专利名称：一种2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物、其制备方法及其在siRNA领 域中的应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来 病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA (double strand RNA, dsRNA)导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失， 这一过程属于转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene siliencing，PTGS)范畴。 RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物到植物、真菌、无脊椎动物、甚至近来在哺乳动物 中也发现了此种现象，只是机制也更为复杂。现已初步阐明RNAi的作用机制RNAi的第一步是dsRNA在内切核酸酶(一种具 有RNaselll样活性的核酸酶，称为Dicer)作用下加工裂解形成21_25nt的由正义链和反 义链组成的干扰性小dsRNA，即siRNA。RNAi的第二步是由siRNA中的反义链指导形成一 种核蛋白体，该核蛋白体称为RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencingcomplex, RISC)，由RISC介导切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而达到干扰基因表 达作用。RISC由多种蛋白成分组成，包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜 索活性等。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，已经成为功能基 因组研究的有力工具。最近在人类体细胞里已经成功地对近20种基因功能进行了敲除，尤 其是因此而了解了人类空泡蛋白TsglOl对HIV在人体内增殖的作用，进一步深化了对HIV 的研究。siRNA的化学稳定性差不是由于其在双链形式下被降解，而是由于在双链-单链 的杂交_解旋平衡中，其单链形式被RNase酶降解造成的。根据以上原理，用非核酸分子将 两条siRNA链各自的一端连接起来，将siRNA链锁定，siRNA链就不易解旋降解，从而可以 改善siRNA的化学稳定性和血液容留时间。在细胞内，利用细胞内存在的Dicer酶释放被 锁定的siRNA，对靶基因的表达进行抑制。但是，已有的修饰和连接方法对siRNA的稳定性的改进十分有限；而且，在所修饰 的结构中不易引入功能性分子，如荧光标记分子。从化学活性角度看，烷烃链和杂环结构是非常稳定的化学结构。尤其在机体内它 们可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶的水解，对生理环境的氧化、还原、取代、消除、加成等反应 及广泛的PH环境均可耐受，因此设计合成烷烃或杂环结构固定的siRNA是提高siRNA稳定 性和活性的理想途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物。
本发明的另一目的是提供上述核苷衍生物的制备方法。本发明的进一步目的是提供上述核苷衍生物在提高siRNA稳定性中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种偶联氨基酸的核苷衍生物，其结构如式1或 式2所示 式1式 2其中，B为带有氨基保护基的核苷碱基，所述核苷碱基优选为胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺 嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤；n为1-6的整数；Linker为的直链烷烃氓为H或甲基；R2为 碳碳双键、碳碳三键或叠氮基；2’ -0H和3’ -0H可以为R构型或S构型。前述的核苷衍生物，其中所述的氨基保护基为苯甲酰基、异丙酰基或乙酰基。上述2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备方法，其包括步骤1)将核苷溶于水溶性有机溶剂中，在碱的作用下与带氨基的linker偶联得到中 间体A，柱层析分离2’偶联产物或3’偶联产物；2)将步骤1)的偶联产物和氨基酸溶于水溶性有机溶剂中，在脱水剂的作用下发 生脱水反应，得产物B。前述的方法，其中步骤1)和步骤2)中所述的水溶性有机溶剂包括DMF、DMS0、THF、 1，4-二氧六环、吡啶、乙腈。前述的方法，其中步骤1)中所述的碱包括氢化钠、碳酸钾、叔丁醇钾、DMAP、二乙胺。前述的方法，其中步骤1)中所述的带氨基的linker包括 其中，nl=0_8。前述的方法，其中步骤2)中所述的氨基酸，其侧链末端带有碳碳双键、碳碳三键
或叠氮基。前述的方法，其中步骤2)中所述的氨基酸可以是R构型或S构型，其包括 其中，n2为1-6的整数。前述的方法，其中步骤2)中所述的脱水剂包括DCC、DIC、EDCI。前述的方法，具体步骤如下1)将真空干燥的核苷溶于预先干燥的水溶性有机溶剂中，控制温度在0-10°C之 间，加入相当于1-3倍核苷物质的量的碱，搅拌10-30min，缓慢滴加相当于0. 5-1. 5倍核苷 物质的量的带氨基的linker，5-30min内滴加完毕，室温搅拌8_24h ；向体系中加入少量水 (约为2-6倍核苷物质的量)，淬灭反应，旋干溶剂，柱层析分离2’偶联产物和3’偶联产 物；2)将步骤1)的偶联产物和氨基酸按1 1-3物质的量比溶于预先干燥的水溶 性有机溶剂中，搅拌均勻，向体系中加入相当于2-5倍核苷物质的量的脱水剂，室温下搅拌 6-12h ；向体系中加入少量水(约为4-10倍核苷物质的量)，淬灭反应，滤除生成的固体，将 滤液旋干，柱层析分离得到目标产物。上述2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物在提高siRNA稳定性中的应用。将式1或式2所示的2’ -或3’ -位偶联氨基酸的核苷单体通过固相合成，连接到 两条siRNA链的3’端和5、端。2:或;T-位的若是末端双键，在Grubbs催化剂的作用下 发生烯烃复分解反应，将两条siRNA链锁定；或者利用Click化学原理使2’ -或3’ -位的 末端的碳碳三键和叠氮基偶联成三氮唑，从而将两条siRNA链锁定。被固定两端的siRNA不 仅化学稳定性和血液容留时间得到明显的改善，而且容易透过细胞膜。被锁定的siRNA进 入细胞后，经细胞内存在的Dicer酶的剪切和加工后释放被锁定的siRNA，从而对靶基因的 表达进行抑制。此外，利用上述方法固定的双链siRNA两端还有裸露的氨基，可以根据需要 偶联任何功能基团，包括荧光基团、靶向识别分子或可增加细胞膜通透性的脂类分子等。本发明所述在Grubbs催化剂的作用下的锁定siRNA的方法，包括如下步骤1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列；2)通过常规的固相合成方法，合成需要被锁定的siRNA，并在合成过程中将2’-或 3’ -位含末端双键的核苷衍生物连接到两条siRNA链的3’端和5’端；3)在Grubbs催化剂的作用下发生烯烃复分解反应，将两条siRNA链锁定；4)被锁定的siRNA进入细胞后，经细胞内Dicer酶的剪切和加工后释放被锁定的 siRNA，从而对靶基因的表达进行抑制。本发明所述的利用Click化学原理锁定siRNA的方法，包括如下步骤
1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列；2)通过常规的固相合成方法，合成需要被锁定的siRNA，并在合成过程中将2’-或 3’ -位含末端三键和叠氮基的核苷衍生物连接到两条siRNA链的3’端和5’端；3)在Cul的催化下，将两条siRNA链锁定；4)被锁定的siRNA进入细胞后，经细胞内Dicer酶的剪切和加工后释放被锁定的 siRNA，从而对靶基因的表达进行抑制。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果1)本发明提供的2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物为全新化合物，制备方法简单， 无需苛刻的反应条件和复杂的化学反应过程；2)本发明将侧链末端带有双键、三键或叠氮基的氨基酸偶联到核苷的2’或3’位， 不仅可以用于固定siRNA双链，而且在其裸露的氨基上还可以根据需要偶联任何功能基 团，如荧光基团等；3)采用本发明2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物固定的siRNA双链，具有良好的 亲脂性和膜透性，在机体内可以耐受各种酶的水解，对生理环境的氧化、还原、取代、消除、 加成等反应及广泛的PH环境均可耐受，其化学稳定性和血液容留时间得到明显的改善；4)本发明利用Grubbs催化剂或Click化学原理进行偶联固定，反应简单易行。
图1表示本发明2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备路线；图2为本发明利用Grubbs催化剂固定siRNA的方法示意图；图3为本发明利用Click化学原理固定siRNA的方法示意图；图4为本发明实施例1的2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备路线示意图；图5为本发明实施例2的2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备路线示意图；图6为本发明实施例3的2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备路线示意图；图7为本发明实施例4的在Grubbs催化剂的作用下锁定两条siRNA链的示意图；图8为本发明实施例5的利用Click化学原理锁定两条siRNA链的示意图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1(1)将真空干燥的尿苷(4. 88g,20mmol)溶于预先干燥的50ml的DMF中，控制温 度在0°C，加入氢化钠(0. 48g，20mmol)，搅拌30min。缓慢滴加2-溴乙胺(1. 35g,22mmol), 5min内滴加完毕，室温搅拌8h ；向体系中加入5ml水，淬灭反应，旋干溶剂，柱层析分离2’ 偶联产物A2-l(产率为32%)和3’偶联产物A3-l(产率为17%)，如图4所示。(2)将 A2-1 (0. 29g, lmmol)和(S) _2_ 氨基 ~4~ 戊烯酸(0. 23g, 2mmol)溶于预先 干燥的10ml乙腈中，搅拌均勻，向体系中加入DCC(5mmol)，室温下搅拌8h;向体系中加入 lml水，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干，柱层析分离得到目标产物B2-1 (产率为 72% )。NMR 1. 33(m,2H) ；1.79(m，2H) ；1.96(m，2H) ；3. 30(t，2H) ；3. 38(m，lH)；3.54(d，lH) ； 3. 51 (d，3、0H) ；3. 63(t，2H) ； 3. 79(d，lH) ； 3. 82 (t，5、0H) ；3. 90 (m, 1H)；
4.40(m，lH) ；4. 75 (m, 1H) ；5. 02 (m, 1H) ；5. 07 (m, 1H) ；5. 76 (m, 1H) ；5. 82 (d, 1H) ；6.17 (m， 1H) ；9. 62(d,1H) ；MS :[M+1]+:413。(3)将 A3-1 (0. 29g, lmmol)和(S) _2_ 氨基 ~4~ 戊烯酸(0. 23g, 2mmol)溶于预先 干燥的10ml乙腈中，搅拌均勻，向体系中加入DCC(5mmol)，室温下搅拌8h;向体系中加入 lml水，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干，柱层析分离得到目标产物B3-1 (产率为 70% )。NMR :1. 33(m，2H) ；1.79(m，2H) ；1.96(m，2H) ；3.30(t，2H) ；3. 38 (m, 1H)；
3.54 (d, 1H) ；3. 58(d，2、0H) ；3.63(t，2H) ；3. 79 (d, 1H) ；3. 88 (t，5、0H) ；3. 90 (m, 1H)；
4.52(m，lH) ；4. 75 (m, 1H) ；5. 02 (m, 1H) ；5. 07 (m, 1H) ；5. 76 (d, 1H) ；5. 82 (m, 1H) ；5.93 (m， 1H) ；9. 62(d,1H) ；MS :[M+1]+:413。实施例2(1)将真空干燥的5-甲基尿苷(4. 88g，20mmol)溶于预先干燥的50ml的DMF中， 控制温度在0°c，加入氢化钠(0.48§，20讓01)，搅拌301^11。缓慢滴加2-溴乙胺(1. 35g， 22mmol)，5min内滴加完毕，室温搅拌8h ；向体系中加入5ml水，淬灭反应，旋干溶剂，柱层析 分离2’偶联产物A2-1 (产率为32% )和3’偶联产物A3-1 (产率为17% )，如图5所示。(2)将 A2-1 (0. 29g, lmmol)和(S) _2_ 氨基 ~4~ 戊烯酸(0. 23g, 2mmol)溶于预先 干燥的10ml乙腈中，搅拌均勻，向体系中加入DCC(5mmol)，室温下搅拌8h;向体系中加入 lml水，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干，柱层析分离得到目标产物B2-1 (产率为 72% )。NMR :1. 26(m，6H) ；1.42(m，8H) ；1.56(s，3H) ；1. 75(t,2H) ；2. 43(s，3H)；
2.46 (t, 2H) ；2. 83(s, 1H) ；3. 20 (t, 2H) ；3. 37(t,2H) ；3. 54 (m, 1H) ； 3. 58 (d，3、0H)；
3.65(t,5~-0H) ；3. 79 (m, 1H) ；3. 90 (m, 1H) ；4. 40 (m, 1H) ；4. 75 (m, 1H) ；5. 11 (s, 1H)； 6. 17(m，lH) ；7. 57(d，lH) ；MS : [M+l] + :523。(3)将 A3-1 (0. 29g, lmmol)和(S) _2_ 氨基 ~4~ 戊烯酸(0. 23g, 2mmol)溶于预先 干燥的10ml乙腈中，搅拌均勻，向体系中加入DCC(5mmol)，室温下搅拌8h;向体系中加入 lml水，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干，柱层析分离得到目标产物B3-1 (产率为 70% )。NMR :1. 26(m，6H) ；1.42(m，8H) ；1.56(s，3H) ；1. 75(t,2H) ；2. 43(s，3H)； 2. 46(t，2H) ；2. 83 (s, 1H) ；3. 20(t，2H) ；3. 27 (m, 1H) ；3. 37(t，2H) ；3. 54 (m, 1H) ；3.62 (d， 2~-0H) ；3. 65(t，5、0H) ；3. 79 (m, 1H) ；4. 53 (m, 1H) ；4. 64 (m, 1H) ；5. 11 (s, 1H) ；5. 93 (m, 1H) ；7. 57(d,1H) ；MS:[M+1]+:523。实施例3(1)将真空干燥的5-甲基尿苷(4. 88g，20mmol)溶于预先干燥的50ml的DMF中， 控制温度在0°c，加入氢化钠(0.48§，20讓01)，搅拌301^11。缓慢滴加2-溴乙胺(1. 35g， 22mmol)，5min内滴加完毕，室温搅拌8h ；向体系中加入5ml水，淬灭反应，旋干溶剂，柱层析 分离2’偶联产物A2-l(产率为32% )和3’偶联产物A3-l(产率为17% )，如图6所示。(2)将 A2-1 (0. 29g, lmmol)和(S) _2_ 氨基 ~4~ 戊烯酸(0. 23g, 2mmol)溶于预先 干燥的10ml乙腈中，搅拌均勻，向体系中加入DCC(5mmol)，室温下搅拌8h;向体系中加入lml水，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干，柱层析分离得到目标产物B2-1 (产率为 72% )。NMR 1. 29(m,6H) ； 1.46(m，6H) ； 1.72(m，lH) ；2. 03 (m, 1H) ；3. 30 (m, 5H)；
3.54 (m, 1H) ；3. 58(d，3、0H) ； 3. 63 (m, 1H) ；3. 69 (t，5、0H) ； 3. 79 (m, 1H) ； 3. 90 (m, 1H)；
4.40(m，lH) ；4. 75 (m, 1H) ；6. 40 (m, 1H) ；7. 32 (m, 3H) ；8. 03 (m, 2H) ；8. 16 (s, 1H) ；8.35 (s， 1H) ；9. 15 (s, 1H, NH) ；MS :[M+1]+:611。(3)将 A3-1 (0. 29g, lmmol)和(S) _2_ 氨基 ~4~ 戊烯酸(0. 23g, 2mmol)溶于预先 干燥的10ml乙腈中，搅拌均勻，向体系中加入DCC(5mmol)，室温下搅拌8h;向体系中加入 lml水，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干，柱层析分离得到目标产物B3-1 (产率为 70% )。NMR 1. 29(m,6H) ； 1.46(m，6H) ； 1.72(m，lH) ；2. 03 (m, 1H) ；3. 30 (m, 5H)；
3.46(d，2~-0H) ； 3. 54 (m, 1H) ； 3. 63 (m, 1H) ；3. 69 (t，5、0H) ； 3. 79 (m, 1H) ； 3. 90 (m, 1H)；
4.64(m，lH) ；4. 99 (m, 1H) ；6. 16 (m, 1H) ；7. 32 (m, 3H) ；8. 03 (m, 2H) ；8. 16 (s, 1H) ；8.35 (s， 1H) ；9. 15 (s, 1H, NH) ；MS :[M+1]+:611。实施例4 2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物固定siRNA(在Grubbs催化剂的作用 下)(1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列选择GAPDH (Genbank登记号为NC_000012)为靶基因，设计siRNA，其对应于 NC_000012 的位置为 2700-2718bp。正义链5，-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3，反义链5，-CUUGAGGCUGUU⑶CAUACTT-3，(2)固相合成 siRNA 其中，2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的合成方法参考实施例L
(3)在Grubbs催化剂的作用下发生烯烃复分解反应，将两条siRNA链锁定，如图7 所示。实施例5 2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物固定siRNA(利用Click化学原理)(1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列选择GAPDH (Genbank登记号为NC_000012)为靶基因，设计siRNA，其对应于 NC_000012 的位置为 2700-2718bp。正义链5，-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3，反义链5，-CUUGAGGCUGUU⑶CAUACTT-3，(2)固相合成 siRNA 其中，2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的合成方法参考实施例2和3。(3)在Cul催化剂的作用，利用Click化学原理，将两条siRNA链锁定，如图8所示。实施例6锁定的siRNA稳定性检测将未锁定的siRNA和实施例4与实施例5制得的siRNA和10 %的血清分别孵育 lmin、30min、l. 5h、3h、6h、12h、24h后进行20% PAGE电泳，以观察锁定的siRNA在血清中的 稳定性。结果表明未锁定的siRNA在血清中孵育30min就明显降解，6h时完全降解，而实 施例4和实施例5中锁定的siRNA在24h内未观察到明显降解。进一步实验表明，72h内实 施例4和实施例5中的siRNA始终未观察到明显降解。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
一种偶联氨基酸的核苷衍生物，其结构如式1或式2所示式1 式2其中，B为带有氨基保护基的核苷碱基；n为1-6的整数；Linker为C2-C10的直链烷烃；R1为H或甲基；R2为碳碳双键、碳碳三键或叠氮基。FSA00000068421400011.tif
2.根据权利要求1所述的核苷衍生物，其中所述的氨基保护基为苯甲酰基、异丙酰基或乙酰基。
3.制备权利要求1或2所述的核苷衍生物的方法，其包括步骤1)将核苷溶于水溶性有机溶剂中，在碱的作用下与带氨基的linker偶联得到中间体， 柱层析分离2’或3’偶联产物；2)将步骤1)的偶联产物和氨基酸溶于水溶性有机溶剂中，在脱水剂的作用下发生脱 水反应，即得；其中，步骤1)和步骤2)中所述的水溶性有机溶剂包括DMF、DMS0、THF、1，4-二氧六环、 吡啶或乙腈；步骤1)中所述的碱包括氢化钠、碳酸钾、叔丁醇钾、DMAP或二乙胺；步骤2)中 所述的氨基酸，其侧链末端带有碳碳双键、碳碳三键或叠氮基；步骤2)中所述的脱水剂包 括DCC,DIC 或 EDCI。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤1)中所述的带氨基的linker包括 其中，nl = 0-8。
5.根据权利要求3所述的方法，其中步骤2)中所述的氨基酸包括 其中，n2为1-6的整数。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的方法，具体步骤如下1)将真空干燥的核苷溶于预先干燥的水溶性有机溶剂中，控制温度在0-10°C之间，力口 入相当于1-3倍核苷物质的量的碱，搅拌10-30min，缓慢滴加相当于0. 5-1. 5倍核苷物质的 量的带氨基的linker，5-30min内滴加完毕，室温搅拌8_24h ；向体系中加入相当于2_6倍 核苷物质的量的水，淬灭反应，旋干溶剂，柱层析分离2’偶联产物和3’偶联产物；2)将步骤1)的偶联产物和氨基酸按1 1-3物质的量比溶于预先干燥的水溶性有机 溶剂中，搅拌均勻，向体系中加入相当于2-5倍核苷物质的量的脱水剂，室温下搅拌6-12h ； 向体系中加入相当于4-10倍核苷物质的量的水，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干， 柱层析分离得到目标产物。
7.权利要求1或2所述的核苷衍生物在提高siRNA稳定性中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其采用如下方式进行1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列；2)通过常规的固相合成方法，合成需要被锁定的siRNA，并在合成过程中将2’-或 3’ -位含末端双键的核苷衍生物连接到两条siRNA链的3’端和5’端；3)在Grubbs催化剂的作用下发生烯烃复分解反应，将两条siRNA链锁定；4)被锁定的siRNA进入细胞后，经细胞内Dicer酶的剪切和加工后释放被锁定的 siRNA，从而对靶基因的表达进行抑制。
9.根据权利要求7所述的应用，其采用如下方式进行1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列；2)通过常规的固相合成方法，合成需要被锁定的siRNA，并在合成过程中将2’-或 3’ -位含末端三键和叠氮基的核苷衍生物连接到两条siRNA链的3’端和5’端；3)在CuI的催化下，将两条siRNA链锁定；4)被锁定的siRNA进入细胞后，经细胞内Dicer酶的剪切和加工后释放被锁定的 siRNA，从而对靶基因的表达进行抑制。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其中所述的锁定的双链siRNA的两端偶联有荧光 基团、靶向识别分子或脂类分子。
全文摘要
本发明提供了一种偶联氨基酸的核苷衍生物，其结构如式1或式2所示其中，B为带有氨基保护基的核苷碱基；n为1-6的整数；Linker为C2-C10的直链烷烃；R1为H或甲基；R2为碳碳双键、碳碳三键或叠氮基。本发明还提供了所述2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备方法及其在提高siRNA稳定性中的应用。采用本发明提供的2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物固定的siRNA双链，具有良好的亲脂性和膜透性，在机体内可以耐受各种酶的水解，对生理环境的氧化、还原、取代、消除、加成等反应及广泛的pH环境均可耐受，其化学稳定性和血液容留时间得到明显的改善。
文档编号C07H1/00GK101845071SQ20101013347
公开日2010年9月29日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者刘迎春, 高源 申请人:北京欧凯纳斯科技有限公司