一种脱抗原生物骨及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种脱抗原生物骨的制备方法。包括骨块预处理、部分脱蛋白处理、辐照处理、有机质去除、EDC/NHS交联和干燥灭菌。本发明使用辐照处理骨颗粒，使蛋白变性后，再使用表面活性剂、过氧化氢的混合溶液，处理辐照后的骨颗粒，再使用次氯酸盐溶液及过氧化氢溶液处理，经环氧乙烷灭菌后获得脱蛋白生物骨。本发明所制备的骨材料具有三维多孔状结构，有良好的毛细吸附作用，植入体内可吸附成骨细胞及蛋白因子，诱导新生骨形成;有效去除了抗原成分，保留部分胶原蛋白，生物相容性较好；羟基磷灰石结晶度低于15%，以弱的结晶形态存在而无其他结晶相，其中碳酸盐的含量为4%～6%，力学强度较高，且具有良好的降解性。该发明适用于非承重部位骨缺损的修复手术用材料。
【专利说明】一种脱抗原生物骨及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程学之生物材料技术，具体涉及一种脱抗原生物骨及其制备方法。
【背景技术】
[0002]骨移植手术应用于骨科临床已有多年的历史，自体骨移植作为植骨的金标准，在临床上有着很好的愈合效果。自体骨多取自患者腓骨或髋骨，取骨量有限，患者承受二次手术的痛苦，自体骨移植应用因此而受限。
[0003]为了解决骨移植的问题，人们使用人工骨、同种异体骨、异种异体骨等材料，代替自体骨移植用于临床治疗。人工骨材料多为经1000°c以上高温煅烧后的羟基磷灰石晶体或经化学反应合成的β -磷酸三钙或硫酸钙晶体，但其无法模拟天然骨材料复杂的微观结构，天然骨中----尤其是以弱结晶形式存在的少量碳酸盐，其对于骨的降解性有着重要的影响。因而人工骨材料的降解性一直是制约其临床应用的瓶颈。
[0004]同种异体骨来源于人尸体骨，制备过程中只需除去脂肪和部分蛋白(主要是抗原性物质)，经消毒灭菌即可。由于未完全除去蛋白，所以同种骨的抗压性强，材料与人体的组织相容性好，植入后免疫排斥轻，骨诱导性能也相对较好。但由于捐赠者的年龄差异，可用于骨移植的骨源十分有限，且同种骨有一定的病毒感染风险。
[0005]异种异体骨多为牛骨或猪骨，由于与人体骨结构相似，且来源广泛，应用前景良好。最具代表性的牛骨产品即Bio-Oss骨粉——选取牛股骨末端，通过甲苯索氏抽提脱脂，乙二胺溶液脱蛋白处理，160°C干燥后经350°C低温煅烧可得无机松质骨颗粒。由于使用了煅烧工艺，Bio-Oss骨粉中的羟基磷灰石部分结晶，导致骨材料抗压性较差，仅适用于口腔、颌面骨等`部位的骨缺损，而对于缺损部位较大、需要一定力学强度支持的骨缺损修复，并无理想的临床应用。
[0006]新鲜骨中引起免疫反应的物质，主要是非胶原蛋白及骨细胞膜表面的糖蛋白、月旨肪。如何有效地破坏细胞表面抗原，除去抗原性物质，获得低免疫原性的异种骨材料是异种骨制备工艺中的重点。在现有技术中，去抗原的方法主要有深低温冷冻，化学试剂(如甲醇/氯仿混合溶液，20%~30%过氧化氢，乙二胺)、表面活性剂(SDS，Triton等)、蛋白酶处理以及高温煅烧等。高温煅烧可完全除去抗原及有机质成分,但由于完全去除有机质,骨材料的抗压性能较差，仅具有骨传导性，失去了诱导性，无法应用于骨科的缺损修复中；而使用化学试剂或酶处理，对于抗原性较高的异种骨来说，无法有效的去除抗原，植入体内后会有免疫排斥的风险。
【发明内容】
[0007]针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于:提供一种脱抗原生物骨及其制备方法。
[0008]本发明是这样实现的:[0009]本发明的脱蛋白生物骨制备方法，包括骨块预处理，部分脱蛋白处理，辐照处理，有机质去除，EDC/NHS交联，干燥灭菌，其具体方法步骤如下:[0010]步骤一、骨块预处理:将牛股骨或猪股骨干骺端切割成< Icm3小块骨块，纯化水清洗至无骨髓和血液；粉碎粒径至5mm~IOmm大小。
[0011]步骤二、部分脱蛋白处理:将步骤一得到的骨颗粒，放在0.1%~2%SDS、0.5%~4%氢氧化钠的1%~5%过氧化氢混合溶液，或者是0.1%~2%SDS、0.5%~4%氢氧化钾的1%~5%过氧化氢混合溶液，再或者是0.5%~2%Triton X_100、0.5%~4%氢氧化钠的1%~5%过氧化氢混合溶液，亦或者是0.5%~2%Triton X_100、0.5%~4%氢氧化钾的1%~5%过氧化氢混合溶液中；37°C浸泡0.5~I小时，再经40KHz超声处理I~3分钟，待骨颗粒充分吸附溶液后震荡处理I~2小时，纯化水清洗至中性。
[0012]原料骨中主要的抗原成分为骨细胞膜表面的糖蛋白、脂肪及其他有机成分，现有工艺中均无法将抗原暴露以达到脱抗原的目的，而是使用较强的物理和/或化学工艺处理，完全清除骨材料中的有机成分代之。本发明使用表面活性剂与强碱的过氧化氢混合溶液处理原料骨，其中表面活性剂可使蛋白质的肽链伸展，暴露其内部的官能团；强碱可使羟基磷灰石上附着的胶原充分溶胀，暴露其内部的细胞及脂肪等成分；二者又兼有脱脂功能，可破坏、溶解细胞膜上的脂肪成分，达到脱脂、脱细胞的作用；过氧化氢具有强氧化性，可将骨材料中已充分溶胀的小分子蛋白氧化、变性，更好地达到部分脱蛋白的目的。本发明人通过实验发现，使用该混合溶液作用于胶原膜类材料一段时间后，明显可见胶原膜材料发生溶胀，表现为胶原膜材料的厚度增加。使用纯化水清洗无法使溶胀的胶原膜材料消胀，厚度基本没有变化。组织学结果表明，该混合溶液有良好的溶胀胶原结构及脱细胞功能。因而可得出使用该混合溶液处理骨材料时，材料中的胶原蛋白也会充分的溶胀，暴露内部的抗原成分，进而被有效去除。
[0013]步骤三、辐照处理:将步骤二获得的骨颗粒使用15KGy~35KGy钴60辐照处理。
[0014]使用钴60辐照处理骨材料时，Y射线将能量传递给蛋白质分子，引起电离和激发，导致分子结构的改变，或通过自由基作用于蛋白质，造成肽链的断裂和空间结构松散的辐射损伤，从而使蛋白空间结构的有序性降低，蛋白发生降解变性。有研究表明，使用35KGy以上剂量的辐照照射才会对骨的力学强度有影响，所以本发明使用35KGy以下的辐照处理骨材料，使蛋白变性，有利于进一步去除。
[0015]步骤四、有机质去除:将步骤三得到的骨颗粒放入含有2.5%~5%次氯酸钠或次氯酸钙溶液中震荡处理8~24小时，每4~6小时更换溶液，换液前使用40KHz超声处理5~10分钟,最后用纯化水清洗；再使用1%~5%过氧化氢溶液浸泡处理骨颗粒4~6小时,纯化水清洗至中性。
[0016]使用次氯酸盐处理骨材料时，可将骨材料中较长的多肽链断裂，并使蛋白质末端基团氯化而引起非特异性的蛋白水解，有效去除骨颗粒中残余的抗原成分。次氯酸盐有很强的杀菌作用，使用牛源性材料时，具有一定的朊病毒风险。世界卫生组织推荐的朊病毒灭活方法中，使用2.5%次氯酸钠20°C处理I小时，可有效的灭活朊病毒，因而本发明专利中使用的次氯酸盐去除抗原操作，也具有灭活朊病毒的作用。
[0017]步骤五、EDC/NHS交联:将步骤四获得的骨颗粒置于EDC交联液中(含40~60mMMES, 3~8mM EDC, 2~6mM NHS)室温交联12小时~24小时，纯化水清洗15~25次；[0018]EDC/NHS与骨胶原蛋白之间的化学作用，主要是EDC与胶原蛋白中的冬氨酸和谷氨酸残基上的羧基进行反应，形成一种不稳定的脲衍生物；NHS通过形成更稳定的酯而增强其交联产物的稳定性。EDC/NHS在交联过程中并不进入胶原基质，而是转变成水溶性的脲衍生物，其细胞毒性很小。通过交联作用，胶原蛋白分子结构更加稳定，有利于维持骨颗粒力学特性。
[0019]步骤六、干燥与灭菌:将步骤五得到的骨颗粒置于20°C~60°C烘箱中干燥8小时~12小时，环氧乙烷灭菌6小时~12小时。
[0020]现有骨修复产品中，同种异体骨由于原料本身的抗原性较弱，因而制备工艺中不需要完全脱除有机质，保留了骨中原有的胶原成分，因此具有良好的抗压性和骨诱导性；而异种骨由于抗原性较强，现有的制备工艺中若不进行高温煅烧则无法有效去除抗原，植入体内后有免疫排斥的风险。但煅烧后的骨材料，力学强度差，骨诱导性不理想。本发明所制备的脱抗原生物骨，在有效去除抗原的同时保留了天然骨中原有的部分胶原蛋白，与煅烧骨相比，具有较好的抗压性以及骨诱导活性，且由于未经过煅烧，脱抗原生物骨中羟基磷灰石的结晶度要小于煅烧骨，材料也表现出更好的生物可吸收性；异种骨的原料来源广泛，成本较低，也缓解了同种异体骨在来源上的困难。
[0021]与现有技术相比，本发明首次使用表面活性剂与强碱的过氧化氢混合溶液处理骨材料，该溶液可使骨材料内的胶原蛋白在充分溶胀的同时，暴露其内部结构，进而去除骨材料中的细胞、脂肪及部分蛋白，且经纯化水清洗后胶原的溶胀效果不会被消除，对于后续的辐照、有机质脱除等处理，可保证抗原有效去除；骨颗粒经交联处理后，材料内部的胶原蛋白结构更加稳定，最大程度的保留骨颗粒的力学特性。本发明未使用条件相对极端的煅烧工艺及化学处理，保 证了骨材料的天然结构及特性；通过本发明的工艺处理，可获得免疫源性低、抗压性强、具有较完整孔隙结构的生物骨材料。整个工艺操作简单，所用原料及设施易得，成本较低，适合大规模生产。
[0022]本发明之脱抗原生物骨具，有完整的三维多孔结构，孔径分布在IOnm~300 μ m之间，比表面积约60~80m2/g，具有良好的毛细吸附作用，植入体内可吸附成骨细胞及蛋白因子，诱导新骨形成；能有效地去除抗原物质，保留部分骨胶原蛋白，其中蛋白含量为15%~25%(羟脯氨酸含量为9%~11%)，具有良好的生物相容性及抗压性；羟基磷灰石结晶度低于15%，以弱结晶形态存在，碳酸盐含量在4%~6%之间，具有良好的生物可吸收性，适用于骨科临床中非承重部位的骨缺损修复手术用材料。
[0023]本发明进行的动物实验证明，该材料具有良好的生物相容性:
[0024]将本发明制备的脱抗原生物骨进行兔颅骨缺损修复动物实验，分别于术后4周、
12周、24周取材观察材料修复情况。结果表明，4周时，骨材料周围已有新生软骨细胞形成，未见有免疫细胞，说明材料具有较好的生物相容性；12周时，软骨细胞骨化形成新生骨组织，并可见新生毛细血管；24周时，骨材料周围已被新生骨组织包围，可见骨髓组织，且骨材料出现降解的趋势。空白对照组24周取材结果显示，缺损部位有较多的结缔组织形成，但未见有修复的迹象。进行大鼠皮下植入试验，分别于术后I周、2周、4周取材观察，均未发现有炎症反应发生，说明材料具有良好的生物相容性。
[0025]下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1.为采用本发明方法制备的脱抗原生物骨的扫描电镜图片；
[0027]图中可见:脱抗原生物骨中有较好的孔径结构，骨小梁结构完整，清晰可见骨小梁表面附有较多的微孔。
[0028]图2.为煅烧骨和脱抗原生物骨的扫描电镜图片
[0029]图中，图2-A为煅烧骨的扫描电镜图片，图2-B为脱抗原生物骨的扫描电镜图片，从图中可见，煅烧后的骨材料表面，羟基磷灰石有明显的结晶现象，而在脱抗原生物骨中，仍可见微小的孔隙结构，结晶现象不明显。
[0030]图3.为脱抗原生物骨与现有两种骨材料之比表面积对比图示
[0031]图中，A为脱抗原生物骨，B为Bio-Oss骨，C为羟基磷灰石生物陶瓷,该图为三种骨材料的比表面积对比，其中脱抗原生物骨与Bio-Oss同样具有较高的比表面积，且远高于羟基磷灰石生物陶瓷。
[0032]图4.为脱抗原生物骨与煅烧骨之两种材料之结晶度分析图示
[0033]图中，A为脱抗原生物骨，B为煅烧骨，该图为两种骨材料的结晶度分析结果。
[0034]图5.为兔颅骨缺损后不同时间段的修复情况对比图
[0035]图中，图5-A为4周取材，图5-B为12周取材，图5-C为24周取材。可见，材料植入缺损部位后，随时间延长会有新生骨组织形成，并有逐步降解的趋势，说明材料具有良好的骨诱导性及降解性能。
【具体实施方式】
[0036]以下例举本发明脱蛋白生物骨制备方法的多个实施例。均包括骨块预处理，部分脱蛋白处理，辐照处理，有机质去除，EDC/NHS交联和干燥灭菌的方法步骤。
[0037]实施例1:制备脱抗原猪骨
[0038]步骤一、骨块预处理:取猪股骨干骺端，切割成< Icm3小块后，纯化水清洗，以洗去多余的骨髓和血液，再用粉碎机对骨块粉碎至5mm~10mm。
[0039]步骤二、部分脱蛋白处理:将步骤一得到的骨颗粒，放在0.5%SDS、2%氢氧化钠的3%过氧化氢混合溶液中；37°C浸泡I小时，再经40KHz超声处理3分钟，待骨颗粒充分吸附溶液后震荡处理2小时，纯化水清洗至中性。以此为一个循环，共处理4个循环后纯化水清洗。
[0040]步骤三、辐照处理:使用25~30KGy剂量的Co6°处理步骤二所得的骨颗粒。
[0041]步骤四、有机质去除:将步骤三得到的骨颗粒经过2.5%次氯酸钙溶液震荡处理16小时，每6小时更换次氯酸钠溶液，换液前使用40KHz超声处理10分钟，处理后使用纯化水清洗。再用3%过氧化氢溶液浸泡处理骨颗粒6小时，纯化水清洗至中性。
[0042]步骤五、EDC/NHS交联:将步骤四中获得的骨颗粒置于EDC交联液中(含45mM MES,6mM EDC,4mM NHS)，室温交联16h，纯化水反复清洗17次。
[0043]步骤六、干燥与灭菌:将步骤五得到的骨颗粒置于60°C烘箱中干燥8小时，环氧乙烷灭菌6小时。
[0044]猪骨中有机成分含量较高，在本实例中使用较高剂量的辐照及SDS、氢氧化钠的过氧化氢混合溶液以及较长的处理时间，可充分处理有机质，脱除抗原成分，猪骨骨小梁间孔隙结构较小，次氯酸钠处理时间较长，有效的去除材料中残留的抗原成分。将本实例制备的脱抗原猪骨进行家兔颅骨缺损修复观察，植入材料3个月后，修复区内可见新生骨细胞，6个月后可见新生小梁结构，材料植入部位可见破骨细胞，与正常结构无明显差异。
[0045]实施例2:制备脱抗原牛骨
[0046]步骤一、骨块预处理:将牛股骨或猪股骨干骺端切割成骨块，纯化水清洗至无骨髓和血液；粉碎粒径至5mm~IOmm大小。
[0047]步骤二、部分脱蛋白处理:将步骤一得到的骨颗粒，放在2%Tritonl00_X、l%氢氧化钠的2%过氧化氢混合溶液中；37°C浸泡0.5小时，再经40KHz超声处理3分钟，待骨颗粒充分吸附溶液后震荡处理1.5小时，纯化水清洗至中性。以此为一个循环，共处理4个循环后，纯化水清洗至中性。
[0048]步骤三、辐照处理:使用20KGy Co60辐照处理步骤二所得的骨颗粒。
[0049]步骤四、有机质去除:将步骤三所得的骨颗粒使用5%次氯酸钠溶液震荡处理12小时，每6小时更换次氯酸钠溶液，换液前使用40KHz超声处理5分钟，处理后使用纯化水清洗。再用5%过氧化氢溶液浸泡处理骨颗粒4小时，纯化水清洗至中性。
[0050]步骤五、EDC/NHS交联:将步骤四中获得的骨颗粒置于EDC交联液中(含50mM MES,6mM EDC, 5mM NHS)，室温交联18h，纯化水反复清洗20次。
[0051]步骤六、干燥与灭菌:将步骤五得到的骨颗粒置于20°C烘箱中干燥12小时，环氧乙烷灭菌8小时。
[0052]牛骨中有机成分含量较低，且小梁间孔隙结构较大，本实例中使用合适的溶剂浓度及处理时间，可有效的去除抗原成分，且不会对骨材料结构有影响。附图2中图2-B为专利工艺处理的脱抗原牛骨材料，图中明显可见骨表面有微孔结构，与煅烧骨(图2-A)差异明显。将本实例制备的脱抗原牛骨进行家兔颅骨缺损修复观察，植入材料3个月后，修复区内可见新生骨细胞，6个月后可见新生小梁结构，材料植入部位，与正常结构无明显差异。附图5为本专利工艺处理的脱抗原牛骨材料植入家兔颅骨缺损模型。图5-B为植入后3个月的组织学结果，图中可见材料周围有成骨细胞富集，且有新生骨组织形成；图5-C为植入后6个月的组织学结果，图中可见修复部位有骨髓组织形成，与正常组织结构无明显差异。
[0053]实施例3
[0054]本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于:
[0055]步骤二部分脱蛋白处理:将步骤一得到的骨颗粒，放在l%Triton X_100、2%氢氧化钠的3%过氧化氢混合溶液中；37°C浸泡I小时，再经40KHz超声处理3分钟，待骨颗粒充分吸附溶液后震荡处理1.5小时，纯化水清洗至中性。
[0056]实施例4
[0057]本实施例与实施例2基本相同，不同之处在于:
[0058]步骤二、部分脱蛋白处理:步骤一得到的骨颗粒，放在0.5%Triton X_100、3%氢氧化钠的5%过氧化氢混合溶液中；37°C浸泡I小时，再经40KHz超声处理3分钟，待骨颗粒充分吸附溶液后震荡处理I小时，纯化水清洗至中性。
[0059]步骤四、有机质去除:将步骤三得到的骨颗粒放入含有3%次氯酸钙溶液中震荡处理8小时，每5小时更换溶液，换液前使用40KHz超声处理8分钟，最后用纯化水清洗；再使用1%过氧化氢溶液浸泡处理骨颗粒5小时,纯化水清洗至中性。[0060]实施例5
[0061]本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于:
[0062]步骤二、部分脱蛋白处理:将步骤一得到的骨颗粒，放在1%SDS、3%氢氧化钾的3%过氧化氢混合溶液中，37°C浸泡0.5小时后，再经40KHz超声处理I分钟，待骨颗粒充分吸附溶液后震荡处理2小时，纯化水清洗至中性。
[0063]步骤四、有机质去除:将步骤三得到的骨颗粒放入含有2.5%次氯酸钙溶液中震荡处理24小时，每4小时更换溶液，换液前使用40KHz超声处理8分钟，最后用纯化水清洗；再使用1%过氧化氢溶液浸泡处理骨颗粒5小时，纯化水清洗至中性。
[0064]实施例6
[0065]本实施例与实施例2基本相同，不同之处在于，
[0066]步骤二部分脱蛋白处理:步骤一得到的骨颗粒，放在2%SDS、0.5%氢氧化钾的5%过氧化氢混合溶液中，37°C浸泡0.5小时后，40KHz超声处理I分钟，待骨颗粒充分吸附溶液后震荡处理I小时，纯化水 清洗至中性。
【权利要求】
1.一种脱抗原生物骨的制备方法，其特征在于:包括骨块预处理、部分脱蛋白处理、辐照处理、有机质去除、EDC/NHS交联和干燥灭菌。
2.根据权利要求1所述生物骨的制备方法，其特征在于:所述骨块预处理，系指将牛股骨或猪股骨干骺端切割成< Icm3小块骨块，纯化水清洗至无骨髓和血液；粉碎后的粒径为 5mm ~10mnin
3.根据权利要求1所述生物骨的制备方法，其特征在于:所述部分脱蛋白处理，系指将上述权利要求2得到的骨颗粒，放在0.1%~2%SDS、0.5%~4%氢氧化钠的1%~5%过氧化氢混合溶液，或者是0.1%~2%SDS、0.5%~4%氢氧化钾的1%~5%过氧化氢混合溶液，再或者是0.5%~2%Triton X_100、0.5%~4%氢氧化钠的1%~5%过氧化氢混合溶液，亦或者是0.5%~2%Triton X_100、0.5%~4%氢氧化钾的1%~5%过氧化氢混合溶液中；37°C浸泡0.5~I小时，再经40KHz超声处理I~3分钟，待骨颗粒充分吸附溶液后震荡处理I~2小时，纯化水清洗至中性。
4.根据权利要求1所述生物骨的制备方法，其特征在于:所述辐照处理，系指将上述权利要求3获得的骨颗粒使用15KGy~35KGy钴60进行辐照处理。
5.根据权利要求1所述生物骨的制备方法，其特征在于:所述有机质去除，系指将上述权利要求4得到的骨颗粒，放入含有2.5%~5%次氯酸钠或次氯酸钙溶液中震荡处理8~24小时，每4~6小时更换溶液，换液前使用40KHz超声处理5~10分钟，最后用纯化水清洗；再使用1%~5%过氧化氢溶液浸泡处理骨颗粒4~6小时,纯化水清洗至中性。
6.根据权利要求1所述生物骨的制备方法，其特征在于:所述EDC/NHS交联，系指将步骤四获得的骨颗粒置于含40~60mM MES, 3~8mM EDC, 2~6mM NHS的EDC交联液中，室温交联12小时~24小时，纯化水清洗15~25次。
7.根据权利要求1所述生物骨的制备方法，其特征在于:所述干燥与灭菌，系指将步骤五得到的骨颗粒置于20°C~60°C烘箱中干燥8小时~12小时，环氧乙烷灭菌6小时~12小时。
【文档编号】A61L27/24GK103638557SQ201310507012
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】耿阳雪 申请人:陕西佰傲再生医学有限公司