具有氨基酸骨架的单链核酸分子的制作方法
【专利摘要】本发明旨在提供可简便有效地生产并可抑制基因表达的新核酸分子。一种包含用于抑制靶基因表达的表达抑制序列的单链核酸分子，所述分子的特征在于包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)。所述连接子区域(Lx)连接在区域(Xc)和区域(X)之间，区域(Xc)与区域(X)互补，区域(X)和区域(Xc)的至少之一包含表达抑制序列，和连接子区域(Lx)包含源自氨基酸的原子团。所述单链核酸分子可抑制靶基因的表达。
【专利说明】具有氨基酸骨架的单链核酸分子
【技术领域】
[0001]本发明涉及抑制基因表达的单链核酸分子。更特别地，本发明涉及具有氨基酸骨架的单链核酸分子、包含其的组合物及其用途。
【背景技术】
[0002]作为抑制基因表达的技术，例如，RNA干扰(RNAi)是已知的(非专利文献I)。通过RNA干扰来抑制基因表达通常例如通过将短的双链RNA分子施用至细胞等来进行。前述双链RNA分子通常称为siRNA(小干扰RNA)。已报道基因表达还可通过具有由分子内退火而在其中部分形成的双链的环状RNA分子抑制(专利文献I)。
[0003][文献列表]
[0004][非专利文献]
[0005]非专利文献I =Fire 等人，Nature, 1998Febl9 ；391 (6669):806-11
[0006][专利文献]
[0007]专利文献1:US-A-2004-058886
【发明内容】
[0008]发明要解决的问题
[0009]然而，在前述各技术中，诱导基因表达抑制的RNA分子具有下列问题。
[0010]首先，为了生产前述SiRNA，必须分别合成正义链和反义链，并在该过程结束时将这些链杂交。因此，存在低制造效力的问题。此外，当前述siRNA施用至细胞时，必须在抑制单链RNA解离的同时将siRNA施用至细胞，这需要大量设定操作siRNA的条件的工作。环状RNA分子具有合成困难的问题。
[0011]这些RNA分子基本上由核苷酸残基构成。目前，为了赋予前述RNA分子一些功能或标记，没有其它方法，只有修饰例如核苷酸残基中的组分即碱基、糖残基或磷酸基团中的任一种。因此，在利用RNA干扰的药品等的研发中，非常难以在维持RNA分子的抑制基因表达的功能的同时更改RNA分子来向其赋予进一步的功能或将其标记。
[0012]因此，本发明的目的为提供可简便有效生产且抑制基因表达的新的核酸分子。
[0013]用于解决问题的方案
[0014]为了实现前述目的，本发明的核酸分子为单链核酸分子，其包含抑制靶基因表达的表达抑制序列，并包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xe)，其中前述连接子区域(Lx)连接在前述区域(X)和前述区域(Xe)之间，前述区域(Xe)与前述区域(X)互补，前述区域(X)和前述区域(Xe)的至少之一包含前述表达抑制序列，和前述连接子区域(Lx)包含源自氨基酸的原子团。
[0015]本发明的第一组合物为用于抑制靶基因表达的组合物，且其特征在于包含上述本发明的单链核酸分子。
[0016]本发明的第二组合物为药物学组合物，其特征在于包含上述本发明的单链核酸分子。
[0017]本发明的表达抑制方法为抑制靶基因表达的方法，其特征在于使用上述本发明的单链核酸分子。
[0018]本发明的表达诱导方法为诱导抑制靶基因表达的RNA干扰的方法，其中使用上述本发明的单链核酸分子。
[0019]本发明的治疗疾病的方法包括将上述本发明的单链核酸分子施用至患者的步骤，其中上述单链核酸分子具有抑制由上述疾病引起的基因的表达的序列作为上述表达抑制序列。
[0020]发明的效果
[0021]本发明的单链核酸分子可抑制基因表达。由于其不是环状的，其合成容易。由于其为不需要用于双链的退火的单链，其可有效地生产。此外，由于前述连接子区域包含前述非核苷酸残基，例如核苷酸残基的常规改变并不受限，但例如，诸如前述连接子区域等的修饰等的改变也是可能的。
[0022]本发明的发明人首先发现了基因表达可根据本发明的单链核酸分子的结构受到抑制。推测本发明单链核酸分子的基因表达抑制效果由类似于RNA干扰的现象所引起。然而，要注意的是，本发明 中基因表达的抑制不受RNA干扰的限定或约束。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1示出说明本发明单链核酸分子的实例的示意图。
[0024]图2示出说明本发明单链核酸分子的另一实例的示意图。
[0025]图3示出说明本发明单链核酸分子的其它实例的示意图。
[0026]图4为示出本发明实施例中GAPDH基因的相对表达水平的图。
[0027]图5示出参考例中使用的ssRNA。
[0028]图6为示出参考例中GAPDH基因的相对表达水平的图。
[0029]图7为示出参考例中TGF-β I基因的相对表达水平的图。
[0030]图8为示出参考例中LAMA基因的相对表达水平的图。
[0031 ]图9为示出参考例中LMNA基因的相对表达水平的图。
[0032]图10示出参考例中使用的ssRNA。
[0033]图11为示出参考例中GAPDH基因的相对表达水平的图。
[0034]图12为示出本发明实施例中稳定表达萤火虫荧光素酶(pGL3Luc)的乳腺癌细胞系MCF-7中萤火虫荧光素酶基因表达抑制效果(荧光素酶的相对活性)的图。
【具体实施方式】
[0035]除非另有说明，否则本说明书中使用的术语意指其在本领域通常所指的含义。
[0036]1.ssPN 分子
[0037]如上所述，本发明的单链核酸分子为包含抑制靶基因表达的表达抑制序列且包含区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xe)的单链核酸分子，其中前述连接子区域(Lx)连接在前述区域(X)和前述区域(Xe)之间，前述区域(Xe)与前述区域(X)互补，前述区域(X)和前述区域(Xe)的至少之一包含前述表达抑制序列，前述连接子区域(Lx)包含源自氨基酸的原子团。
[0038]在本发明中，"靶基因的表达抑制〃意指，例如抑制前述靶基因的表达。实现前述抑制的机理不特别限定，并可为例如下调或沉默。前述靶基因的表达抑制可通过例如源自靶基因的转录产物量的降低；前述转录产物活性的降低；或由前述靶基因产生的翻译产物量的降低；前述翻译产物活性的降低等来证实。前述蛋白质可为例如成熟蛋白质或者在进行加工或翻译后修饰之前的前体蛋白质等。
[0039]本发明的单链核酸分子在下文中还可称作本发明的"ssPN分子〃。本发明的ssPN分子可用于抑制例如体内或体外靶基因的表达，并且还可称作"抑制靶基因表达用ssPN分子〃或〃靶基因表达抑制剂〃。此外，本发明的ssPN分子可通过例如RNA干扰抑制前述靶基因的表达，并且还可称作〃RNA干扰用ssNP分子〃、〃诱导RNA干扰用ssPN分子〃或〃RNA干扰剂或RNA干扰-诱导剂〃。本发明还可抑制例如诸如干扰素诱导的副反应。
[0040]在本发明的ssPN分子中，5’端和3’端彼此不连接。因此，本发明的ssPN分子还可称作"线性单链核酸分子"。
[0041]在本发明的ssPN分子中，前述表达抑制序列为在本发明的ssPN分子体内或体外引入细胞时显示例如抑制前述靶基因表达的活性的序列。前述表达抑制序列不特别限定，并可根据靶基因的种类而适当设定。作为前述表达抑制序列，例如，由siRNA引起的RNA干扰中涉及的序列可作为适当使用。一般而言，RNA干扰为其中长的双链RNA (dsRNA)在细胞中被Dicer切割产生由约19至21个碱基对构成且具有突出的3’端的双链RNA(siRNA:小干扰RNA)，且单链RNA之一结合至靶mRNA以降解前述mRNA，从而抑制mRNA的翻译的现象。作为结合至前述靶mRNA的前述siRNA的单链RNA的序列，例如，已报道了用于各种靶基因的各种序列。在本发明中，例如，前述siRNA的单链RNA的序列可用作前述表达抑制序列。 [0042]应注意的是，本发明的焦点不在于用于前述靶基因的前述表达抑制序列的序列信息，而是在于例如由于细胞中的前述表达抑制序列而允许前述靶基因表达抑制活性功能的核酸分子的结构。因此，在本发明中，不仅可使用在提交本申请时已知的siRNA的单链RNA序列，而且还可使用未来将被识别的序列，例如作为前述表达抑制序列。
[0043]前述表达抑制序列与前述靶基因的预设区域例如优选至少90%互补，更优选95%互补，更加优选98%互补，并特别优选100%互补。当满足这种互补性时，例如可充分减少脱祀效应(off-target effect)。
[0044]作为具体实例，当靶基因为GAPDH基因时，例如，SEQ ID NO: 5所示的19个碱基长的序列可用作上述表达抑制序列。当靶基因为TGF-β I时，例如，SEQ ID NO: 15所示的21个碱基长的序列可用作上述表达抑制序列；当靶基因为LAMAl基因时，例如SEQ ID NO: 16所示的19个碱基长的序列可用作上述表达抑制序列；当靶基因为LMNA基因时，例如，SEQ IDNO: 17所示的19个碱基长的序列可使用。
[0045]5，-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3’ (SEQ ID NO:5)
[0046]5’ -AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3’ (SEQ ID NO:15)
[0047]5，-AUUGUAACGAGACAAACAC-3，(SEQ ID NO: 16)
[0048]5’ -UUGCGCUUUUUGGUGACGC-3’ (SEQ ID NO: 17)
[0049]推测例如通过RNA干扰实现通过本发明的ssPN分子的前述靶基因表达抑制。然而，应注意的是，本发明决不受限于该机理。不像所谓的siRNA，例如，本发明的ssPN分子不以由两个单链RNA构成的dsRNA的形式引入细胞等,并且不总是必须切出(cleave out)细胞中的前述表达抑制序列。因此，可以说，例如本发明的ssPN分子显示RNA干扰样功能(RNA interference-like funct1n)。
[0050]本发明的ssPN分子可抑制例如副反应如体内干扰素诱导并显示优异的耐核酸酶性。
[0051]各前述连接子区域可仅由例如具有前述非核苷酸结构的一个(或多个)非核苷酸残基构成，或可包含具有前述非核苷酸结构的一个(或多个)非核苷酸残基和一个(或多个)核苷酸残基。
[0052]在前述连接子区域中，在前述“源自氨基酸的原子团”不特别限定的同时，其例如为由下式(IA)表示的原子团。
[0053]
【权利要求】
1.一种单链核酸分子，其包括抑制靶基因表达的表达抑制序列，并包括区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xe)，其中 所述连接子区域(Lx)连接在所述区域(X)和所述区域(Xe)之间， 所述区域(Xe)与所述区域(X)互补， 所述区域(X)和所述区域(Xe)的至少之一包含所述表达抑制序列，和 所述连接子区域(Lx)包含源自氨基酸的原子团。
2.根据权利要求1所述的单链核酸分子，其中所述连接子区域(Lx)由下式(I)表示:
3.根据权利要求2所述的单链核酸分子，其中，在式(I)中， A包括选自由链式原子团、脂环式原子团和芳族性原子团组成的组的至少之一，各所述原子团可以进一步具有或可以不进一步具有取代基或保护基。
4.根据权利要求1至3任一项所述的单链核酸分子，其中所述氨基酸为天然氨基酸或人工氨基酸。
5.根据权利要求1至3任一项所述的单链核酸分子，其中所述氨基酸为构成蛋白质的氨基酸。
6.根据权利要求1至3任一项所述的单链核酸分子，其中所述氨基酸为甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸、β -丙氨酸、1-氨基-2-羧基环戊烷或氨基苯甲酸，其任选地进一步具有取代基或保护基。
7.根据权利要求1至6任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(X)的碱基数(X)与所述5’侧区域(Xe )的碱基数(Xe)满足下式(3)或(5)的条件:
X>Xc...(3)
X = Xe...(5)。
8.根据权利要求7所述的单链核酸分子，其中所述区域(X)的碱基数(X)与所述5’侧区域(Xe)的碱基数(Xe)满足下式(11)的条件:
X-Xc = 1、2 或 3...(11)。
9.根据权利要求1至8任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(Xe)的碱基数(Xe)为19至30。
10.根据权利要求1至9任一项所述的单链核酸分子，其中所述单链核酸分子进一步包括区域(Y)和区域(Yc)，其中所述区域(Yc)与所述区域(Y)互补，内部区域(Z)由彼此连接的所述区域⑴和所述区域⑴构成。
11.根据权利要求10所述的单链核酸分子，其中所述单链核酸分子进一步包括连接子区域(Ly)，所述连接子(Ly)连接在所述区域(Y)和所述区域(Yc)之间。
12.根据权利要求11所述的单链核酸分子，其中所述连接子区域(Ly)由下式(I)表示:
13.根据权利要求12所述的单链核酸分子，其中所述区域(Xe)和所述区域(X)与所述由式(I)表示的连接子区域(Lx)的结构的连接，和 所述区域(Yc)和所述区域(Y)与所述由式(I)表示的连接子区域(Ly)的结构的连接各自满足下列条件(1)-(4)中任一项: 条件⑴:所述区域(Xe)和(X)分别经-OR2-和-OR1-连接至所述式(I)的结构；和 所述区域(Yc)和(Y)分别经-OR1-和-OR2-连接至所述式(I)的结构， 条件⑵: 所述区域(Xe)和(X)分别经-OR2-和-OR1-连接至所述式(I)的结构；和 所述区域(Yc)和(Y)分别经-OR2-和-OR1-连接至所述式(I)的结构， 条件⑶: 所述区域(Xe)和(X)分别经-OR1-和-OR2-连接至所述式(I)的结构；和 所述区域(Yc)和(Y)分别经-OR1- 和-OR2-连接至所述式(I)的结构， 条件⑷: 所述区域(Xe)和(X)分别经-OR1-和-OR2-连接至所述式(I)的结构；和 所述区域(Yc)和(Y)分别经-OR2-和-OR1-连接至所述式(I)的结构。
14.根据权利要求2至13任一项所述的单链核酸分子，其中，在式(I)中，L1为聚醚链，和所述聚醚链为聚乙二醇。
15.根据权利要求2至14任一项所述的单链核酸分子，其中，在式(I)中，L1的原子数(η)和L2的原子数(m)的合计(m+n)在O至30的范围内。
16.根据权利要求2至15任一项所述的单链核酸分子，其中所述式(I)的结构为下式(1-1)至(1-4)的任一，在下式中，η为0-30的整数和m为0-30的整数
17.根据权利要求16所述的单链核酸分子，其中，在式(1-1)中，η= 11且m= 12。
18.根据权利要求16所述的单链核酸分子,其中,在式(1-1)中，n= 5且m = 4。
19.根据权利要求16所述的单链核酸分子,其中,在式(1-4)中，n= 5且m = 4。
20.根据权利要求7至19任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(X)的碱基数(X)、所述区域(Y)的碱基数(Y)、所述区域(Xe)的碱基数(Xe)和所述区域(Yc)的碱基数(Yc)满足下式(2)的条件:
Z ≤ Xc+Yc...(2)。
21.根据权利要求7至20任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(X)的碱基数(X)、所述区域(Xe)的碱基数(Xe)、所述区域(Y)的碱基数(Y)和所述区域(Yc)的碱基数(Yc)满足下列条件(a)至(d)的任一项: (a)满足下式(3)和⑷的条件；
X>Xc...(3)Y= Yc...(4) (b)满足下式(5)和(6)的条件；
X = Xe...(5)
Y>Yc...(6) (c)满足下式(J)和⑶的条件；
X>Xc...(7)
Y>Yc...(8) (d)满足下式(9)和(10)的条件；
X = Xe...(9)
Y= Yc...(10)。
22.根据权利要去21所述的单链核酸分子，其中，在所述条件(a)至(d)中，所述区域(X)的碱基数(X)和所述区域(Xe)的碱基数(Xe)之差、所述区域(Y)的碱基数(Y)和所述区域(Yc)的碱基数(Yc)之差满足下列条件: (a)满足下式(11)和(12)的条件；
X-Xc = 1、2 或 3...(11)
Y-Yc = 0...(12) (b)满足下式(13)和(14)的条件；
X-Xc = 0...(13)
Y-Yc = 1、2 或 3...(14) (c)满足下式(15)和(16)的条件；
X-Xc = 1、2 或 3...(15)
Y-Yc = 1、2 或 3...(16) (d)满足下式(17)和(18)的条件；
X-Xc = 0...(17)
Y-Yc = 0...(18)。
23.根据权利要求7至22任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(Xe)的碱基数(Xe)为 1 至 11。
24.根据权利要求23所述的单链核酸分子，其中所述区域(Xe)的碱基数(Xe)为I至7。
25.根据权利要求23所述的单链核酸分子，其中所述区域(Xe)的碱基数(Xe)为I至3。
26.根据权利要求7至25任一项所述的单链核酸分子，其中所述区域(Yc)的碱基数(Yc)为 I 至 11。
27.根据权利要求26所述的单链核酸分子，其中所述区域(Yc)的碱基数(Yc)为I至7。
28.根据权利要求26所述的单链核酸分子，其中所述区域(Yc)的碱基数(Yc)为I至3。
29.根据权利要求1至28任一项所述的单链核酸分子，其中所述单链核酸分子包括至少一种修饰的残基。
30.根据权利要求1至29任一项所述的单链核酸分子，其进一步包括标记物质。
31.根据权利要求1至30任一项所述的单链核酸分子，其进一步包括稳定同位素。
32.根据权利要求1至31任一项所述的单链核酸分子，其为RNA分子。
33.根据权利要求1至32任一项所述的单链核酸分子，其中所述单链核酸分子的总碱基数为50以上。
34.根据权利要求1至33任一项所述的单链核酸分子，其中所述基因的表达受RNA干扰的抑制。
35.一种组合物，其用于抑制靶基因表达，所述组合物包括: 根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子。
36.一种药物学组合物，其包括: 根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子。
37.根据权利要求36所述的药物学组合物，其用于治疗炎症。
38.一种用于抑制 靶基因表达的方法，其包括使用根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子。
39.根据权利要求38所述的方法，其包括下列步骤: 将所述单链核酸分子施用至细胞、组织或器官。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述单链核酸分子在体内或体外施用。
41.根据权利要求38至40任一项所述的方法，其中所述基因的表达受RNA干扰的抑制。
42.一种诱导抑制靶基因表达的RNA干扰的方法，其包括使用根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子。
43.根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子用于抑制靶基因表达的用途。
44.根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子用于诱导RNA干扰的用途。
45.—种核酸分子,其用于治疗疾病,其中 所述核酸分子为根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子，和 所述单链核酸分子包括抑制引起所述疾病的基因的表达的序列作为表达抑制序列。
46.一种单体，其用于核酸分子合成，并具有下式(II)的结构:
47.根据权利要求46所述的单体，其中所述式(II)的结构为下式(I1-1)至式(ΙΙ-4)的任一，在下式中，η为O-30的整数，和m为O-30的整数:
48.根据权利要求47所述的单体,其中,在式(I1-1)中，n= 11和m= 12。
49.根据权利要求47所述的单体,其中,在式(I1-1)中，η= 5和m = 4。
50.根据权利要求47所述的单体,其中，在式(I1-4)中，η= 5和m = 4。
51.根据权利要求46至50任一项所述的单体，其中，在式(II)中，L1为聚醚链，所述聚醚链为聚乙二醇。
52.根据权利要求46至51任一项所述的单体，其中，在式(II)中，L1的原子数(η)和L2的原子数(m)的合计(m+n)在O至30的范围内。
53.根据权利要求46至52任一项所述的单体，其进一步包括标记物质。
54.根据权利要求46至53任一项所述的单体，其进一步包括稳定同位素。
55.根据权利要求46至54任一项所述的单体，其用于自动核酸合成。
56.—种核酸分子的生产方法,其包括使用根据权利要求46至55任一项所述的单体。
57.根据权利要求56所述的生产方法，其中所述核酸分子为根据权利要求1至34任一项所述的单链核酸分子。
【文档编号】C07C225/06GK104039961SQ201280066290
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年12月29日 优先权日:2012年1月7日
【发明者】大木忠明, 铃木宽, 滨崎智洋, 青木绘里子 申请人:株式会社博纳克