专利名称：一种使用聚酰胺氢键吸附色谱分离纯化胸腺五肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种胸腺五肽的分离方法，具体的是涉及一种使用聚酰胺氢键吸附色 谱分离纯化胸腺五肽的方法。
背景技术：
胸腺五肽(TP5)是一种人工合^g多肽，其氨基酸顺序和结构与胸腺生成素(TP) 中第32-36位的氨基酸组成相同，它的基本序列为H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr - OH。 胸腺五肽是胸腺生成素的重要功能活性部分，具有与其相似的生物活性。TP5能够诱 导T细胞分化，促进T淋巴细胞亚群发育并活化，对机体的免疫功能具有双向调节作用， 能使过高或过低的免疫反应趋向正常。动物实验和临床研究证明胸腺五肽对免疫功能 低下和自身免疫病患者的免疫功能具有重要的调节作用。目前，胸腺五肽在临床上主 要应用于免疫缺陷、自身免疫性疾病、传染病、肿瘤和艾滋病等疾病。
胸腺五肽的合成包括液相合成法和固相合成法两种。在TP5液相合成过程中，由 于每次接肽后都需要对产物进行分离纯化或结晶以便除去未反应的原料和副产物
(申请号031343554)，这增加了操作步骤和复杂性，并导致最终收率较低，因此， 胸腺五肽的合成多采用固相合成法。传统的胸腺五肽固相合成法是利用Merrifidd树脂 和叔丁氧羰基保护的酪氨酸反应生成酪氨酸树脂，以此为起始原料，依次保护缬氨酸、 天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸起縮合反应，生成保护TP5树脂，在用液态氟化氢将其从 树脂上脱除以获得胸腺五肽粗品。但是由于该方法采用液态氟化氢作为作为TP5树脂 的脱除剂，使得反应条件苛刻且较为危险，因而人们在此基础上进行了一些改进，如 用溴乙酰胺树脂(Int. J. Peptide Protein Res. 28,1986,22-28)或wang树脂 (CN1534042A)作为新的固相载体进行合成以获得大量的胸腺五肽粗品。
但是，合成所得的胸腺五肽粗品中还含有部分杂质，因此仍需纯化后才能应用于 临床治疗。作为化学合成多肽，胸腺五肽的分离纯化方法以离子交换色谱法和反相液 相色谱法为主。 一些研究者采用离子交换凝胶SPSepharoseFF，在pH4.4的醋酸缓冲体 系中分离TP5，经HPLC检测纯度为98.23M，纯化收率为67.03% (南京工业大学学报， 2005， 27 (2) : 13-17.)另外，也有研究者采用C18柱，以三乙胺磷酸甲醇体系作为
3流动相进行分离。随后用sephadexG25柱脱盐后获得的纯度在90。/。以上，回收率也相对 较高(CN1733797A)。这些方法存在分离介质价格昂贵、担载量低、分离设备要求 高等缺点，尤其是RP-HPLC大规模分离多肽时，会产生大量的有机溶剂，既是影响环 保，又增加后处理成本。另有研究者采用离子交换、纳滤和结晶相结合的工艺进行分 离，纯化后TP5的纯度为99.12M，但由于操作步骤较多，其最终收率仅为48.35% (高 校化学工程学报，2008， 22 (4) : 709-713)。因此，仍需一种成本合算且操作简单 的胸腺五肽纯化工艺。
发明内容
本发明方法针对目前纯化工艺中所存在的纯化效率和回收率低以及纯化成本较高 等诸多问题，通过聚酰胺氢键吸附色谱一步分离纯化获得较高纯度的胸腺五肽。 本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
本发明提供一种使用聚酰胺氢键吸附色谱分离纯化胸腺五肽的方法，具体步骤如
下
1) 胸腺五肽合成物离心去除可见颗粒物；
2) 取聚酰胺粉末，加入95%乙醇于室温110转/分钟振荡洗錄40-50分钟，倾出95% 乙醇，用水洗至无醇味，再分别用5%氢氧化钠溶液及30%乙酸溶液按相同方法 洗涤，最后用20%乙醇洗涤，装柱平衡至初始流动相，采用干法或湿法装填成柱；
3) 聚酰胺氢键吸附色谱流动相包括水，乙醇-水，乙醇-乙酸-水，乙醇-三氟乙酸-水， 甲醇-水，甲醇-乙酸-水，甲醇-三氟乙酸-水，乙腈-水，乙腈-乙酸-水，乙腈-三氟 乙酸-水等体系，采用不同溶剂配比；流动相超声脱气或真空脱气10-30 min，室 温静置0.5-1 h;
4) 洗脱方式包括等度洗脱、线性梯度洗脱和分步洗脱；
5) 采用初始流动相平衡聚酰胺色谱柱两个柱体积，线性流速0.1-10 ml/min，紫外检 测器210-280 nm或采用示差检测器在线监测，自动收集馏分；
6) 将步骤8)收集的馏分干燥后用C18分析柱检测纯度，并计算回收率。 本发明提供了一种使用聚酰胺色谱分离胸腺五肽的方法，该方法与现有技术相比
具有以下优势 一步分离可获得较高纯度的胸腺五肽，回收率高；工艺过程操作简单， 成本低；介质对粗样品耐受强，样品载量高，介质可多次重复利用，易于规模放大， 生物安全性好。
图1.聚酰胺色谱分离化学合成胸腺五肽的色谱图
图2.聚酰胺色谱分离从猪脑垂体后叶提取的胸腺五肽的色谱图
具体实施例方式
实施例l、使用聚酰胺色谱分离固相合成的胸腺五肽
1) 胸腺五肽溶液的制备称取10mg固相合成的胸腺五肽粗品，将其溶于lml水中 配制成10 mg/ml的胸腺五肽溶液，离心去除颗粒物；
2) 取300目聚酰胺粉末，加入95%乙醇于室温110转/分钟振荡洗涤40-50分钟，倾 出95%乙醇，用水洗至无醇味，再分别用5%氢氧化钠溶液及30%乙酸溶液按相 同方法洗涤，最后用20%乙醇洗涤，装柱平衡至初始流动相，釆用干法或湿法装 填成柱；
3) 聚酰胺介质湿法装柱，层析柱内径16 mm，装填高度250 mm，接入Akta Prime Plus 层析系统，压力限2.5MPa，层析柱用流动相平衡2个柱床体积；
4) 步骤l)制备好的胸腺五肽溶液，通过自动进样阀进样lml;
5) 等度洗脱，流速为0.8 ml/min，紫外检测器280 nm监测，收集洗脱峰；
6) 聚酰胺色谱分离胸腺五肽的谱图如图1所示，分别收集各个洗脱峰，冻干后重新 溶解，经RP-HPLC (C18柱)检测，其中所标示的峰为聚酰胺色谱峰，其纯度 大于95%,收率大于90%。
实施例2、使用聚酰胺色谱分离猪脑垂体后叶提取的胸腺五肽
1) 胸腺五肽溶液的制备量取lml浓缩过的猪脑垂体后叶提取的胸腺五肽，经0.45 pm滤膜过滤后备用，离心去除颗粒物；
2) 取400目聚酰胺粉末，加入95%乙醇于室温110转/分钟振荡洗涤40-50分钟，倾 出95%乙醇，用水洗至无醇味，再分别用5%氢氧化钠溶液及30%乙酸溶液按相 同方法洗涤，最后用20%乙醇洗涤，装柱平衡至初始流动相，采用干法或湿法装 填成柱；
3) 聚酰胺介质湿法装柱，层析柱内径16 mm，装填高度250 mm，接入Akta Prime Plus 层析系统，压力限2.5MPa，层析柱用流动相平衡2个柱床体积；
4) 步骤l)制备好的胸腺五肽溶液，通过自动进样阀进样lml;5) 等度洗脱，流速为1.0ml/min，紫外检测器280 nm监测，收集洗脱峰；
6) 聚酰胺色谱分离胸腺五肽的谱图如图2所示，分别收集各个洗脱峰，冻干后重新 溶解，经RP-HPLC (C18柱)检测，其中所标示的峰为聚酰胺色谱峰，其纯度 大于95%，收率大于85%。
权利要求
1、一种使用聚酰胺色谱法分离胸腺五肽的方法，利用聚酰胺介质与胸腺五肽及其混合物中杂质之间吸附作用的差异，对不同来源的胸腺五肽进行纯化。
2、 根据权利要求1所述使的使用聚酰胺色谱分离胸腺五肽的方法，其包括如下的 步骤1) 胸腺五肽溶液的制备称取10mg固相合成的胸腺五肽粗品，将其溶于lml水中 配制成10 mg/ml的胸腺五肽溶液，离心去除颗粒物；2) 取300目聚酰胺粉末，加入95%乙醇于室温110转/分钟振荡洗涤40-50分钟，倾 出95%乙醇，用水洗至无醇味，再分别用5%氢氧化钠溶液及30%乙酸溶液按相 同方法洗涤，最后用20%乙醇洗涤，装柱平衡至初始流动相，采用干法或湿法装 填成柱；3) 聚酰胺介质湿法装柱，层析柱内径16 mm，装填高度250 mm，接入Akta Prime Plus 层析系统，压力限2.5MPa，层析柱用流动相平衡2个柱床体积；4) 步骤l)制备好的胸腺五肽溶液，'通过自动进样阀进样1 ml;5) 等度洗脱，流速为0.8 ml/min,紫外检测器280 nm监测，收集洗脱峰；6) 聚酰胺色谱分离胸腺五肽的谱图如图1所示，分别收集各个洗脱峰，冻干后重新 溶解，经RP-HPLC (C18柱)检测，其中所标示的峰为聚酰胺色谱峰，其纯度 大于95%，收率大于90%。
全文摘要
本发明涉及一种使用聚酰胺氢键吸附色谱分离纯化胸腺五肽的方法。该方法根据聚酰胺介质对胸腺五肽及其混合物中杂质吸附作用的差异，针对目前纯化工艺中所存在的纯化效率低、回收率低、以及纯化成本高等诸多问题，通过聚酰胺色谱一步分离了获得较高纯度的胸腺五肽。提供了一种纯度较高，回收率高，成本低，样品载量高，对粗样品耐受强，工艺简单，易于规模放大的胸腺五肽分离纯化方法。
文档编号C07K7/00GK101643498SQ20091008756
公开日2010年2月10日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者孟桂凤, 邢思亮 申请人:北京康铭优盛生化技术有限公司