使用混合式或多模式树脂来纯化因子Ⅷ的制作方法

专利名称：使用混合式或多模式树脂来纯化因子Ⅷ的制作方法
专利说明使用混合式或多模式树脂来纯化因子Ⅷ 发明领域 本发明涉及使用含有配体的多模式(multimodal)或混合式树脂来纯化重组蛋白质的方法，其中配体包含疏水性部分和带负电荷的部分。使人感兴趣的蛋白是凝血因子，尤其与重组体[凝血]因子(Factor)VIII的组合物的纯化有关。

背景技术：
人类因子(Factor)VIII，亦称抗血友病因子或FVIII:C，是由两种多肽组成的人血浆蛋白，其中多肽具有80,000道尔顿的轻链分子量和从90,000至220,000变化的重链分子量。人们认为其在因子X转化为它的活性形式因子Xa所必需的凝结途径中是关键辅助因子之一。因子VIII在血浆中以与von Willebrand因子的非共价配合物形式(亦称FVIII:RP)循环。血友病(出血障碍)是由于因子VIII的异常水平所导致的。在人中，低于20％正常值的因子VIII水平可以导致血友病症。因子VIII的水平降低小于1％就会引起严重的出血障碍，自发性关节出血是最常见的症状。
过去已经描述了重组体因子VIII的结构和生物化学。
传统地，因子VIII的分离和纯化是从血浆取得渠道进行(低温沉淀)的。从血浆取得渠道进行的纯化方法包括那些使用免疫亲和纯化的方法，其使用多克隆和单克隆抗体来纯化FVIII。然而，由于用载体基质浸提，有可能存在因子VIII排出流含有一些残余抗体的情况，这可以在最终使用期间(即，当人或动物系统采用时)产生抗原性。
在例如琼胶糖珠粒上使用离子交换色谱的纯化方法还用于从血浆中纯化因子VIII。然而，这些方法常常使所得到的FVIII:C具有某些污染水平。
然而，在过去十年中，由遗传工程设计的重组体渠道来纯化因子VIII已经赢得了重要地位。在重组体蛋白的分离过程中，最终产物的蛋白回收率和浓度是非常重要的。在重组产生的蛋白中的污染物包括在培养基中分泌的蛋白、介质组份、细胞溶解产物、细胞产生的不希望有的蛋白和核苷酸。
当纯化重组蛋白时，进一步常常看到水源性物质(在其中可以得到使人感兴趣的多肽)被一或多种病毒污染。使多肽混合物中的病毒失活的技术在本领域是已知的，例如使用溶剂/洗涤液的化学方法，照射方法或热法，但将这种技术与已知的多肽提纯方法相组合的努力已经产生的方法，具有许多步骤，不适合大量制备。同样重要的是，必须注意所使用的病毒失活试剂不能使蛋白变性，或很难从使人感兴趣的蛋白中分离出来。然而，这些试剂已经使感兴趣的多肽变性，或难以从感兴趣的多肽中分离出来，并且需要特殊处理或分离步骤。对于潜在的病毒污染，处理含有多肽的制品的其它常规方法，例如加热或照射，已经导致感兴趣的多肽的显著变性，和/或不能使病毒充分灭活。许多可商购的重组体因子VIII产品(Advate

，Helixate，

Kogenate FS

，ReFacto

)是使用免疫亲和色谱制备的，其包含用于纯化和病毒灭活的洗涤剂。
在通过重组DNA技术制备的治疗蛋白的纯化中，众所周知的是，当设法将DNA和宿主细胞蛋白(HCP)的含量降低至目标极低水平时，会遇到相当大的问题。
Nordfang等人(Thrombosis and Haemostasis 58(4)，1043-1048(1987))描述了使用抗体树脂和含有50％乙二醇和高盐的缓冲液所进行的分离方法。
在哺乳动物细胞系统中表达的重组蛋白的纯化一般需要用几个步骤进行。不同的步骤通常可分为捕获、中间物和精制。捕获步骤的目的有两层a)以稳定溶液形式获得靶蛋白，和b)减少体积(即，与装填到柱(“装填”)上的溶液相比，获得相对于蛋白含量的浓缩溶液)。
后面的步骤(减少体积)是便于后面的纯化步骤的关键性步骤。捕获步骤通常使用带有离子交换树脂的色谱达成。使用离子交换树脂的缺点是必须调节装填的电导率和/或pH值。当调节电导率时(大多数情况下降低)，是通过加入水进行的，这就会增加起始原料的体积，使得后面的步骤不能进行，给制备目的造成总体麻烦。此外，调节pH值常常导致形成团聚体，其可以妨碍纯化步骤的效能。
捕获步骤之后，可以进行中间物纯化，纯化可以除去大部分显著的杂质，包括DNA、病毒和内毒素。这些杂质还可以在捕获过程中除去/减少。精制步骤是指最后的纯化步骤，在该步骤中，可以除去痕量染污物和杂质，并且得到活性生物制品。在精制步骤期间除去的污染物常常是靶分子的构象异构体，或可能是渗漏的产品。
本领域仍然需要快速和有效的改进的纯化方法，并且要求这种纯化方法基本上保留因子VIII的活性。
本发明的方法具有以下优点在一步法中，可以使体积减少，并且可以使比活性得到相当大的提高。由此，该方法用一步法组合了捕获和纯化步骤。
本发明还提供了制备重组体因子VIII的高度浓缩和非常纯溶液的有效方法，其中因子VIII蛋白针对降解作用具有稳定性。对于本发明，可以组合捕获和纯化步骤，同时FVIII分子没有严重的不稳定危险，并且可以在一步法中获得粗品样品的初始纯化，获得相当大的体积减少(由此便于更进一步的纯化步骤)，以及获得基本上纯化的因子(增加FVIII比活性)和产物溶液(“捕获池”)，其中蛋白针对降解作用是稳定的。
本发明概述 本发明涉及重组体蛋白的新的和有效的纯化方法，尤其是凝血因子VIII。本发明人已经发现，用多模式(multimodal)柱来捕获哺乳动物细胞培养液中的因子VIII分子，是从FVIII蛋白(从培养物中采集)中除去污染物的出人意外地快速和有效的纯化方法，并且蛋白的活性没有损失。
在一方面，本发明提供了纯化含有一或多种污染物的凝血因子VIII蛋白的方法，该方法包括下列步骤 (a)使因子VIII蛋白与含有配体的多模式或混合式树脂接触，该配体包含疏水性部分和带负电荷的部分； (b)用洗脱缓冲液将所述因子VIII蛋白洗脱，缓冲液含有至少1.5M的盐和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和钙离子。
在不同的实施方案中，该方法进一步包括步骤(c)，在该步骤中，将源于步骤(b)的含有因子VIII的溶液进行收集；和/或，该方法更进一步包括步骤(a1)，在该方法中，在步骤(a)之后和在步骤(b)之前，使一或多种洗涤缓冲液通过柱。
在其各种实施方案中，一或多种所述洗涤缓冲液包含10mM至1000mM盐，和/或步骤(b)的洗脱缓冲液含有至少2M的盐和至少45％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物，例如2.3-2.6M的盐和48-52％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物；和/或，包含在步骤(b)的洗脱缓冲液中的盐选自NaCl，NH4Cl，KCl，(NH4)2SO4，CH3CO2NH4，或这些中的两种或多种的混合物。
在另一个方面，本发明提供了纯化含有一或多种污染物的因子VIII蛋白的一步方法，该方法包括下列步骤 a)使蛋白与含有配体的多模式(multimodal)树脂接触，该配体包含疏水性部分和带负电荷的部分； b)用洗脱缓冲液将所述蛋白洗脱，缓冲液含有至少1.5M的盐和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和钙离子； 其中所述方法可以使柱体积减少大约250倍。
在另一个方面，本发明提供了纯化含有一或多种污染物的因子VIII蛋白的一步方法，该方法包括下列步骤 a)使蛋白与含有配体的多模式(multimodal)树脂接触，该配体包含疏水性部分和带负电荷的部分； b)用洗脱缓冲液将所述蛋白洗脱，缓冲液含有至少1.5M的盐和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和钙离子； 其中所述方法可以获得至少30倍的“纯化系数(purificationfactor)”。
在又一个方面，本发明提供了使因子VIII蛋白稳定的方法，该方法包括下列步骤 a)使蛋白与含有配体的多模式(multimodal)树脂接触，该配体包含疏水性部分和带负电荷的部分； b)用洗脱缓冲液将所述蛋白洗脱，缓冲液含有至少1.5M的盐和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和钙离子。
附图的简要说明

图1A是色谱图，其显示了用平衡、装填、洗涤和洗脱进行纯化操作时的在280nm时的UV吸收、电导率和pH值。
图1B显示了图1的色谱图的洗涤和洗脱部分的放大图。
图2显示了银染色的SDS凝胶电泳，其举例说明了在装填、流过(FT)和洗脱的纯化步骤中使用Capto MMC柱所获得的纯化。泳道1MW标准，泳道2细胞培养介质，泳道3空泳道，泳道4从Capto MMC柱穿过(没有结合物质)，泳道5空泳道，泳道6捕获池(从Capto MMC柱结合和洗脱的蛋白物质)。
图3是矩形图，显示了重组体因子VIII的百分比产率，其中使用Capto MMC树脂进行纯化，用含有各种浓度的NaCl或NH4Cl和乙二醇的不同洗脱缓冲液。
图4显示了重复冷冻/解冻循环对捕获池中因子VIII的稳定性的效果。
本发明的说明 纯化凝血因子VIII的本方法是通过使用多元(multimodal)色谱(使用疏水性的和带负电荷的树脂)来进行的。将准备纯化的蛋白溶液，例如，从哺乳动物细胞发酵作用中获得的含有蛋白的上清液，通过使溶液含有所述树脂的色谱柱，从而施加到多模式(multimodal)树脂上。一般将溶液(装填)过滤(例如，通过死端式过滤或交叉流过滤)和/或离心，以便在装填到树脂上之前除去细胞和颗粒。装填步骤不需要调节pH值或电导率。装填之后，一般用一或多种洗涤缓冲液洗涤柱，其中之一含有高浓度的盐。在一个实施方案中，装填之后，用平衡缓冲液洗涤柱，任选接着用第二个含有高浓度盐的缓冲液洗涤。
为了回收吸附的物质，使包含高浓度盐和有机溶剂的洗脱缓冲液通过柱来进行洗脱。
与装填样品的体积相比(和由其计算)，本发明提供了大约250倍的柱体积(CV)减少，由此获得出色的体积减小。“体积减少”是指当与含有蛋白的装填溶液(例如，得自于发酵工艺的澄清粗品样品)的体积相比时，含有蛋白的洗脱溶液体积的减少。
本发明的纯化方法进一步提供了70-100％的蛋白产率，并且纯化系数(比活性增加)最高达100倍。在-70℃，得到的纯化蛋白在洗脱缓冲液中至少可以稳定2个月。
此外，本发明方法可提供稳定的因子VIII溶液捕获洗脱物可以至少冷冻和解冻3次，而活性没有显著损失。
本发明使用多元(multimodal)色谱树脂从污染物中分离使人感兴趣的因子VIII蛋白。已经确定多元(multimodal)色谱(其中两种或多种不同的、但合作的(co-operative)位点与靶向相互作用)是纯化因子VIII蛋白的合适系统。在本发明中纯化重组蛋白所使用的色谱树脂是可商购的，例如Capto MMCTM(GE Healthcare)或MBI HyperCelTM(Pall，原来是BioSepra)。
Capto MMC含有配体(带有多模式(multimodal)官能团)，与传统离子交换剂相比，其可以得到不同的选择性，并且还可以在高达0.5M至1.0M的盐浓度下提供结合蛋白的可能性。本文的配体显示了与靶分子相互作用的不同的官能性，并由此呈现出离子相互作用、氢键合和疏水性相互作用。在本发明的一个实施方案中，多模式(multimodal)树脂是Capto MMCTM。
MBI HyperCelTM(Pall)(另一种多元(multimodal)色谱)可有效处理稳定性问题和蛋白基亲和柱的渗漏问题。更具体地说，MBIHypercelRTM(Pall)(吸附剂，包含巯基-苯并咪唑-磺酸配体)可以提供与所提供蛋白的疏水性以及离子性相互作用。可以将疏水性相互作用假设为由于芳香环系统，而离子相互作用应该由于SO3-取代基，其被称为强阳离子交换剂。另外，在一定条件下，MBI配体的芳香系统的氮原子是带电的，并因而可以提供与带负电荷基团的离子性相互作用。
在一个有利的实施方案中，污染物被吸收到多模式(multimodal)配体上，并且通过随后的选择性洗脱，将凝血因子VIII的基本上纯的馏份回收。捕获步骤可提供至少80倍的纯化系数(比活性增加)，例如80至100倍、90至100倍或100-160倍。
得到的捕获池包含至少10％纯度的因子VIII蛋白，例如至少20％或大约30％至60％的纯度，例如30％至50％纯度。以凝血因子VIII的量占蛋白总量的％(w/w)(例如，通过ELISA测定)来定义纯度。
在本方法的一个实施方案中，装填到多元(multimodal)色谱树脂上的溶液是含有因子VIII的、得自于哺乳动物细胞发酵作用的采集物。在其一个实施方案中，将所述采集物过滤和/或离心，以除去细胞和颗粒；在另一个实施方案中，将采集物装填到树脂上，不用调节装填溶液的pH值或电导率。
本发明具体包括一种方法，在该方法中，装填步骤包括在与含有凝血因子VIII的采集物的pH值和电导率相类似的pH值和电导率条件下，将含有蛋白的装填溶液装填到树脂上，其中采集物得自于哺乳动物细胞发酵作用，任选是经过过滤的采集物。
通过限制体积(否则需要调节(降低)装填溶液的电导率)，这可以在初始捕获步骤中提供更大的优点。
在一个实施方案中，通过加入咪唑(例如，每升采集物加入1-10mmol咪唑)，使含有因子VIII的采集物稳定化。与采集物的体积相比，由于所加入咪唑的数量和体积很小，采集物的pH值和/或电导率的任何变化可以忽略不计。在进一步实施方案中，然后将采集物(i)过滤和/或离心，以除去细胞和颗粒，和(ii)装填到树脂上，而不用进一步加入化学试剂。
本发明的方法一般进行若干步骤柱的平衡、装填和洗脱。装填之后和洗脱之前，可以包括一个或多个洗涤步骤。洗涤步骤一般使用至少一种含有高浓度盐的缓冲液进行。在一个实施方案中，使用缓冲液来进行洗涤步骤，该缓冲液包含10mM至1000mM盐，例如100-1000mM盐，或250-1000mM盐，或500-1000mM盐，或500-800mM盐。在另一个实施方案中，该方法包括洗涤步骤，在该步骤中，装填之后，将柱首先用平衡缓冲液洗涤，然后用含有高盐的第二个缓冲液洗涤。
在一个实施方案中，平衡缓冲液包含缓冲剂(例如，5mM至100mM范围内的咪唑，例如20mM咪唑)，Ca盐(1mM至100mM，例如10mMCaCl2)，洗涤剂(例如0.001％至0.1％(w/v)范围内的TweenTM 80，例如0.02％(w/v)TweenTM 80)和盐(10mM至1000mM，例如50mM NaCl)。平衡缓冲液保持6.0至8.0的pH值条件下；优选，pH条件保持在7.3至7.5。本领域技术人员可以理解，本文举例说明的因子VIII蛋白在大约6.0至8.0的pH值条件下是稳定的，并由此平衡缓冲液是在7.3-7.5的pH值条件下，更优选pH7.5。
在一个实施方案中，洗涤缓冲液包含缓冲剂(例如，5mM至100mM范围内的咪唑，例如20mM咪唑)，Ca盐(1mM至100mM，例如10mMCaCl2)，洗涤剂(例如0.001％至0.1％(w/v)范围内的TweenTM 80，例如0.02％(w/v)Tween 80)和盐(例如在50mM至1000mM范围内的NaCl)。
用洗脱缓冲液进行洗脱步骤，缓冲液包含至少1.5M的盐和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和钙离子(1mM至100mM，例如10mM CaCl2)。洗脱缓冲液具有6.0至8.0的pH值；优选，pH条件保持在7.3至7.5。为了保持目标pH值条件，洗脱缓冲液还含有缓冲剂。
术语“缓冲剂”包括能够使溶液pH值保持在目标范围之内的那些试剂，在本发明的范围内，目标范围在6.0至8.0、例如7.3至7.5范围内。为了保持溶液的优选pH值，应该选择缓冲液浓度范围。缓冲剂还可以是至少两种缓冲剂的混合物，其中该混合物能够提供特定范围的pH值。
缓冲剂可以包括但不局限于柠檬酸(钠或钾)盐，乙酸(铵、钠或钙)盐，组氨酸(L-组氨酸)，磷酸(钠或钾)盐，酒石酸，琥珀酸，MES，HEPES，咪唑，TRIS，乙醇胺，和其两种或多种的混合物。在一个实施方案中，使用的缓冲剂是在5mM至100mM范围内的咪唑。
优选的盐是NaCl，NH4Cl，KCl，(NH4)2SO4，CH3CO2NH4(乙酸铵，NH4Ac)，或其两种或多种的混合物。在一个实施方案中，洗脱缓冲液包含大约2.5M的盐和至少40％的二醇；在另一个实施方案中，洗脱缓冲液包含大约2.5M的盐和大约50％的二醇。在一个实施方案中，盐是NaCl；在另一个实施方案中，盐是NH4Cl。在一个实施方案中，二醇是乙二醇；在另一个实施方案中，二醇是丙二醇。在又一个实施方案中，洗脱缓冲液包含NaCl和乙二醇。
在另一个实施方案中，浓度2.5M的NH4Cl与乙二醇也用于洗脱蛋白。在又一个实施方案中，洗脱缓冲液进一步包含洗涤剂。在本方法的一个具体实施方案中，洗脱液是20mM咪唑、10mM CaCl2、0.02％(v/v)Tween 80、2.5M NaCl和8M乙二醇(pH7.5)。
在另一个实施方案中，MBI HyperCelTM树脂在本方法中用于纯化因子VIII。在一个实施方案中，向采集物中加入100mM Na2SO4之后，使用MBI HyperCelTM柱进行重组体因子VIII的结合，用1M NaCl和5M丙三醇进行洗脱。
在本发明的一个具体实施方案中，本方法包括下列步骤 a)使因子VIII与含有配体的多模式(multimodal)或混合式树脂接触，该配体包含疏水性部分和带负电荷的部分； b)用平衡缓冲液和洗涤缓冲液通过柱，平衡缓冲液包含20mM咪唑，10mM CaCl2，0.02％(w/v)Tween 80和50mM NaCl，洗涤缓冲液包含20mM咪唑，10mM CaCl2，0.02％(w/v)Tween 80和1.5M NaCl； c)用洗脱缓冲液洗脱所述蛋白，洗脱缓冲液包含20mM咪唑、10mMCaCl2、0.02％(v/v)Tween 80、2.5M NaCl和8M乙二醇。
在最通常的情况下，纯化重组蛋白质(在哺乳动物细胞中表达)的第一步操作大的装填体积。对于商业化的蛋白纯化，重要的是减少体积，以达到容易操作。此外，对于商业或其它目的，纯化步骤必须具有显著的产率，以便获得经济性的方法。在第一步中，大约20至100倍的体积减少的目的在于，在蛋白纯化的第一步中，认为纯化是充分的体积减少。
在一个实施方案中，含有将要纯化的蛋白的装填体积超过500柱体积(CV)。洗脱后的蛋白提供超过100倍的最终体积减少。本发明包括50-600CV的装填体积。优选，体积减少是大约100-300倍。在一个实施方案中，装填体积大约为500CV，或大约为450-600CV，并且用大约2CV来洗脱因子VIII蛋白，获得大约250倍的体积减少。
在另一个实施方案中，捕获步骤可以与一或多种病毒灭活剂结合，例如Triton X-100(例如，大约1％(w/v)的浓度)。病毒灭活剂可以例如加入到一或多种所使用的缓冲液中。
除洗脱和现场清洗(CIP)步骤(其中流速是30-350cm/h)之外，对于本纯化方法的所有步骤，流速控制在300-950cm/hr之间。
在一个实施方案中，装填流速是450cm/h；在洗脱和CIP期间，流速减少到30cm/h。在本发明的一个实施方案中，装填流速大约为450-600cm/h。
在一方面，本发明还涉及包含下列的制剂 (i)因子VIII蛋白；和(ii)缓冲液，其含有至少1.5M的盐和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和钙离子； 其中因子VIII是30％至60％纯度。
定义 在本发明中，“因子VIII蛋白”是指包括全长因子VIII、FVIII:C和具有凝结活性的全长因子VIII的缺失衍生物。对于缺失衍生物，它是指其中B区域的全部或部分失去、同时保留凝结活性的因子VIII。因子VIII的这种B区域缺失形式描述在例如WO91/09122中。通常，因子VIII的结构和生物化学已经由Kaufman进行了描述(Trends inBiotechnology，9，p.353-359(1991)and Hematology，63，p.155-165(1991))。还包括因子VIII序列变体和衍生物，包括因子VIII的PEG化的、酰化的和多唾液酸化(polysialylated)形式，同时保持特征性的因子VIII生物活性。因子VIII可以通过重组方法获得。在一个实施方案中，因子VII是重组制备的因子VIII。在一个实施方案中，因子VIII是全长因子VIII；在另一个实施方案中，因子VIII蛋白是B区域缺失的因子VIII。在又一个实施方案中，因子VIII是PEG化的、酰化的或多唾液酸化的因子VIII。
衍生自人血浆的因子VIII浓缩物含有一些不完整的完全活性的因子VIII形式，如下列所描述Andersson等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，p.2979-2983(1986))。最小的活性形式具有170kDa的分子量，并且由90kDa和80kDa的两个链组成，两个链通过金属离子结合在一起(参见，例如EP197901)。还包括这种因子VIII片段，这种片段的纯化构成本发明的一个实施方案。
按照例如实验部分中描述的方法来试验因子VIII的生物活性(见下文)。
术语“洗脱液”是指本领域所确定的其常规含义，其是具有合适的pH值和/或离子强度的缓冲液，以便从分离基质中释放一或多种蛋白或化合物。
在洗脱步骤中，本文使用的“盐”是指碱土金属盐、碱金属盐或铵盐，即，具有源于碱土或碱金属元素的阳离子或铵阳离子和具有无机或有机(基于烃)阴离子的盐。这种盐的实例包括氯化钠，氯化铵，枸橼酸钠，柠檬酸钾，氯化钾，氯化镁，氯化钙，磷酸钠，磷酸钙，磷酸铵，磷酸镁，磷酸钾，硫酸钠，硫酸铵，硫酸钾，硫酸镁，硫酸钙，等等。本文优选的盐是氯化物或硫酸盐。本文最优选的盐是氯化钠。
术语“多元色谱配体”是指能够提供至少两种不同的、但合作的位点的配体，该位点与所要结合的蛋白相互作用。这些位点之一在配体和感兴趣的物质之间给出吸引类型的电荷-电荷相互作用。另一个位点一般提供电子受体-供体相互作用和/或疏水和/或亲水相互作用。本发明尤其涉及疏水性相互作用。电子供体-受体相互作用包括例如下列相互作用氢键，.pi-.pi，cation-.pi，电荷转移，偶极-偶极，诱导偶极等等。本文或其它地方使用的多元色谱配体亦称为“混合模式”色谱配体。
在液相色谱的范围内，术语“捕获步骤”指的是分离方法的初始步骤。最通常，捕获步骤包括从可溶性污染物中净化、浓缩、稳定和显著的纯化。捕获步骤之后，可以接着进行中间物纯化，纯化可以除去大部分显著的杂质，包括DNA、病毒和内毒素。这些杂质还可以在捕获过程中除去/减少。
术语“精制步骤”是指最后的纯化步骤，在该步骤中，除去痕量染污物和杂质，并且得到活性生物制品。在精制步骤期间除去的污染物常常是靶分子的构象异构体，或可能是渗漏的产品。
色谱领域已知的术语“柱体积”是指含有填装物的管部分的几何体积。按照本发明，装填体积超过50柱体积(CV)或多于或小于大约300-600CV或450-600CV。在纯化的最后步骤洗脱的蛋白大约为2-5CV，获得大约100倍至350倍的体积减少，例如250倍。
“纯化系数”定义为比活性的增加也就是说，纯化步骤之前的U/mg蛋白与纯化步骤之后的U/mg蛋白相比值。
利用商业上可得到的活性试验，例如按照制造商的方案使用CoaTest

ChromogenixTM(Instrumentation Laboratory，Belgium)，或下面实验部分中描述的方法，可以试验凝血因子VIII的比活性。
术语“一步法”是指纯化含有一或多种污染物的因子VIII蛋白的方法，其中该方法可同时获得体积减少和比活性增加(纯化系数＞1)。
在本发明的一个实施方案中，该方法可提供(i)大约250倍的柱体积减少，和(ii)至少30倍的“纯化系数”。
参考下列实施例，可以更充分地理解本发明。然而，不应该将这些实施例理解为限制本发明的范围。
实施例 过去已经描述了重组体因子VIII的结构和生物化学。(参见，例如Trends in Biotechnol.1991，9353-359，Transfus.Med.Rev.1992，6235-246。
此外，本领域还描述了因子VIII的分离以及因子VIII的重组体生成(全长和变体/截短形式) 重组DNA技术已经可以构成质粒，其在转染哺乳动物细胞中控制因子VIII蛋白的融合产物的表达。在细胞培养物中的因子VIII的重组体生成由Wood等人进行了报道(参见Nature，1984，312330-337)。还报道了因子VIII蛋白的活性变体和类似物和编码它们的DNA序列(US4868112，EP0786474，WO 86/06101和WO 87/07144)。遗传序列的各种操作已经表明，因子VIII的B区域对于促凝血活性不是关键性的，并且活性促凝血蛋白可以通过表达编码因子VIII的、缺乏B区域的核苷酸区域来表达。在这种变体和类似物中，重要的修饰包括部分或所有B区域失去，和/或具体氨基酸位置发生改变，例如，这样就可以使正常蛋白酶-不稳定位点对解朊作用(例如通过凝血酶或活化蛋白C)具有抗性。其它类似物包括在一或多种赖氨酸和/或酪氨酸残基处的修饰。蛋白的截短形式是由1438个氨基酸组成的170kDa糖蛋白。这种B区域缺失的蛋白是血浆衍生的因子VIII的翻译后修饰，并且在抗血友病活性方面可以与母体相比。
因子VIII活性试验 评价凝血因子VIII的生物活性的试验对技术人员来说是众所周知的，并且这种试验可以在商业上得自于许多供应者。
纯化因子VIII的活性可以例如按照制造商的方案、使用CoaTest

Chromogenix(Instrumentation Laboratory，Belgium)来试验。
实施例1 因子VIII的重组体生成在本领域是众所周知的；参考文献可以是例如US 5633150(Genentech)和US 7138505(Novo Nordisk/Novartis)。
在可商购的不含血清的介质中，在CHO细胞中表达重组体因子VIII。得自于发酵作用的蛋白采集物进一步用于纯化。
实施例2 重组体因子VIII的纯化 Capto MMC(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)树脂用于重组蛋白的纯化。用12cm的床高度和24ml床体积填装柱。
对于第一步，纯化方法包括装填，其中将得自于发酵作用的采集物施加到柱上。装填的柱体积(CV)是450CV(表1)。而后，使平衡缓冲液通过柱，平衡缓冲液由20mM咪唑、10mM CaCl2、0.02％(v/v)Tween 80和50mM NaCl组成。将平衡缓冲液的pH值调节至7.5。在pH值等于平衡缓冲液的pH值(即7.5)的条件下，将柱进一步用洗涤缓冲液(20mM咪唑，10mM CaCl2，0.02％(v/v)Tween 80和1.5M NaCl)洗涤。平衡和洗涤步骤的柱体积是3CV(表1)。
表1.在因子VIII纯化的各个步骤中使用的柱体积(CV) 使洗脱缓冲液通过柱，进行洗脱。洗脱缓冲液由20mM咪唑、10mMCaCl2、0.02％(v/v)Tween 80和2.5M NaCl和8M乙二醇组成。
除洗脱和CIP(在此期间，流速是30cm/h)之外，在纯化的所有步骤中，流速保持在450cm/h。
在通过平衡、装填、洗涤和洗脱进行操作的纯化过程中，表明在280nm处的UV吸收的色谱图，提供于图1中。
实施例3 活性试验 使用CoaTest

SP试验的改型来测定纯化因子VIII的活性 使用得自于CoaTest

SP试剂盒的试剂和缓冲液储备溶液。在开始实验之前，使所有的试剂达到室温。将样品在CoaTest试验缓冲液(50mMTris，150mM NaCl，1％BSA，pH7.3，含有防腐剂)中稀释至大约2mU/ml。将参比血浆在试验缓冲液中稀释至5-0.5mU/ml。将样品在试验缓冲液中稀释至12和9U/ml，然后在缺乏FVIII的血浆(含有VWF(DadeBehring))中稀释10倍，最后在CoaTest

试验缓冲液中稀释10和20倍((每种试样产生4个稀释度)。将50μl样品、标准样品和缓冲液阴性对照加入到96孔微孔板(Nunc)中，一式两份。将因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl2(得自于CoaTest

SP试剂盒)以5∶1∶3(vol∶vol∶vol)的比例混合，并将其75μl加入到孔中。在室温下培养15min之后，加入50μl因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581的混合物，在室温下培养反应10min，而后加入25μl 2％枸橼酸。在Spectramax

微孔板读数器(Molecular Devices)上测定415nm处的吸光度，以及用作参考波长的620nm处的吸光度。从所有样品中减去阴性对照值，通过吸光度值对FVIII浓度(mU/ml)作图的线性回归制作标准曲线。
ELISA试验 基本上按照制造商所描述的方法，使用商业ELISA试剂盒(得自于Affinity Biologicals(VisuLize因子VIII抗原试剂盒，Lot AG8-0006))测定因子VIII抗原。
从上面实施例2中描述的发酵采集物中纯化重组体因子VIII。利用上述CoA和ELISA，测定因子VIII蛋白的纯化系数和产率 纯化凝血因子和产率(利用CoA试验测定)(表2) 从上面的结果可知，有可能将含有FVIII的介质从11000ml浓缩至45ml(244倍)，同时比活性从55U/mg增加至5300U/mg，例如，获得96倍的纯化系数(通过活性测量法测定)。
纯化系数和产率(利用ELISA测定)(表3) 从上面的结果可知，有可能将含有FVIII的介质从11000ml浓缩至45ml(244倍)，同时比活性从0.0046mg因子VIII/mg总蛋白增加至0.6mg因子VIII/mg总蛋白，例如，获得130倍的纯化系数(通过ELISA测定)。
实施例4 蛋白凝胶电泳 基本上按照制造商(Invitrogen)的描述，使用7％NuPage

tris乙酸盐凝胶，使用tris乙酸盐作为运行缓冲液，进行SDS凝胶电泳。简要地说，在150伏特将凝胶电泳进行50min，并按照制造商说明书中描述的方法，将样品用SilverQuest

染色试剂盒(Invitrogen)进行染色。使用的分子量(MW)标准是Mark12(得自于Invitrogen)。
示于图2的结果显示，在捕获池中重组体因子VIII的富集程度很高，这可以通过存在高数量的重链(HC)和轻链(LC)谱带而得到说明(通过图2中的箭头表明)。
实施例5 通过SDS-凝胶电泳显现的纯化 在含有50mM DTT的LDS样品缓冲液(Invitrogen)中，将用于电泳的蛋白样品在70℃下变性和还原10分钟。分离凝胶是7％tris-乙酸盐(TA)Pre-Cast Novex聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)，并在150V的极限电压下进行电泳60min，用tris-乙酸盐缓冲液(Invitrogen)作为阳极和阴极缓冲液。按照制造商的说明书，使用SilverQuest

(Invitrogen)进行银染色。
凝胶举例说明了使用捕获MMC柱获得的大量纯化。细胞介质含有一系列蛋白。使这些蛋白的大部分通过柱，而因子VIII在柱的捕获池中高度浓缩。
实施例6 洗脱条件 对于Capto MMC树脂试验各种洗脱条件。向含有重组体因子VIII的采集物中加入丙三醇(5％最后浓度)和CHAPS(5mM)。用20mM咪唑、10mM CaCl2、Tween 80(0.2％v/v)、50mM NaCl、5mM CHAPS和5％丙三醇的平衡缓冲液(pH7.5)进行平衡。
使用20mM乙醇胺、10mM CaCl2、Tween 80(0.2％v/v)的洗脱缓冲液(pH8.3)，含有不同的盐和乙二醇浓度，其包括a.不加入；b.1MNH4Cl；c.2.5M NH4Cl；d.3M乙二醇；e.1M NH4Cl+3M乙二醇；f.2.5MNH4Cl+3M乙二醇；g.8M乙二醇；h.1M NH4Cl+8M乙二醇；I.2.5MNH4Cl+8M乙二醇；2.5M NaCl+8M乙二醇。基于百分比产率测定洗脱条件。图3表明，在2.5M NH4Cl或2.5M NaCl和8M乙二醇的浓度条件下，蛋白的百分比产率最大(图3)。
实施例7 捕获池的冷冻/解冻稳定性 对捕获池的等分样品(从实施例2中描述的Capto MMC树脂中洗脱)进行多次冷冻/解冻循环，在-80℃冷冻过夜，而后在第二天、在4℃解冻。在实验的最后，使用CoA试验(实施例3中描述的CoaTest

ChromogenixTM)同时对所有样品测定因子VIII活性。
表4.重复冷冻/解冻循环之后的捕获池中的因子VIII的比活性
权利要求
1.纯化含有一或多种污染物的凝血因子VIII蛋白的方法，该方法包括下列步骤
(a)使因子VIII蛋白与含有配体的多模式或混合模式树脂接触，该配体包含疏水性部分和带负电荷的部分；
(b)用洗脱缓冲液将所述因子VIII蛋白洗脱，缓冲液含有至少1.5M的盐和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和钙离子。
2.按照权利要求1的方法，进一步包括步骤(c)其中将源于步骤(b)的含有因子VIII的溶液进行收集。
3.按照权利要求1的方法，进一步包括步骤(a1)其中在步骤(a)之后和步骤(b)之前，使一或多种洗涤缓冲液通过柱。
4.按照权利要求3的方法，其中一或多种洗涤缓冲液包含10mM至1000mM盐。
5.按照权利要求4的方法，其中洗涤缓冲液含有0.5-0.8M盐。
6.按照权利要求1-5的任一项的方法，其中步骤(b)的洗脱缓冲液含有至少2M的盐和至少45％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物。
7.按照权利要求6的方法，其中步骤(b)的洗脱缓冲液含有2.3-2.6M的盐和48-52％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物。
8.按照权利要求1-7的任一项的方法，其中包含在步骤(b)的洗脱缓冲液中的盐选自NaCl，NH4Cl，KCl，(NH4)2SO4，CH3CO2NH4，或这些中的两种或多种的混合物。
9.按照权利要求8的方法，其中所述洗脱缓冲液含有NaCl和乙二醇。
10.按照权利要求1的方法，其中洗脱缓冲液含有1mM至100mM浓度的钙离子。
11.按照权利要求1-10的任一项的方法，其中步骤(a)是如下进行的
(i)在pH值等于装填溶液的pH值的条件下，和/或
(ii)不调节电导率。
12.按照权利要求1-11的任一项的方法，其中因子VIII蛋白选自全长因子VIII，FVIII:C，因子VIII的B区域缺失形式，因子VIII的PEG化的衍生物，因子VIII的多唾液酸化(polysialylated)的衍生物，和其组合，优选因子VIII的B区域缺失形式。
13.按照权利要求1-12的任一项的方法，其中步骤(b)中的洗脱缓冲液由下列组成20mM咪唑，10mM CaCl2，0.02％(w/v)Tween 80和2.5MNaCl和gM乙二醇，pH值大约7.5。
14.纯化含有一或多种污染物的因子VIII蛋白的一步法，该方法包括下列步骤
a)使蛋白与含有配体的多模式树脂接触，该配体包含疏水性部分和带负电荷的部分；
b)用洗脱缓冲液将所述蛋白洗脱，缓冲液含有至少1.5M的盐和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物，和钙离子；
其中所述方法使柱体积减少大约250倍。
15.纯化含有一或多种污染物的因子VIII蛋白的一步法，该方法包括下列步骤
a)使蛋白与含有配体的多模式树脂接触，该配体包含疏水性部分和带负电荷的部分；
b)用洗脱缓冲液将所述蛋白洗脱，缓冲液含有至少1.5M的盐和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物，和钙离子；
其中所述方法获得至少30倍的“纯化系数”。
16.使因子VIII蛋白稳定的方法，该方法包括下列步骤
a)使蛋白与含有配体的多模式树脂接触，该配体包含疏水性部分和带负电荷的部分；
b)用洗脱缓冲液将所述蛋白洗脱，缓冲液含有至少1.5M的盐和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物，和钙离子。
全文摘要
本文描述了使用含有配体的多模式或混合式树脂来纯化重组蛋白质的方法，其中配体包含疏水性部分和带负电荷的部分。本发明具有以下优点它是单步色谱方法，在装填步骤期间不需要调节pH值或电导率，并且具有高的产率和效能。该方法用于凝血因子的重组体组合物的纯化，尤其是重组体因子VIII。
文档编号C07K14/755GK101730707SQ200880023645
公开日2010年6月9日 申请日期2008年7月11日 优先权日2007年7月11日
发明者S·邦, L·西姆, J·卡尔森 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司