一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于先进纳米材料与生物技术领域，涉及一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，具体涉及一种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料在全氟烷基衍生的磷酸化肽富集与MALD1-TOF MS分析中的应用。
【背景技术】
[0002]全氟烷基能够在含氟环境中产生离域效应，氟氟固相微萃取便是利用这一特性，通过全氟烷基修饰的介质，将含有全氟烷基的物质同不含氟的物质分离开来。氟氟固相微萃取技术通常被应用于靶向合成、非均相催化和有机小分子化合物的分离提纯等。近来，氟氟固相微萃取的应用已拓展到生物化学领域，包括蛋白质和肽段的分析鉴定、纳米微阵列设计和荧光检测等。
[0003]然而生物分子通常是不含氟的，所以必须用合适的含全氟烷基的亲和试剂进行衍生后，再利用氟氟相互作用将它们提取出来。基于氟亲和作用的蛋白质组学便是将生物样品中特定的蛋白/肽段标记上全氟烷基基团后，用氟氟固相微萃取技术进行富集的新型分析平台。传统的基于亲和作用的富集策略只适用于某一类有着特定功能基团的蛋白/肽段，比如金属氧化物亲和色谱用于磷酸化肽的富集，硼酸亲和色谱用于糖肽的富集等。与上述基于亲和作用的富集方法不同，对目标蛋白/肽段进行适当的衍生后，基于氟亲和作用的富集方法能够应用于富集含有不同功能基团或翻译后修饰的蛋白/肽段，并展现了很高的选择性。
[0004]另一方面，基于氟亲和作用的富集方法还被同功能化磁性纳米材料进行了结合。全氟癸基功能化的磁性纳米微球被成功合成并应用于水样中含氟物质的萃取，为结合了磁性材料的氟氟固相微萃取技术应用于蛋白质组学研究提供了启示。考虑到磁性分离的快速和简便性，融合了磁性材料的氟氟固相微萃取方法与质谱鉴定技术相结合，是取代传统亲和方法鉴定肽段的理想手段。此外，这一新的富集策略具有从一个蛋白样品中同时富集多种含有不同功基团或翻译后修饰肽段的潜力，而无须对富集的介质做出改变。
[0005]本发明中设计与合成的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料，被成功应用于全氟烷基衍生的肽段的富集。首先通过传统水热合成方法制备四氧化三铁磁性微球，接着通过表面活性剂辅助的一锅法在四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅，其中正硅酸乙酯作为硅源，十六烷基三甲基溴化铵作为介孔形成的模板剂，1H, 1H, 2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷作为全氟烷基的来源。由于材料表面富含硅羟基而介孔二氧化硅孔道中修饰有全氟烷基，合成所得复合材料具有良好的分散性、较高的富集容量和对于全氟烷基衍生肽段的特异性吸附作用，能够应用于氟相衍生的低浓度肽段的富集与质谱检测。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法。
[0007]该方法将介孔二氧化硅复合材料配成浓度为10 mg/mL的分散液，溶剂为50% (体积分数)乙醇；将该分散液加入全氟烷基衍生的肽段溶液稀释液中，混合，在酶解仪中孵育30-60分钟；通过外加磁场分离出介孔二氧化硅复合材料，用去离子水洗涤，用0.4 Μ氨水洗脱；取1 μ L洗脱液点在基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD1-TOF MS)靶板上，自然干燥后再滴加0.8 μ L浓度为20 mg/mL的2，5- 二羟基苯甲酸(DHB )溶液于被分析物液滴上，形成薄基质层，干后进行质谱分析。
[0008]其中，所述介孔二氧化硅材料为磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料。
[0009]本发明中，介孔二氧化硅复合材料的具体制备步骤如下:
(1)将六水合三氯化铁溶于乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入醋酸钠，充分搅拌溶解后转移至水热合成反应釜中，超声5分钟后，放入烘箱中190-200°C下加热10-18小时，取出反应釜，冷却10-12小时；从反应釜中倒出反应所得的磁球，并用去离子水和无水乙醇充分洗涤，40-60°C下真空干燥；
(2)将步骤(1)所得产物与十六烷基三甲基溴化铵按质量比1:10分散在去离子水中，超声30分钟；将所得分散液与氢氧化钠溶液混合，超声5分钟后得到均一稳定的分散液；将该混合溶液在60°C水浴中加热搅拌30分钟后，向其中缓慢滴加正硅酸乙酯/乙醇溶液，滴加完毕后在60°C水浴中加热搅拌30分钟；
(3)将1H，1H,2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯溶液滴加到步骤(2)所得产物中，在60°C水浴中加热搅拌12小时；
(4)用磁铁将步骤(3)所得产物从反应液中分离出来，在60°C乙醇溶液中加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵模板剂，在40-60 V下真空干燥。
[0010]本发明中，步骤(1)中六水合三氯化铁和醋酸钠的质量比为:(1.0-1.5):(3.0-10.0)。
[0011]本发明中，步骤(2)中步骤(1)所得的产物和去离子水的质量比为1.0:1.0 ;氢氧化钠溶液的浓度范围为1.0X 10 3摩尔/升-1.5X 10 3摩尔/升；氢氧化钠溶液与去离子水的体积比为9.0:1.0 ;正硅酸乙酯与分散液的体积比为1.0:1000 ;正硅酸乙酯与乙醇的体积比为1.0:4.0。
[0012]本发明中，步骤(3)中1H，1H, 2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯的体积比为1.0:2.0 ；1H, 1H, 2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯混合溶液与步骤(2)中正硅酸乙酯/乙醇混合溶液的体积比为1.0:( 15.0-20.0)。
[0013]本发明中，全氟烷基衍生的肽段溶液稀释液的具体制备步骤如下:
(1)向标准磷酸化肽、蛋白酶解液或人体血清中依次加入二甲亚砜/乙醇溶液、饱和氢氧化钡溶液、浓度为500 mM的氢氧化钠溶液和衍生试剂1H，2H, 2H, 2H-全氟-1-硫醇，在酶解仪中37°C下避光反应1小时；
(2)加入体积分数为5%的三氟乙酸溶液，将步骤(1)所得的溶液调节至酸性，终止衍生反应，然后加入过氧化氢溶液在酶解仪中20°C下氧化30分钟，磷酸化肽中的磷酸根将被全氟烷基所取代；用去离子水将衍生液稀释100倍。
[0014]本发明中，步骤(1)中二甲亚砜/乙醇溶液与肽段溶液的体积比为1.0:1.0，二甲亚砜与乙醇的体积比为3.0:1.0，饱和氢氧化钡溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为23.Ο:25.0,500 mM氢氧化钠溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为1.0:5.0，1H, 2H, 2H, 2H-全氟-1-硫醇与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为7.0:50.0
本发明中，步骤(2)中5%三氟乙酸溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为3.0:5.0，过氧化氢溶液的终浓度为体积分数3%。
[0015]本发明的有益效果在于:所提供的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法中，磁性微球包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料用表面活性剂辅助的一锅合成法合成，制备方法简便，合成所得材料具有良好的磁响应性、大比表面积和在水溶液中的分散性，对全氟烷基衍生的磷酸化肽具有很强的亲和作用，可作为富集分离全氟烷基修饰的磷酸化肽的固相微萃取吸附剂。该材料以全氟烷基修饰的介孔二氧化硅作为壳层，提供了对目标含氟肽段的特异性吸附，并显示出了很高的选择性，取得了对于非磷酸化肽1:1000(物质的量之比)的选择性，并适用于复杂生物样品中全氟烷基衍生的磷酸化肽的鉴定。
【附图说明】
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