专利名称：色谱法从钩吻醇取物中制备钩吻碱甲的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种钩吻碱甲(gelsemine)的制备方法，特别是涉及一种从钩吻提取物中分离制备钩吻碱甲的方法。
背景技术：
钩吻(Gelsemium elegans Benth.)为马钱科胡蔓藤属植物，分中国钩吻和北美钩吻两种。我国盛产于福建、浙江、广西、广东、湖南等地，又名断肠草。其药用部位为全草。具有祛风攻毒，消肿止痛的功效。钩吻碱类化合物是存在于钩吻中的一类化合物，被证明在肿瘤、镇痛等方面有较好的活性。临床上用于抑制肿瘤细胞生长、治疗神经痛、局部用于扩瞳等作用，可以被认为是钩吻药效的物质基础之一。钩吻碱甲(Gelsemine)是自钩吻中分离得到的一种钩吻碱类化合物，其含量较高，具有一定的开发新药的潜力。其药理作用主要包括其能抑制肿瘤细胞生长，镇痛、镇静等作用。目前技术公开钩吻碱甲的制备方法(专利号CN 101323618A，
公开日2008年12 月17日)是将钩吻总碱用流动相溶解后，采用高速逆流色谱仪进行制备，该制备方法操作繁琐，设备费用昂贵，制备量少，不利于工业化生产。因此，钩吻碱甲分离手段的不足是限制其医药用途的一个主要原因。
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从钩吻提取物中制备钩吻碱甲的方法，以解决现有技术中制备手段繁琐，产率极低的技术问题。为解决上述技术问题，本发明从钩吻提取物中制备钩吻碱甲的方法，包括步骤(1)乙酸乙酯萃取步骤将钩吻提取物的水溶液用体积比为0.5 1 2 1的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得萃取纯化的浸膏A。(2)硅胶色谱纯化步骤将步骤(1)所得浸膏A用100-200目或200-300目柱层析硅胶柱色谱分离，并以体积比为100 1 25 1氯仿-甲醇溶液进行洗脱，将洗脱液薄层硅胶板(GF254)点样后于紫外灯254nm下观察，合并含有钩吻碱甲的流份，减压回收溶剂，得浸膏B。
(3)反相C18色谱纯化步骤将步骤⑵所得的浸膏C用30%甲醇溶解后，反相硅胶分离(浸膏样品与C18反相硅胶重量比为1 30 1 50)，体积比为40% 50%的甲醇-水溶液洗脱，洗脱液作 TLC检识，合并含有钩吻碱甲的流份，减压回收溶剂，得钩吻碱甲的纯品。其中，所述硅胶色谱纯化步骤与反相色谱纯化步骤的顺序能够颠倒。所述步骤(1)中钩吻提取物中所用的提取溶剂为体积浓度为70% 95%的乙醇溶液。采用本发明的方法依次经(1)乙酸乙酯萃取；( 硅胶色谱纯化；(3)反相色谱纯化；能极大地提高得率，因此，该方法是一种制备钩吻碱甲的简化工艺，可用于钩吻碱甲的工业制备。
图1是钩吻碱甲的1H-WR图。 图2是钩吻碱甲的13C-NMR图。 图3是钩吻碱甲的DEPT图。
具体实施例方式下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例1钩吻碱甲的制备钩吻药材1kg，去除杂质后粉碎成粗粉，体积浓度为70%乙醇5L回流提取3次，每次2小时，合并提取液，回收溶剂得提取液约1L。将提取液用2L乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压回收溶剂得浸膏A约 40g。将浸膏A用硅胶柱色谱分离(硅胶为100-200目或200-300目柱层析硅胶，浸膏样品与硅胶重量比为1 30，硅胶柱规格Φ100*1000πιπι)，并以体积比为50 1的氯仿-甲醇溶液进行洗脱，将洗脱液薄层硅胶板(GF254)点样，以体积比为10 1的氯仿-甲醇溶液展开后置于紫外灯254nm下观察，收集含有钩吻碱甲的部分，减压回收溶剂，得浸膏B约7g。将浸膏B用反相Cw硅胶柱色谱分离(浸膏样品与硅胶重量比为1 40，硅胶柱规格Φ60*600πιπι)，体积比为40%的甲醇-水溶液洗脱，将洗脱液薄层硅胶板(GF254)点样， 以体积比为10 1的氯仿-甲醇溶液展开后置于紫外灯254nm下观察，收集含有钩吻碱甲的部分，即得纯化的钩吻碱甲0. 26go最终所得钩吻碱甲经常规公知的NMR方法鉴定Heterocycles，1996，43 1015-1020.，并经高效液相检测[Kromasil-Cw柱(4. 6mm*250mm)，检测波长254nm，流动相水-甲醇(50 50)，流速ImL · mirT1，进样量10μ 1，柱温25°C，理论塔板数以钩吻碱甲计不低于5000含量在96%以上，其得率为0. 026%实施例2钩吻碱甲的制备钩吻药材1kg，去除杂质后粉碎成粗粉，体积浓度为95%乙醇5L回流提取3次，每次2小时，合并提取液，回收溶剂得提取液约2L。将提取液用IL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压回收溶剂得浸膏A约 35g。将浸膏A用反相Cw硅胶柱色谱分离(浸膏样品与Cw硅胶重量比为1 30，硅胶柱规格Φ100*1000πιπι)，体积比为50%的甲醇-水溶液洗脱，将洗脱液薄层硅胶板(GF254)点样，以体积比为10 1的氯仿-甲醇溶液展开后置于紫外灯254nm下观察，收集含有钩吻碱甲的部分，得浸膏B约3g。将浸膏B用硅胶柱色谱分离(硅胶为100-200目或200-300目柱层析硅胶，浸膏样品与硅胶重量比为1 100，硅胶柱规格Φ60*600πιπι)，并以体积比为100 1的氯仿-甲醇溶液进行洗脱，将洗脱液薄层硅胶板(GF254)点样，以体积比为10 1的氯仿-甲醇溶液展开后置于紫外灯254nm下观察，收集含有钩吻碱甲的部分，减压回收溶剂，即得纯化的钩吻碱甲0. 31g。最终所得钩吻碱甲经常规公知的NMR方法鉴定Heterocycles，1996，43 1015-1020.，并经高效液相检测[Kromasil-Cw柱(4. 6mm*250mm)，检测波长254nm，流动相水-甲醇(55 45)，流速ImL · mirT1，进样量10μ 1，柱温25°C，理论塔板数以钩吻碱甲计不低于5000含量在98%以上，其得率为0. 031%。 实施例3钩吻碱甲的制备钩吻药材1kg，去除杂质后粉碎成粗粉，体积浓度为80%乙醇5L回流提取3次，每次2小时，合并提取液，回收溶剂得提取液约1L。将提取液用0. 5L乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压回收溶剂得浸膏A约 35g。将浸膏A用硅胶柱色谱分离(硅胶为100-200目或200-300目柱层析硅胶，浸膏样品与硅胶重量比为1 50，硅胶柱规格Φ100*1000πιπι)，并以体积比为50 1的氯仿-甲醇溶液进行洗脱，将洗脱液薄层硅胶板(GF254)点样，以体积比为10 1的氯仿-甲醇溶液展开后置于紫外灯254nm下观察，收集含有钩吻碱甲的部分，减压回收溶剂，得浸膏B约15g。将浸膏B用30%甲醇溶解后，反相C18硅胶分离(浸膏样品与C18硅胶重量比为 1 50，硅胶柱规格Φ60*600mm)，体积比为45 %的甲醇-水溶液洗脱，将洗脱液薄层硅胶板(GF254)点样，以体积比为10 1的氯仿-甲醇溶液展开后置于紫外灯254nm下观察，收集含有钩吻碱甲的部分，即得纯化的钩吻碱甲0. 35g。最终所得钩吻碱甲经常规公知的NMR方法鉴定Heterocycles，1996，43 1015-1020.，并经高效液相检测[Kromasil-Cw柱(4. 6mm*250mm)，检测波长254nm，流动相水-甲醇(55 45)，流速ImL · mirT1，进样量10μ 1，柱温25°C，理论塔板数以钩吻碱甲计不低于5000含量在97%以上，其得率为0. 035%以上实验结果表明，本方法用于制备钩吻碱甲，工艺简单，得率在万分之二以上， 因此，本发明可用于钩吻碱甲的工业制备。
权利要求
1.从钩吻提取物中制备钩吻碱甲的方法，其特征在于包括步骤(1)乙酸乙酯萃取步骤将钩吻提取物的水溶液用体积比为0.5 1 2 1的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得萃取纯化的浸膏A。(2)硅胶色谱纯化步骤将步骤(1)所得浸膏A用100-200目或200-300目柱层析硅胶柱色谱分离，并以体积比为100 1 25 1的氯仿-甲醇溶液进行洗脱，将洗脱液薄层硅胶板(GF254)点样后于紫外灯254nm下观察，合并含有钩吻碱甲的流份，减压回收溶剂，得浸膏B。(3)反相C18色谱纯化步骤将步骤⑵所得的浸膏C反相硅胶柱色谱分离，体积比为40% 50%的甲醇-水溶液洗脱，将洗脱液薄层硅胶板(GF254)点样后于紫外灯254nm下观察，合并含有钩吻碱甲的流份，减压回收溶剂，即得纯化的钩吻碱甲。其中，所述硅胶色谱纯化步骤与反相色谱纯化步骤的顺序能够颠倒。
2.如权利要求1所述的从钩吻提取物中制备钩吻碱甲的方法，其特征在于所述步骤 (1)中钩吻提取物中所用的提取溶剂为体积浓度为70% 95%的乙醇溶液；钩吻提取物的水溶液浓度相当于生药0. 5g · πιΓ1 1. Og · Iiir10
3.如权利要求1所述的从钩吻提取物中制备钩吻碱甲的方法，其特征在于所述乙酸乙酯萃取中，钩吻提取物的水溶液与乙酸乙酯溶液的体积比为0.5 1 2 1。
4.如权利要求1所述的从钩吻提取物中制备钩吻碱甲的方法，其特征在于所述硅胶色谱纯化步骤中，硅胶为100-200目或200-300目柱层析硅胶或薄层层析硅胶，浸膏样品与硅胶重量比为1 30 1 100。
5.如权利要求1所述的从钩吻提取物中制备胡钩吻碱甲的方法，其特征在于所述反相色谱纯化步骤中，浸膏样品与Cw反相硅胶重量比为1 30 1 50。
全文摘要
本发明公开了一种从钩吻提取物中制备钩吻碱甲的方法，包括步骤(1)乙酸乙酯萃取；(2)硅胶色谱纯化；(3)反相色谱纯化。本发明是一种制备钩吻碱甲的简化工艺，能极大地提高钩吻碱甲的得率，可用于钩吻碱甲的工业制备。
文档编号C07D491/22GK102199156SQ20101013392
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者冯怡, 梁爽, 王源, 郑向炜, 阮克锋 申请人:上海张江中药现代制剂技术工程研究中心