嵌合水痘带状疱疹病毒病毒样颗粒的制作方法

专利名称：嵌合水痘带状疱疹病毒病毒样颗粒的制作方法
嵌合水痘带状疱疹病毒病毒样颗粒相关申请本申请要求2007年9月9日提交的美国申请60/970，592,2008年5月20日提交的美国申请61/071，835、和2007年7月19日提交的美国申请60/950，707的优先权，本文 出于所有目的通过提及而收录所有申请。对电子形式提交的文本文件的描述本文通过提及而完整收录与本文一起以电子形式提交的文本文件的内容计算机可阅读形式拷贝的序列列表(文件名N0VV 035 02W0SeqList_ST25. txt，2008年7月21日 记录的数据，文件大小37千字节)。
背景技术：
水痘带状疱疹病毒(VZV)(也称为人疱疹病毒3(HHV_3))是病毒疱疹病毒科(Herpesviridae)白勺 α(alphaherpesvirus subfamily)白勺。VZV i—禾中 有包膜病毒，具有约125，000个核苷酸的线性双链DNA基因组。它的基因组被二十面体核 壳体装入。位于核壳体和病毒包膜间间隔的间层是由病毒编码的蛋白质和酶构成的结构。 病毒包膜是从宿主细胞膜获得的，并且含有病毒编码的糖蛋白。人疱疹病毒中最小的VZV基因组编码至少70个可读框，其中8个编码推定的 糖蛋白(gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM)，它们在病毒复制周期的不同步骤中发挥功能。 糖蛋白E(gE，也称为ORF 68)对于病毒复制是必要的(Mallory等(1997) J. Virol. 71 8279-8288 ；Mo等(2002) Virology 304 176-186)，并且是受感染细胞以及成熟病毒体中存 在的最丰富的糖蛋白(Grose, 2002, The predominant varicella-zoster virus gE and gl glycoproteincomplex,In Structure-function relationships of human pathogenic viruses, Holzenburg 禾口 Bogner (编)，Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY)。糖蛋白I (gl，也称为ORF 67)在受感染的细胞中与gE形成复合物，这便于两种糖蛋 白质的胞吞，并将它们引导至反式高尔基体(trans-Golgi)，在那里获得最终的病毒包膜 (Olson 和 Grose (1998) J.Virol. 72 1542-1551)。糖蛋白 B(gB，也称为 ORF 31)(认为其在 病毒进入中发挥作用)结合中和性抗体，并且是第二普遍的糖蛋白(综述于Arvin(1996) Clin. Microbiol. Rev. 9 361-381) 0认为糖蛋白H(gH)具有便于病毒的细胞间传播的 融合功能。针对gE、gB、和gH的抗体在天然感染后和疫苗接种后是普遍的，并且已经显 示了在体外中和病毒感染性(Keller 等(1984) J. Virol. 52 293-297 ；Arvin 等(1986) J. Immunol. 137 1346-1351 ；Vafai 等(1988)J.Virol. 62 :2544_2551 ；Forghani 等(1990) J.Clin. Microbiol. 28 :2500_2506)。用VZV的初次感染引起禽痘(水痘)，其特征在于主要在面部和躯干上发生的极端 传染性的皮疹。初始感染后，病毒DNA可以整合入宿主神经元细胞的基因组中，并保持潜伏 达数年。病毒可以再活化，并在成人中引起疾病带状疱疹(shingles，herpes zoster) 0带 状疱疹产生的皮疹不同于初次感染过程中产生的。皮疹与严重的疼痛有关，并且可以导致 更严重的疾患，诸如疱疹后神经痛(post-herpetic neuralgia)。水痘疫苗(Varivax)是公众可获得的，并且已经在数个国家(包括美国)被添加至推荐的儿童疫苗接种日程表。更浓的水痘疫苗(Zostavax)配制剂已得到食品药品管理 局(Food and Drug Administration)批准用于在人群的老年成员中预防带状疱疹。虽然 已经证明了水痘疫苗是安全的，但是有一些如下的证据，即由疫苗赋予的对VAV感染的免 疫随时间而减弱(Chaves等(2007) N. Engl. J. Med. 356 :1121_1129)。因此，经过疫苗接种的 个体仍会对带状疱疹，即由VZV引起的更为严重的疾患易感。另外，疫苗是由活的减毒病毒 制成的，这产生从疫苗接种形成禽痘或带状疱疹的个体的可能性。实际上，已经有数例报告 的似乎由疫苗中使用的毒株所引起的带状疱疹病例(Matsubara等(1995). Acta Paediatr Jpn 37 648-50 ；Hammerschlag 等(1989). J Infect Dis. 160 :535_7)。疫苗中存在的活的 减毒病毒还限制了疫苗在无免疫应答的个体中的应用。
病毒样颗粒(virus like particle ；VLP)在结构上类似于成熟的病毒体，但是缺 乏病毒基因组而使其不可能发生病毒复制。VLP含有类似完整病毒的抗原性蛋白质，诸如壳 体和病毒包膜蛋白，并且也可以进行构建以在其表面上表达外来结构蛋白。因此，VLP可以 作为免疫原性组合物(例如疫苗)安全施用。此外，因为VLP类似天然病毒，而且是多价颗 粒结构，所以VLP可以比可溶性抗原更有效地诱导中和性抗体。先前已经从不同疱疹病毒科成员生成了表达糖蛋白或间层蛋白的VLP。由有包膜 的间层蛋白构成的轻颗粒(L颗粒)已经获自用单纯疱疹病毒1型(HSV-I)、马疱疹病毒 1 型(EHV-I)、或假狂犬病病毒感染的细胞(McLauchlan 和 Rixon (1992) J. Gen. Virol. 73 269-276 ；美国专利号5，384，122)。可以通过在存在病毒DNA复制抑制剂的情况中用HSV-I 感染细胞来生成不同类型的VLP，其称作病毒DNA复制前包膜颗粒(PREP)。PREP在结构上 类似L颗粒，但是含有不同的蛋白质组成(Dargan等(1995) J. Virol. 69 =4924-4932 ；美国 专利号5，994，116)。已经通过使用由酵母Ty反转录转座子编码的蛋白pi进行的技术来 生成表达来自VZV的gE蛋白的片段的杂合VLP (Garcia-Valcarcel等(1997) Vaccine 15 709-719 ；Welsh 等(1999) J. Med. Virol. 59 :78_83 ；美国专利号 6，060，064)。本发明描述了 新的嵌合VLP，其包含至少一种VZV蛋白，但是不包含酵母Ty蛋白。发明概述本发明包含一种纯化的嵌合VLP，其包含病毒核心蛋白和至少一种水痘带状疱疹 病毒(VZV)蛋白，其中所述VLP不包含酵母Ty蛋白，而且不包含VZV核酸。在一个实施方 案中，所述VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞外域和异源蛋白的跨膜和/或胞质结 构域。在另一个实施方案中，所述异源蛋白与所述病毒核心蛋白结合。在另一个实施方案 中，所述VZV蛋白选自下组gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM。在另一个实施方案中，所述 VZV蛋白是gE和/或gl。在另一个实施方案中，所述异源蛋白的所述跨膜和/或胞质结构 域来自流感病毒。在另一个实施方案中，所述流感病毒蛋白是血凝素(HA)和/或神经氨酸 酶(NA)。在另一个实施方案中，所述HA和/或NA来自甲型流感病毒/印尼/5/05。在另 一个实施方案中，所述病毒核心来自正粘病毒(orthomyxovirus)。在另一个实施方案中，所 述病毒核心来自副粘病毒(paramyxovirus)。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP包含SEQ ID NO. 1 和 / 或 SEQ ID N0. 9。本发明还包含一种生成嵌合VLP的方法，包括将编码至少一种VZV蛋白和病毒核 心蛋白的载体转染入合适的宿主细胞中，并在容许VLP形成的条件下表达所述嵌合VZV和 病毒核心蛋白，其中所述宿主细胞不包含酵母Ty蛋白。在一个实施方案中，所述VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞外域和异源蛋白的跨膜和/或胞质结构域。在另一个实施方案中，所述VZV蛋白是gE和/或gl。在另一个实施方案中，所述异源蛋白与所述病毒 核心蛋白结合。在另一个实施方案中，所述异源蛋白的所述跨膜和/或胞质结构域来自流 感病毒。在另一个实施方案中，所述核心是来自甲型流感病毒/印尼/5/05的流感病毒Ml。本发明还包含一种抗原性配制剂，其包含VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一种VZV蛋白和病毒核心蛋白，并且不包含酵母Ty蛋白。在一个实施方案中，至少一种VZV蛋白 是嵌合的，并且选自下组gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM。在另一个实施方案中，所述VZV 蛋白是gE和/或gl。在另一个实施方案中，所述VZV蛋白是gE和/或gl。在另一个实施 方案中，所述核心蛋白是来自甲型流感病毒/印尼/5/05的流感病毒Ml。本发明还包含一种疫苗，其包含嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一种VZV蛋白和病毒核心蛋白，并且不包含酵母Ty蛋白。在一个实施方案中，至少一种VZV蛋白是嵌 合的，并且选自下组gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM。在另一个实施方案中，所述VZV蛋白 是gE和/或gl。在另一个实施方案中，所述VZV蛋白是gE和/或gl。在另一个实施方案 中，所述核心蛋白是来自甲型流感病毒/印尼/5/05的流感病毒Ml (SEQ ID NO. 9)。本发明还包含一种在人或动物中引发针对感染的保护性免疫的方法，包括给所述人或动物施用包含嵌合VZV-VLP的抗原性配制剂或疫苗，其中所述嵌合VZV-VLP包含至少 一种VZV蛋白和病毒核心蛋白，其中所述嵌合VLP不包含酵母Ty蛋白，而且不包含VZV核 酸。附图简述

图1描绘了(A)AcMNPV杆状病毒多角体蛋白启动子(PolH)下游的嵌合VZV gE基 因与甲型禽流感/印尼/5/05 (H5W)的流感跨膜和C末端胞外域和(B)用考马斯蓝染色的 SDS-PAGE (左侧小图)和用抗E单克隆抗体进行的Western印迹(右侧小图)。图2描绘了对纯化的嵌合VZV gE VLP的EM分析。用PTA对VZV gE (HATM/CT) / Indo Ml嵌合VLP进行的电子显微镜(EM)负染色(高放大率)。黑色条带表示lOOnm。图3描绘了对纯化的嵌合VZV gE VLP的免疫金EM分析。VZV gE (HATM/CT)/Indo Ml嵌合VLP的免疫金EM图像。㈧是对照，而⑶描绘了位于嵌合VLP上的6nm金颗粒。 黑色条带表示lOOnm。发明详述如本文中所使用的，术语“病毒样颗粒”(VLP)指在至少一种属性上类似病毒但是 已经证明其没有感染性的结构。依照本发明的病毒样颗粒不携带编码所述病毒样颗粒的蛋 白质的遗传信息，并且不包含Ty酵母蛋白或其部分。一般而言，病毒样颗粒缺乏病毒基因 组，并且不能复制。另外，病毒样颗粒通常可以通过异源表达来大量生产，而且可以容易地 纯化。该术语还指通过下文所描述的方法生成的任何亚病毒颗粒。此术语包括可以通过下 文所描述的或本领域中已知的任何方法纯化的蛋白质聚集物。如本文中所使用的，术语“嵌合的”或“嵌合蛋白，，指包含不是由VZV生成的模块 的部分的蛋白质。该术语排除酵母Ty-pl-VZV融合蛋白。一般而言，该术语指与异源蛋白 的跨膜和/或胞质结构域融合的VZV胞外域。如本文中所使用的，术语“核心”蛋白指驱动出芽和颗粒从宿主细胞的释放的蛋白 质。如本文中所使用的，术语“核心”和“基质”蛋白可互换使用。驱动出芽和颗粒从宿主细胞的释放的核心蛋白的例子包含流感Ml和新城疫蛋白M。如本文中所使用的，术语“抗原性配制剂”或“抗原性组合物”指在给脊椎动物(例 如哺乳动物)施用时会诱导免疫应答的制备物。如本文中所使用的，术语“纯化的VLP ”指本发明的VLP制备物，其至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大地不含混合物 中其它分子(不包括溶剂在内)。例如，本发明的VLP可以基本上没有与制备本发明的VLP 有关的其它病毒、蛋白质、脂质、和碳水化合物。该术语还涵盖已经从具有污染的VZV基因 组DNA或其部分的VLP分离的VLP。如本文中所使用的，术语“嵌合VLP”指含有来自至少两种不同病毒的蛋白质(异 源蛋白)或其部分的VLP。出于本发明的目的，所述蛋白质之一衍生自可以驱动VLP自宿主 细胞形成的病毒(例如流感Ml)，而另一种蛋白质是嵌合VZV蛋白。如本文中所使用的，术语“疫苗”指含有本发明VLP的配制剂，其处于能够向脊椎 动物施用的形式，而且其诱导的保护性免疫应答足以诱导免疫以预防和/或改善感染和/ 或减轻至少一种感染症状和/或增强另一剂VLP的功效。如本文中所使用的，术语“有效量”指实现想要的生物学效应所必需的或足以实现 想要的生物学效应的VLP的量。组合物的有效量将是达到选定结果的量，并且该量可以由 本领域技术人员作为常规事项确定。例如，用于预防、治疗和/或改善感染的有效量可以是 引起免疫系统活化所必需的量，其导致在暴露于本发明VLP时形成抗原特异性免疫应答。 该术语也是“足够量”的同义词。如本文中所使用的，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”指由脊椎动物(例 如人)展现出的针对感染原的免疫或引发针对感染原的免疫应答，其阻止或改善感染或减 少至少一种其症状。如本文中所使用的，术语“脊椎动物”或“受试者”或“患者”指脊椎动物亚门 (subphylum cordata)的任何成员，包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，诸如 黑獲獲(cgunoabzee)禾口其它猿类(apes)禾口猴物禾中(monkey species)。家畜(farm animal) (诸如牛、绵羊、猪、山羊和马)；家养哺乳动物(domestic mammal)(诸如狗和猫)；实验动 物(包括啮齿动物，诸如小鼠、大鼠(包括棉鼠)和豚鼠)；鸟类(包括家禽、野鸟和猎禽， 诸如鸡、火鸡及其它鹑鸡类鸟类、鸭、鹅)等也是非限制性例子。该定义中包括术语“哺乳动 物”和“动物”。意图涵盖成体和新生个体两者。一般而言，病毒样颗粒(VLP)缺乏病毒基因组，因此是非感染性的。另外，病毒样 颗粒通常可以通过异源表达来生产，而且可以容易地纯化。大多数VLP至少包含病毒核心 蛋白。此核心蛋白通常驱动出芽和颗粒从宿主细胞的释放。然而，对于有效的疫苗或抗原 性产品，抗原应当在VLP上表达以正确呈递从而诱导免疫应答。本发明包含包含VZV蛋白 的嵌合VLP。在一个实施方案中，所述VZV蛋白是嵌合的。本发明的嵌合VLP可用于制备用 于治疗、预防和/或改善VZV感染疫苗和抗原性组合物。所述嵌合VLP的一项重要特征在于在所述VLP的表面上表达蛋白质的能力，使得脊椎动物的免疫系统可以诱导针对所述蛋白质的免疫应答。然而，不是所有的蛋白质都可 以在VLP的表面上表达。某些蛋白质不在VLP的表面上表达或者在VLP的表面上表达不佳 可能有许多原因。一个原因在于所述蛋白质不被引导至宿主细胞膜，或者所述蛋白质不具有跨膜域。如此，一种提高VZV蛋白在VLP的表面上表达、和/或提高所述蛋白质掺入VLP 中的方法是融合异源蛋白的胞质域和/或跨膜域与VZV蛋白以创建VZV嵌合蛋白。在本 发明的一个实施方案中，所述异源胞质域和/或跨膜域可以与所述核心蛋白结合。不限于 具体的理论，所述异源蛋白的胞质域和/或跨膜域与核心的结合可能有助于驱动所述嵌合 VZV蛋白进入VLP中。如此，本发明的另一个实施方案包含嵌合VLP，其包含会驱动VLP生 成并有助于驱动嵌合VZV蛋白掺入VLP中的核心蛋白。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP 不包含酵母Ty蛋白。在一些实施方案中，本发明包含包含至少一种嵌合VZV蛋白的嵌合VLP，其中所述 嵌合VZV蛋白包含异源蛋白的跨膜域和/或胞质域。在一个实施方案中，所述VLP包含驱 动VLP形成的核心蛋白。在另一个实施方案中，所述异源蛋白的跨膜域和/或胞质域与所 述核心蛋白结合以驱动所述嵌合VZV蛋白进入VLP中。在另一个实施方案中，所述嵌合VZV 蛋白包含VZV蛋白的部分，所述VZV蛋白选自下组gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM。在另 一个实施方案中，所述VZV蛋白是gE。在另一个实施方案中，所述VZV蛋白是gl。在另一 个实施方案中，嵌合VZV gE和嵌合VZV gl在同一 VLP中。可以与本发明一起使用的核心蛋白是在细胞中表达时驱动VLP形成的病毒蛋白。 具体地，病毒核心蛋白可以包括但不限于病毒Gag蛋白，具体的是逆转录病毒gag蛋白(例 如人免疫缺陷病毒(HIV)Gag病毒蛋白(GenBank序列号AAA44987和p55gag GenBank序列 号AAF43628)、猿免疫缺陷病毒(SIV) Gag病毒蛋白(GenBank序列号AAA91922))、鼠白血病 病毒(MuLV)Gag病毒蛋白(GenBank序列号NP040332))、杆状病毒基质蛋白M蛋白(例如水 泡性口炎病毒(vesicular stomatis virus，VSV)M蛋白(GenBank序列号CAM83684))、线状 病毒病毒核心蛋白(例如埃博拉VP40病毒蛋白(GenBank登录号AAN37506))、立夫特山谷 热病毒(Rift Valley Fever virus)N蛋白(GenBank登录号ABK91994)、冠状病毒M、E和NP 蛋白(NP蛋白的GenBank登录号为AAP49024、M蛋白为AAR86790、E蛋白为AAP82979 (SARS 冠状病毒ShanghaiQXCl))、布尼亚病毒N蛋白(GenBank登录号AAA47114)、流感Ml蛋白、 副粘病毒M蛋白(例如新城疫蛋白M(AAK55549)和呼吸道合胞病毒(RSV)M(NP_056860))、 沙粒病毒Z蛋白(例如拉沙热病毒Z蛋白)、新城疫蛋白M(AAK55549)、副流感病毒M(例如 人副流感病毒1MAAB22344))和其组合。在一个实施方案中，所述核心或基质蛋白来自正粘 病毒。在另一个实施方案中，所述正粘病毒核心不包括流感病毒Ml。在另一个实施方案中， 所述核心或基质蛋白来自副粘病毒。在另一个实施方案中，所述副粘病毒核心不包括新城 疫病毒M、RSV M、或人副流感病毒M。在本发明的另一个实施方案中，所述异源蛋白可以与所述核心蛋白相互作用以有 助于驱动VZV嵌合蛋白进入VLP中。例如，若本发明的所述嵌合VLP包含流感M1，则与VZV 蛋白融合的所述异源跨膜域和/或胞质域可以来自流感病毒HA和/或NA。已经显示了这 些蛋白质有助于驱动异源蛋白进入VLP中(参见共同悬而未决的申请W02008/005777，本文 通过提及而完整收录)。所述核心和异源蛋白不需要来自相同病毒。例如，已经显示了，可 以使用来自非HIV病毒的数种跨膜域和/或胞质域来与来自HIV的p55gag核心一起进行 表达(参见Wang等，J. Virol.，81，10869-10878，本文通过提及而完整收录)。在某些实施方案中，所述异源蛋白的跨膜域和/或胞质域会来自相同的病毒。在 一个实施方案中，所述嵌合VLP包含流感病毒Ml和具有来自流感HA和/或NA的跨膜域和/或胞质域的嵌合VZV蛋白。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP包含来自A/印尼/5/05的流感病毒Ml和具有来自流感病毒HA和/或NA的跨膜域和/或胞质域的嵌合VZV蛋白。 在另一个实施方案中，所述来自流感HA和/或NA的跨膜域和/或胞质域来自下组:A/鹌鹑 / 香港 /G1/97、A/ 香港 /1073/99,A/ 香港 /2108/03、鸭 /HK/Y280/97、CK/HK/G9/97、Gf/HK/ SSP607/03、Ph/HK/CSW1323/03、WDk/ST/4808/01、CK/HK/NT142/03、CK/HK/WF126/03、SCk/ HK/WF285/03、CK/HK/YU463/03、CK/HK/YU577/03、SCk/HK/YU663/03、Ck/HK/CSW161/03、和 GF/HK/NT101/03。在另一个实施方案中，流感病毒HA和/或NA的跨膜域和/或胞质域来 自A/印尼/5/05。在另一个实施方案中，所述嵌合VZV蛋白包含gE的胞外域及流感HA和 /或NA的跨膜域和/或胞质域。在另一个实施方案中，用所述流感HA和/或NA替换所述 gE的跨膜域。在一个实施方案中，所述嵌合蛋白包含SEQ ID NO. 1。在另一个实施方案中， 所述嵌合VZV蛋白包含gl的胞外域及流感病毒HA和/或NA的跨膜域和/或胞质域。在另 一个实施方案中，所述嵌合蛋白包含SEQ ID NO. 3。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP包 含流感病毒Ml、嵌合gE和嵌合gl。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP包含流感病毒Ml、 天然的gE和嵌合gl。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP包含流感病毒Ml、嵌合gE和天 然的gl。在另一个实施方案中，已经对所述天然的gE和gl进行过工程化改造以除去它们 的天然跨膜域(分别为SEQ ID 10和12)。因为gE和gl产生异二聚体(heterodimer)，所 以为了掺入VLP中仅所述二聚体的一个成员会需要具有异源跨膜域和/或胞质域。在本发明的一个实施方案中，所述嵌合VLP包含新城疫病毒(NDV)蛋白M和具有 来自新城疫病毒蛋白的跨膜域和/或胞质域的嵌合VZV蛋白。在一个实施方案中，所述来 自NDV蛋白的跨膜域和/或胞质域来自融合物(F)和/或血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白 (NDV F的Genbank登录号为CAA00288和NDV HN的为CAA00292)。在另一个实施方案中， 所述嵌合VLP包含NDV M和嵌合gE。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP进一步包含嵌合 gL·在本发明的一个实施方案中，所述嵌合VLP包含RSV蛋白M和具有来自RSV蛋白 的跨膜域和/或胞质域的嵌合VZV蛋白。在一个实施方案中，所述来自RSV蛋白的跨膜域 和/或胞质域来自融合物(F)和/或G蛋白(RSV F的Genbank登录号为AAR14266和RSV G的为AAR14265)。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP包含RSV M和嵌合gE。在另一个实 施方案中，所述嵌合VLP进一步包含嵌合gl。在某些实施方案中，所述异源蛋白(例如流感HA和/或NA)的跨膜域和/或胞质 域包含蛋白质区段之间的间隔物序列。所述间隔序列可以是对于VZV或所述异源蛋白而言 非天然的任何氨基酸。此间隔物序列对于在VLP的表面上表达所述VZV嵌合蛋白可能是重 要的。间隔物序列的例子包括多G氨基酸。所述间隔物的长度可以从1个至约100个氨基酸。本发明还涵盖本发明VLP之上或之中所表达的所述VZV蛋白的变体(包括所述嵌 合物)。所述变体可以含有在组分蛋白质的氨基酸序列中的变化。术语“变体”就多肽而言 指相对于参照序列改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可以具有“保守的”变化， 其中用于替代的氨基酸具有类似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替换亮氨酸。或者，变 体可以具有“非保守的”变化，例如用色氨酸替换甘氨酸。类似的次要变化还可以包括氨基 酸缺失和/或插入。使用本领域公知的计算机程序，例如DNASTAR软件，可以找到确定哪些氨基酸残基可供取代、插入或缺失而不消除生物学活性或免疫学活性的指导。描述可应用于本发明的分子生物学技术(诸如克隆、突变、细胞培养等)的通 用教禾斗书包括 Berger 禾口 Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods 于 Enzymology 卷 152Academic Press，Inc.，San Diego, Calif. (Berger) ；Sambrook 等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第 3 片反)，卷 1-3，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，N. Y.，2000( ‘‘Sambrook，，)禾口 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等编，Current Protocols，ajoint venture between Greene Publishing Associates，Inc. and John Wiley & Sons，Inc.，( ‘‘Ausubel，，)。这 些教科书描述了诱变、载体的应用、启动子和许多其它相关的主题，所述主题涉及例如VZV 的gE、gl、gM、gH、gB或间层蛋白的克隆和突变等。如此，本发明还涵盖使用已知的蛋白 质工程和重组DNA技术的方法来改进或改变在本发明嵌合VLP之上或之中表达的蛋白质 的特性。可以使用多种类型的诱变来产生和/或分离编码蛋白质分子的变体核酸和/或 进一步修饰/突变本发明嵌合VLP之中或之上的蛋白质。它们包括但不限于定点诱变、 随机点诱变、同源重组(DNA改组)、使用含尿嘧啶模板进行的诱变、寡核苷酸指导的诱变 (oligonucleotide-directed mutagenesis)、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用缺口双链体 DNA的诱变等。其它合适的方法包括点错配修复(point mismatch r印air)、使用修复缺陷 的宿主株的诱变，限制选择和限制纯化、缺失诱变、通过全基因合成的诱变、双链断裂修复寸。克隆本发明VZV蛋白的方法是本领域已知的。例如，可以从感染了 VZV病毒的细 胞提取多聚腺苷酸化mRNA，通过RT-PCR从中分离出编码特定VZV蛋白的基因。所得的产物 基因可以作为DNA插入物克隆入载体中。术语“载体”指可用于扩增(propagate)核酸和 /或在生物体、细胞、或细胞组分之间转移核酸的手段。载体包括自主复制或可整合入宿主 细胞的染色体中的质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体还可以 是非自主复制性的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一条链内由DNA和RNA两者组成 的多核苷酸、聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的DNA等。在许 多但不是所有的常见实施方案中，本发明的载体是质粒。如此，本发明包括克隆入表达载体的编码蛋白质的核苷酸(例如核心蛋白和至少 一种VZV蛋白或嵌合VZV蛋白)，所述载体可在细胞中表达，诱导本发明嵌合VLP的形成。 “表达载体”是能够促进掺入其中的核酸的表达以及复制的载体，诸如质粒。通常，要表达的 核酸与启动子和/或增强子“可操作连接”，并受该启动子和/或增强子的转录调节控制。 在一个实施方案中，所述核苷酸编码VZV gE(0RF 68)蛋白或嵌合VZV gE蛋白。在另一个 实施方案中，所述载体包含如下的核苷酸，其编码VZV gE和至少一种另外的VZV蛋白(例 如gl或嵌合gl)。在另一个实施方案中，所述载体包含如下的核苷酸，其编码VZV gE蛋白 和gI(0RF 67)、gM(0RF 50)、gH、gB和/或间层VZV蛋白(或所述蛋白质的嵌合型式)。在 另一个实施方案中，所述载体还包含能够驱动VLP形成的核心蛋白。在另一个实施方案中， 所述表达载体是杆状病毒载体。在本发明的一些实施方案中，蛋白质可以包含含有如下变化的突变，所述变化产 生沉默的取代、添加或缺失，但是不改变所编码蛋白质的特性或活性或者生成所述蛋白质 的方式。可以出于多种原因而产生核苷酸变体，例如为了针对特定宿主优化密码子表达(将人mRNA中的密码子改变为昆虫细胞诸如Sf9细胞优选的那些密码子)。另外，可对核苷酸测序以确保正确的编码区得到克隆，且不含有任何不想要的突变。可以将所述核苷酸亚克隆入表达载体(例如杆状病毒)中用于在任意细胞中表达。上 文仅仅是如何能够克隆VZV病毒蛋白的一个例子。本发明技术人员应当理解的是，其它方 法也是可用和可能的。本发明还提供了如下的构建体和/或载体，其包含编码VZV蛋白(包括gE、gI、gM、 gH、gB、间层蛋白、其嵌合蛋白或部分)的VZV核苷酸。所述载体可以是例如噬菌体、质粒、 病毒、或逆转录病毒载体。包含VZV基因(包括gE、gl、gM、gH、gB、间层蛋白、它们的嵌合 物、或其部分)的构建体和/或载体应当与合适的启动子可操作连接，诸如AcMNPV多角体 蛋白启动子(或其它杆状病毒)、λ噬菌体PL启动子、大肠杆菌laC、phoA和tac启动子、 SV40早期和晚期启动子、和逆转录病毒LTR的启动子是非限制性例子。根据想要的宿主细 胞和/或表达率，本领域技术人员会知道其它合适的启动子。表达构建体将进一步含有转 录起始位点、终止位点、以及被转录区中用于翻译的核糖体结合位点。所述构建体所表达的 转录物的编码部分优选在要翻译的多肽的起始处包含翻译起始密码子，而在该多肽末尾处 的合适位置上含有终止密码子。表达载体将优选包含至少一种选择标志物。此类标志物包括用于真核细胞培养的 二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，以及用于培养大肠杆菌和其它细菌的四环素、卡那霉 素或氨苄青霉素抗性基因。优选的载体包括病毒载体，诸如杆状病毒、痘病毒(例如牛痘病 毒、禽痘病毒(avipox virus)、金丝雀痘病毒、禽痘病毒(fowlpox virus)、浣熊痘病毒、猪 痘病毒等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、疱疹病毒和逆转录病毒。可与本发明一起使用的其它 载体包括用于细菌的载体，包括pQE70、pQE60和pQE_9，pBluescript载体、Phagescript载 体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、pRIT5。优选的 真核载体是 pFastBacl pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl 和 pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、禾口 pSVL。 其它合适的载体会是本领域技术人员显而易见的。接下来，上文所提及的重组构建体可以用来转染、感染、或转化，并且可以在真核 细胞和/或原核细胞中表达嵌合VZV蛋白，其包含gE、gl、gM、gH、gB、和间层蛋白或其部分 和至少一种核心蛋白。如此，本发明提供了包含载体(或多个载体)的宿主细胞，所述载体 含有的核酸编码嵌合VZV蛋白，所述嵌合VZV蛋白包含gE、gl、gM、gH、gB、和间层蛋白或其 部分和至少一种核心蛋白，并且在容许形成VLP的条件下表达嵌合VZV基因。真核宿主细胞包括酵母、昆虫、两栖类、禽类、植物、秀丽隐杆线虫(C. elegans) (或线虫)和哺乳动物宿主细胞。昆虫细胞的非限制性例子有草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) (SF)细胞、例如 Sf9, Sf21,粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞，例如 High Five细胞，和果蝇(DrOSOphila)S2细胞。真菌(包括酵母)宿主细胞的例子有酿酒 酵母(S. cerevisiae)、乳克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis ；K. Iactis)、假丝酵母属 (Candida)菌种包括白色假丝酵母(C. albicans)和光滑假丝酵母(C. glabrata)、构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe ；S. pombe)、巴其Jf德 毕赤酵母(Pichia pastoris)、和解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)。哺乳动物细胞的 例子有COS细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚 肾(HEK)细胞和非洲绿猴细胞、CVl细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、Vero和H印-2细胞。非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞，或两栖类来源的其它细胞也可以使用。原核宿主细胞包 括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和分枝杆菌。可以依照本领域公知的方法将载体，例如包含VZV基因(或嵌合VZV基因)的多 核苷酸的载体转染入宿主细胞中，所述VZV基因(或嵌合VZV基因)包含编码gE、gl、gM、 gH、gB、和间层蛋白或其部分和至少一种核心蛋白的基因。例如，可以通过磷酸钙共沉淀、电 穿孔、显微注射、脂转染、和采用多胺转染试剂的转染来将核酸导入真核细胞中。在一个实 施方案中，所述载体是重组杆状病毒。在另一个实施方案中，所述重组杆状病毒被转染入真 核细胞中。在一个优选的实施方案中，所述细胞是昆虫细胞。在另一个实施方案中，所述昆 虫细胞是Sf9细胞。在另一个实施方案中，所述载体和/或宿主细胞包含如下的核苷酸，所述核苷酸 编码嵌合VZV蛋白gE、或其部分。在另一个实施方案中，所述载体和/或宿主细胞基本上由 编码嵌合VZV蛋白gE、或其部分的核苷酸组成。在又一个实施方案中，所述载体和/或宿 主细胞包含如下的核苷酸，其编码嵌合VZV蛋白gI、gM、gH、gB、和/或间层蛋白，或其部分。 在一些实施方案中，上文所描述的载体和/或宿主细胞含有嵌合VZV gE、gl、gM、gH、gB、或 间层蛋白、或其部分，和任选地任何另外的嵌合VZV蛋白，并且可以含有另外的细胞组分， 诸如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、碳水化合物等。本发明还提供了生成嵌合VLP的方法，所述方法包括在容许VLP形成的条件下表 达至少一种核心蛋白和至少一种嵌合VZV基因，其包含gE、gl、gM、gH、gB、间层蛋白或其部 分。根据所选的表达系统和宿主细胞，在表达重组蛋白和形成嵌合VLP的条件下通过培养 用表达载体转化的宿主细胞来生成VLP。在一个实施方案中，本发明包含一种生成嵌合VLP 的方法，包括将编码病毒核心蛋白和嵌合VZV gE蛋白的载体转染入合适的宿主细胞中，并 在容许VLP形成的条件下表达所述蛋白质。在另一个实施方案中，本发明包含一种生成嵌 合VLP的方法，包括将编码病毒核心蛋白、嵌合VZV gE和嵌合VZV gl蛋白的载体转染入合 适的宿主细胞中，并在容许VLP形成的条件下表达所述蛋白质。在另一个实施方案中，所述 真核细胞选自酵母细胞、昆虫细胞、两栖类细胞、禽类细胞或哺乳动物细胞组成的组。在另 一个实施方案中，所述嵌合VLP不包含酵母Ty蛋白。合适的培养条件的选择在本领域普通 技术人员的技术之内。培养经过工程化改造而生成本发明嵌合VLP的细胞的方法包括但不限于分批、分 批补料、连续和灌注(perfusion)细胞培养技术。细胞培养意思是在生物反应器(发酵室) 中使细胞生长和增殖，细胞在生物反应器中增殖并表达蛋白(例如重组蛋白)以供纯化和 分离用。典型地，细胞培养在生物反应器中无菌、受控的温度和大气条件下进行。生物反应 器是用于培养细胞的腔室(chamber)，其中可以监控环境条件诸如温度、大气、搅拌和/或 pH。然后使用保持嵌合VLP完整性的方法来分离嵌合VLP，诸如通过梯度离心，例如氯 化铯、蔗糖和碘克沙醇(iodixanol)梯度离心，以及标准纯化技术，包括例如离子交换和凝 胶过滤层析。在一个实施方案中，本发明包含本发明的纯化的嵌合VLP。在另一个实施方案 中，本发明的所述嵌合 VLP 至少 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%, 96%,97%,98%,99%或更多地没有混合物中存在的其它分子(不包括溶剂在内)。在另一 个实施方案中，本发明的所述嵌合VLP基本上没有与制备本发明的嵌合VLP有关的其它病毒、蛋白质、脂质、和碳水化合物。以下是可以如何制备、分离和纯化本发明的嵌合VLP的一个例子。通常，嵌合VLP是由重组细胞系生成的，所述细胞系经过工程化改造从而当所述细 胞在细胞培养(见上文)中生长时产生嵌合VLP。本领域技术人员应当理解的是，可以使用 其它的方法来制备和纯化本发明的嵌合VLP，如此本发明不限于所述的方法。本发明VLP的生产可首先将Sf9细胞(未感染的)接种到摇瓶中，使细胞随着细 胞生长繁殖而膨胀和规模放大(例如从125ml烧瓶到50L Wave袋)。培养细胞所用的培养 基是为合适的细胞系配制的(优选无血清培养基，例如昆虫培养基ExCell-420，JRH)。接 着，用重组杆状病毒以效率最高的感染复数(例如每个细胞约1个到约3个噬斑形成单位) 感染所述细胞。一旦发生感染，嵌合VZV蛋白和/或其它蛋白质自装配成嵌合VLP，并在感 染后大约24到72小时从细胞分泌。通常，在细胞处于生长的对数中期(mid-log phase) (4-8xl06个细胞/ml)且至少约90%存活时，感染效率最高。可以在感染后大约48到96小时，在细胞培养基中嵌合VLP水平接近最大值但在 广泛的细胞溶解之前收获本发明的嵌合VLP。收获时的Sf9细胞密度和生存力可以为约 0. 5xl06个细胞/ml至约1. 5xl06个细胞/ml，生存力至少为20%，如染料排除测定法所示。 接着，取出培养基并将其澄清。可以向培养基添加NaCl至浓度为约0. 4至约1. 0M，优选至 约0. 5M，以避免VLP聚集。可利用一次性使用的预灭菌中空纤维0. 5或1. 00 μ m筒式滤器 或类似的装置，通过切向流过滤(TFF)来实现从含有本发明VLP的细胞培养基中除去细胞 和细胞碎片。接着，可以使用一次性的、预灭菌的500，000分子量截留中空纤维筒通过超滤来 浓缩经过澄清的培养基中的嵌合VLP。可以将经过浓缩的VLP对10倍体积的含0.5M NaCl 的pH 7. 0至8. 0的磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行渗滤(diafiltrate)来除去残余的培养基 成分。可以将经过浓缩、渗滤的VLP在含0. 5M NaCl的pH 7. 2PBS缓冲液中20% -60%不 连续蔗糖梯度上，于约4°C至约10°C以6，500xg离心18小时来进一步纯化。通常，嵌合VLP 将在约30%至约40%蔗糖之间或者在界面上(在20%和60%的分步梯度中)形成显著可 见的条带，可从该梯度中收集该条带并保存。可稀释该产物使其包含200mM NaCl,以准备纯 化过程的下一步。该产物含有嵌合VLP，并可能含有完整的杆状病毒颗粒。可以通过阴离子交换层析或者44%等密度蔗糖垫层(cushion)离心来实现嵌合 VLP的进一步纯化。在阴离子交换层析中，将来自蔗糖梯度(见上文)的样品上样入含有带 阴离子的介质(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的柱中，并经由盐梯度(从约0. 2M至 约1.0M NaCl)洗脱，该梯度可以将嵌合VLP与其它杂质(例如杆状病毒和DNA/RNA)分开。 在蔗糖垫层方法中，将包含嵌合VLP的样品添加到44%蔗糖垫层，并在30，OOOg离心约18 小时。VLP在44%蔗糖的顶部形成条带，而杆状病毒沉淀于底部，其它污染蛋白停留在顶部 的0%蔗糖层中。收集嵌合VLP峰或嵌合VLP带。若想要的话，可以将完整的杆状病毒灭活。可以通过化学方法，例如甲醛或β-丙 内酯(BPL)灭活。还可以使用本领域已知的选择性沉淀和层析方法，如上文例示的，来大部 分实现完整杆状病毒的除去和/或灭活。灭活方法包括将含有VLP的样品在0. 2% BPL中 于约25°C至约27°C温育3小时。还可以通过将含有VLP的样品在0. 05% BPL于4°C温育 3天，然后在37°C温育1小时，来灭活杆状病毒。灭活/除去步骤后，可使含有VLP的产物运行经过另一渗滤步骤以除去任何来自灭活步骤的试剂和/或任何残余的蔗糖，并将嵌合VLP置入期望的缓冲液(例如PBS)中。包含嵌合VLP的溶液可以通过本领域已知的方法(例如无菌过滤)灭菌，并保存在冰箱或 冷冻箱中。上文的技术可以在多种规模上实施。例如，T形瓶(T-flasks)、摇瓶、转瓶 (spinner bottle)、乃至工业尺寸的生物反应器。生物反应器可包括不锈钢罐或预灭菌的 塑料袋(例如，Wave Biotech, Bridgewater, NJ出售的系统)。本领域技术人员会知道用 于其目的的最佳选择。药物或疫苗配制剂和施用本文中有用的药物组合物含有本发明的嵌合VLP和药学可接受载体(包括任何合 适的稀释剂或赋形剂)，所述药学可接受载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的脊椎 动物有害的免疫应答、并且可以不带有异常毒性地(Without undue toxicity)施用的任何 药剂。如本文中所使用的，术语“药学可接受的”指获得联邦或州政府监管部门批准，或者 在美国药典、欧洲药典或其它公认的药典中列出的用于哺乳动物，更具体地用于人类中。这 些组合物可以用作疫苗和/或抗原性配制剂，用于在脊椎动物中诱导保护性免疫应答。本 发明涵盖一种抗原性配制剂，其包含如下的嵌合VLP，所述嵌合VLP包含至少一种VZV蛋白 (例如嵌合gE蛋白)，但不包括VZV核酸或酵母Ty蛋白。在另一个实施方案中，所述抗原 性配制剂包含如下的嵌合VLP，其包含至少一种另外的掺入VLP中的嵌合VZV蛋白。在另一 个实施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含gl (0RF 67)蛋白。在另一个实施方案中，所 述另外的嵌合VZV蛋白包含gM(0RF 50)蛋白。在另一个实施方案中，所述另外的嵌合VZV 蛋白包含gH。在另一个实施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含gB。在另一个实施方案 中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含间层蛋白。在另一个实施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋 白包含gI、gM、gH、gB或间层蛋白的组合。在另一个实施方案中，所述嵌合VZV VLP不包含 VZV 壳体蛋白(例如 ORF 20、ORF 40、ORF 41)。通常，疫苗包含本发明组合物悬浮或溶解于其中的常规盐水或缓冲的水溶液介 质。处于这种形式，便可以方便地使用本发明的组合物以预防、改善或以其它方式治疗感 染。导入宿主中后，疫苗能够刺激免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的生成和/ 或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突细胞的活化和/或其它细胞应答。本发明还涵盖一种疫苗配制剂，其包含如下的嵌合VLP，所述嵌合VLP包含至少一 种VZV蛋白(例如嵌合gE蛋白)，但不包括VZV核酸或酵母Ty蛋白。在另一个实施方案 中，所述疫苗配制剂包含如下的嵌合VLP，其包含至少一种另外的掺入VLP中的嵌合VZV蛋 白。在另一个实施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含嵌合gl (0RF 67)蛋白。在另一个 实施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含嵌合gM(0RF 50)蛋白。在另一个实施方案中， 所述另外的嵌合VZV蛋白包含嵌合gH。在另一个实施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包 含嵌合gB。在另一个实施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含嵌合间层蛋白。在另一个 实施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含嵌合gI、gM、gH、gB或间层蛋白的组合。在另一 个实施方案中，所述VZV VLP不包含VZV壳体蛋白(例如ORF 20、ORF 40、ORF 41)。本发明的所述抗原性和疫苗配制剂包含如上文所描述的本发明的VLP和药学可 接受载体或赋形剂。药学可接受载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖(dextrose)、 水、甘油、无菌等渗缓冲水溶液，和它们的组合。对药学可接受载体、稀释剂和其它赋形剂的全面讨论呈现于 Remington' sPharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N. J. current edition)中。配制剂应当适合施用模式。在一个优选的实施方案中，配制剂适于给人施用， 优选是无菌、非颗粒性(non-particulate)和/或非热原性的。若想要的话，药学组合物还可以含有小量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。组合 物可以是固体形式，诸如适于重构的冻干粉末；液体溶液；悬液；乳液；片剂；丸剂；胶囊； 持续释放配制剂；或粉剂。口服配制剂可包括标准的载体，诸如药品级的甘露糖醇、乳糖、淀 粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。本发明提供了嵌合VLP配制剂包装在标示组合物量的密封容器诸如安瓿或小药 囊(sachette)中。在一个实施方案中，所述嵌合VLP组合物作为液体提供，在另一个实施 方案中，作为密封容器中的干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物提供，并且可以用例如水或盐 水重构为用于向受试者施用的合适浓度。在一个可选的实施方案中，在标示嵌合VLP组合物的量和浓度的密封容器中以 液体形式提供嵌合VLP组合物。优选地，在密封容器中以至少约50 u g/ml、更优选至少约 100 u g/ml、至少约200 u g/ml、至少500 u g/ml、或至少lmg/ml提供液体形式的嵌合VLP组 合物。—般而言，本发明的嵌合的VZV VLP以足以刺激针对一种或多种VZV毒株的免疫 应答的有效量或数量施用。优选地，施用本发明的嵌合VLP引发针对VZV的免疫。典型地， 可以根据例如年龄、身体健康状况(physicalcondition)、体重、性别、饮食、施用时间和其 它临床因素，在该范围内调节该剂量。预防性疫苗配制剂是全身施用的，例如通过使用针头 和注射器或无针头注射装置进行皮下或肌内注射来施用。或者，疫苗配制剂是鼻内施用的， 通过滴剂、大颗粒气溶胶(大于约10微米)、或喷雾入上呼吸道中。虽然上文的任何递送途 径均导致免疫应答，但鼻内施用还带来额外的益处，即在许多病毒(包括VZV)进入的部位 引发粘膜免疫。如此，本发明还包括诱导哺乳动物中针对感染或其至少一种症状的免疫的疫苗或 抗原性组合物的配制方法，包括向所述配制剂添加有效剂量的嵌合的VZV VLP。在一个实 施方案中，所述感染是VZV感染。“有效剂量” 一般指足以诱导免疫、预防和/或改善感染 或减轻至少一种感染症状、和/或增强另一剂嵌合VLP的功效的本发明VLP的量。有效剂 量可以指足以延迟感染发作或使之最小化的嵌合VLP的量。有效剂量还可以指在感染的 治疗或控制中提供治疗益处的嵌合VLP的量。此外，有效剂量是就单独的或与其它疗法组 合在感染的治疗或控制中提供治疗益处的本发明嵌合VLP而言的量。有效剂量还可以是 足以增强受试者(例如人)自己针对后来向感染原暴露的免疫应答的量。免疫水平可以 通过例如测量中和性分泌抗体和/或血清抗体的量来加以监测，所述测量例如通过噬斑中 禾口(plaque neutralization)、补体结合(complement fixation)、醇联免疫吸附、或微中禾口 (microneutralization)测定法来进行。在疫苗的情况中，“有效剂量”是预防疾病和/或 降低症状严重性的剂量。如上文所提及，本发明的VLP预防或减轻受试者中VZV感染的至少一种症状。由 VZV感染引起的两种疾病的症状是本领域中公知的。由初次VZV感染产生的禽痘(水痘) 的症状包括发热、不适(malaise)、头痛、腹痛、疲劳、食欲缺乏(anorexia)、和主要在头皮、 面部和躯干上发生的皮肤损伤。源自于潜伏VZV再活化的带状疱疹的特征在于下列症状通常在胸部生皮节单侧出现的皮疹、急性神经炎痛(neuritic pain)、和超敏感性。如此，本发明的方法包括预防或减轻与VZV感染有关的至少一种症状。症状的减轻可以主观地或者 客观地确定，例如通过受试者的自我评估、由内科医生评估、或通过实施合适的测定或测量 (例如体温)，包括例如生活质量评价、VZV感染或其它症状的进展减慢、VZV症状的严重程 度降低或者合适的测定法(例如抗体效价和/或T细胞活化测定法)。客观评价包括动物 和人的评价。虽然优选用单剂刺激免疫，但是可以通过相同或不同路径施用额外的剂量，以达 到想要的效果。例如在新生儿和婴儿中，可能需要多次施用来引发足够的免疫水平。按照 维持足够水平的抗感染(例如VZV感染)保护的需要，可以在整个儿童期以一定间隔继续 进行施用。类似地，特别容易受到反复或严重的感染的成年人，例如卫生保健工作者、日间 护理工作者、幼儿的家人、老年人、以及心肺功能受损的个体等，可能需要进行多次免疫来 建立和/或维持保护性免疫应答。可以通过例如测量中和性分泌和血清抗体的量来监测诱 导产生的免疫的水平，并按照引发和维持期望的保护水平的需要来调整剂量或重复接种。施用包含嵌合VLP的组合物(疫苗和/或抗原性配制剂)的方法包括，但不限于， 胃肠外施用(例如皮内、肌内、静脉内和皮下)、硬膜夕卜、和粘膜(例如鼻内和口腔或肺途径 或通过栓剂)。在一个具体实施方案中，本发明的组合物通过口服、皮内、鼻内、肌内、腹膜 内、静脉内或皮下施用。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过 经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、结肠、结膜、鼻咽、口咽、阴道、尿道、膀胱和肠粘 膜等)的吸收，并且可以与其它生物学活性剂一起施用。在一些实施方案中，含本发明嵌合 VLP的组合物的鼻内或其它粘膜施用途径可以诱导显著高于其它施用途径的抗体或其它免 疫应答。在另一个实施方案中，含本发明嵌合VLP的组合物的鼻内或其它粘膜施用途径可 诱导这样的抗体或其它免疫应答，所述抗体或其它免疫应答会诱导针对其它VZV毒株的交 叉保护。施用可以是全身性的或者是局部的。本发明的疫苗和/或抗原性配制剂还可以按照剂量日程表(dosageschedule)来 施用，例如用疫苗组合物进行初次施用，随后进行加强施用。在具体的实施方案中，第二剂 组合物在初次施用后大约两周至一年的任何时间，优选约1个月、约2个月、约3个月、约4 个月、约5个月到约6个月施用。另外，可以在第二剂之后，且在距初次施用后约3个月至 约两年甚至更长时间，优选约4个月、约5个月、或者约6个月、或者约7个月至约1年施用 第三剂。在第二剂后在受试者的血清和/或尿或者粘膜分泌物中没有检测到或者检测到低 水平的特异性免疫球蛋白时，可任选地施用第三剂。在一个优选的实施方案中，第二剂在第 一次施用后约1个月施用，而第三剂在第一次施用后约6个月施用。在另一个实施方案中， 第二剂在第一次施用后约6个月施用。在另一个实施方案中，所述本发明的嵌合VLP可以 作为联合疗法的一部分施用。例如，本发明的嵌合VLP可以与其它免疫原性组合物、抗病毒 剂和/或抗生素一起配制。技术人员可以容易地确定药物配制剂的剂量，例如通过首先鉴定有效引发预防性 或治疗性免疫应答的剂量，例如通过测量病毒特异性免疫球蛋白的血清效价或通过测量血 清样品或尿样品或粘膜分泌物中抗体的抑制比。所述剂量可以由动物研究确定。用于研究 疫苗功效的动物的非限制性目录包括豚鼠、仓鼠、雪貂(ferret)、灰鼠(chinchilla)、小鼠 和棉鼠。大多数动物不是感染原的天然宿主，但仍可用于该疾病的各个方面的研究。例如，可以对任何上文的动物定量给予疫苗候选物，例如本发明的嵌合VLP，以部分地表征所诱发 的免疫应答，和/或确定是否生成了任何中和性抗体。例如，已经在小鼠模型中进行了许多 研究，因为小鼠体型小，而且它们的成本低使得研究者可以进行更大规模研究。另外，技术人员可以进行人体临床研究来确定用于人的优选有效剂量。这样的临 床研究是常规的，且为本领域公知。要使用的确切剂量还将依赖于施用途径。可以从源自 体外或动物试验系统的剂量_应答曲线外推得到有效剂量。如本领域中还公知的，可以使用免疫应答的非特异性刺激物来增强特定组合物的 免疫原性，这样的刺激物称为佐剂。术语“佐剂”指这样的化合物，在其与特定的免疫原(例 如VLP)在配制剂中组合使用时，会增进或以其它方式改变或修饰由此所致的免疫应答。对 免疫应答的修饰包括对抗体和/或细胞免疫应答的强化或使其特异性增宽。对免疫应答的 修饰还可以意味着降低或抑制某些抗原特异性免疫应答。实验上已经使用佐剂来促进针对 未知抗原的免疫的普遍增加(例如美国专利号4，877，611)。免疫规程使用佐剂来刺激应答 已有多年，因此，本领域普通技术人员对佐剂是熟知的。有些佐剂影响抗原呈递的方式。例 如，在蛋白抗原被明矾沉淀时，免疫应答增加。抗原的乳化也延长抗原呈递的持续时间。本 发明的范围意图涵盖Vogel 等，“ACompendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (第 2版)，”(本文通过提述收录该文献全部内容用于所有目的)中所述任何佐剂。示例性的佐剂包括完全弗氏佐剂(一种免疫应答的非特异性刺激物，含有已杀死 的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。其 它佐剂包括GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物诸如thur_MDP和nor_MDP、CGP (MTP-PE)、脂 质A和单磷酰脂质A(MPL)。还设想使用RIBI，其在2%角鲨烯/Tween 80乳剂中含有从细 菌提取的3种成分MPL、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。还可以使用MF-59、 Novasomes 、MHC 抗原。在本发明的一个实施方案中，所述佐剂是少片层(paucilamellar)脂质小泡，其 具有大约2到10个双层，它们排列成多个基本呈球形的壳的形式，其由水性层隔开，所述 水性层围绕着不含脂质双层的无定形中心大空腔。少片层脂质小泡可以通过数种方式起 作用来刺激免疫应答作为非特异性刺激物、作为抗原的载体、作为其它佐剂的载体，以及 这些方式的组合。例如，在通过混合抗原与预先形成的小泡，使得抗原相对于小泡保持在 胞外的方法制备疫苗时，少片层脂质小泡起非特异性免疫刺激物的作用。通过将抗原包囊 在小泡的中心空腔中，小泡起到免疫刺激物和抗原载体两方面的作用。在另一个实施方案 中，小泡主要由非磷脂小泡构成。在其它实施方案中，小泡是Novasomes 。Novasomes 是约lOOnm到约500nm范围的少片层非磷脂小泡。它们包含Brij 72、胆固醇、油酸和角鲨 烯。Novasomes已被证明是流感抗原的有效佐剂(参见美国专利5，629，021、6，387，373和 4,911,928,本文通过提述收录它们的全部内容用于所有目的)。本发明的嵌合VLP还可以与“免疫刺激物”一起配制。术语“免疫刺激物”指经由 身体自身的化学信使(细胞因子)增强免疫应答的化合物。这些分子包括具有免疫刺激、 免疫强化和促炎症活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，诸如白介素(例如IL-I、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)集落刺激因子 (CSF))；及其它免疫刺激分子，诸如巨噬细胞炎性因子、Flt3配体、B7. 1 ；B7. 2等。免疫刺 激物分子可以在与本发明VLP相同的配制剂中施用，或者可以分开施用。可以施用蛋白质或编码该蛋白质的表达载体来产生免疫刺激效应。如此，在一个实施方案中，本发明包含包 含佐剂和/或免疫刺激物的抗原性和疫苗配制剂。通过下面的实施例进一步例示本发明，这些实施例不应解释为限制性的。本文通 过提述收录本申请中引用的所有参考文献、专利和已公开的专利申请，以及附图和序列表 用于所有目的。
实施例实施例1下文描述了嵌合VZV VLP在Sf9昆虫细胞中的克隆、表达和纯化方法，所述嵌合 VZV VLP包含嵌合gE(HA TM/CT)糖蛋白(SEQ ID No. 1)和禽流感Ml (A/印尼/5/05H5m毒 株)基质蛋白(SEQ ID No. 9) 克隆嵌合gE和禽流感Ml，并在容许VLP形成的条件下在杆 状病毒表达系统中表达。图1A中描绘了此构建体。为了证实VLP得到制备，在杆状病毒感染后64小时通过低速离心来使Sf9细胞培 养基离心，所述Sf9细胞培养基含有用包含VZV gE(HA TM/CT)/IndoMl嵌合构建体的杆状 病毒感染的Sf9细胞。通过用500kDa MWC0中空纤维滤膜(GE healthcare)进行的超滤 (UF)来浓缩无细胞的培养基。通过渗滤(DF)使保留物与25mM TrisCl pH 8. 0,500mM NaCl 进行缓冲液交换。在相同缓冲液中平衡的离子交换柱(Fractogel TMAE)上加载UF/DF保 留物。接着，用超滤进一步浓缩含有VLP和杆状病毒的流过级分，之后加载至用25mM TrisCl pH 8.0 300mM NaCl 平衡的 S印hacryl S500 大小排阻柱(GEhealthcare)上。在 S500柱的空隙体积中洗脱VLP和杆状病毒级分，而在稍后的层析级分中洗脱可溶性蛋白质 和细胞片段。将来自S500柱的空隙峰(voidpeak)以300mM NaCl加载至第二 TMAE柱。在这 些条件下，VLP不结合阴离子树脂，而带更多负电荷的杆状病毒结合该柱。这是至关重要的 分开步骤，其依赖于如下事实，即VLP缺乏DNA或RNA基因组，而杆状病毒含有大的137KDa 双链DNA基因组，其增加杆状病毒的负电荷，如此提高该病毒的结合特征。通过流过30% 蔗糖垫层进行的超速离心(100Kg小时)来浓缩含有VLP的第二 TMAE流过级分(图4B，第 2道)。接着，使用纯化的嵌合VZVgE(HA TM/CT)/Indo Ml嵌合VLP进行SDS PAGE分析、 Western印迹分析、电子显微镜(EM)和免疫金分析。如先前所描述的那样实施SDS PAGE和Western印迹分析。图1B中显示了这些结 果。第1道是来自第二 TMAE离子交换层析柱的VLP，而第2道和第3道分别是高速离心后 30%蔗糖界面顶部附近回收的VLP和沉淀物。注意到，通过超速离心使痕量的杆状病毒和 VZV嵌合VLP沉淀，但是大部分gE/Ml嵌合VLP是较高浮力密度的，并且接近30 %蔗糖界面。 注意到，嵌合gE(HATM/CT)具有与杆状病毒蛋白GP64相同的分子量，在凝胶上所述条带重 叠。如此，第2道中的64kDa蛋白质(包含纯化的VLP)主要是嵌合gE(HATM/CT)，而第3道 中的相同大小的条带(包含VLP和杆状病毒)主要是杆状病毒包膜糖蛋白GP64。通过比较 经考马斯蓝染色的凝胶和抗gE Western印迹得出此结论。纯化的嵌合VZV VLP (第1道) 具有大于90%的纯度，其中主要的蛋白质是Ml和没有完全由SDS破坏的Ml 二聚物(25KDa 和50KDa)和嵌合gE(60KDa)。如此，这些结果显示了，生成了嵌合VLP，并得到了纯化。接着，用电子显微术(EM)负染色来使嵌合VLP成像(图2)。这些EM图像显示了，嵌合VLP具有球状核心，其具有高度结构化的包膜。实施对VLP的免疫金染色以确定VZV gE是否在嵌合VLP的表面上得到表达。拍 摄EM图像前，将嵌合VLP与正常的小鼠IgG (A)或小鼠抗VZV-gE (来自Santa Cruz的克隆 9C8) (B) 一起温育，接着与金标记的针对小鼠的第二抗体一起温育。位于嵌合
金颗粒证实了 VLP上存在gE蛋白。如图3所显示的，所述抗体确实染色VLP。如此，VLP确实表达VZV gE。这些数据显示了，可以生成并纯化包含嵌合VZV蛋白的嵌合VZV VLP。本文通过提及而收录所有专利、出版物和专利申请，其程度就像明确且单独指明 通过提及而收录每篇单独的专利、出版物或所引用的专利申请一样。仅为了理解的清楚而提供了上述详细的说明书，并且不应当将此理解成不必要的 限制，因为各种修饰形式对于本领域技术人员会是显而易见的。并不承认本文中所提供的 任何信息都是现有技术或与目前要求保护的发明有关，或者明确或隐含提及的任何出版物 都是现有技术。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领 域的普通技术人员一般理解的相同的含义。虽然已经描述了本发明以及其具体的实施方案，但是可理解的是，其能够进一步 进行修饰，并且本申请意图覆盖本发明的任何变化、用途、或改编，它们一般遵循本发明的 原理，并且包括对本公开内容在本发明所属领域内的已知或习惯实践之内的、且可适用于 上文所列出的和所附权利要求书的范围内的本质特征的偏离。
权利要求
一种嵌合VLP，其包含病毒核心蛋白和至少一种水痘带状疱疹病毒(VZV)蛋白，其中VLP不包含酵母Ty蛋白，而且不包含VZV核酸。
2.权利要求1的嵌合VLP，其中所述VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞外域和 异源蛋白的跨膜和/或胞质结构域。
3.权利要求2的嵌合VLP，其中所述异源蛋白与所述病毒核心蛋白结合。
4.权利要求2的嵌合VLP，其中所述VZV蛋白选自下组gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM。
5.权利要求4的嵌合VLP，其中所述VZV蛋白是gE。
6.权利要求4的嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含gE和gl。
7.权利要求2的嵌合VLP，其中异源蛋白的所述跨膜和/或胞质结构域来自流感病毒。
8.权利要求7的嵌合VLP，其中所述流感病毒蛋白是血凝素(HA)和/或神经氨酸酶 (NA)。
9.权利要求8的嵌合VLP，其中所述HA和/或NA来自甲型流感病毒/印尼/5/05。
10.权利要求1的嵌合VLP，其中所述病毒核心来自正粘病毒或副粘病毒。
11.权利要求1的嵌合VLP，其中所述病毒核心选自下组流感病毒M1、NDVM、RSVM和 HIV gag。
12.权利要求11的嵌合VLP，其中所述病毒核心是流感病毒Ml。
13.权利要求12的嵌合VLP，其中所述流感Ml来自甲型流感病毒/印尼/5/05。
14.权利要求1的嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1或SEQ IDN0. 9。
15.权利要求1的嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1和SEQ IDNO. 9。
16.一种生成嵌合VLP的方法，包括将一种或多种编码至少一种VZV蛋白和病毒核心蛋 白的载体转染入合适的宿主细胞中，并在容许VLP形成的条件下表达所述嵌合VZV和病毒 核心蛋白，其中所述宿主细胞不包含酵母Ty蛋白。
17.权利要求16的方法，其中所述VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞外域和异 源蛋白的跨膜和/或胞质结构域。
18.权利要求17的方法，其中所述异源蛋白与所述病毒核心蛋白结合。
19.权利要求17的方法，其中至少一种VZV蛋白选自下组ge、gl、gB、gH、gK、gL、gC、 禾口 gM。
20.权利要求19的方法，其中所述VZV蛋白是gE或gl。
21.权利要求19的方法，其中所述VZV蛋白是gE和gl。
22.权利要求17的方法，其中异源蛋白的所述跨膜和/或胞质结构域来自流感病毒。
23.权利要求22的方法，其中所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。
24.权利要求23的方法，其中所述HA和/或NA来自甲型流感病毒/印尼/5/05。
25.权利要求16的方法，其中所述病毒核心来自正粘病毒。
26.权利要求16的方法，其中所述病毒核心来自副粘病毒，附加条件为所述核心或基 质蛋白来自呼吸道合胞病毒(RSV)M。
27.权利要求16的方法，其中所述病毒核心选自下组流感病毒Ml、NDVM、RSV M和 HIV gag。
28.权利要求27的方法，其中所述病毒核心是流感病毒Ml。
29.权利要求28的方法，其中所述流感Ml来自甲型流感病毒/印尼/5/05。
30.权利要求16的方法，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 9。
31.权利要求16的方法，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 9。
32.—种抗原性配制剂，其包含嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一种VZV蛋白和 病毒核心蛋白，并且不包含酵母Ty蛋白。
33.权利要求32的抗原性配制剂，其中所述VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞 外域和异源蛋白的跨膜和/或胞质结构域。
34.权利要求33的抗原性配制剂，其中所述异源蛋白与所述病毒核心蛋白结合。
35.权利要求32的抗原性配制剂，其中至少一种VZV蛋白选自下组gE、gI、gB、gH、gK、 gL、gC、和 gM。
36.权利要求35的抗原性配制剂，其中所述VZV蛋白是gE或gl。
37.权利要求35的抗原性配制剂，其中所述VZV蛋白是gE和gl。
38.权利要求32的抗原性配制剂，其中所述核心蛋白是来自甲型流感病毒/印尼 /5/05的流感Ml。
39.权利要求32的抗原性配制剂，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 9。
40.权利要求32的抗原性配制剂，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 9。
41.一种疫苗，其包含嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一种VZV蛋白和病毒核心 蛋白，并且不包含酵母Ty蛋白。
42.权利要求41的疫苗，其中所述嵌合VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞外域 和异源蛋白的跨膜和/或胞质结构域。
43.权利要求42的疫苗，其中所述异源蛋白与所述病毒核心蛋白结合。
44.权利要求40的疫苗，其中至少一种VZV蛋白选自下组gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、 禾口 gM。
45.权利要求44的疫苗，其中所述VZV蛋白是gE或gl。
46.权利要求44的疫苗，其中所述VZV蛋白是gE和gl。
47.权利要求41的疫苗，其中所述核心蛋白是来自甲型流感病毒/印尼/5/05的流感Ml。
48.权利要求41的疫苗，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 9。
49.权利要求41的疫苗，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 9。
50.一种在人或动物中引发针对感染的保护性免疫的方法，包括给所述人或动物施用 包含嵌合VZV-VLP的抗原性配制剂或疫苗，其中所述嵌合VZV-VLP包含至少一种嵌合VZV 蛋白和病毒核心蛋白，其中所述嵌合VLP不包含酵母Ty蛋白，而且不包含VZV核酸。
全文摘要
本发明公开了新的嵌合水痘带状疱疹病毒(VZV)病毒样颗粒(VLP)，其包含嵌合VZV糖蛋白。本发明还公开了嵌合VZV-VLP的疫苗配制剂和在受试者中诱导免疫应答的方法。
文档编号C07K14/11GK101801411SQ200880108050
公开日2010年8月11日 申请日期2008年7月21日 优先权日2007年7月19日
发明者彼得·普什科, 盖尔·史密斯 申请人:诺瓦瓦克斯股份有限公司