、1.5ml(9mmol)的DIEA，将酸性氟化物(如上所述得到)溶解于5ml CH2Cl2和催化量的DMAP(0.28mmol)中。在氩气下搅拌反应混合物1小时。滤去形成的固体，将滤液浓缩到干燥。在残余物中加入10ml EtOAc，用EtOAc和CH2Cl2洗涤形成的沉淀物数次，得到产量60-80％的微黄色物质。此物质用于下一步，如果需要较高纯度，可采用EtOAc∶MeOH＝7∶1(1％TEA)进行急聚层析。
从PY化合物产生PU-A、PU-B和PU-c衍生物的步骤如下在13ml的25％NaOMe溶液中加入13ml MeOH含500mg(1.5mmol)的5-酰化-4，5，6-吡啶，生成的溶液回流5小时。冷却后，加入5ml水，溶液浓缩到5ml。生成的水溶液用4×10mlTHF和2×10ml EtOAc提取。用MgSO4干燥合并的有机层；浓缩到干燥，得到产量80-90％的微黄色固体。如果需要较高纯度，可将生成的产物加到硅胶柱上，用CH2Cl2∶EtOAc∶MeOH＝4∶4∶1洗脱。
采用Mitsunobu烷化将取代基加到9-N位的步骤如下在含0.16mmol嘌呤衍生物的5ml甲苯和1ml CH2Cl2中加入2.2当量的pph3和1.3当量的ROH继之以5当量的DEAD。用TLC监测反应，进行15分钟到1小时。将混合物加到ISCO Combi Flash系统(硅胶柱)，用梯度CH2Cl2/丙酮洗脱得到30-75％分离的产物。采用图6所示40种非分支、分支、直链和环状、饱和和不饱和的初级和次级醇进行此步骤。在这些合成中，发现只有两种醇新戊基醇和环己醇在此反应中未得到产物。
在最初试验中使用了4种化合物(PU-A-4、PU-B-4、PU-C-4和PU-C-15)。为方便起见，如图13所示，这4种结构分别称为PU1、PU2、PU3和PU4。
实施例2从美国典型培养物保藏所(Manassas，VA)获得人癌细胞系MCF-7、SkBr3和MDA-MB-468，并维持在补充有2mM谷氨酰胺、50单位/ml青霉素、50单位/ml链霉素和5％(用于MCF-7和MDA-MB-468)或10％(用于SkBr3)热灭活胎牛血清(Gemini Bioproducts)的DME∶F12(1∶1)混合液中，在5％CO2中37℃培育。
就蛋白质水平的试验而言，使生长到60-70铺满的细胞在指明的时间接触药物或DMSO载体。采用BCA试剂盒(Pierce Chemical Co.)，按照厂商说明测定蛋白质浓度。在变性SDS-PAGE上，电泳分辨澄清的蛋白质裂解物(20-50mg)，转移到硝酸纤维素，并用以下第一抗体检测抗-Her2(C-18)、-Her3(C-17)、-Raf-1、-细胞周期蛋白D1、-Rb(C-15)(SantaCruz)、抗-hsp90、-hsp70、ER(Stressgen)、抗-Trap-1(MSK81)、抗-b-肌动蛋白、-微管蛋白(Sigma)、抗-P13k(p85)(Usptate Biotechnologies)。
为了测定抗增殖指数，在药物处理前，于6孔平皿中每孔接种10,000个细胞培育24小时进行生长试验。如每次实验草拟的那样给予药物或载体，培育细胞至所述时间，然后用Coulter计数器计数。
按照Nusse等方法采用Becton Dickinson荧光激活细胞分选仪测定了细胞周期分布，并用细胞周期多循环系统(Phoenix Flow System，SanDiego，CA)分析。
实验1用不同浓度(0、10、50、100或250μM)的PU3或对照嘌呤Ad-But处理MCF-7细胞24小时，然后裂解。用Western印染法评价Hsp90、Trap1和Hsp70的水平。结果表明像GM那样，PU3增加了Hsp90和Hsp70的细胞水平。用PU3处理细胞还诱生一个迁移比Trap-1更迅速的蛋白带，该蛋白带可被抗-Trap-1抗体识别。虽然，此蛋白带的身份未知，但其表观似乎是细胞接触Hsp90抑制剂的一种标志。在相同浓度Ad-But对所研究的蛋白质水平无影响。
实验2用几种PU3浓度之一或DMSO对照处理MCF-7、SKBr3和MDA-MB-468细胞的细胞培养物，以测试抗增殖作用的发生率。图14A-图14C显示随时间而变的细胞数量的结果。如图所示，PU3明显抑制这些乳腺癌细胞系的生长。
实验3用PU1、PU2、PU3或PU4(以0、10、50、100或250μM的浓度)处理SKBr3细胞的细胞培养物。24小时后，裂解细胞，评价细胞中Her2和Raf-1的量。虽然这种化合物在结构上很相似，但发现它们在促进这两种蛋白的降解上有不同的效力。在测试的任何浓度PU1显示对任一蛋白几乎无降解，而在250μM时PU2降解Her2但不降解Raf-1。当浓度超过100μM时PU3降解Her2，但在250μM时导致Raf-1仅有部分丧失。在浓度大于50μM时PU4降解Her2及在浓度250μM时降解Raf-1。
实验4为了测试降解的时间过程，用10μM PU3处理MCF-7细胞。在1.5，3，6，12和24小时回收等份的细胞，评价Her2、Raf-1、Hsp90和Trp-1的量。显示此化合物诱导了Her2的迅速降解(在给药3小时内丧失50％以上)，在24小时内有效地合成了Hsp90和Hsp70。在此时间中Raf-1的量没有明显变化。
实验5用PU1、PU2、PU3或PU4(以0，10，50，100和250μM的浓度)处理MCF-7细胞的细胞培养物。24小时后，裂解细胞，评价细胞中Her2的量。虽然这些化合物在结构上很相似，但发现它们在促进Her2降解上有不同的效力。在浓度超过50μM时PU1显示仅有部分降解，而在250μM时PU2完全降解Her2。在浓度超过10μM时，PU3基本上降解了Her2，在浓度大于100μM时PU4基本上降解了Her2。
实验6用PU1、PU2、PU3或PU4(以0，10，50，100和250μM的浓度)处理MCF-7细胞的细胞培养物。24小时后，裂解细胞，评价细胞中雌激素受体的量。虽然这些化合物在结构上很相似，但发现它们在促进雌激素受体降解上有不同的效力。在测试的浓度PU1显示基本上不降解，而在250μM时PU2完全降解雌激素受体。浓度超过50μM时PU3部分降解雌激素受体。浓度大于100μM时PU4基本上降解了Her2。
实验7用不同的浓度(0，10，50，100和250μM)处理SKBr3和MCF-7细胞的细胞培养物24小时。裂解细胞，用Western印染法分析Her2、Raf-1、Her3、雌激素受体(ER)、p85(P13K)、微管蛋白和肌动蛋白的水平。观察到其功能依赖于hsp90的那些信号传递蛋白(Her2、Raf1、Her3和ER)的量减少。观察到对与其它信号传递途径有关的P1 3K、微管蛋白或肌动蛋白等蛋白质没有影响。
实施例3实施例2的实验表明了本发明的合成化合物PU1、PU2、PU3和PU4的能力是提供激酶HER3、雌激素受体(ER)、Her2、Raf、Rb和p85的差异性降解(不应该作为参比蛋白，且不降解)。从此数据中可作出几种重要的观察。
PU3使雌激素受体复合物不稳定，且诱导此蛋白质的剂量依赖性降解。PU3还迅速降低Har2水平，且引起低分子量(170KDa对180KDa成熟蛋白)HER-2带的积聚，也见于GM，认为这是体内被隔离在内质网中的不完全糖基化的Her2。Raf和Her的水平对PU3的敏感小，但在较高浓度时降解。PU2也诱导一较低分子量Rb条带，认为是高磷酸化的Rb。
相反，PU2显示能基本降解Her2而无较低分子量带的积累，对Raf激酶降解的效力低。当PU1用作结合分子时，也不存在较低分子量带。PU2降解ER的效力低，而PU1对ER基本上无影响。这些差异提供的证据提示，PU3结合的HSP90家族成员与PU1和PU2不同，这解释了不同特异性的原因。PU4还显示降解Her的能力大于ER或Raf。
实施例4制备PU-C家族的6种化合物(如图15所示，X4＝H，X2＝1，2，3 OMe，X3＝H和可变X1基团)，并测试它们在MCF-7细胞中对Her2、HER3和TRAP-1的作用。用10，50，100和250μM的每种化合物处理细胞24小时。
X1基团的性质和大小对化合物的活性有显著的影响。能较好装满N-末端袋的大的疏水基团显示出降解Her2但不降解Her3的能力。此外，这些化合物降解Her2的能力和诱导Trap-1合成之间有相关性。
另一方面，具有大的僵硬和有点极性的×1基团的化合物有利的相互作用小，且在测试浓度不显著降解Her2。
实施例5按照图16A和图16B所示的合成图将PU3通过中间OH与生物素连接。将PU3-生物素固定在琼脂糖凝胶-链霉亲和素珠上。这些珠用来显示PU3与Trap-1和Hsp90的相互作用。
实施例6在MCF-7异种移植中测试了PU3的安全性和效力。
腹膜内(i.p)给与500mg/kg此化合物不显示明显的毒性征兆。用单剂量PU3(剂量为50,100和500mg/kgi.p)治疗已建立肿瘤的小鼠。单用DMSO治疗对照小鼠。治疗后12小时处死小鼠。对于免疫印迹法，肿瘤组织以2％SDS裂解缓冲液(PH7.4)均浆化。所有的例子中，在免疫印迹结果中观察到Her2水平降低。未观察到PI3激酶(p85)水平变化。
实施例7通过PU-C的9-N-烷化产生几种9-烷基-8-苄基-9H-嘌呤-6-胺基(4-46)(图6B)。此外，采用HF/吡啶配的亚硝酸叔丁酯(TBN)，通过非水介质中的重氮化反应将3的2-氨基(图7B)转化为氟。将生成的嘌呤烷化产生2-氟基-9-烷基-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基47-59。采用Mitsunobu反应进行烷化，此方法可容纳大量伯醇和仲醇。在相应的醇和NaOMe中回流将2-氟基衍生物转化为2-烃氧基嘌呤60和61。大多数修饰发生在从(3)开始的嘌呤部分的2位上。采用二碘甲烷配的硝酸异戊酯在该位置上引入碘产生62。用DMF配的三-正-丁基氰基锡烷和四重(三苯基膦)钯(O)将该2-碘代衍生物转化为氰基衍生物63，和用乙烯三丁基锡和(MeCN)2PdCl2转化为乙烯基衍生物64。
使该苄基部分富含供电子基团以增加其与袋中赖氨酸的相互作用。采用叔丁基氢过氧化物和相应的酸性卤化物，通过自由基间的反应加入氯和溴。在氯的例子中仅观察到单基取代的(65)，而溴产生单基取代的(66)和小量二溴取代的产物(67)(图8B)。
另外修饰了嘌呤和苯环之间桥的性质和长度。作为起始原料，我们利用8-Br-腺嘌呤。在高温与苯胺、苯酚或苄基衍生物反应产生相应产物68-70(图10)。
用3开始装配完全取代的衍生物71和72。先通过上述自由基间反应加入氯产生73。接着将2-氨基转化为氟，通过Mistsunobu反应烷化生成的嘌呤。
以下列出了各种化合物的具体反应3(DAAC)8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-2，6-二胺在溶于DCM(20ml)的三甲氧苯基乙酸(1.0g，4.4mmol)中加入氰尿酰氟(371ml，4.4mmol)和吡啶(356ml，4.4mmol)(在惰性气氛下)。室温搅拌混合液1小时后，再加入30mlDCM。生成的溶液用水(5ml)洗涤一次，除去DMF(10ml)中的溶剂产生酸性氟化物，并用于下一步。将2，4，5，6-四氨基嘧啶硫酸盐(0.9g，3.8mmol)溶解于含NaOH(456mg，11.4mmol)的水(40ml)中。加热生成的溶液到70℃，在20分钟期间滴加酸性氟化物。70℃搅拌反应混合物1.5小时，然后浓缩到干燥。在粗原料中加入含MeOH(16ml)和MeOH(16ml)配的25％NaOMe溶液，90℃加热生成的溶液18小时。冷却后，加入浓盐酸将溶液的PH调节到7。除去水溶液，粗制物溶解于DCM(100ml)和MeOH(50ml)中。滤掉未溶解的固体，用EtOAc∶DCM∶MeOH(4∶4∶2)在硅胶柱上纯化产物(47mg，37％)。
FAC2-氟-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基在3(500mg，1.5mmol)中缓慢加入溶于吡啶(2ml)的70％HF溶液和吡啶(8ml)，再加入亚硝酸叔丁酯(200ml，2.0mmol)，搅拌混合液2小时，然后用溶于水(15ml)和MeOH(10ml)的8g CaCO3淬灭过夜。浓缩此溶液到干燥，使生成的粗制物在MeOH(30ml)和DCM(10ml)中溶解。滤掉不溶解的固体，除去溶剂产生粗产物。在硅胶柱上，用已烷∶DCM∶EtOAc∶MeOH(10∶5∶5∶0.75)洗脱，纯化产物(240mg，50％)。
通过前述的Mitsunobu反应进行烷化，在溶于甲苯∶DCM(5∶1)的FAC中加入1.3当量的相应醇、2当量的PPh3，3当量的二-叔丁-偶氮二羧化物，室温搅拌生成的溶液10分钟到1小时(用TLC监测转化)产生48(PU3F)2-氟-9-丁基-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基60％产量。
52(PU29F)2-氟-9-(2-异丙氧基-乙基)-8-(3，4，5-三甲氧基)-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基86％产量。
54(PU47F)2-氟-9-戊-4-enyl-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基86％产量。
59(PU20F)2-氟-9-(四氢呋喃-2-甲基)-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基53％产量。
50(PU44F)2-氟-9-(2-甲氧基-乙基)-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基28％产量。
47(PU43F)2-氟-9-丙基-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基66％产量。
57(PU24F)2-氟-9-戊-4-ynyl-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基76％产量。
53(PU8F)2-氟-9-丁-3-enyl-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基42％产量。
55(PU48F)2-氟-9-丁-3-ynyl-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基36％产量。
56(PU49F)2-氟-9-戊-4-ynyl-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基25％产量。
58(PU16F)2-氟-9-环丁甲基-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基33％产量。
51(PU26F)2-氟-9-[(S)-2-甲基-丁基]-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基68％产量。
49(PU21F)2-氟-9-戊基-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基65％产量。
PU24DA9-戊-4-ynyl-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-2，6-二胺在溶于甲苯(20ml)和DCM(4ml)的DAAC(200mg，0.6mmol)中加入PPh3(330mg，1.3mmol)、4-戊炔-1-醇(75ml，0.8mmol)和二叔丁基偶氮二羧化物(600mg，2.5mmol)。室温搅拌混合物2小时。在硅胶柱上，用已烷∶CHCl3∶EtOAc∶EtOH(10∶8∶4∶4)洗脱经柱层析分离的产物(120mg固体，49％)。
62(PU24I)2-碘-9-戊-ynyl-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基在PU24DA(50mg，0.13mmol)中加入CH2I2(2.5ml)和硝酸异戊酯(100ml，0.78mmol)，生成的溶液于80℃加热1小时。冷却后，浓缩溶液然后加到硅胶柱上。采用洗脱剂己烷∶CHCl3∶EtOAc∶EtOH(10∶4∶4∶0.75)分离得到产物(40mg，61％)。
63(PU24CN)2-氰-9-戊-4-ynyl-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基将PU24I(20mg，0.04mmol)、Pd(PPh3)4(7mg，6.3×10-3mmol)和三丁基氰化锡(14mg，0.043mmol)的溶液在干燥的DMF(2.5ml)中180℃加热6小时。冷却后除去溶剂，经柱层析[己烷∶CHCl3∶EtOAc∶EtOH(10∶8∶4∶0.75)]分离得到产物(13mg，81％)。
64(PU24V)9-戊-4-ynyl-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-2-乙烯基-9H-嘌呤-6-胺基将PU24I(20mg，0.04mmol)、(MeCN)2PdCl2(2×10-3mmol)和三丁基乙烯锡(12.5ml，0.041mmol)的溶液在于燥的DMF(3ml)中100℃加热1小时。冷却后除去溶剂，经柱层析[己烷∶CHCl3∶EtOAc∶EtOH(10∶8∶4∶1)分离得到产物(15mg，92％)。
60(PU30Me)2-甲氧基-9-丁基-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基在溶于MeOH(1ml)的PU3F(20mg，0.051mmol)溶液中加入MeOH(1.5ml)配的25％NaOMe溶液。生成的混合液于85℃加热2小时。冷却后，混合液用4N盐酸中和，然后浓缩到干燥。在硅胶柱上用己烷∶己烷∶EtOAc∶DCM∶MeOH(10∶5∶5∶1)纯化粗制物产生一种固体(11mg，51％)。
61(PU30Et)2-乙氧基-9-丁基-8-(3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基在溶于EtOH(2ml)的PU3F(20mg，0.051mmol)溶液中加入NaOMe(15mg，0.28mmol)，混合液回流2小时。冷却后，用盐酸中和溶液，浓缩到干燥。如上所述纯化得到产物(12mg，56％)。
65(PU3Cl)-9-丁基-8-(2-氯-3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基在溶于MeOH(3ml)的PU3(37mg，0.1mmol)中加入浓盐酸(33ml，0.4mmol)。溶液冷却到0℃，加入叔丁基氢过氧化物的90％水溶液(44ml，0.4mmol)。生成的溶液回流过夜。冷却后除去溶剂，经柱层析[用已烷∶EtOAc∶DCM∶MeOH(10∶5∶5∶1.5)洗脱]分离得到产物(31mg固体，72％)。
66和67(PU3PhBr和PU3PhBr2)在溶于MeOH(3ml)的PU3(37mg，0.1mmol)中加入HBr的48％水溶液(45ml，0.4mmol)。混合物冷却到0℃，滴加叔丁基氢过氧化物(44ml，0.4mmol)。0℃搅拌生成的溶液30分钟，然后再回流1小时。冷却后除去溶剂，经柱层析[用已烷∶EtOAc∶DCM∶MeOH(10∶5∶5∶1.5)洗脱]分离混合物，主要产生一溴化产物(31mg，60％)和少许二溴化产物(2.3mg，4.4％)。
66(PU3Br)-9-丁基-8-(2-溴-3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H吡啶-6-胺基；67(PU3Br2)-9-丁基-8-(2，6-二溴-3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-胺基。
73(DAACPhCl)在溶于MeOH(50ml)的DAAC浆液(1g，3.0mmol)中加入浓盐酸(11.5ml，18mmol)。生成的溶液冷却到0℃，缓慢加入叔丁基氢过氧化物的70％水溶液(2.5ml，8mmol)，混合液于0℃搅拌30分钟，然后回流20小时。在高真空下除去溶剂产生纯化产物(1.09g，98％)。
74(FDAACPhCl)在溶于吡啶(6.5ml)的20％HF溶液中加入(在惰性气氛下)吡啶(13.5ml)，再加入DAACPhCl(1g，2.7mmol)。搅拌混合液5分钟，缓慢加入亚硝酸叔丁酯(450ml，3.5mmol)。再继续搅拌30分钟。加入溶于水(10ml)MeOH(10ml)的CaCO3(16.5g)淬灭反应，搅拌2小时，浓缩溶液，以DCM(50ml)∶MeOH(50ml)溶解生成的浆液。滤掉不溶的固体，用DCM∶MeOH(1∶1，2×25ml)洗涤。除去溶剂后，在硅胶柱上用已烷∶EtOAc∶DCM∶MeOH(10∶5∶5∶1)纯化得到产物(370mg固体，37％)。
71(PU24FCl)2-氟-9-戊-4-ynyl-8-(2-氯-3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基(308mg，76％)。
72(PU29FCl)2-氟-9-(2-异丙氧基乙基)-8-(乙-氯-3，4，5-三甲氧基-苄基)-9H-嘌呤-6-胺基68(PAM3)9-丁基-N*8*-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-9H-嘌呤-6，8-二胺将BrAd3(50mg，0.186mmol)和三甲氧苯胺(120mg，0.65mmol)的混合液于160℃加热30分钟。冷却后，以DCM(20ml)和MeOH(5ml)溶解固体，滤掉任何不溶的固体。在硅胶柱上用DCM∶EtOAc∶MeOH(7∶4∶1)洗脱纯化得到产物(57mg固体，83％)。
70(PU3OBn)9-丁基-8-(3，4，5-三甲氧基-苄氧基)-9H-嘌呤-6-胺基搅拌25％NaOM和NaOH(50ml)的苄醇溶液(250mg，2.5mmol)5分钟。除去甲醇后，加入BrAd3(26mg，0.096mmol)和铜粉(10mg，0.16mmol)，混合液于180℃加热2分钟。在硅胶上用已烷∶DCM∶EtOAc∶MeOH(10∶5∶5∶1)洗脱纯化得到产物(5.5mg，14％)。
69(PU3OPh)9-丁基-8-(3，4，5-三甲氧基-苯氧基)-9H-嘌呤-6-胺基。将三甲氧基苯酚(75mg，0.4mmol)叔-BuOk(34mg，0.3mmol)、铜粉(10mg，0.64mmol)和BrAd3(26mg，0.1mmol)的混合液于140℃加热1小时。经柱层析[己烷∶DCM∶EtOAc∶MeOH(10∶5∶5∶1)分离得到产物(13mg固体，35％)。
实施例8从美国典型培养物保藏所获得人癌细胞系MCF-7、SKBr3和MDA-MB-468，并维持在补充有2mM谷氨酰胺、50单位/ml青霉素、50单位/ml链霉素和5％(用于MCF-7和MDA-AB-468)或10％(用于SKBr3)热灭活胎牛血清(Gemini Bioprocducts)的DME∶F12(1∶1)混合液中，在5％CO2中37℃培育。
蛋白质试验细胞生长到60-70％铺满，并在指示的时间接触药物或DMSO运载体。使用50mMTris(PH7.4)、2％SDS和10％甘油裂解缓冲液制备裂解物。使用BCA试剂盒(Pierce Chemical Co.)，按照厂商说明测定蛋白质浓度。在变性的SDS-PAGE上，电泳分离澄清的蛋白质裂解物(20-50μg)，转移到硝酸纤维素，并用下列第一抗体检测抗-Her2(C-18)、Her3(C-17)、-Raf-1、细胞周期蛋白D1、Rb(C-15)(Santa CruzBiotechnology)、抗-hsp90、-hsp70(Stressgen)和Trap-1(MSK 81)、抗-b-肌动蛋白、-微管蛋白(Sigma)、ER、抗-P13K(P85)(UpstateBiotechnologies)。
抗增殖指数在药物处理前，6孔平皿中每孔接种10,000个细胞(MCF-7和MDA-MB-468)和20,000个细胞(SKBr3)；培育24小时进行生长试验。如每次实验草拟的那样给予药物或载体，培育细胞至所述时间，然后用Coulter计数器计数。
组织培养物的IC50研究使用前述的磺基罗丹明B试验进行生长抑制研究。用BT-474、MDA-MB-468、MCF-7和TSU-Prl进行实验。使贮存赔养物生长于含有30ml DME(HG、F-12、非必需氨基酸和青霉素及链霉素)、与谷氨酰胺和10％FBS的T-175烧瓶中。TSU-Prl生长于含有谷氨酰胺和10％EBS的RPMI1640中。用无钙镁PBS配的0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA解离细胞。
除BT-474以3,000个细胞/孔的密度接种外，实验培养物以1,000个细胞/孔的密度接种在100μl生长培养液的微量滴定板(Nunc)上。
留下1排没有细胞的孔作为空白对照。让细胞附着过夜(BT-474附着48小时)。次日，每孔中再加100μl生长培养液。将贮存药物或DMSO以所需的初始浓度分两次溶解于生长培养液中。在微量滴定板中以1∶1比例连续稀释药物或DMSO，并加到重复的孔中。生长72小时后，用10％三氯乙酸处理和用1％乙酸配的0.4％磺基罗丹明B染色后，测定处理孔和对照孔中的细胞数。计算IC50作为与对照生长相比，抑制细胞生长50％的药物浓度。
Her2降解、总蛋白质试验细胞生长到60-70％铺满，并在指明的时间接触药物或DMSO。使用50mMTris(PH7.4)、2％SDS和10％甘油裂解缓冲液制备裂解液。使用BCA试剂盒(Pierce Chemical Co.)，按照厂商说明测定蛋白质浓度，在变性的SDS-PAGE上，电泳分离澄清的蛋白质裂解物(20-50μg)，转移到硝酸纤维素，并用抗-Her2第一抗体(C18)(Santa Cruz Biotechnology)检测。
结合研究、固相竞争试验按所述方法将GM固定在Affigel 10树脂(BioRad)上。用含蛋白酶抑制剂的TEN缓冲液(50mM Tris，PH7.4，1mMEDTA，1％NP-40)洗涤GM珠，然后用含TEN缓冲液配的0.5％BSA 4℃封闭45分钟。将购自Stressgen(SPP-770)的HSP90蛋白质与或不与药物在冰上培育17分钟。在每个样品中加入20μl GM珠，混合液在4℃旋转1小时，接着各用500μl冰冷TEN洗涤3次。通过65μl 1×SDS加热，从固相中洗脱GM珠结合的蛋白质，以20μl等分分装样品用于Hsp90-α分析，40μl等分用于Hsp90-β分析，加到SDS/PAGE凝胶上，分别用Hsp90-α(Stressgen#SPA-840)和Hsp90-β(NeoMarkers#RB-118)免疫印迹显色。
测试了化合物PU4-72对HSP90的结合，Her2总蛋白质的降解及其抗增殖作用。结果小结于表1、2、3和4中。
表1 9-N链的特性对活性的影响
表2 C-2氟化对活性的影响
表3 引入供电子基团对苯基部分的影响
表4 最佳取代基的同化作用产生衍生物71和72
实施例9PU3和PU24FCl诱导Akt蛋白降解的能力。如图17A和B所示，对于Her2降解观察到30倍的活性差异，这也反映在Akt降解中。在Hsp90结合亲和力中也观察到约30倍差异。
实施例10分析数据以了解在有效诱导Her2降解的PU系列化合物浓度和MCF-7细胞系生长抑制所需浓度之间是否有相关性，以及Hsp90结合常数和生长抑制所需浓度之间是否有相关性。如图18A和图18B所示，实验结果提示，在生长抑制、Her2总蛋白质降解和Hsp90结合效力之间有良好的相关性。
实施例11细胞培养从美国典型培养物保藏所获得人癌细胞系MCF-7、SKBr3和BT-474，并维持在补充有2mM谷氨酰胺、50单位/ml青霉素、50单位/ml链霉素和5％(用于MCF-7)或10％(用于SKBr3和BT-474)热灭活胎牛血清(Gemini Bioproducts)的DME∶F12(1∶1)的混合液中，在5％CO2中37℃培育。
Her降解，总蛋白质试验细胞生长到60-70％铺满，并在指明的时间接触药物或DMSO运载体。使用50mM Tris(PH7.4)、2％SDS和10％甘油裂解缓冲液制备裂解液。使用BCA试剂盒(Pierce Chemical Co.)按照厂商说明测定蛋白质浓度。在变性的SDS-PAGE上，电泳分离澄清的蛋白质裂解物(20-50μg)，转移到硝酸纤维素，并用抗-Her2第一抗体(C-18)(Santa Cruz Biotechnoloy)检测，如图19所示，PU24FCI在低浓度时，诱导了致癌蛋白Her2的有效降解(对于SkBr3、MCF-7和BT-47的IC50分别是1.7、2、4.5uM)。
权利要求
1.一种含有与HSP90蛋白质家族成员的N-末端袋结合的结合部分的化合物，其特征在于，所述化合物是合成分子，所述结合部分不是安莎霉素抗生素或根赤壳菌素或其衍生物。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物溶于水溶液。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述结合部分是取代的嘌呤。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述结合部分与特异性结合于蛋白质受体或标记物的靶向部分偶联。
5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述结合部分选自以下基团 其中X是O，S，NH，CH2，或CO；X1是疏水链或COR，其中R是疏水链；X2是1-5个氢受体/供体官能度，可以相同或不同；X3是小基团，选自烷基(饱和、不饱和、环状或直链)、烷氧基、卤素、SMe和SEt；X4是H或是X3，X5是H或是X1；X6是-NH2、-OH、-O烷基，-CONH2或相似的氢供体官能度；和R1是H或烷基。
6.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所述结合部分的结构式为 其中Y是C、O、N或O-C；X1是疏水链或COR，其中R是疏水链；X2是1-5氢受体/供体官能度，可以相同或不同；X3是小基团，选自烷基(饱和、不饱和、环状或直链)、烷氧基、卤素、SMe和SEt；X4是不存在、是H或是X3；X5是H或是X1；X6是-NH2、-OH、-O烷基，-CONH2或相似的氢供体官能度；和R1是H或烷基。
7.如权利要求6所述的化合物，其特征在于，所述结合部分的结构为 其中X7是氢或卤素；和X3是卤素。
8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，所述结合部分的结构为
9.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，所述结合部分的结构为
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其特征在于，第一结合部分与第二结合部分偶联，形成二聚体。
11.一种药物组合物，该组合物含有药学上可接受的载体和含与HSP90蛋白质家族成员的N-末端袋结合的结合部分的化合物，其中，所述结合部分具有一骨架，当将其安排在HSP90蛋白质家族成员的N-末端袋内时，可获得折叠的C-构型，该骨架上各取向的取代基能与N-末端袋中的多个潜在结合位点相互作用，作用程度为对于SHP90蛋白质家族的至少一个成员而言，该结合部分对N-末端袋的结合亲和力大于ADP，且不同于格尔德霉素，并提供需要HSP家族伴侣分子的蛋白质的差异性降解。
12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，所述结合部分是权利要示求1-8中任一项所述的化合物的一部分或全部。
13.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，所述结合部分是权利要求9的化合物的一部分或全部。
14.一种抑制依赖于功能上需要HSP90家族成员的蛋白质或受体的细胞生长的方法，其特征在于，该方法包括用权利要求1-8中任一项所述的化合物处理细胞的步骤。
15.一种抑制依赖于功能上需要HSP90家族成员的蛋白质或受体的细胞生长的方法，其特征在于，该方法包括用权利要求9所述化合物处理细胞。
16.一种化合物，其特征在于，具有以下结构式 其中X是O、S、NH、CH2或CO；X1是疏水链或COR，其中R是疏水链；X2是1-5个氢受体/供体官能度，可以相同或不相同，X3是小基团，选自烷基(饱和、不饱和、环状或直链)、烷氧基、卤素、SMe和SEt；X4是H或是X3；X5是H或是X1；X6是-NH2、-OH、-O烷基、-CONH2或相似的氢供体官能度；和R1是H或烷基C或
17.一种化合物，其特征在于，具有以下结构式 其中Y是C、O、N或O-C；X1是疏水链或COR，其中R是疏水链；X2是1-5个氢受体/供体官能度，可以相同或C X3是小基团，选自烷基(饱和、不饱和、环状或直链)、烷氧基、卤素、SMe和SEt；X4是不存在的，H或是X3；X5是H或是X1；X6是-NH2、-OH、-OAlKy1、-CONH2或相似的氢供体官能度；和R1是H或烷基。
18.一种制备8-苄基嘌呤组合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a)将羧酸起始原料转化为酸性卤化物；b)使酸性卤化物与氨基取代的嘧啶反应产生中间产物，中间产物经历环封闭产生8-苄基嘌呤。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，该方法还包括烷化8-苄基嘌呤9-位氮的步骤。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，采用Mitsonobu烷化反应进行烷化。
21.一种根据与HSP90家族成员的N-末端袋的结合亲和力筛选测试化合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a)使测试化合物和HSP家族成员与其上固定有hsp结合部分的底物接触；和b)观察被固定的安莎霉素抗生素结合的HSP家族成员的量，其中与没有测试化合物时结合的量相比，HSP90家族成员结合量的减少，表明该测试化合物能与HSP家族成员结合。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，其中hsp结合部分是安莎霉素抗生素或根赤壳菌素。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，其中hsp结合部分是格尔德霉素。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，其中hsp结合部分是权利要求1-9，16或17中任一项所述的化合物。
25.一种筛选能选择性结合hsp90α或β的化合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a)在待筛的化合物存在时，将具有非特异性Hsp90结合部分的载体与含有Hsp90制备物的溶液混合，该制备物含有Hsp90-α和β；b)检测与载体结合的Hsp90-α和β的量，其中具有差异结合选择性的化合物将不同程度抑制Hsp-α和β与载体的结合。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，其中非特异性HSP90结合部分是格尔德霉素。
全文摘要
通过使用设计的与HSP90家族成员N－末端结合袋相互作用的小分子(亲和力大于ADP并且对HSP90家族的至少一种蛋白质而言不同于安莎霉素抗生素)，可利用HSP90家族成员结合袋中的结构差异获得对激酶和其它信号传递蛋白的差异性降解。此外，设计的这些小分子可溶于水性介质，从而提供可超过使用安莎霉素抗生素的又一优点。可配制含有药学上可接受的运载体和分子的药物组合物，所述分子包含有与HSP90蛋白质家族至少一个成员的N－末端袋结合的结合部分。发现这种结合部分对依赖于需要HSP90伴侣分子的蛋白质的肿瘤细胞有抗增殖作用。但是不同的化学物质有不同的活性，例如可选择降解Her2但不降解Raf激酶的化合物。因此，此结合部分具有固有的靶向能力。此外，可将这些小分子连接于靶向分子以将其活性导向特定类型的细胞。因此，本发明还提供了给予这些组合物治疗疾病(包括癌症)的方法。也可使用此种结合部分的二聚体形式。
文档编号A61P35/00GK1501928SQ01818469
公开日2004年6月2日 申请日期2001年11月1日 优先权日2000年11月2日
发明者G·基奥西斯, N·罗森, G 基奥西斯 申请人:斯隆-凯特林癌症研究所