40]实施例6:将实施例5得到的磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料作为固相微萃取吸附剂用于肝癌病人血清样品溶液中全氟烷基衍生的磷酸化肽的富集与MALD1-TOF MS检测。
[0041 ] (1)血清样品的衍生:向血清样品10 μ L中依次加入二甲亚砜/乙醇溶液(体积比为3:1)10 μ L、饱和氢氧化钡溶液9.2 μ L、浓度为500 mM的氢氧化钠溶液2 μ L和衍生试剂1Η，2Η, 2Η, 2Η-全氟-1-硫醇1.4 μ L，在酶解仪中37°C下避光反应1小时；加入三氟乙酸溶液(5%，体积分数)6 μ L将反应液调节至酸性，终止衍生反应，然后加入终浓度为3% (体积分数)的过氧化氢溶液在酶解仪中20°C下氧化30分钟，磷酸化肽中的磷酸根将被全氟烷基所取代；富集前，用去离子水将衍生液稀释100倍。
[0042](2)试样的富集:向200 μ L步骤(1)所得人体血清的全氟烷基衍生液稀释液中，加入10 μ L磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的分散液(浓度为10 mg/mL，溶剂为50%乙醇)，在酶解仪中37°C下孵育30分钟；通过外加磁场分离出磁性微球，用去离子水洗涤三次后，用0.4 Μ氨水10 μ L洗脱10分钟，用磁铁将洗脱液与材料分离开来。
[0043](3)点靶:取1 μ L步骤(2)所述洗脱液点到MALD1-TOF MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取0.8 μ L浓度为20 mg/mL的2，5- 二羟基苯甲酸(DHB)溶液作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干后进行质谱分析。
[0044](4)质谱分析以磁性微球包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料作为吸附剂从肝癌病人血清溶液中富集到的全氟烷基衍生的磷酸化肽分子。
[0045]全氟烷基衍生的肝癌病人血清溶液富集前，全氟烷基衍生的磷酸化肽在质谱中的信号受到非磷酸化肽的严重干扰而难以检测到；经磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料富集后，质谱图中显示出四条肝癌病人的特征磷酸化肽经全氟烷基衍生的峰(m/z= 1671，1742，1827和1898)和去磷酸化肽经全氟烷基衍生的峰(m/z=1489 和 1591)。
【主权项】
1.一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于:将介孔二氧化硅复合材料配成浓度为10 mg/mL的分散液，溶剂为50%体积分数的乙醇；将该分散液加入全氟烷基衍生的肽段溶液稀释液中，混合，在酶解仪中孵育30-60分钟；通过外加磁场分离出介孔二氧化硅复合材料，用去离子水洗涤，用0.4 Μ氨水洗脱；取1 μ L洗脱液点在基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱靶板上，自然干燥后再滴加0.8 yL浓度为20 mg/mL的2，5- 二羟基苯甲酸溶液于被分析物液滴上，形成薄基质层，干后进行质谱分析； 其中，所述介孔二氧化硅复合材料为磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料。2.根据权利要求1所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于所述介孔二氧化娃复合材料的具体制备步骤如下: (1)将六水合三氯化铁溶于乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入醋酸钠，充分搅拌溶解后转移至水热合成反应釜中，超声5分钟后，放入烘箱中190-200°C下加热10-18小时，取出反应釜，冷却10-12小时；从反应釜中倒出反应所得的磁球，并用去离子水和无水乙醇充分洗涤，40-60°C下真空干燥； (2)将步骤(1)所得产物与十六烷基三甲基溴化铵按质量比1:10分散在去离子水中，超声30分钟；将所得分散液与氢氧化钠溶液混合，超声5分钟后得到均一稳定的分散液；将该混合溶液在60°C水浴中加热搅拌30分钟后，向其中缓慢滴加正硅酸乙酯/乙醇溶液，滴加完毕后在60°C水浴中加热搅拌30分钟； (3)将1H，1H,2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯溶液滴加到步骤(2)所得产物中，在60°C水浴中加热搅拌12小时； (4)用磁铁将步骤(3)所得产物从反应液中分离出来，在60°C乙醇溶液中加热回流除去十六烷基三甲基溴化铵模板剂，在40-60 V下真空干燥。3.根据权利要求2所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于步骤(1)中六水合三氯化铁和醋酸钠的质量比为:(1.0-1.5): (3.0-10.0)。4.根据权利要求2所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于步骤(2)中步骤(1)所得的产物和去离子水的质量比为1.0:1.0 ;氢氧化钠溶液的浓度范围为1.0X 10 3摩尔/升-1.5X 10 3摩尔/升；氢氧化钠溶液与去离子水的体积比为9.0:1.0 ;正硅酸乙酯与分散液的体积比为1.0:1000 ;正硅酸乙酯与乙醇的体积比为1.0:4.0。5.根据权利要求2所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于步骤(3)中1H，1H, 2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯的体积比为1.0:2.0 ；1H, 1H, 2H, 2H-全氟癸基三乙氧基硅烷/正硅酸乙酯混合溶液与步骤(2)中正硅酸乙酯/乙醇混合溶液的体积比为1.0:(15.0-20.0)。6.根据权利要求1所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于全氟烷基衍生的肽段溶液稀释液的具体制备步骤如下: (1)向标准磷酸化肽、蛋白酶解液或人体血清中依次加入二甲亚砜/乙醇溶液、饱和氢氧化钡溶液、浓度为500 mM的氢氧化钠溶液和衍生试剂1H，2H, 2H, 2H-全氟-1-硫醇，在酶解仪中37°C下避光反应1小时； (2)加入体积分数为5%的三氟乙酸溶液，将步骤(1)所得的溶液调节至酸性，终止衍生反应，然后加入过氧化氢溶液在酶解仪中20°C下氧化30分钟，磷酸化肽中的磷酸根将被全氟烷基所取代；用去离子水将衍生液稀释100倍。7.根据权利要求6所述的介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，其特征在于步骤(1)中二甲亚砜/乙醇溶液与肽段溶液的体积比为1.0:1.0，二甲亚砜与乙醇的体积比为3.0:1.0，饱和氢氧化钡溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为23.0:25.0,500 mM氢氧化钠溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为1.0:5.0，1H, 2H, 2H, 2H-全氟-1-硫醇与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为7.0:50.0。8.根据权利要求5所述的在磷酸化肽上修饰全氟烷基的衍生方法，其特征在于步骤(2)中5%三氟乙酸溶液与二甲亚砜/乙醇溶液的体积比为3.0:5.0，过氧化氢溶液的终浓度为体积分数3%。
【专利摘要】本发明提出了一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法，将磁性微球四氧化三铁表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料用于全氟烷基衍生的肽段的基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析。该材料对于氟相衍生的磷酸化肽显示出超强的亲和作用，同时在水溶液中保持了良好的分散性。该材料所具有的四氧化三铁磁性内核简化了富集分离的过程。基于该磁性微球表面包覆全氟烷基修饰的介孔二氧化硅复合材料的固相微萃取方法取得了对于非磷酸化肽的选择性富集，并被能够成功应用于人体血清中的内源性磷酸化肽的富集。
【IPC分类】B01J20/28, B01J20/30, B01J20/26, B01J20/281
【公开号】CN105363426
【申请号】CN201510892678
【发明人】邓春晖, 赵曼
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月8日