朊病毒蛋白相关疾病的治疗的制作方法

专利名称：朊病毒蛋白相关疾病的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及朊病毒蛋白相关疾病例如癌症的治疗。本发明的应用还包括应 用于淀粉样疾病例如淀粉样变性病和阿尔茨海默病；以及应用于炎症和移植技术。本 发明涉及糖胺聚糖(GAG)、合成的多硫酸化多糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和包含 这些物质的药物组合物，以及GAG、合成的多硫酸化多糖、HSPG、朊病毒蛋白、叠朊蛋白 (doppelprotein)和沙杜(shadoo)蛋白抗体或抗体片段，以及这些物质的药物组合物。
背景技术：
1.本领域技术的背景朊病毒是“蛋白性感染颗粒”的缩写。这一术语是在1982年由旧金山加利福尼亚 大学的神经病学家Stanley B. Prusiner创造的，他提出仅由蛋白质组成的新型病原体导 致了被称作可传播性海绵状脑病(TSE)的一组致死性神经退行性疾病。所述疾病包括例如 羊类的羊瘙痒症(scrapie)、牛类的牛海绵状脑病(BSE或“疯牛病”)以及人类的库贾氏病 (Creutzfeldt-Jakob(CJD))。尽管已经在朊病毒疾病和朊病毒蛋白(PrP)方面进行了大量的研究，但是正常的 细胞型朊病毒蛋白(PrPG)的作用仍然是未知的。除在中枢神经系统细胞中之外，PrPG还 在免疫系统、造血干细胞以及成熟淋巴区室和脊髓区室(mature lymphoid and myeloid compartments)中广泛表达。有若干证据表明，PrPG可保护人神经元免受各种内部压力或 环境压力的作用。造血干细胞的自我更新可能需要PrPG，并且PrPG还可能在免疫系统中具 有独特的作用。PrPe的破坏会引起对细胞增殖、分化和存活非常重要的一组基因的调控异 常。PrPM以乎在调节多层面的网络内的细胞生理功能方面发挥根本性的作用。朊病毒蛋白疾病TSE感染性的性质仍然难以捉摸。有若干证据表明，朊病毒蛋白甚至可能并非单独 起作用。举例来说，科学家们已经确定了“辅因子”例如RNA和硫酸化糖胺聚糖(GAG)对于 感染性传播的重要性。同时还确定，PrPSe与感染性并无关联，并且PrPSe的积聚并非总是与 病理相关。PrPc已被证明涉及几种癌症，其中已经记载了细胞凋亡功能。值得注意的是，PrPG 在某些癌细胞系中是被过表达的(Du等人，Int J Cancerll3(2005)p213)o同时，还证明 卩冲°可与金属结合并且因而可在体内作为结合铜的抗氧化剂。在患有散发性CJD的患者脑 中检出异常的微量金属水平(尤其是锰)，该事实支持了这一理论。此外，已经表明？冲°构 成了细胞抗氧化防御机制的一部分。PrP在阿尔茨海默病中的表达已经引起注意McNeill，A.，MUM 8 (2004) p7_14，与 此类似，在急性发送信号(acute signaling)的情形例如在器官移植中，GAG/HSPG信号发 送的上调迅速发生。这一信号发送导致局部缺血。PrPc和HSPG之间的关联已经有人对PrP与硫酸化糖胺聚糖的关联进行了报道(Caughey等人，Acc. Chem.
4Res. 39(2006)p646)。实际上，人们已经注意到了 PrP和肝素/HS之间复杂的相互作用及其 与PrP功能的关联。已经发现硫酸化多糖可抑制以及刺激PrPse的形成。例如，多硫酸戊聚糖 是朊病毒疾病(TSE)的有效治疗方式(Larramendy-Gozalo C等人，J. Gen. Virol. 88 (2007) P1062)。另外，人们发现PrPse可与硫酸乙酰肝素共存，并且这种硫酸乙酰肝素具有显著硫 酸化不足的基序。为了研究其在羊瘙痒症发病机制中可能的作用，人们已经尝试去合成这 种硫酸乙酰肝素的活性糖表位。将HSPG的GAG链和核心蛋白均免疫定位于CJD和羊瘙痒症 中的朊病毒蛋白淀粉样斑块。类似于PrP，GAG已被证明也能在癌症方面引起变化。GAG的 代谢显示出在朊病毒疾病中被破坏。因而在感染朊病毒的动物和人的尿中以及在切除PrP 基因的小鼠的尿中都分泌有GAG。多硫酸化多糖刺激了 PrPG的胞吞作用并改变了 PrPG前 体的细胞定位。PrP与乙酰肝素样分子的结合被证明具有特异性，并且HS增加了神经母细 胞瘤细胞中的PrP浓度。可观察到在感染朊病毒的细胞中HSPG合成的 转录模式发生显著 变化，这表明硫酸化作用和PrPse之间存在关联。另据报道，发生致病性突变的朊病毒蛋白也显示出与糖胺聚糖的结合增强(Yin S 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. 104 (2007) p7546)，而人们已经发现硫酸化多糖能抑制以及刺激 PrPsc 的形成(Kocisko DA 等人，Antimicrob. Agents Chemother. 50 (2006)pl034)。目前已 有累积的证据支持下述理论一级的错误折叠的PrP模板在发生二聚作用时，PrP的二级结 构发生构象变化。关于淀粉样变性病，淀粉样斑块或淀粉样原纤维的积聚被认为是由PrP系统的 HSPG周转效率(turnover)低引起的，以至于致病性GAG/HSPG与淀粉样蛋白的结合致使所 述蛋白具有更长的生物半衰期。这转而导致以斑块形式从溶液中沉淀析出的过量蛋白的积聚。胃θ (priori—like protein)所述的朊病毒样叠朊蛋白(Dpi，Behrens, Α.等人，EMBO J. 21 (2002)p3652)具有 许多与所述细胞型朊病毒蛋白(PrPG)同样的生化性质和结构性质，而沙杜蛋白(Premzl， Μ.等人，Gene 314 (2003) p89)也是与PrP具有显著相似性的蛋白。在朊病毒蛋白存在这些 同源物的意义上，用于朊病毒表达的基因组看来存在多样性(我们认为不是冗余性)。人 们发现Dpl会在Sertoli细胞中永久表达，但根据物种不同其表达的水平也不同(Serres， C.等人，Biol. R印rod. 74(2006)p816)。已证明Dpi可通过控制雄性配子发生方面来调节雄 性可育性(Behrens，A.等人，EMBO J. 21 (2002)p3652)，以及在某些肿瘤中以相关的方式被 上调至恶性水平(Comincini, S.等人，Anticancer Res. 24 (2004)pl507)。可能实现的是， 更好地设计在过表达这些蛋白的组织中具有特定的PrP样作用的这些同源物。2. 一般信息本文所使用的术语“来源于”应理解为是指特定的整体可能从特定的源中获得，尽 管不一定是直接从该源中获得的。除非上下文另有需要或是明确陈述为相反含义，本文以单数表示的整体、步骤或 元素叙述的本发明中的整体、步骤或元素无疑包含所述的整体、步骤或元素的单数形式以 及复数形式。贯穿本说明书，除非上下文另有需要，单词“包括/包含”或其变形例如“包括了 / 包含了”或“包括于/包含于”将被理解为下述含义包括所陈述的步骤或元素或整体、或者包括步骤或元素或整体的组，而并不排除任何其他步骤或元素或整体、或者是元素或整体 的组。除非另有明确陈述，对于本文所描述的本发明具体实施方式
的每个特征，在加以 必要的变更后均适用于本发明的每个其他实施方式。本领域技术人员应当理解的是，除了明确地描述以外，本文所描述的发明可容许 进行各种变化和修改。应理解的是，本发明包括所有这类的变化和修改。本发明还包括在 本说明书中单独或整体提到或指明的全部步骤、特征、组合物和化合物，以及任意和全部的 组合或任何两个或多个所述的步骤或特征。本发明不限于本文所记载的具体实施例的范围。如本文所述，功 能等同的产物、组 合物和方法无疑也在本发明的范围内。所有在这一申请中引用的参考文献都明确地引入本文作为参考。除非另有指明，本发明的完成没有进行不当实验，在该不当实验中，使用了分子生 物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液法肽合成、固相肽合成和免疫学中的常规技 术。举例来说，这些过程描述于下面引入本文作为参考的正文中Sambrook, Fritsch&Maniatis, Molecular Cloning :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York，第二版(1989)，全部卷 I、II 和 III ；DNA Cloning :A Practical Approach，卷 I 和 II (D. N. Glover，编者，1985)，IRL Press, Oxford,全文；Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach(M. J. Gait,编 1984) IRL Press, Oxford，全文，尤其是其中的下述论文 Gait，ppl-22 ；Atkinson 等人，pp35_81 ； Sproat 等人，pp 83-115 ；以及 Wu 等人，pp 135-151;Nucleic Acid Hybridization :A Practical Approach (B. D. Hames&S. J. Higgins, 编者，1985) IRL Press, Oxford,全文；Immobilized Cells and Enzymes :A Practical Approach(1986)IRLPress, Oxford，全文；Perbal, B. , A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；Methods In Enzymology (S. Colowick 禾口 N. Kaplan,编者，AcademicPress, Inc.), 全部系列；J. F. Ramalho OrtigSo，“The Chemistry of Peptide Synthesis" In knowledge database of Access to Virtual Laboratory website(Interactiva, Germany)；Iozzo, Proteoglycan protocols(2001), Humana Press ；Leteux, C.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) pl2539 ；Toshihiko 等人，Trends in Glycoscience and Clycotechnology, 15 (2003) p29。本说明书中所包括的任何关于文件、行为、材料、装置或论文等的论述，其目的仅 在于为本发明提供背景资料。不应因为其存在于本申请的每一项权利要求的优先权日之 前，而允许将其理解为这些材料的任何部分或全部构成了现有技术基础的一部分或已经成 为本发明相关领域的公知常识。

发明内容
本发明涉及治疗朊病毒蛋白相关疾病，例如癌症(尤其是肿瘤)、淀粉样疾病(例 如淀粉样变性病和阿尔茨海默病)、炎症、移植技术以及相关的局部缺血。应当理解的是，本文所使用的术语“朊病毒蛋白相关疾病”包含涉及朊病毒蛋白或朊病毒样蛋白(例如沙杜蛋白和/或叠朊蛋白)的疾病。本发明不涉及被认为是由朊病 毒感染引起的“经典的”朊病毒疾病，例如TSE，尤其不是指在其范围内包括例如库贾氏病、 Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征、致死性家族性失眠或库鲁病(kuru)等朊病毒 疾病。相反，本发明所涉及的相关疾病不一定仅由朊病毒蛋白错误折叠所引起。最令人惊讶的是，本发明者在进行本发明的工作中发现朊病毒蛋白与特定的糖 胺聚糖(GAG)和/或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)结合并相互作用，从而导致或有助于所 述病程。在本文中，以下GAG和HSPG被称为“疾病相关的”与朊病毒蛋白和朊病毒样蛋白 结合的GAG和HSPG、在特定的疾病状态(例如癌症)中被确定上调的GAG和HSPG和/或另 外导致或有助于病程的GAG和HSPG。根据本发明，对于朊病毒蛋白相关疾病特别是癌性肿瘤的治疗是通过向对其有需 求的受试者提供治疗有效量的、能够对朊病毒蛋白和/或朊病毒样蛋白与疾病相关的GAG 和/或HSPG的结合进行调节的药剂来实现的。本发明者证明，这些疾病相关的GAG、HSPG、朊病毒蛋白和/或朊病毒样蛋白抗体 或抗体片段可用于治疗或改善受试者体内的朊病毒蛋白相关疾病或其病症或并发症。本 发明者还证明，选定的竞争性结合的糖胺聚糖(GAG)、合成的多硫酸化多糖、硫酸肝素蛋白聚糖 (HSPG)以及包含这些物质的药物组合物可用于抑制朊病毒蛋白和/或朊病毒样蛋白与疾病相 关的GAG和/或HSPG结合和/或相互作用，并可治疗性地用于治疗或改善疾病，包括例如预防 或减缓受试者体内肿瘤的生长。所述的竞争性结合剂尤其可用于治疗癌症和淀粉样疾病。概括地说，本发明所提供的疗法应理解为包含对朊病毒蛋白和/或朊病毒样蛋白 与疾病相关的GAG和/或HSPG的结合的调节作用或结合破坏的调节作用。这一调节作用 还应理解为包括破坏包含朊病毒蛋白或朊病毒样蛋白与疾病相关的GAG和/或HSPG的复 合体；或者防止或减少其形成。因此，本发明的第一个方面提供了用于治疗朊病毒蛋白相关疾病的方法，所述方 法包括向对其有需求的受试者提供给予有效量的、能够对朊病毒蛋白和/或朊病毒样蛋白 与疾病相关的GAG和/或HSPG的结合进行调节的药剂。在优选的实施方式中，所述朊病毒蛋白为PrPe。在另一个实施方式中，所述朊病毒 样蛋白为沙杜蛋白或叠朊蛋白。在一个实施方式中，所述药剂为能够对朊病毒蛋白或朊病毒样蛋白与疾病相关的 GAG和/或HSPG的结合进行调节的抗体或抗体片段。在一个优选的实施方式中，所述药剂为抗HSPG抗体、或抗GAG抗体，或它们的片段。在另一个实施方式中，所述药剂为抗朊病毒蛋白抗体(即抗PrP抗体)、或抗朊病 毒样蛋白抗体(例如抗Dpl蛋白抗体或抗沙杜蛋白抗体)，或它们的片段。优选所述抗体能够特异性结合至PrP、Dpi或沙杜蛋白和/或结合至疾病相关的 HSPG 或 GAG。
优选任何这些实施方式中的所述抗体为单克隆抗体或其片段。应当理解的是，本 发明中的抗体片段为免疫有效的部分。在一个实施方式中，所述单克隆抗体为PrP抗体，例如1E5/G6、3B8/D5、3F4、4H7、 5121、5B2、6G3、7B6、7D9、8B4、C-20、FL-253、M-20、WD3C7 (Santa Cruz)、3C10、5G12 (Jena)、 6H4.34C9 (Prionics),3C8.8H4(Alicon) 、 BAR221, BAR236, SAF83, SAF32, SAF53, SAF54 (SPIBio)。在另一个实施方式中，所述单克隆抗体为Dpl抗体，例如10005517 (Cayman)。在另一个实施方式中，所述单克隆抗体为HSPG或GAG抗体，例如 10E4 (Seikagaku)、B-A38、BC/B-B4、CSI 001-74、CSI 001-76、SPM255 (Abeam)、 1C9(Abnova)、297716、307801、300712、300736(R&DSystems)、1G12(Santa Cruz)、A71、A74、 A76(AntibodyShop)、A7L6 (Chemicon)、7B5(Invitrogen)。 在优选的实施方式中，所述单克隆抗体或片段为人源化的。在另一个实施方式中，所述片段为所述单克隆抗体的Fab、Fab'、F(ab' )2片段 或Fv0在另一个实施方式中，所述药剂为抗抑制性肽抗体。在所描述的优选实施方式更进一步的特征中，所述抗体或其片段的抗原识别区域 包含于如下多抗原肽(MAP)氨基酸序列KMMERVVEQMCITQYERESQ, SEQ ID NO 1SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRE, SEQ ID NO 2TNMKHMAGAAAAGAVVGGLG, SEQ ID NO 3GWGQGGGTHSQWNKPSK, SEQ ID NO 4 以及RYPPQGGGGffGQPHGGG, SEQ ID NO :5。在另一个实施方式中，本发明提供了一种杂交瘤，该杂交瘤能够产生对于朊病毒 蛋白或疾病相关的HSPG或GAG具有特异性的单克隆抗体。在一个优选的实施方式中，所述抗体与细胞毒剂一同给予。在一个实施方式中， 所述细胞毒剂为化学治疗剂。已知细胞毒剂的实例包括伊立替康(irinotecan)、吉西他滨 (gemcitabine)、多柔比星(doxorubicin)、阿霉素、甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇、顺 钼、奥沙利钼(oXaliplatin)、5-FU或长春瑞滨(vinorelbine)，但不限于此。在一个实施方式中，所述细胞毒剂连接于所述抗体。在本发明中的替代实施方式中，所述调节剂选自于由糖胺聚糖(GAG)、合成的多硫 酸化多糖和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)所组成的组。优选所述合成的多硫酸化多糖、GAG或HSPG可竞争性地结合至朊病毒蛋白。优选 所述药剂为非致病性GAG或HSPG、或者是合成的多硫酸化多糖。如此，所述感染性的或疾病 相关的GAG或HSPG的扩增和/或信号传输可通过非致病性药剂被竞争性地抑制。在一个实施方式中，GAG调节剂包括四糖例如UA-GlcN-UA-GlcNAc。在一个实施方式中，所述调节剂为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，其选自于多配体蛋 白聚糖(syndecan)或磷脂酰肌醇蛋白聚糖细胞表面蛋白聚糖(glypican cell surface proteoglycans)，或来源于上述物质中。在另一个实施方式中，所述蛋白聚糖为基底膜蛋白 聚糖(perlecan)或丝甘蛋白聚糖(serglycin)或其他硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。在一个优选的实施方式中，所述调节剂来源于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2、磷 脂酰肌醇蛋白聚糖_3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖_4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖_5、磷脂酰肌醇蛋白 聚糖-6、人基膜聚糖(lumican)、基底膜蛋白聚糖、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、 多配体蛋白聚糖_3、多配体蛋白聚糖-4或丝甘蛋白聚糖。 在一个实施方式中，所述的GAG调节剂包含实质上类似于HSPG表位决定簇的序 列，该表位决定簇被抗体10E4结合，优选包含序列UA-GlcN-UA-GlcNAc。实质上类似是指优选80 %或更高的同源性，更优选90 %或95 %或更高的同源性。在另一个实施方式中，所述调节剂为多硫酸戊聚糖例如多硫酸吡喃木糖(XPS)，它 是山毛榉木材的半合成衍生物。在另一个实施方式中，可给予调节剂的组合。在一个实施方式中，抗体与细胞毒剂 一同给予。举例来说，抗PrP抗体可与细胞毒剂一同给予，抗PrP相关蛋白可与细胞毒剂一 同给予，抗疾病相关的GAG和/或HSPG抗体可与细胞毒剂一同给予。在另一个实施方式中，抗体与GAG或HSPG—同给予。举例来说，抗PrP抗体可与 GAG和/或HSPG —同给予，抗PrP相关蛋白抗体可与GAG和/或HSPG —同给予，抗疾病相 关的GAG和/或HSPG抗体可与GAG和/或HSPG —同给予。在另一个实施方式中，GAG和/或HSPG与细胞毒剂一同给予。在另一个实施方式中，抗体与细胞毒剂以及GAG和/或HSPG —同给予。另一方面，本发明提供了一种能够对朊病毒蛋白或朊病毒样蛋白与疾病相关的 GAG或HSPG的结合进行调节的药剂在制备治疗朊病毒蛋白相关疾病的药物方面的用途。此外，本发明提供了用于本发明所公开内容中的用途的药物组合物，所述药物组 合物包含GAG或HSPG或者其变体或模拟物(mimetic)(例如包括多硫酸戊聚糖在内的合成 的多硫酸化多糖，且不限于此)或其混合物和/或抗体(在某些实施方式中，与细胞毒剂一 起或连接于细胞毒剂)，并包含药学上可接受的载体或稀释剂。本发明还包括一种治疗朊病毒蛋白相关疾病的方法，所述方法通过向对其有需求 的动物给予治疗有效量的本发明中的药物组合物来治疗所述朊病毒蛋白相关疾病。另一方面，本发明提供一种治疗对其有需求的受试者的方法，所述方法包括(i)确定患有朊病毒蛋白相关疾病的受试者；(ii)获得一些本文任何实施方式中的组合物；以及(iii)将所述组合物给予所述受试者。在另一个实施例中，本发明还提供一种治疗对其有需求的受试者的方法，所述方 法包括(i)确定患有朊病毒蛋白相关疾病的受试者；以及(ii)推荐给予本文的任何实施方式中的组合物。在另一个实施例中，本发明提供一种治疗方法，所述方法包括向此前确定为患有 朊病毒蛋白相关疾病的受试者给予或推荐本文任何实施方式中的组合物。在另一个实施例中，本发明提供一种治疗方法，所述方法包括(i)确定患有朊病毒蛋白相关疾病的受试者；(ii)获得本文任何实施方式中的组合物；(iii)将(ii)中所述的组合物与合适的载体和/或赋形剂进行制剂，从而例如用于口服给予、局部给予、吸入、注射或灌注，其中所述组合物的量足以缓解或预防对其有需 求的受试者体内的本文任何实施方式中的一种或多种症状或并发症或所述疾病本身，和/ 或所述组合物的量足以抑制、阻遏、延缓或降低朊病毒蛋白或朊病毒样蛋白与疾病相关的 GAG或HSPG的结合或相互作用；以及(iv)将所述的制剂给予所述的受试者。在另一个实施例中，本发明提供一种治疗方法，所述方法包括(i)确定患有朊病毒蛋白相关疾病的受试者；
(ii)获得本文任何实施方式中的组合物；(iii)将(ii)中所述的组合物与合适的载体和/或赋形剂进行制剂；以及(iv)推荐(iii)中的制剂。在本发明特别优选的实施例中，所述的治疗方法包括重复给予，其中每次给予都 是定时的，以确保在所述的治疗方案中，所述制剂物质的生物活性化合物或其他组分在所 述受试者的血浆中具有足够高的浓度。本发明的另一方面提供了确定或筛选适于治疗朊病毒蛋白相关疾病的候选调节 剂的方法。所述方法通过确定能够对朊病毒与特异性GAG或HSPG的结合进行调节的分子 来实现，所述分子即为所述候选药物。举例来说，在一个实施方式中，本发明提供一种了确定或筛选候选调节剂的方法， 所述方法包括使用抑制PrPsen向PrPresR化的体外分析方法。所述方法通过下述步骤实现 在PrPres的存在下和适于发生PrPsen向PrPres转化的条件下，将所述候选药剂与PrPsen接触 一段时间，测定所述PrPsen向PrPres的转化是否实际上已经发生或是被抑制。用于本发明的 治疗方法的候选化合物会对转化进行抑制(参见实施例3)。所述分析方法还提供了筛选所 述候选调节剂的变体、类似物和模拟物的方法。在优选的实施方式中，所述方法包括⑴获得经纯化的PrPres ；(ii)在存在或不存在候选药剂的条件下，将纯化的PrFes与PrPsen进行培养；以及(iii)测定 PrPsen 是否转化为 PrPres,其中，没有转化为PrFes表明所述候选药剂为有效的调节剂。优选所述PrFes经过纯化。本领域技术人员应当理解的是，如具体实施方式
所示，在不背离广泛记载的本发 明的精神或范围的情况下，可对本发明作出许多变化和/或修改。因此，本文中的实施方式 在各方面都应认为是说明性的而非限制性的。


图1为在乳癌细胞系的近融合培养物中朊病毒表达随侵袭性/恶性变化的图示。图2为结肠癌细胞系中PrP水平的图示。图3为MTT分析法中，PrP抗体对于HCTl 16细胞的相对抑制作用的图示。图4为MTT分析法中，不同的抗体浓度对于HCTl 16细胞生长的图示。图5为IRI与IRI/2A5抗体的IC50比值的图示。图6为人结肠癌HCTl 16细胞中，对HS抗体10E4的抗增殖响应的图示。
图7显示了相比于对照组(左图)，用BAR221抗PrP抗体(右图)处理24小时 后，HCTl 16结肠癌细胞形态的变化。图像为50倍(A)和200倍(B)放大后的图像。图8为用BAR221抗PrP抗体处理后蛋白表达变化的图示，通过狭缝印迹分析得 至IJ。相比于β -肌动蛋白对照，10E4HS的表达增加而抗细胞凋亡标记物Bcl-2减少。图9为不同的乳癌细胞系中10E4HS表达的图示。表达的增加与侵袭的减少有关。图10为用抗PrP抗体处理后裸鼠体内HCTl 16肿瘤异种移植物尺寸的图示。图11表明相比于单独使用伊立替康的情况，用抗PrP抗体实施组合疗法后， H CTl 16异种移植肿瘤的生长速率更低。图12为相比于单独使用伊立替康，在WiDr肿瘤异种移植物中，多硫酸戊聚糖组合 疗法的有效性的图示。图13为相比于单独接受伊立替康的小鼠，接受多硫酸戊聚糖组合疗法的、带有 WiDr肿瘤异种移植物的小鼠其存活率增加的Kaplan-Meier图。
具体实施例方式缩写CJD 库贾氏病Dpl 叠朊蛋白GAG 糖胺聚糖HS 硫酸乙酰肝素HSPG 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖PG 蛋白聚糖PrP 朊病毒蛋白PrPc 细胞型朊病毒蛋白PrPres对蛋白酶K具有抗性的朊病毒蛋白PrPsc羊瘙痒症型朊病毒蛋白(致病型)PrPsen对蛋白酶K敏感的朊病毒蛋白PK 蛋白酶KTSE 可传播性海绵状脑病在进行本发明的工作中，本发明者惊讶地发现细胞型朊病毒蛋白(PrPe)以及朊病 毒样蛋白(叠朊蛋白(Dpi)和沙杜蛋白)参与了包括糖胺聚糖(GAG)和硫酸乙酰肝素蛋白 聚糖(HSPG)的细胞信息传递系统。本发明者假定朊病毒蛋白和朊病毒样蛋白的作用之一是在HSPG和/或GAG的转 运、扩增和传播中发挥作用。本文所使用的术语“转运”是指HSPG和/或GAG在细胞内或细胞间的移动。本文 所使用的术语“扩增”是指例如GAG或HSPG组分的量的增加。本文所使用的术语“传播”是 指传染物或疾病从患病的细胞或动物传递至此前健康的细胞或动物。参考实施例4，本发明者提出在蛋白错误折叠循环扩增(PMCA)过程中，特定的HS 表位与PrPse—起扩增。本发明者证实了肿瘤细胞(在本案中为结肠癌细胞)过表达朊病毒蛋白(PrPse)(参见实施例5)，并且本发明者惊讶地发现硫酸乙酰肝素和朊病毒蛋白以分布于细胞表面 和核内体的方式共存于癌细胞中。共存也在细胞间转运和细胞分裂中得到了证明(参见实 施例6)。这一成果表明所述的朊病毒蛋白/GAG/HSPG机理(machinery)在癌细胞中相互 关联并有所上调。最令人惊讶的是，本发明者证明可对这一机理进行抑制以作为癌症的治疗方式。 参考所述的实施例，在实施例7和实施例8中，本发明者用抗PrP抗体处理了患有 肿瘤的动物。本发明者将用抗PrP抗体处理的动物体内的肿瘤块和细胞增殖与未用抗PrP 抗体处理的对照动物进行对比。本发明者发现，治疗防止或减少了肿瘤生长和/或细胞增 殖。用于这些实施例的抗体为6D11。更优选所使用的抗体为BAR221、或BAR226、或有效抑 制癌细胞(例如MTT分析法中的HCT116细胞)生长的任何其他抗体(参见图3和图4)。 本发明者在实施例9中进一步证明，抗体(在本案中为抗PrP抗体)引起或增加了癌细胞 的凋亡。在实施例10中，本发明者证明通过给予抗PrP抗体与细胞毒剂(在本案中为伊 立替康)的组合，可以抑制或压制(suppressed)或逆转癌细胞增殖和/或肿瘤块生长。根 据本发明，在对于朊病毒相关疾病(例如癌症，特别是肿瘤)提供增强治疗方面，抗PrP抗 体的效果优于单独使用所述细胞毒素的效果。在实施例11中，本发明者证明HS抗体10E4防止了癌细胞的增殖(如在针对人结 肠癌HCT116细胞的MTT分析法中所测定的)。根据所述结果，相比于用HS 10E4抗体处理 的细胞，对照细胞之间的相对抑制百分比存在显著的差异。最后，本发明者证明，给予GAG(即多硫酸戊聚糖)与抗PrP抗体和细胞毒素类药 物的组合，对于治疗、防止和减少肿瘤块或肿瘤细胞增殖更为有效。因而，概括地说，本发明者发现相比于正常组织，试图改变其环境表型或保持强 烈的异常表型变化的细胞(例如癌细胞)过表达PrP、Dpl和/或沙杜蛋白以及某些疾病相 关的GAG和HSPG，还发现通过给予干扰所述PrP、Dpi或沙杜蛋白的扩增、转运或传递系统 的药剂，可抑制肿瘤的生长。本发明者提出，从感染有朊病毒疾病(例如可传播性海绵状脑病(TSE))的细胞或 动物中分离的特异性的GAG和/或HSPG (本文中被称为“疾病相关的GAG和HSPG”)，可用 这一朊病毒蛋白细胞信息传递系统来扩增特异性的GAG和/或HSPG，也可用于感染正常的 细胞或动物，使在此前未感染的细胞或动物中传播或引起各种疾病病理。本发明提出了用天然的朊病毒蛋白或朊病毒样蛋白扩增特异性的GAG序列或 HSPG序列的方法。如实施例13和实施例14所述的方法包括获得要进行扩增的HSPG ；在 适宜发生扩增的条件下，将所述HSPG与脑勻浆或脑勻浆的一部分接触一段时间，或与脑勻 浆的必要的酶/组分接触一段时间。优选所述方法包括对所述样品进行培养和/或超声处 理。优选所述方法包括将扩增的GAG或HSPG进行分离。在一个实施例中，本发明者还假定从感染羊瘙痒症的神经母细胞瘤细胞系分离 的HSPG能够在未感染的神经母细胞瘤培养物中引起羊瘙痒症。用肝素酶对HSPG的处理可 用于显示这一模型中感染性的去除。本发明者关于朊病毒蛋白参与GAG/HSPG信号的转运、扩增和/或传播这一非比寻 常的发现，能够使得对这一机理的抑制成为其他相关紊乱(例如淀粉样变性病和阿尔茨海默病)的治疗方式以及移植技术中的治疗方式。关于淀粉样变性病，认为淀粉样斑块或淀粉样原纤维的积聚是由所述PrP系统的HSPG周转效率低引起，从而使得致病性GAG/HSPG 与淀粉样蛋白的结合致使所述蛋白具有更长的生物半衰期。这转而导致以斑块形式从溶液 中沉淀析出的过量蛋白的积聚。阿尔茨海默病中PrP的表达已经引起人们的注意=McNeill, A.，MUM8 (2004) P7-14。与此类似，在急性发送信号(acute signaling)的情形(例如在器官移植)中，GAG/ HSPG信号发送的上调迅速发生。可用本发明的方法通过抑制所述的PrP机理，使这一导致 局部缺血的信号发送得以最小化。因此，本发明提供了一种用于治疗包括例如癌症、淀粉样疾病和炎症在内的朊病 毒蛋白相关疾病的方法，所述方法包括向对其有需求的受试者给予有效量的、能够对PrP、 沙杜蛋白或叠朊蛋白与疾病相关的GAG或HSPG的结合进行调节的药剂。举例来说，调节剂可为单克隆抗体或多克隆抗体或抗体片段，这些抗体或抗体片 段能够与PrP、沙杜蛋白、叠朊蛋白或疾病相关的GAG或HSPG结合。优选所述抗体特异性 结合PrP、沙杜蛋白或叠朊蛋白的至少一个表位，或是特异性识别GAG或HSPG。在替代的方 面，例如对于癌症和淀粉样疾病的特异性治疗，所述调节剂也可为GAG、HSPG或合成的多硫 酸化多糖，优选与朊病毒蛋白、叠朊蛋白或沙杜蛋白特异性且竞争性地结合的上述物质。术语“特异性结合”是指能够仅与确定的靶点实质上结合的药剂。在本发明优选的实施方式中，所述调节剂包括下列物质的组合抗体和/或GAG和 /或HSPG和/或合成的多硫酸化多糖和/或细胞毒剂。朊病毒蛋白和朊病毒相关蛋白PrP是作为所述PrP基因翻译产物的动物蛋白，其中，所述蛋白在人体内由253个 氨基酸组成(公开于 Kretzschmar 等人，DNA 5 :315_324，1986 ；Pucket 等人，Am. J. Hum. Genet. 49 :320_329，1991)，在仓鼠和小鼠体内由254个氨基酸组成，在牛体内由264个 氨基酸组成，在羊体内由256个氨基酸组成。所有这些蛋白的氨基酸序列都是已知的，并 公开于美国专利No. 5，565，186以及下述文章中Locht，C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 6372-6376,1986 ；Kretzschmar, H. Α.等人，DNA 5 315-324,1986 ；Yoshimoto, J.等人，Virus Genes 6 :343_356，1992 ；以及 Goldmann，W.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 =2476-2480,1990o所述PrP蛋白包括由蛋白酶K降解的天然PrPsen(PrPc)同工型 (isoform)以及对蛋白酶K部分具有抗性的、与病理学相关的PrFes(PrPse)形式，所述的病 理PrFes(PrPse)形式诱导了 PrPsen的构象变化，从而形成在所述海绵状脑病中发现的这种 特征性淀粉样沉积。本文所使用的术语“PrP”从种类上说，是指来自于动物的蛋白，并且包括特定 人、仓鼠、鼠、羊、牛或鸟等形式的PrP。抑制性PrP肽和cDNA为所公开的鼠PrP序列和人 PrP序列的直系同源物，并具有类似的氨基酸和核酸结构，从而在结构上相关。所述PrP 的第119-136位的区域与人(Pl 13-136)、小鼠(P112-119)、水貂、大鼠、羊(Pl 16-123)、 牛(P124-131)、中国仓鼠和亚美尼亚仓鼠的相同。序列在不同物种中的更长区域实质上 同源。举例来说，除了在小鼠比对(aligned)序列第138位用异亮氨酸(Ile)取代了甲硫 氨酸(Met)，小鼠和人类的序列在第113-141位的窗口区域内是相同的。除了在人类序列 的第138位和第139位分别用异亮氨酸(Ile)取代了甲硫氨酸(Met)，仓鼠和人类的序列在P113-141的窗口区域内是相同的。除了在所述小鼠序列中P109和P112处的甲硫氨酸 (Met)至亮氨酸(Leu)的替换以及甲硫氨酸(Met)至异亮氨酸(Ile)的替换，小鼠和仓鼠的 序列在P109-141的比对窗口区域内是相同的。沙杜蛋白和叠朊蛋白为所述朊病毒蛋白的同源物。所述沙杜蛋白序列由 Lampo, E.等人，BMC Genomics 8 (2007) 138页所提供，而最近关于叠朊蛋白的综述见于 Comincini, S. ^A Central European Journal ofBiology 1(2006)494 页。抗体和表位在本发明中，适于用作调节剂的抗体实例包括例如PrP的单克隆抗体，例如 BAR221、BAR236、SAF83、SAF32、SAF53、SAF54 (SPIBio)、1E5/G6、3B8/D5、3F4、4H7、5121、 5B2、6G3、7B6、7D9、8B4、C-20、FL-253、M- 20、WD3C7(Santa Cruz)、3C10、5G12(Jena)、6H4、 34C9 (Prionics)、3C8、8H4 (Alicon)。Dpi 抗体包括例如 10005517 (Cayman)。HSPG/GAG 抗 体包括例如 10E4 (Seikagaku)、B-A38、BC/B-B4、CSI001-74、CSI 001-76、SPM255 (Abeam)、 1C9 (Abnova)、297716、307801、300712、300736(R&D Systems)UG12(Santa Cruz)、A71、 A74> A76 (AntibodyShop)、A7L6 (Chemicon)、7B 5 (Invitrogen)。朊病毒蛋白PrP抗体[8H4] (ab61409)的可选名称包括例如ASCR抗体、致死性家 族性失眠抗体、CD230抗原抗体、CJD抗体、库贾氏病抗体、Gerstmann-Strausler-Scheinker 综合征抗体、GSS抗体、Major朊病毒蛋白抗体、MGC26679抗体、朊病毒相关蛋白抗体、PRIP 抗体、Prni 抗体、Prnp 抗体、PrP 抗体、PrP27_30 抗体、PrP33_35C 抗体、PrPC 抗体、PrPSc 抗体以及Sine抗体。根据本发明，在一个实施方式中，本发明的抗体与包含于下述氨基酸序列(人类 PrP)的抗原特异性地结合KMMERVVEQMCITQYERESQ, SEQ ID NO 1SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRE, SEQ ID NO 2TNMKHMAGAAAAGAVVGGLG, SEQ ID NO 3GWGQGGGTHSQWNKPSK, SEQ ID NO 4 以及RYPPQGGGGffGQPHGGG, SEQ ID NO :5。本文所使用的术语“表位”是指抗原上与抗体的抗体结合部位结合的任何抗原决定簇。表位决定簇由例如氨基酸或碳水化合物侧链等分子的化学活性表面基团 (groupings)组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。举例来说，本发明 优选的表位包括包含上述序列的表位。本文所使用的术语“抗体”包括具有结合区域的任何特异性结合的物质，所述结合 区域具有朊病毒蛋白或朊病毒样蛋白(或者是其片段或表位)或疾病相关的GAG或HSPG所 需要的特异性和/或亲和力。所述术语“抗体”包括完整的分子及其功能性片段，例如Fab、 F(ab' )2*Fv。将这些功能性抗体片段描述如下l.Fab，一种片段，该片段含有抗体分子的单价抗原结合片段，可通过用木瓜蛋白 酶将整个抗体酶切以产生完整的轻链和一条重链的一部分而进行制备；2. Fab'，抗体分子的片段，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后进行还原，以产 生完整的轻链和重链的一部分来获得；每个抗体分子获得两个Fab'片段；
3. (Fab' )2，抗体分子的片段，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行随后的还原而获得；F(ab' )2为两个Fab'片段通过两个二硫键连接在一起形成的二聚物；4. Fv，定义为含有所述轻链可变区和所述重链可变区的基因工程片段，表达为两 条链；以及5.单链抗体(“SCA”)，含有所述轻链可变区和所述重链可变区的基因工程分子， 通过适当的多肽连接子连接为基因融合的单链分子。术语“抗体”包括抗体和片段的结合物。进一步地讲，所述术语“抗体”还应包括 对抗体或其部分进行表达的细胞。制备多克隆抗体和单克隆抗体及其片段的方法在本领域中是公知的(参见例如 Harlow 禾口 Lane, Antibodies :A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York, 1988，引入本文作为参考)。举例来说，抗体，优选单克隆抗体，通过用相关的免疫原对动物(例如小鼠)进行 免疫来产生。任选所述免疫原在佐剂(例如Freimd完全佐剂或不完全佐剂)、溶血卵磷脂 和/或二硝基苯酚的存在下进行注射，以增强对所述免疫原的免疫响应。所述免疫原还可 连接至载体蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)。然后，由所述的免疫动物获得脾细胞。再通过 例如与骨髓瘤细胞融合伴侣(fusion partner)进行融合，使所述脾细胞永生化，所述融合 伴侣优选与所述免疫动物同系。可使用各种融合技术，例如，所述脾细胞和骨髓瘤细胞可用 非离子型去污剂进行结合，或进行电融合，然后在支持杂交细胞生长而不支持骨髓瘤细胞 生长的选择性培养基中进行生长。优选的选择技术是使用HAT (次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷) 选择。在足够长的时间后，通常为约1至2星期，观察到杂合体的细胞群。选定单个细胞群， 并对其中所述细胞已经生长的生长培养基进行测试，测试抗多肽(免疫原)结合活性是否 存在。优选具有高反应性和高特异性的杂交瘤细胞。使用例如亲和纯化法从生长的杂交瘤细胞群的上清液中分离单克隆抗体，所述亲 和纯化法使用对动物进行免疫的免疫原，将能够与其结合的抗体分离。此外，可使用各种技 术以增加产率，例如将所述杂交瘤细胞系注射入适当脊椎动物宿主(例如小鼠)的腹膜腔。 然后，从该动物受试者的腹水或血液中收集单克隆抗体。通过常规技术，例如层析法、凝胶 过滤法、沉淀法和/或萃取法，从所述抗体中除去污染物。可通过所述抗体的蛋白水解来制备本发明中的抗体片段，或者通过编码所述片段 的DNA在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白表达系统) 中的表达来制备本发明中的抗体片段。可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶对整个抗 体进行酶切而获得抗体片段。举例来说，抗体片段可以如下制备将抗体用胃蛋白酶酶促切 害!]，从而提供5S片段表示的F(ab' )2。可进一步用硫醇还原剂和任选使用巯基(所述巯基 由二硫键切割产生)的保护基团切割这一片段，从而产生3. 5S Fab'单价片段。或者，利用 胃蛋白酶进行酶促切割，直接产生Fc片段以及两个单价Fab'片段。这些方法描述于例如 Goldenberg，美国专利No. 4，036, 945和No. 4，331，647以及其中所包含的参考文献，将所述 专利整体引入本文作为参考。还参见Porter，R. R. (Biochem. J. 73 119-126 (1959))。还可 使用其他切割抗体的方法，例如将重链分离以形成单价的轻-重链片段、进一步切割片段 或使用其他酶学技术、化学技术或遗传学技术，只要所述片段能结合至可被完整的抗体识 别的抗原。
Fv片段包含VH和VL链的缔合。这一缔合可为非共价的，如Inbar等人所述(Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 69:2659-62(1972))。或者，所述可变链可通过分子间的二硫键进 行连接或通过化学试剂例如戊二醛进行交联。优选所述Fv片段包含通过肽连接子连接的 VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)通过构建结构基因来进行制备，所述的结构基 因包含编码由寡聚核苷酸连接的VH和VL区域的DNA序列。所述结构基因被插入到表达载 体中，所述表达载体随后被引入宿主细胞例如大肠杆菌。本发明所使用的抗体优选为能够被传递至哺乳动物细胞的抗体片段、或在哺乳动 物细胞中被表达的抗体片段。抗体片段的另一种形式为对单个互补决定区(⑶R)进行编码的肽。⑶R肽(“最 小识别单位”)可通过构建编码所关注抗体的CDR的基因来获得。这些基因例如通过聚合 酶链式反应，由产生抗体的细胞的RNA来合成所述可变区来进行制备。参见例如Larrick 和 Fry(Methods, 2 106-10(1991))。非人(例如鼠)抗体的人源化形式为免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段的嵌合 分子，所述片段例如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗体的其他抗原结合子序列，所述 嵌合分子包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗 体)，所述人免疫球蛋白中来自所述受体互补决定区(CDR)的残基被来自具有所希望的特 异性、亲和性和结合容量(capacity)的非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的CDR 的残基所取代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基取代。人源 化抗体还可包括在所述受体抗体中和输入的(imported) CDR或框架序列中均未发现的残 基。一般说来，所述人源化抗体实质上会包括至少一个、通常为两个的全部可变区，其中全 部或实质上全部的CDR区域与非人免疫球蛋白的CDR区域对应，并且全部或实质上全部的 FR区域为人免疫球蛋白共有序列的FR区域。最理想的情况下，所述人源化抗体还会包括免 疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区(Jones等人，Nature, 321 522-525(1986) ；Riechmann 等人，Nature, 332 :323_329 (1988)；以及 Presta, Curr. Op. Struct. Biol.，2 :593_596(1992))。将非人抗体人源化的方法在本领域中是公知的。人源化抗体通常具有从非人来 源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常被称为输入残基(import residues)，这些残基通常取自输入可变区(import variable domain)。基本上可按照 Winter 及其合作者的方法(Jones 等人，Nature, 321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等人， Nature, 332 :323_327 (1988) ；Verhoeyen 等人，Science, 239 :1534_1536 (1988))进行人源 化，通过用啮齿类动物的CDR或CDR序列取代人抗体相对应的序列来进行。因此，这类人源 化抗体为嵌合抗体(美国专利No. 4，816，567)，其中，实质上少于完整的人可变区已经由非 人物种相对应的序列取代。实际上，人源化抗体通常为人抗体，所述人抗体中某些CDR残基 以及可能某些FR残基被来自啮齿类动物抗体类似部位的残基所取代。人抗体也可利用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol, 227 391 (1991) ；Marks 等人，J. Mol. Biol，222 :581 (1991))。 Cole等人和Boerner等人的技术也可用于人单克隆抗体的制备(Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan R. Liss,p. 77 (1985)以及Boerner 等人，J. Immunol, 147(1) :86-95(1991))。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如所述内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠)而制备人抗体。在激活(challenge) 后，观察到了人抗体的生成，其在各方面都与在人体内所发现的十分类似，包括基因重 排、组装以及抗体集合(r印ertoire)。这一方法描述于例如美国专利No. 5，545，807、 5，545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016 以及下述科技出版物中:Marks 等人，Bio/Technology 10 :779_783 (1992) ；Lonberg 等人，Nature 368 :856_859 (1994)； Morrison, Nature 368:812-813(1994) ；Fishwild φ A, Nature Biotechnology 14, 845-851(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996);以及 Lonberg 禾口 Huszar, Intern.Rev. Immunol. 13,65-93(1995)。通过本文所公开的内容，对于熟练的技术人员来说，用于对治疗受试者体内朊病 毒蛋白疾病或与朊病毒蛋白疾病有关的并发症所用的任意量的抗体或抗体片段或结合物 的功效进行评价的方法是显而易见的。举例来说，将包含一定量的抗体或抗体片段或结合 物的组合物给予感染有朊病毒蛋白疾病的受试人群，并对其中疾病或其症状或其并发症的 严重程度降低 疾 病的抗体或抗体片段或结合物的量。举例来说，在至少约50%、或至少约60%、或至少约 70%、或至少约80%、或至少90%、或至少约95%的所述人群中，有效量的抗体、片段或结 合物降低了所述疾病或症状或并发症的严重程度。细胞毒素类药物根据本发明，相比于单独使用细胞毒素类药物，抗体和细胞毒素类药物的组合提 供了对朊病毒相关疾病例如癌症特别是肿瘤的改进疗法。细胞毒素类药物优选包括伊立替 康、吉西他滨、多柔比星、阿霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、顺钼、奥沙利钼、5-FU或长春瑞滨，但不 限于此。应当理解的是，所述细胞毒素类药物适于使用，并且给予对其有需求的患者时具有 相容性。下面为目前使用的细胞毒素类药物的列表，但是这一列表并未穷尽。
商品名称 六甲蜜胺Ml
安吖唆Amsidyl
L-门冬酰胺酶 参见左旋门冬酰胺酶 博来霉素Blenoxane、Blenamax、博来霉素
白消安^Wl
卡培他滨WWE 蛋白聚糖和多糖疾病相关的GAG/HSPG疾病相关的GAG/HSPG可通过例如对肿瘤和TSE组织的糖序列和/或二糖组合物 的分析进行鉴别。然后将这一信息与来自正常组织GAG/HSPG的糖序列进行对比。具有不 同于正常的糖组合物/序列的GAG/HSPG被确定为是与疾病相关的。差异可存在于硫酸化 位点、硫酸化程度或糖序列中。二糖组合物可按照下述文献来完成Ha等人，Carbohydrate Res. ,340 (2005)p411-416 ；Lyon ^ 人，J. Biol. Chem.，269 (1994)pll208_11215 ；或者 Parthasarathy 等人，J. Biol. Chem. 273 (1998) p21111-21114。测序可按照下述文献来完成 Turnbull 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，96 (1999) p2698_2703 或 Vives 等人，Biochem. J. ,339 (1999)p767-7730作为调节剂在本发明的某些方面包括例如癌症和淀粉样疾病的治疗，调节剂可为蛋白聚糖 和多糖，例如HSPG、GAG和多硫酸化多糖。这些物质可为天然的调节剂或合成的调节剂。 其制备方法描述于本文的实施例中，并因记载于下述资料而公知IoZZO，Proteoglycan protocols (2001)，HumanaPress ；Leteux, C.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) pl2539 ； Toshihiko 等人，Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 15 (2003) p29。优选在实施例3公开的此类分析中，本发明中所述的GAG或HSPG药剂以低于约 1000 iiM 的 IC5Q，例如低于约 600iiM、550iiM、200iiM、120iiM 甚至 100 y M 的 IC5(1 特异性地 抑制PrPsen向PrFes的无细胞转化。虽然实施例3的分析使用仓鼠PrP来测定对所述转化 反应(PrPsen转化为PrFes)的抑制，但可在所述分析中用人PrP或其他物种的PrP进行取代，尤其是在希望对用于不同物种的变体进行测试的情形。举例来说，可通过在实施例3的 分析中，用人PrP取代仓鼠PrP来对用于人PrP的所述转化反应的抑制进行测试。在优选的实施方式中，所述竞争性结合调节剂包括短GAG(天然的或合成的)，例 如包含至少4-8个糖的GAG，更优选包含9、10、12、14或15个糖的GAG。这类糖可例如由 利用肝素裂合酶III解聚的硫酸乙酰肝素进行制备。优选10-90%解聚的、低硫酸酯含量 (4-9% )的硫酸乙酰肝素。在一个实施方式中，GAG调节剂包括四糖例如UA-GlcN-UA-GlcNAc。各类GAG/HSPG调节剂分别为HSPG (例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖_1、磷脂酰肌醇蛋白 聚糖-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5、磷脂酰 肌醇蛋白聚糖_6、人基膜聚糖、基底膜蛋白聚糖、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖_2、 多配体蛋白聚糖_3、多配体蛋白聚糖-4或丝甘蛋白聚糖)、GAG(例如来源于磷脂酰肌醇蛋 白聚糖-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4、磷脂 酰肌醇蛋白聚糖_5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖_6、人基膜聚糖、基底膜蛋白聚糖、多配体蛋白聚 糖-1、多配体蛋白聚糖_2、多配体蛋白聚糖_3、多配体蛋白聚糖-4或丝甘蛋白聚糖的GAG 和GAG片段)、合成的GAG以及多硫酸化多糖(例如葡聚糖硫酸酯和多硫酸戊聚糖)。优选 全部调节剂保持所希望的抑制活性，所述活性通过本说明书公开抑制活性的无细胞分析容 易地进行测定。所述多配体蛋白聚糖家族含有四个成员(多配体蛋白聚糖-1/多配体蛋白聚糖、 多配体蛋白聚糖-2/纤维蛋白聚糖、多配体蛋白聚糖-3/N-多配体蛋白聚糖、多配体蛋白 聚糖-4/抗凝蛋白聚糖(ryudocan) (amphyglycan))，均为跨膜的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG) (1,2)。这些HSPG随表达多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖_2和多配体蛋白聚 糖-4的血管内皮细胞显示出细胞类型特异性分布，并显著靶向基底外侧表面。所述多配体 蛋白聚糖家族成员为具有同源跨膜区和胞浆区的I型整合膜蛋白。所述结合的跨膜区/胞 浆区含有四个高度保守的酪氨酸残基，所述残基对于生物学功能可能发挥了重要的作用。多配体蛋白聚糖-1的胞质尾区与细胞内微丝相互作用，而多配体蛋白聚糖_4的 胞质尾区与黏着斑分子(focal adhesion molecules)相互作用。由于独特的翻译后修饰， 多配体蛋白聚糖-1同时含有具有组织特异性结构多态性的硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素 GAG (糖胺聚糖)链。多配体蛋白聚糖-1还被纯化为来自内皮细胞的抗凝剂HSPG或纯化为 金黄地鼠体内的bFGF受体分子。因而，多配体蛋白聚糖-1的这种多态性可能反映出独特 的HSPG功能。另一个细胞表面HSPG家族磷脂酰肌醇蛋白聚糖由六个成员组成(磷脂酰肌醇蛋 白聚糖-1/磷脂酰肌醇蛋白聚糖、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2/脑蛋白聚糖、磷脂酰肌醇蛋白聚 糖_3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4/K-磷脂酰肌醇蛋白聚糖、磷脂酰肌醇蛋白聚糖_5以及磷脂 酰肌醇蛋白聚糖_6)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族成员具有胞外区，所述胞外区具有GAG附着 位点、使高度紧密的三级结构保持稳定的14个不变的半胱氨酸残基以及羧基末端GPI (糖 基化磷脂酰肌醇)锚。磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族成员在不同的细胞类型上选择性地进行表 达，仅有磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1存在于血管内皮细胞上。这些HSPG主要靶向顶面(apical surfaces)，并且这一过程部分取决于聚糖化的程度。这也表明，磷脂酰肌醇蛋白聚糖通过 类似于多配体蛋白聚糖的HS GAG链在调节成纤维细胞生长因子的生物活性方面起到重要作用。多硫酸戊聚糖(pentosan polysulfates,PPS)特别是多硫酸吡喃木糖可以下列形 式获得碱金属盐或碱土金属盐，例如包括钙盐或钠盐；或过渡金属例如铜和锌；以及贵金 属例如钼。因此，所述特定的络合离子可选自于由下列离子所组成的组碱金属，例如Na+和 K+ ；碱土金属，例如 Ca2\ Zn2\ Mg2+、Ba2+ ；以及 Ag+、Pb2+、Cu2\ Au2\ Pd2+、Pd4+、Pd4+、Pd2+ ；三价 金属离子；以及季铵化合物络合物。后一化合物的实例为氯化吡啶、四烷基氯化铵、氯化胆 碱、氯化十六烷基吡啶、N-十六烷基-N，N, N-三烷基氯化铵或它们的衍生物。这些物质中 最优选二价碱土金属，优选钙和镁，最优选钙络合物，平均每第十个木糖残基有一个甲基葡 糖醛酸。多硫酸化多糖-金属络合物的制备详细描述于美国专利No. 5，668，116，本文将其 所公开的内容整体引入作为参考。包括在本发明范围内的其他多硫酸化多糖例如是多硫酸葡聚糖及其衍生物、多 硫酸环糊精、硫酸肝素、硫酸甘露糖及甘露糖衍生物、木聚糖、多硫酸软骨素、皮肤素以及透 明质酸。进一步的实例为直链或支链的同多糖或杂多糖的多硫酸化多糖衍生物。如上所 述，在这些多硫酸化多糖和多价金属离子、Ag+和Au+以及季铵化合物络合物之间也形成络 合物。所述的糖可来源于戊糖或己糖例如半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、果糖、山梨 糖、木糖、D-阿拉伯糖、核糖、L-阿拉伯糖、葡糖醛酸以及它们的衍生物，但不限于此。术语“过硫酸化”是指所述化合物具有连接于全部可用于硫酸化的氧位点的硫酸 根基团。举例来说，PPS每个碳水化合物单体含有大约两个硫酸根基团。由于PPS上的糖 醛酸侧基，PPS上的硫酸化度大约为1. 8。多糖的硫酸化详细描述于美国专利No. 5，668，116，本文将其所公开的内容整体引 入作为参考。治疗学本发明中的调节剂可用于本发明中的治疗方式本身或用作药物组合物的一部分。本文所使用的术语“治疗”是指逆转、缓解、减缓、抑制或预防使用这一术语的疾 病、紊乱或病症的发展，或指逆转、缓解、减缓、抑制或预防一种或多种这类紊乱或病症的症 状或来源于所述疾病或病症的并发症。术语“治疗方式”或“疗法”是指对所述受试者进行 治疗的行为。本文所使用的词组“对其有需求的受试者”是指患有朊病毒蛋白相关疾病或具有 患朊病毒蛋白相关疾病风险(即有患病倾向)的哺乳动物受试者，优选人类受试者。本文所使用的术语“预防”和“治疗”不应理解为需要绝对去除(即100%去除) 朊病毒蛋白疾病或相关病症，或者绝对预防(即100%预防)具有其危险因素的受试者体内 肿瘤的生长；并且相比于未使用本发明中的预防或疗法的情况，利用本发明中的方法使得 所述有害的症状明显减少就已经足够。类似地，在整个本说明书中所使用的术语“缓解”不应理解为需要去除受试者体内 的朊病毒蛋白疾病或相关病症，相比于未使用本发明中的治疗方式的情况，所述去除不只 是具有显著效果。类似地，在整个本说明书中所使用的术语“抑制”、“增强”、“阻遏”、“延缓”、“增强”、“诱导”、“活化”和“促进”不应理解为需要任何特定的量变，而只是改进的水平和/或活性 和/或表达或者是其改进的时间，即相比于未使用本发明中治疗方式的情况，具有显著量变。本文所使用的“药物组合物”是指具有其他化学组分例如生理上适合的载体和赋 形剂的、本文所述的一种或多种活性成分的制剂。药物组合物的目的是促进化合物向生物 体的给予。在下文中，短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”可互换使用，是 指不会对生物体造成明显刺激、且不会去除所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释 齐U。佐剂包括于这些短语中。本文中的术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中，以进一步促进活性成分给予的 惰性物质。赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种淀粉、纤维素衍生物、明胶、植 物油和聚乙二醇，但不限于此。本文所使用的术语“适当的载体”或“赋形剂”应理解为是指适用于给予受试者的 组合物中的化合物或混合物。举例来说，用于注射入受试者的、本发明所使用的适当的载体 或赋形剂，通常不会在所述受试者体内造成有害反应。用于制剂和给药的技术可以见于“Remington' s PharmaceuticalSciences”， Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版，本文将其引入作为参考。举例来说，合适的给药途径包括口服给药；直肠给药；经粘膜给药，尤其是经鼻 给药；肠道给药；或胃肠外给药，包括肌内给药、皮下给药和髓内给药以及鞘内给药、直接 心内给药、静脉内给药、腹膜内给药、鼻内给药或眼内给药。这一列举不意味着穷举。或者，可以局部方式而非全身方式给予所述药物组合物，例如通过将所述药物组 合物直接注射入患者的肿瘤组织区域。沉积、植入、控释以及任何其他适当的给药方法都被 认为已引入本文。本发明中的药物组合物可通过本领域公知的方法进行制造，例如通过常规的混 合、溶解、造粒、制糖衣(dragee-making)、研磨、乳化、包封、包埋或冻干等工艺。因此，用于本发明中的药物组合物可利用包括赋形剂和助剂在内的一种或多种生 理上可接受的载体以常规方式进行制剂，所述赋形剂和助剂可促进将所述活性成分处理到 药学上可用的制剂中。适当的制剂剂型取决于所选择的给药途径。对于注射，所述药物组合物的活性成分可在水溶液中进行制剂，优选在生理上相 容的缓冲液(例如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液)中进行制剂。适合于本发 明中药物组合物的一种给药途径为骨膜下注射，如Erikkson的美国专利No. 6，525，030所 述。对于经粘膜给药，适于可渗透过屏障的渗透剂被用于所述制剂。这些渗透剂在本领域 中通常是已知的。对于口服给药，所述药物组合物可通过将所述活性化合物与本领域中公知的药学 上可接受的载体进行结合而容易地进行制剂。这些载体能够将所述药物组合物制剂为片 齐IJ、丸剂 、糖衣剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液剂(slurries)和悬浮剂等形式用 于患者的口服摄取。口服使用的药物学制剂可按下述步骤制得使用固态赋形剂，任选将所 产生的混合物磨碎，如果需要的话，加入适当的助剂，并加工所述颗粒的混合物，从而得到 片剂或糖衣剂内核。特别地，适当的赋形剂为填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤 维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯基 吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话可加入崩解剂，例如交联的聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、或藻酸 或其盐(例如藻酸钠)。本文所使用的术语“口服给药”包括将所述药物化合物给予至任何 口部表面，包括舌、齿龈、上腭或其他口腔表面。口服给药的其他方法包括提供与所述口部 表面组织相容的合剂(mist)、喷雾剂或悬浮剂形式的药物组合物。将糖衣剂内核覆以合适的包衣。为此，可使用浓的糖溶液，所述浓的糖溶液任选含 有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、天然树脂溶 解后的溶液(lacquer solution)以及适当的有机溶剂或有机溶剂混合物。可将染料或色 素加入到所述片剂或糖衣剂包衣来识别或表征活性化合物剂量的不同组合。可口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推合式(push-fit)胶囊剂，以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊剂。所述推合式胶囊剂可含有与其他物 质混合的活性成分，所述其他物质为填充剂例如乳糖；粘合剂例如淀粉；润滑剂例如滑石 或硬脂酸镁；以及任选稳定剂。在软胶囊剂中，所述活性成分可溶解或悬浮于适当的液体 中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外可加入稳定剂。用于口服给药的全部制剂 的剂量应适于所选择的给药途径。对于口腔给药，所述组合物可采取以常规方式制剂的片剂或锭剂的形式。对于鼻吸入给药，借助于适当的推进剂以气溶胶喷雾的表现形式，将本发明中所 使用的活性成分从加压的包装或喷雾器中方便地进行输送，所述推进剂例如二氯二氟甲 烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。就加压的气溶胶而言，所述剂量单位可通过 提供输送计量数量的阀来进行测定。例如用于分散剂(dispenser)的明胶的胶囊和药管 (cartridges)可被制剂为含有所述化合物以及适当的粉末基质(base)例如乳糖或淀粉的 粉末混合物。可将本文所描述的药物组合物制剂用于胃肠外给药，例如通过弹丸式注射(bolus injection)或持续输注。用于注射的制剂可以在任选加入防腐剂的情况下以单元剂型(例 如在安瓿)或者多剂量容器中提供。所述组合物可为油性载体或水性载体中的悬浮液、溶 液或乳剂，并且可含有配方剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于胃肠外给药的药物组合物包括水溶性形式的所述活性制剂的水溶液。另外， 可将所述活性成分的悬浮液制成合适的油基或水基注射悬浮液。适当的亲脂性溶剂或载体 包括脂肪油例如芝麻油；或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射 悬浮液可含有增加所述悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选所 述悬浮液可以还含有适合的稳定剂或增加所述活性成分可溶性药剂，以允许所述制剂形成 高浓度的溶液。或者，所述活性成分可在使用前以粉末形式存在，以与适当的载体例如无菌无热 原的水基溶液一起组成制剂。还可利用例如常规的栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)，将本发明的药物组 合物制剂为直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂(retentionenemas)。适用于本发明范围的药物组合物包括所述活性成分以有效达到预定目的的量包 含于其中的组合物。更具体地说，“治疗有效量”的意思是能有效预防、缓解或改善紊乱的症状(例如乳腺肿瘤的发展)或有效延长接受治疗的受试者存活时间的活性成分(例如PrP 抗体)的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围之内，特别是根据本文所提 供的详细公开内容。对于用于本发明的方法中的任何制剂，所述治疗有效量或治疗有效剂量最初可由 体外和细胞培养分析法进行估计。本文所描述的活性成分的毒性和疗效可通过体外标准 药物规程和细胞培养物或实验动物进行测定。从这些体外和细胞培养分析法以及动物研 究获得的数据可用于配制供人使用的一定范围的剂量。不使用不当实验对这些组合物进 行制剂。所述剂量的变化取决于所使用的剂型和所运用的给药途径。确切的制剂、给药途 径和剂量可由医师个人考虑所述患者的病症进行选择。(参见例如Fingl等人，1975,"The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. 1.)。剂量和间隔可分别调整至例如就胚细胞转移(blastic metastases)而言足以延 缓肿瘤发展的活性成分水平(最低有效浓度，MEC)。所述MEC对于每种制剂各不相同，但可 由体外数据进行估计。达到所述MEC的必需剂量取决于个体特征和给药途径。检测分析可 用于测定血浆浓度。根据所治疗病症的严重程度和响应性，给药剂量可为单一给药或多次给药，其疗 程持续几天至几个星期或直至实现所述疾病状态减轻。毫无疑问，所给予的组合物的量取决于接受治疗的受试者、所述痛苦的严重程度、 给药的方式、处方医师的判断等。抗体、抗体片段或抗体结合物的优选单位剂量通常包括每千克体重约0. 1 i； g免 疫球蛋白至每千克体重约lOOmg免疫球蛋白，优选每千克体重约0. lii g免疫球蛋白至每千 克体重约20mg免疫球蛋白，更优选每千克体重约0. 1 ii g免疫球蛋白至每千克体重约10mg 免疫球蛋白，以及更加优选每千克体重约0. 1 P g免疫球蛋白至每千克体重约1. Omg免疫球 蛋白。适当的载体和赋形剂会根据组合物的给药模式和存储要求而改变，所述的组合物包 括抗体、抗体片段或抗体结合物。如果需要的话，本发明中的组合物可提供于包装或分配装置中，所述包装或分配 装置可包含含有所述活性成分的一个或多个单元剂型。举例来说，所述包装可包括金属或 塑料薄膜，例如吸塑包装。所述包装或分配装置可附有给药说明书。所述包装或分配装置 还应符合管理药物制造、使用或销售的政府机关所规定的容器形式的有关公告，所述公告 反映了所述机关对于所述组合物的形式或人类给药或兽医给药的批准。举例来说，这类公 告可能是关于美国食品药物管理局对于处方药物的标注方面的批准，或者是关于经批准的 产品说明书。包含有配制于相容药物载体中的本发明制剂的组合物也会被制备、置于合适 的容器中，并且可被标注为用于治疗指定病症，正如上文进一步的详细说明所述。为便于上文所述方法的实际操作和/或上述药物组合物的生产，本发明进一步提 供了对用于治疗朊病毒蛋白相关疾病的新候选药物进行鉴别的方法。所述方法通过对下述物质在哺乳动物细胞中调节朊病毒_糖胺聚糖复合物或防 止其形成的能力进行筛选而实现糖胺聚糖(GAG)、合成的多硫酸化多糖、硫酸乙酰肝素蛋 白聚糖(HSPG)和包含这些物质的药物组合物；以及针对GAG、合成的多硫酸化多糖、HSPG和 朊病毒蛋白/叠朊蛋白/沙杜蛋白抗体或抗体片段及其药物组合物。可利用PrPSc;无细胞
25转化分析法、或PMCA方法、或MTT分析法来实现所述筛选。示例性的筛选分析详细描述于本文实施例部分的实施例3、实施例4和实施例8中。一旦在体外鉴别出能够调节蛋白-糖胺聚糖复合体的分子，就进行进一步的分析 从而测定其细胞穿透能力以及对哺乳动物的毒性。如果需要的话，对合适的候选药物进行 改进，以求在实质上不影响其调节所述复合体活性的情况下，增加其细胞穿透性并减少毒 性。此外，对于本领域普通技术人员来说，在研究了下列并非意在起限制作用的实施 例后，本发明的优势和新的特征将是显而易见的。另外，本文上面所描述的以及下面权利要 求书部分所要求保护的本发明中每种实施方式和每一方面都会在下列实施例中找到实验 支持。实施例本文所阐明的实施例意在举例说明实现本发明的各个方面，而不在于以任何方式 对本发明进行限制。实施例1试剂通过对下列序列中给定的8支链多抗原肽(MAP)进行免疫来制备抗体 KMMERVVEQMCITQYERESQ(SEQ ID NO 1)、SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRE(SEQ ID NO :2)、 TNMKHMAGAAAAGAVVGGLG(SEQ ID NO 3) , GffGQGGGTHSQffNKPSK(SEQ ID NO 4)以及 RYPPQGGGGffGQPHGGG(SEQ ID NO :5)。杂交瘤的免疫和显色以及随后的所述单克隆抗体细胞 系的选择和生长通过本领域技术人员所熟知的标准程序来进行。利用本领域技术人员所熟知的程序用Boc化学法通过固相肽合成(SPPS)来合成 MAP 肽。简单说来，将四周龄的BALB/c小鼠用混有等体积的弗氏(Freimd)完全佐剂的 MAP肽进行免疫。在几次加强免疫之后，对所述免疫小鼠尾部血进行抗PrP的滴度测试。 在观察到高滴度后，将脾摘除用于与鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合。最初描述于Kohler和 Milstein, Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976)的杂交瘤技术已被广泛应用于产生杂交细胞系，所 述杂交细胞系分泌高水平的抗多种特异性抗原的单克隆抗体。使用ELISA型分析法对杂交 瘤上清液进行测试，确定是否存在对朊病毒蛋白特异的抗体。简而言之，将微量滴定ELISA板用1 μ g/mL重组PrP (100 μ L/孔)在37°C下涂覆 1小时。将孔用含有BSA的PBS-Tween 20 (PBS-T)封闭，然后用PBS-T洗涤。加入抗体 或加入用PBS稀释的细胞上清液，并在37°C培养1小时。将板进行洗涤并在37°C下加入结 合有碱性磷酸酶的抗小鼠免疫球蛋白(100 μ L，1000倍稀释)1小时。在洗涤后，通过含有 对硝基苯基磷酸酯的碳酸盐缓冲液进行显色，并在405nm处对所述板进行读数。实施例2HSPG的提取和纯化HSPG的提取和纯化以类似于已经报道的方式完成(美国7，094，580,Giuseppetti 1994)。将细胞制剂加入到冷的胍提取缓冲液(4. OM盐酸胍、0. 5M乙酸钠、IOmM EDTAU. OmM 苯甲基磺酰氟(PMSF)UOOmM 6-氨基己酸、5mM盐酸苯甲脒、2% Triton X-100, ρΗ 5.81) 中，并在4°C下搅拌24小时。将所述提取物以5，500rpm离心30min以除去不溶性物质，然后在小孔透析管(截留分子量为3，500)中透析到DEAE缓冲液(50mM Tris碱、6. OM尿素、0. IM NaClUOmM EDTAUOmM 6-氨基己酸、l.OmM PMSF.0. 5% Triton X_100，pH 7.0)中，加入到 用含有 0. 2% CHAPS (代替Triton X-100)的 DEAE 缓冲液平衡的 IOmL DEAE-Sephacel (Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO)柱，然后透析到CHAPS-DEAE缓冲液中，再加入到高效液相色 谱(HPLC) 7.5X7. 5mm TSK DEAE 5PW 阴离子交换柱(Bio-Rad，Richmond，CA)。使样品流速 为lmL/min，对蛋白进行0. IM至0. 8M NaCl的线性梯度洗脱。将每Iml的馏分收集并取样。 用电导率仪通过电导率测量来监测所述的盐梯度。与DEAE缓冲液中已知的标准NaCl浓度 进行对比来计算所述馏分中实际的盐浓度。所述HPLC-DEAE柱的回收百分比为90-95%。 将样品透析到含有0. ImMPMSF的去离子水中并冻干。将各等分储存于-80°C并如文中所述 进行使用。实施例3
无细胞转化分析法如前所述进行所述的无细胞转化反应(Kocisko 1994 ；Raymondl997)。经纯化的 PrPres用2. 5M盐酸胍(Gdn-HCl)在37°C下部分变性30-60min。然后在存在或不存在所述 抑制性肽和/或抗体的情况下，将通常为8mL的一个等分的200ng HaPrPres于37°C下与约 Ing经免疫纯化的35S-PrPsen(约12，OOOcpm/反应)在终体积为20mL的转化缓冲液(50mM 柠檬酸钠PH 6. 5mM氯化十六烷基吡啶、0.625% N-月桂酰肌氨酸盐)中培养40小时。在 培养时间结束后，将每个反应分为1 10的两份，将较多的部分用lOOmg/mL蛋白酶K(PK) 在Tris-盐水缓冲液(50mM TrispH 8,130mM NaCl)中于37°C下酶切1小时，而将较少的部 分(-PK)保存起来作为未经酶切的对照。向每部分(+PK和-PK)中加入4mg/mL甲状腺球蛋白和20mM 4_(2_氨乙基)苯 磺酰氟盐酸盐(pefabloc)的混合物10mL，将所述PK反应中止。然后，将样品在5体积的 甲醇中沉淀，并以14，OOOrpm离心20min。将所得到的颗粒状物重悬于样品缓冲液(65mM Tris-HCl pH 6. 8、5%甘油、5% SDS、4M尿素、5%巯基乙醇、0. 5%溴酚蓝)中，煮沸5min，并 在预制的凝胶上通过SDS-PAGE进行分析。经自动射线照相成像分析进行定量，通过PK抗 性35S标记的条带与分子质量比未经酶切的35S-PrPsen低大约5-lOkDa的条带之间的比值来 计算转化的百分比。可对各种合成的GAG及其抗体测试其对代谢标记的PrPsen分子体外转化为PrPres 的作用。用于所述无细胞转化分析法的抗体和/或GAG的各种浓度为2 μ g/mL直至最终浓 度lmg/mL之间。最佳浓度为约10 μ g/mL。实施例4组织勻浆的制备根据已经报道的方法(Sa02006)制备组织勻浆。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)加上 5mM EDTA对健康的动物和患病的动物灌注，然后采集所述组织。在转化缓冲液(含有150mM NaClU.0% Triton X_100、4mMEDTA和蛋白酶抑制剂(Sigma)的PBS)中制备10%的脑勻浆 (w/v)。用Eppendorf离心机通过短暂的低速离心(1500rpm，30s)，将所述样品净化。在转 化缓冲液中将这一脑勻浆进行稀释，并且将所述稀释表示为与脑相关联；举例来说，100倍 的稀释相当于脑勻浆。PMCA 步骤
根据已经报道的方法(Sa02006)进行蛋白错误折叠循环扩增(PMCA)。将在转化缓 冲液中制备的正常仓鼠和患羊瘙痒症仓鼠的脑勻浆等分进行混合并负载于0. 2mL PCR管。 将管置于超声波仪中。进行下述循环在37°C下培养60min，然后超声脉冲(任选设定为 60%效能)处理60s。将样品在不摇动的情况下进行培养并浸于超声波仪水浴中，使整个超 声波仪保持在37°C的培养箱内。实施例4的优选实施方式涉及仓鼠脑的使用。所述实施例的其他实施方式包括小 鼠或大鼠的脑的使用。
利用所述的免疫印迹分析或狭缝印迹分析，表明在PrPG扩增的同时，由硫酸乙酰 肝素抗体染色的HSPG的扩增是明显的(如实施例3由蛋白酶K处理后通过抗PrP抗体进 行鉴别，参见 Sarafoff 等人，J. Biochem. Biophys. Methods, 63 (2005) 213)。实施例5过表达朊病毒蛋白的肿瘤细胞的鉴别(i)在37°C下和5%的CO2中，使来自各种肿瘤细胞系的细胞在培养于合适培养基 中的载玻片上生长2天。2天后除去所述培养基，并替换为含有与荧光团(例如异硫氰酸罗 丹明)结合的抗PrP抗体的乏培养基(spent culture media) 0将细胞在37°C下于5%的 CO2中进一步培养5小时。此时除去所述培养基，并通过所述罗丹明荧光团内化作用的荧光 显微术对所述细胞的摄取进行评价。以相对等级对吸收进行测定。或者，荧光二抗可与非 结合的抗PrP —抗共同使用(参见实施例18)。(ii)在37°C下和5%的CO2中，使各种肿瘤细胞系的细胞在培养于RPMI1640培养 基的6孔板中生长至70-80%融合。2天后除去所述培养基，将细胞用PBS洗涤一次，然后 用缓冲液(NaCl 150mM、Triton X-1000. 5%、脱氧胆酸钠0. 5%、Tris HCl 5mM,pH 7. 5,5mM EDTA)进行提取。用商品ELISA试剂盒(SPI Bio)对PrP进行分析，并将结果归一化至相同 的蛋白含量(通过BCA分析测定)。根据所得到的结果，较为恶性的乳腺癌细胞系具有较高的PrP水平(参见图1)。 同样，较为恶性的结肠细胞系具有较高的PrP水平(参见图2)。更令人惊讶的是，发现了 PrP水平和HS 10E4表位表达之间的负相关性(将图1 与图9进行比较)。因而较为恶性的乳腺癌细胞系具有较低的10E4表达(图9)。如实施 例9所述，通过细胞提取物的狭缝印迹进行10E4表达的分析。实施例6硫酸乙酰肝素和PrP在前列腺癌细胞中的共存从ATCC获得前列腺癌细胞系22rvl。使6孔或12孔多孔板中的所述细胞在处于 RPMI1640培养基中的盖玻片上生长，所述的RPMI1640培养基补充有10%胎牛血清、丙酮酸 钠、葡萄糖和L-谷氨酰胺。在达到60-90%融合度时，将细胞用冷的PBS洗涤，然后固定于 新鲜的含2%多聚甲醛的PBS中。将所述固定的细胞用冷的PBS洗涤，然后通过室温下加入含有2%山羊血清的 PBS/0. 01% Tween-20将其封闭30min。将所述被封闭的细胞用PBS/0. 01 % Tween-20洗涤， 然后在室温下用被PBS/1% BSA以1 200稀释的一抗培养3h。所使用的一抗为小鼠单克 隆IgG抗人朊病毒(3F4，Covance)以及IgM抗硫酸乙酰肝素(克隆10E4，Seikagaku)。将 所得到的单细胞层用PBS/0.01% Tween-20洗涤，然后用以1 2000稀释的二抗进行培养。所使用的抗体来自于Molecular probes 结合alexaflour 633的山羊抗小鼠IgM以及结合 alexafluor 488的山羊抗小鼠IgG。将所得到的单细胞层用PBS/0. 01 % Tween-20洗涤，然 后用DAPI (100ng/ml于PBS中)培养2分钟使细胞核显象。将所述细胞进行洗涤然后封固 (mount)于荧光封片剂(Southern Biotech)中。用Leitz Laborlux三目复式显微镜，在荧光模式下，以400倍放大使染色的细 胞显像。使用ProgRes Capture Pro v2. 5采集软件由ProgRes ClORGB照相机增强版 (Jenoptik)获取图像。使用Adobe Photoshop CS2 ν 9. O进行图像的对比度增强操作。发现硫酸乙酰肝素和朊病毒蛋白共存于所述癌细胞，分布于细胞表面和核内体 中。共存作用在细胞间转运和细胞分裂期间也得到证明。实施例7用抗PrP抗体处理后，HCTl 16肿瘤细胞杀灭作用的增强在RPMI1640培养基中培养人HCT116细胞，然后进行采集并注射(3Χ106细胞)入 裸鼠体内以形成皮下异种移植物。8天后，在所述肿瘤的皮下注射部位出现小的肿块。然 后，以每次9mg/kg抗PrP抗体的剂量对小鼠进行静脉内注射，每周两次，共注射两周。然 后，使所述肿瘤在所述小鼠体内连续生长，并用数字卡尺进行三个方向的测量(a threeway measurement)来确定其尺寸。以所述小鼠的平均肿瘤重量随时间变化的情况对数据进行分 析。虽然在平均肿瘤尺寸方面没有达到显著性差异，但相比于对照动物，在接受所述 抗PrP抗体处理的组中观察到了肿瘤生长减缓的趋势(图10)。实施例8使用MTT分析法测定PrP抗体对于癌细胞增殖的作用通过MTT分析法对药物敏感性进行评价。将细胞以5000个细胞/孔的密度铺板 于96孔板(Nunc，Milan, Italy)中。24小时后，将所述培养基替换为含有5% FCS以及含 有或不含有PrP抗体的各种浓度药物的新鲜生长培养基。在药物存在下，生长72小时后，分 析细胞的生存能力。简单来说，将MTT试剂(最终浓度500yg/mL)加入到每个孔中，4小时 后，用每孔100 μ L的二甲亚砜将粘附细胞裂解。用Molecular Devices读板仪在490nm波 长处测定所得到的甲贿(formazan)产物的吸光度。用相对存活曲线估计对生长产生50% 抑制作用的每种药物浓度或抗体浓度(IC5tl)。根据下式计算不同浓度的药物或抗体对细胞 生长的相对抑制率R= (A2-A1)/Al，其中，R为药物或抗体对细胞生长的相对抑制率，Al为 在药物或抗体存在72小时的情况下细胞的吸光度值，A2为未经处理的对照细胞的吸光度 值。每项研究分三组平行进行并重复多次。用小鼠免疫球蛋白作为对照。图3为MTT分析法中，HCTl 16人结肠癌细胞的10 μ g/mL的PrP抗体筛选结果的 柱状图(参见图3)。所述分析法测定出BAR221和BAR236抗体产生了大约100%的相对抑 制作用。SAF 32、F89/160. 1. 5、8H4和SAF53抗体也产生了 20-40%的相对抑制作用。图4为MTT分析法中，HCTl 16人结肠癌细胞的所选PrP抗体的剂量响应折线图。 当给予1 μ g/mL或更多时，抗体BAR221和BAR 236对肿瘤细胞发育提供了高于30 %的抑制 作用。当给予 5 μ g/mL的BAR221或BAR 236抗体时，肿瘤细胞的生长被抑制了 60% ；而给 予10 μ g/mL的BAR221或BAR236抗体，则提供了完全的生长抑制。实施例9
PrP抗体对于癌细胞凋亡的作用将细胞以50000个细胞/孔的密度铺板于96孔板(Nunc, Milan, Italy)中。24 小时后，将所述培养基替换为不含FCS以及各种浓度的PrP抗体的新鲜生长培养基。24小 时后，除去生长培养基并加入STE-sarkosyl缓冲液(50 y L)。将四孔合并，平行进行蛋白 分析。通过BCA分析测定总蛋白含量。通过狭缝印迹对肌动蛋白、Bcl-2和10E4水平 进行评价。简单来说，将硝化纤维素膜预浸于PBS中，并且每条狭缝负载5iig蛋白。将所 述狭缝用200 u L PBS洗涤两次，并将所述的膜浸于封闭溶液(含1 % BSA的TEN缓冲液) 中0. 5h。在室温下，加入在封闭溶液中稀释20000倍的一抗，保持2h。所述一抗为小鼠IgM 10E4(Seikagaku)、Bcl_2的兔多克隆sc-16323-R以及3 -肌动蛋白120-52614的兔单克隆 (SantaCruz)。加入30%的H202 (500 y L至20mL)，并将所述溶液混合3min以猝灭内源性过 氧化物酶。将所述的膜在洗涤缓冲液(含有0. 1 % Tween20的20mL TEN缓冲液)中洗涤3 次，每次10分钟。在室温下加入二抗(山羊抗兔IgG HRP sc-2004或山羊抗小鼠IgM HRP 结合物sc-2064，20mL，在封闭溶液中稀释20000倍)，保持0. 5h。将所述膜在洗涤缓冲液 (含有0. 1 % Tween 20的20mL TEN缓冲液)中洗涤3次，每次10分钟。在显色前，转移至 化学发光溶液(50 50的过氧化物试剂，20mL)保持2分钟。通过ImageJ软件根据信号 强度进行分析。图7显示了在存在(左图)及不存在(右图)5 ii g/mL PrP的BAR221抗体的情况 下，生长的HCT116细胞的照片。A图50倍放大。B图200倍放大。用抗体处理，细胞形态 区别不大，细胞变得更圆；与细胞凋亡相一致，细胞粘附性更低。图8为用不同水平BAR221PrP抗体处理的HCT116细胞的狭缝印迹法测定的蛋白 表达数据的柱状图。在抗体处理的情况下，肌动蛋白的水平保持不变，证明类似的总蛋 白负载于所述的膜上。5i!g/mL PrP抗体处的Bcl-2水平呈统计学下降，表明细胞凋亡增 加。相反，随之产生的10E4HS表达呈浓度依赖性增加，表明PrP参与HS表达的调节。实施例10用组合疗法治疗后，HCT116肿瘤细胞杀灭作用的增强已经发现，在将抗PrP(公开于实施例8)和伊立替康一同给予的情况下，治疗 HCT116肿瘤会更为成功。简单来说，除了某些组接受抗PrP抗体(9mg/kg，静脉内给药)和 伊立替康(40mg/kg，腹膜内给药)的组合疗法外，按照实施例10的方法进行。然后，使肿瘤 在小鼠体内生长，并用数字卡尺进行三个方向上的测量来测定其尺寸。以小鼠的平均肿瘤 尺寸随时间变化的情况对数据进行分析。在接受伊立替康/抗PrP抗体组合治疗的组中，发现肿瘤尺寸有减小的趋势，优于 单独使用伊立替康的对照组(图11)。使用MTT分析法测定PrP抗体与IRI组合使用对癌细胞增殖的影响使用MTT分析法测定共同给予伊立替康和50 u g/mL 2A5PrP抗体时，研究用伊立 替康治疗各种人结肠癌细胞的相对响应性。除了已知对伊立替康具有抗性的HT29外，均观 察到与PrP表达的强相关性。实施例11使用MTT分析法测定HS抗体对于癌细胞增殖的影响通过MTT分析法对药物敏感性进行评价。将细胞以5000个细胞/孔的密度铺板
30于96孔板(Nunc，Milan, Italy)中。24小时后，将所述培养基替换为含有5% FCS以及含 有或不含有PrP抗体的各种浓度药物的新鲜生长培养基。在药物的存在下，生长72小时后， 分析细胞的生存能力。简单来说，将MTT试剂(最终浓度500yg/mL)加入到每个孔中，4小 时后，用每孔100 μ L的二甲亚砜将粘附细胞裂解。用MolecularDevices读板仪在490nm 波长处测定所得到的甲膽产物的吸光率。通过用相关的存活曲线估计对生长产生50%抑制作用的每种药物或抗体浓度(IC5tl)。 不同浓度的药物或抗体的细胞生长相对抑制率根据下式进行计算R = (A2-A1)/A1，其中， R为药物或抗体的细胞生长相对抑制率，Al为在抗体存在72小时的情况下细胞的吸光度 值，A2为未经处理的对照细胞的吸光度值。每项研究均分三组平行进行并多次重复。在针对人结肠癌HCT116细胞的MTT分析法中所测定的对于HS抗体10E4的抗增 殖响应描述于图6中。根据所述结果，相比于用HS 10E4抗体处理的细胞，在对照细胞之间 的抑制相对百分比存在显著的差异。给予10 μ g/mL的抗体对细胞生长提供了 50-60%的抑 制作用。给予5μ g/mL的抗体对细胞生长提供了 35-40%的抑制作用。给予2. 5 μ g/mL提 供了25-30%的抑制作用。实施例12使用多硫酸戊聚糖组合疗法治疗的情况下，WiDr肿瘤细胞杀灭作用的增强已经发现，共同给予多硫酸戊聚糖和细胞毒素类药物治疗WiDr肿瘤异种移植物 会更为成功。简单来说，除了某些组接受低分子量多硫酸戊聚糖和细胞毒素类药物的组合 疗法外，按照实施例10的方法进行。然后使肿瘤在小鼠体内生长，并用数字卡尺进行三个 方向上的测量来测定其尺寸。以所述小鼠的平均肿瘤重量随时间变化的情况对数据进行分 析。在接受所述多硫酸戊聚糖/药物组合治疗的动物体内发现肿瘤质量明显下降，优 于单独接受药物的对照组(图12)。相比于单独使用伊立替康，使用多硫酸戊聚糖的组合疗 法还使得存活时间延长，这一点由Kaplan-Meier图证明(图13)。实施例13特异性HSPG/GAG的扩增根据本领域技术人员已知的标准程序，将准备扩增的HSPG从仓鼠体内分离并纯 化。然后通过肝素酶和/或辅助一氧化氮/亚硝酸盐对硫酸乙酰肝素链的切割对仓鼠脑进 行处理。通过添加抑制剂(例如肝素酶的多硫酸戊聚糖抑制作用和/或PI88抑制作用，但 不限于此)对负责这类切割的酶进行处理。然后，将纯化的HSPG加入到经处理的脑勻浆 中，并根据实施例4中所述的方法进行所需要循环数的PMCA。所述PMCA技术可通过加入涉 及HS合成过程的蛋白/酶来增强，例如PrP、差向异构酶、磺基转移酶、脱乙酰基酶、EXTl和 EXT2以及UDP-糖(对于更完整的(非限制性)的列表，参见Prydz 2000和Esko 2002)。 可根据本领域技术人员已知的标准程序，使用所述HSPG抗体，通过特异性免疫印迹分析法 来证明HSPG/GAG的扩增。HSPG/GAG的扩增还适用于其他物种例如大鼠和小鼠，但不限于此。这类扩增还扩 展到使用肿瘤勻浆或培养细胞勻浆，代替了使用脑勻浆。HSPG/GAG扩增的增强很可能通过 使用实施例14所列的任何蛋白/酶来补充所述培养基来实现。含有PrP的合成培养基以 及实施例14中所述的酶与其他潜在辅因子例如脊椎动物RNA的混合物也被公开用于HSPG/GAG的扩增。实施例14HSPG信息扩增的机理用于扩增HSPG的方法如下所述在作为HSPG硫酸乙酰肝素链合成部位的高尔基 体中，PrP/Dpl结合至HSPG。所述HSPG为Gpc-I。所述PrP/Dpl_HSPG单元被限制于特定 的构象，所述构象取决于所述硫酸乙酰肝素链的序列。看起来分子与N末端的结合能够影 响所述朊病毒蛋白C末端区内的局部构象。接下来，第二个PrP/Dpl进行结合，其本身强 制形成特异性构象，该特异性构象取决于最初PrP/Dpl-HSPG单元结构。第二个PrP/Dpl 分子根据其构象为另一个具有“截短的”硫酸乙酰肝素链的蛋白聚糖提供了模板。然后， 在由PrP/Dpl-HSPG复合体限制的环境中进行这些硫酸乙酰肝素链的链伸长和链修饰，以 使得新的硫酸乙酰肝素链类似于第一个HSPG上的链或准确复制第一个HSPG上的链。首 先，制备非硫酸化多糖链前体，然后，通过对硫酸化的复合模式进行叠加的连续系列反应 对其进行修饰。所述硫酸化模式通过位于所述高尔基体的磺基转移酶(例如3-0-磺基 转移酶-1 [3-0ST-1]、-2、-3A、-3B、-4、6_0ST-1、-2、-3 以及 N-脱乙酰基酶 N-磺基转移 酶-l[NDST-l]、-2、-3，但不限于此)的复杂相互作用进行测定。其他涉及HS合成的酶包括 GalNAc-转移酶 I、GalNAc 转移酶 II、GlcAc 转移酶 II、C_5GlcA 差向异构酶、4-0ST、2_0ST、 EXTL2、EXTl 和 EXT2 (参见 Sasisekharan 2006、Esko 2002 和 Prydz 2000)。实施例15体内感染性研究263K羊瘙痒因子根据已经报道的方法(Sa02006)，可使用叙利亚金仓鼠作为羊瘙痒症的体内模型。 还可用于测试的其他动物为例如小鼠或大鼠。在接种的时候，动物应为4-6周龄。将麻醉过 的动物用IyL样品在右海马体中进行脑内立体定位注射，或用200 μ L样品进行腹膜内注 射。通过使用下列等级对所述动物每周评分两次，对临床疾病的发病进行测定1.正常动 物；2.轻微的行为异常，包括多动症和对于噪音的超敏反应；3.中度行为问题，包括头部震 颤、共济失调、摇摆步态、点头症、易怒以及攻击性；4.严重行为异常，包括以上全部症状再 加上头部和躯体的抽搐以及自发性反绕(spontaneous backrolls) ；5.所述疾病的末期， 其中所述动物卧于笼中且无法再站立。在连续2星期中，得分水平为4的动物被认为已经 患病，从而用暴露于二氧化碳的方式将其处死以避免过度的疼痛。对于对照实验，在注射入所述动物模型之前，将样品用磷酸盐缓冲盐水、肝素酶I、 肝素酶II或肝素酶III在37°C下处理2小时。优选实施方式为使用肝素酶III。接受感染性HSPG的动物所具有的平均存活率会显著低于接受经肝素酶处理的 HSPG的动物。实施例16体外传染性研究可根据 适合的方法(Enari 2006)进行体外传染性研究。将使用RML小鼠适应朊病 毒感染的N2a细胞穿过21"针和25"针各八次，从而将其均质化，然后用IX Dulbecco磷 酸盐缓冲盐水(GIBC0/BRL)调至10% (wt/vol)。室温下，以1，OOOrpm离心5min后，将上 清液回收，并储存于-80°C。在暴露于感染RML的N2a细胞勻浆或从中提取的HSPG之前，将 N2a细胞(ImL培养基中含2-5X IO4个)接种于24孔板(CorningCostar)中，并培养1-2天，再用完全培养基进行稀释。3天后，除去所述接种物，并且每3-4天将所述细胞按1 5 分开。14天后，通过细胞印迹的方法对所述细胞进行PrPSc;分析(下述)。PrPsc的细胞印迹分析如(Enari 2006)所述进行分析。简单来说，将细胞转移至聚偏二氟乙烯膜，用蛋白酶K处理，变性，依次用抗体6H4 (Prionics)和结合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG1 免疫染色，然后通过增强化学发光来显像(ECL试剂盒；Pierce)。在暴露后，将所述膜用 0. 5mg/mL溴化乙锭染色15min，并在紫外灯下拍照以记录所述细胞层的转移。实施例17在另一个实施例中，所述感染性材料为分离自感染性脑勻浆(RML羊瘙痒症)的 HSPG，或为分离自携带RML羊瘙痒因子的N2a细胞。因此，根据已经报道的方法(Sa02006)，可使用叙利亚金仓鼠作为羊瘙痒症的体内 模型。在接种的时候动物应为4-6周龄。将麻醉的动物用IyL样品在右海马体中进行脑 内立体定位注射，或用200 μ L样品进行腹膜内注射。通过使用下列等级对所述动物每周 评分两次，对临床疾病的发病进行测定1.正常动物；2.轻微的行为异常，包括多动症和对 于噪音的超敏反应；3.中度行为问题，包括头部震颤、共济失调、摇摆步态、点头症、易怒以 及攻击性；4.严重行为异常，包括以上全部症状再加上头部和躯体的抽搐以及自发性反绕 (spontaneous backrolls) ；5.所述疾病的末期，其中所述动物卧于笼中且无法再站立。在 连续2星期中，得分水平为4的动物被认为已经患病，从而用暴露于二氧化碳的方式将其处 死以避免过度的疼痛。对于对照实验，在注射入所述动物模型之前，将样品用磷酸盐缓冲盐水、肝素酶I、 肝素酶II或肝素酶III在37°C下处理2小时。优选实施方式为使用肝素酶III。接受感染性HSPG的动物所具有的平均存活率会显著低于接受经肝素酶处理的 HSPG的动物。实施例18这一实施例类似于实施例15和实施例17，其中所述羊瘙痒症菌株为22L或另一 TSE。因此，根据已经报道的方法(Sa02006)，可使用叙利亚金仓鼠作为羊瘙痒症的体内 模型。在接种的时候动物应为4-6周龄。将麻醉的动物用IyL样品在右海马体中进行脑 内立体定位注射，或用200 μ L样品进行腹膜内注射。通过使用下列等级对所述动物每周 评分两次，对临床疾病的发病进行测定1.正常动物；2.轻微的行为异常，包括多动症和对 于噪音的超敏反应；3.中度行为问题，包括头部震颤、共济失调、摇摆步态、点头症、易怒以 及攻击性；4.严重行为异常，包括以上全部症状再加上头部和躯体的抽搐以及自发性反绕 (spontaneous backrolls) ；5.所述疾病的末期，其中所述动物卧于笼中且无法再站立。在 连续2星期中，得分水平为4的动物被认为已经患病，从而用暴露于二氧化碳的方式将其处 死以避免过度的疼痛。对于对照实验，在注射入所述动物模型之前将样品用磷酸盐缓冲盐水、肝素酶I、 肝素酶II或肝素酶III在37°C下处理2小时。优选实施方式为使用肝素酶III。接受感染性HSPG的动物所具有的平均存活率会显著低于接受经肝素酶处理的 HSPG的动物。
考虑到本发明原理可适用多种可能的实施方式，应当承认的是，所阐明的实施方 式仅为本发明的优选实施例，不应理解为对于本发明范围的限定。相反，本发明的范围由下 面的权利要求书进行限定。因此，我们要求保护所有处于这些权利要求的范围和精神内的 发明。
权利要求
一种治疗朊病毒蛋白相关疾病的方法，所述方法包括向对其有需求的受试者给予有效量的、能够对朊病毒蛋白或朊病毒样蛋白与疾病相关GAG和/或HSPG的结合进行调节的药剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述朊病毒蛋白为PrPe。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述朊病毒样蛋白为沙杜蛋白或叠朊蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述药剂为能够对朊病毒蛋白或朊病毒样蛋白与 疾病相关的GAG和/或HSPG的结合进行调节的抗体或抗体片段。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述药剂为抗HSPG抗体、或抗GAG抗体、或它们的 片段。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述药剂为抗朊病毒蛋白抗体、或抗朊病毒样蛋白 抗体、或它们的片段。
7.如权利要求4所述的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体或其片段。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述单克隆抗体为PrP抗体。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述单克隆抗体为Dpi蛋白抗体。
10.如权利要求7所述的方法，其中，所述单克隆抗体为HSPG抗体或GAG抗体。
11.如权利要求7所述的方法，其中，所述单克隆抗体为人源化的。
12.如权利要求7所述的方法，其中，所述片段为所述单克隆抗体的Fab、Fab'、 F(ab' )2 片段或 Fv。
13.如权利要求7所述的方法，其中，所述抗体为抗抑制性肽抗体。
14.如权利要求7所述的方法，其中，所述抗体或其片段的抗原识别区包含于下述氨基 酸序列KMMERVVEQMCITQYERESQ, SEQ ID NO 1SAMSRPLIHFGSDYEDRYYRE, SEQ ID NO 2TNMKHMAGAAAAGAVVGGLG, SEQ ID NO 3GWGQGGGTHSQWNKPSK, SEQ ID NO 4 以及RYPPQGGGGWGQPHGGG, SEQ ID NO :5。
15.一种能够产生权利要求7所述单克隆抗体的杂交瘤。
16.如权利要求1所述的方法，其中，所述调节剂与细胞毒剂一同给予。
17.如权利要求7所述的方法，其中，所述抗体连接于细胞毒剂。
18.如权利要求1所述的方法，其中，所述调节剂选自于由下列物质所组成的组糖胺 聚糖、合成的多硫酸化多糖和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，或它们的混合物。
19.如权利要求1所述的方法，其中，所述调节剂包括四糖UA-GlcN-UA-GlcNAc。
20.如权利要求1所述的方法，其中，所述调节剂为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，所述硫酸 乙酰肝素蛋白聚糖选自多配体蛋白聚糖或磷脂酰肌醇蛋白聚糖细胞表面蛋白聚糖，或来源 于上述物质中。
21.如权利要求1所述的方法，其中，所述调节剂为基底膜蛋白聚糖或丝甘蛋白聚糖， 或来源于上述物质中。
22.如权利要求1所述的方法，其中，所述调节剂为多硫酸戊聚糖，优选多硫酸吡喃木 糖(XPS)，或来源于上述物质中。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述调节剂为抗体，并且所述调节剂与GAG、合成的 多硫酸化多糖和/或硫酸肝素蛋白聚糖以及任选的细胞毒剂一同给予。
24.如权利要求1所述的方法，其中，所述调节剂为糖胺聚糖、合成的多硫酸化多糖或 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并且所述调节剂与细胞毒剂一同给予。
25.能够对朊病毒蛋白或朊病毒样蛋白与疾病相关GAG或HSPG的结合进行调节的药剂 在制备用于治疗朊病毒蛋白相关疾病的药物中的用途。
26.如权利要求25所述的用途，其中，所述朊病毒蛋白相关疾病选自于包括癌症、癌性 肿瘤、淀粉样疾病、炎症或局部缺血所组成的组。
全文摘要
根据本发明，对朊病毒蛋白相关疾病特别是癌性肿瘤的治疗是通过向对其有需求的受试者提供治疗有效量的、能够对朊病毒蛋白和/或朊病毒样蛋白与疾病相关的GAG和/或HSPG的结合进行调节的药剂来实现。
文档编号C07K16/18GK101861164SQ200880110132
公开日2010年10月13日 申请日期2008年8月8日 优先权日2007年8月9日
发明者戴维德·卡利斯-希尔, 约翰·弗格斯·姆伊万, 马丁·林德尔·温莎 申请人:西尔万医药有限公司