丝聚合蛋白原c末端结构域特异性抗体及其用途
【专利摘要】本发明提供抗体、以及利用该抗体的丝聚合蛋白基因异常的检测方法及用于该检测的试剂盒，所述抗体是对人丝聚合蛋白原基因的C末端结构域为特异性的抗体，该C末端结构域是包含序列号1所记载的氨基酸序列的肽或其突变体。
【专利说明】丝聚合蛋白原C末端结构域特异性抗体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明提供丝聚合蛋白原(Profilaggrin)C末端结构域特异性抗体及其用途，特别是提供使用该抗体的丝聚合蛋白(Filaggrin)基因异常的检测方法及用于该检测的试剂盒。
【背景技术】
[0002]表皮颗粒层的角蛋白纤维在角化时与被称为丝聚合蛋白的蛋白质结合而凝聚，从而建立被称为“角蛋白模型”的特异性形态。丝聚合蛋白的前体物质被称为丝聚合蛋白原，蓄积于颗粒层的透明角质颗粒中。丝聚合蛋白原具有由连续10个~12个丝聚合蛋白分子连接而成的丝聚合蛋白重复介于N末端结构域与C末端结构域之间的结构(图1)。在角化的同时这些结构域等被切下，生成单个的丝聚合蛋白。最终丝聚合蛋白被分解，由此产生天然保湿因子(natural moisturizing factor ；NMF)。已知NMF的构成成分是氨基酸及其派生物，它们是皮肤保湿所必须的因子(Horii I, Kawasaki K, Koyama J, et al.J Dermatol.1983 ；10:25-33)。
[0003]丝聚合蛋白异常引起NMF降低，其结果导致角质层的保水能力降低。然而，最近的研究显示，丝聚合蛋白的基因异常是鱼鳞病、部分特应性皮炎的原因(SandilandsA, Terron-Kwiatkowski A, Hull PR, et al.Nat Genet2007 ；39:650-654)，丝聚合蛋白异常不仅导致由NMF降低引起的角质层的保水能力的降低，也直接影响屏障功能这样的令人惊讶的结果已经明确。
[0004]由于角质层的屏障功能异常而引发上述疾病的事实，在平成22年的日本皮肤科学会志中报告的特应性皮炎的治疗指南(加藤则人，卜一性皮膚炎Θ治療力'^卜'' 9 4 i正P治療(特应性皮炎的治疗指南与正确治疗)”，日本皮肤科学会志2010，120 (13) ,2564-2565)中被如下表达:“对于特应性皮炎的病状，‘伴随着由表皮、尤其是角质层异常引起的皮肤干燥和屏障功能异常这样的皮肤生理学的异常’。”
[0005]其后的研究中估计，丝聚合蛋白的基因异常在欧洲约为一半，在日本则为3成左右。由这点来看，虽然特应性皮炎是多因性的疾病的事实已经被充分理解，但判断丝聚合蛋白基因有无异常在确定今后的治疗方针上是非常重要的。另外，对于没有出现特应性皮炎病症的受试者，只要发现丝聚合蛋白基因的异常，就可以预测将来患特应性皮炎的可能性闻。
[0006]然而，关于丝聚合蛋白基因的异常进行了许多报告。特别是异常不是存在于特定的部位，而是几乎全部区域存在突变(图1)。另外，据说不仅丝聚合蛋白基因自身，而且即使作为其前体的丝聚合蛋白原基因的C末端区域的一部分突变，也会变得难以产生丝聚合蛋白重复(Sandilands A, Terron-Kwiatkowski A, Hull PR, et al.Nat Genet2007 ；39:650-654)。因此，为了弄清楚丝聚合蛋白有无异常，需要对全部丝聚合蛋白原基因进行测序，但即使利 用最近的基因分析技术，丝聚合蛋白原基因的分析中也伴随着许多困难。
[0007]例如，关于丝聚合蛋白原基因中最重要的区域丝聚合蛋白重复，各个重复略微不同，必须将它全部正确地读出。另外，丝聚合蛋白基因的异常每个民族不同。其结果是，由这些各种各样的部位的各种各样的每个重复的变化、乃至民族性差异中，断定I个碱基的不同是突变是非常困难的。因此，现状是能够分析丝聚合蛋白原基因异常的设施在世界中也是有限的。
[0008]现有技术文献
[0009]非专利文献
[0010]非专利文献I:Horii I, Kawasaki K, Koyama J, et al.J Dermatol.1983 ; 10:25-33
[0011]非专利文献2:Sandilands A, Terron-Kwiatkowski A, Hull PR, et al.NatGenet2007 ；39:650-654
[0012]非专利文献3:加藤则人“ 7卜C 一性皮膚炎O治療力' ^ F 9 4 i正P治療(特应性皮炎的治疗指南与正确治疗)”，日本皮肤科学会志2010，120(13)，2564-2565
【发明内容】
[0013]发明要解决的课题
[0014]本发明的课题在于，提供新的丝聚合蛋白原C末端结构域特异性抗体、以及利用该抗体的丝聚合蛋白基因 异常的检测方法及用于该检测的试剂盒。
[0015]用于解决课题的方法
[0016]本
【发明者】发现，利用C末端结构域特异性抗体，能够无创且简便地检测丝聚合蛋白基因异常，从而完成了本发明。
[0017]所以，本申请包含以下发明。
[0018](I)抗体，是对人丝聚合蛋白原基因的C末端结构域为特异性的抗体，该C末端结构域是包含序列号I所记载的氨基酸序列的肽，或者是包含该氨基酸序列的I个或数个氨基酸缺失或被替换了的氨基酸序列、或对该氨基酸序列添加了 I个或数个氨基酸的氨基酸序列的肽。
[0019](2)用于检测丝聚合蛋白基因的异常的方法，该方法包括以下工序:利用(I)的抗体，检测对象的皮肤试样中有无该C末端结构域的工序；以及在没有检测到该C末端结构域的情况下，判断为该对象的丝聚合蛋白基因存在异常的工序。
[0020](3)根据⑵所述的方法，其中，在没有检测到所述C末端结构域的情况下，判断为所述对象患有特应性皮炎、或患特应性皮炎的可能性高。
[0021](4)根据(3)所述的方法，其中，所述皮肤试样是通过胶带剥离而得的角质层试样。
[0022](5)用于检测丝聚合蛋白基因的异常的试剂盒，该试剂盒包含(I)的抗体。
[0023]发明的效果
[0024]如果丝聚合蛋白原基因的中途发生突变，则无法产生接着突变之后的丝聚合蛋白重复、以及丝聚合蛋白原的C末端结构域。根据本发明，可以利用该结构域特异性抗体简便地检测出皮肤试样中有无C末端结构域，从而可以简便地检测出有无丝聚合蛋白基因异常。进而由于丝聚合蛋白原基因异常可成为特应性皮炎的原因，因此，通过利用本发明的抗体，可以无创且简便地进行特应性皮炎的诊断或预测。【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1:显示具有12个丝聚合蛋白重复的丝聚合蛋白原基因(Chrlq21.3/人)的构成和该基因的突变位置的模式图。
[0026]图2:丝聚合蛋白原基因没有异常的正常皮肤(正常(+/+))以及特应性皮炎的皮肤(AD (+/+))的免疫染色图。分别左侧是被苏木精-曙红染色的结果(HE染色)，右侧是被丝聚合蛋白原C末端结构域特异性抗体和生色底物DAB (3，3’- 二氨基联苯胺)染色的结果(FLG-C)。
[0027]图3:丝聚合蛋白原基因(S2889X ；K4022X)存在异常的特应性皮炎的皮肤的免疫染色图。分别左侧是被苏木精曙红染色的结果(HE染色)，右侧是被丝聚合蛋白原C末端结构域特异性抗体和生色底物DAB (3，3’ - 二氨基联苯胺)染色的结果(FLG-C)。
【具体实施方式】
[0028]本发明在第一观点中提供抗体，是对人丝聚合蛋白原基因的C末端结构域为特异性的抗体，该C末端结构域是包含序列号I所记载的氨基酸序列的肽或其突变体。在此，丝聚合蛋白大体划分有I型和II型，在本说明书中使用的情况，术语“丝聚合蛋白原”是指I型的丝聚合蛋白。丝聚合蛋白原具有由连续10个~12个丝聚合蛋白分子连接而成的丝聚合蛋白重复介于N末端结构域与C末端结构域之间的结构(图1)。将包含157个氨基酸的C末端结构域的全长序列不于序列号2。
[0029]序列号I所记载的氨基酸序列，是在丝聚合蛋白原的C末端结构域中，与II型的丝聚合蛋白原、以及丝聚合蛋白原类似分子Hornerin的任一者均不显示同源性的I型特异性序列。因此，对该氨基酸序列为特异性的抗体与这些类似蛋白质不发生交叉反应。
[0030]上述突变体，只要以其作为抗原而得到的抗体为不识别与皮肤中的具有与序列号I所记载的氨基酸序列类似的序列的肽、且对人丝聚合蛋白原基因的C末端结构域为特异性的抗体，就可以是任何突变体，例如可以是包含序列号I所记载的氨基酸序列的I个或数个氨基酸缺失或被替换了的氨基酸序列、或对该氨基酸序列添加了 I个或数个氨基酸的氨基酸序列的妝。
[0031]虽然不意味着进行限定，但上述肽可以按照常规方法通过化学合成而获得。本发明的抗体通过对哺乳动物例如大鼠、小鼠、兔等施与作为抗原的该肽、优选使该肽与适当载体结合而得的抗原复合体而获得。关于抗原或抗原复合体相对于每只动物的施与量，不使用佐剂时为0.1~lOOmg，使用佐剂时为10~1000 μ g，但不限定于此。作为佐剂，可以举出弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂等。
[0032]免疫主要通过注射到静脉内、皮下或腹腔内等来进行。另外，对免疫的间隔没有特别限定，以数天~数周间隔、优选2~5周间隔进行，进行I~10次、优选2~5次免疫。然后，优选从最终免疫日起6~60天后，采用蛋白质印迹法、酶免疫测定法(ELISA或EIA)、放射性免疫测定法(RIA)等测定抗体效价，在显示出最大的抗体效价的日子采血，获得抗血清。
[0033]多克隆抗体的纯化，可以通过利用结合有抗原肽的柱的亲和色谱法、其他本领域技术人员周知的纯化方法例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、高效液相色谱法等进行纯化。另外，本发明的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以利用具有序列号I所记载的氨基酸序列的肽或其突变体，依据现有的方法制成。
[0034]本发明在第二观点中提供用于检测丝聚合蛋白基因的异常的方法，该方法包括以下工序:利用上述丝聚合蛋白原C末端结构域特异性抗体，检测对象的皮肤试样中有无该C末端结构域的工序；以及在没有检测到该C末端结构域的情况下，判断为该对象的丝聚合蛋白基因存在异常的工序。在本说明书中使用的情况，所谓“丝聚合蛋白基因的异常”，是指阻碍丝聚合蛋白原的C末端结构域的形成的丝聚合蛋白基因的I个或多个突变。作为该突变的例子，有以位于丝聚合蛋白原第2889号的丝氨酸终止的突变S2889X、以位于第4022号的赖氨酸终止的突变K4022X等(图1)。
[0035]丝聚合蛋白原基因异常与特应性皮炎有关。所以，在本发明的方法中，没有检测到上述C末端结构域的情况，可以判断为上述对象患有特应性皮炎、或患特应性皮炎的可能性高。
[0036]有无C末端结构域的检测通过本领域技术人员公知的免疫学方法、例如免疫测定(ELISA、RIA等)来实施。皮肤试样可以从对象的臂、腿、脸等通过任意方法采取。该对象是疑似患有由丝聚合蛋白基因异常引起的皮肤疾病、特别是特应性皮炎的哺乳类，优选为人。对皮肤试样的采取方法没有特别限定，但胶带剥离法由于简便、无创，因而优选。所谓胶带剥离，是通过在皮肤表层贴附胶带片、剥离，而使皮肤角质层附着于该剥离的胶粘胶带，从而采取角质层试样的方法。如果利用胶带剥离法，则可以简便地获得包含丝聚合蛋白原基因的皮肤试样，从而无创地检测丝聚合蛋白基因异常。
[0037]胶带剥离的优选方法如下进行:首先，用例如乙醇等净化皮肤的表层，除去皮脂、污垢等，将切成适当的大小(例如5X5cm)的胶带片轻轻地放在皮肤表面上，对胶带整体施加均等的力而压平，其后，用均等的力剥掉胶带。胶带可以是市售的玻璃纸胶带等，例如可以使用Scotch Superstr ength Mailing Tape (3M社制)、玻璃纸胶带(七口 f 一 7° (注册商标)；二々株式会社)等。
[0038]为了从进行了胶带剥离的角质层中提取可溶性成分，可以使用含有非离子性的表面活性剂的中性~弱碱性的缓冲液，例如以下所述的缓冲液，但不限定于此=10mMTrisHCl+0.14M NaCl+0.1% Triton X100]。可以通过将附着了角质层的胶带用剪刀等切细，转移到Eppendorf管等容器中，在少量上述缓冲液中浸溃，进行颠倒搅拌，由此高效地提取可溶性成分。将提取出的可溶性成分进行使用本发明的抗体的免疫测定等，判断有无丝聚合蛋白原基因异常。
[0039]本发明在第三观点中提供用于检测丝聚合蛋白基因的异常的试剂盒，其中包含上述抗体。在该试剂盒中，本发明的抗体可以包含在容器中。该试剂盒还可以包含实施上述检测方法所需的试剂，例如采用ELISA法检测异常的情况下，可以包含酶复合体、底物溶液、停止液、洗涤液、酶复合体稀释液、分析缓冲液、对照、样品稀释液、偶联物等，并且还可以包含对该方法的步骤等进行说明的操作说明书。
[0040]下面，列举出具体例更具体地说明本发明。此外，本发明不限定于此。
[0041]实施例
[0042]免疫组织化学染色
[0043]准备丝聚合蛋白原基因没有观察到异常的正常皮肤以及特应性皮炎的皮肤切片、和丝聚合蛋白原基因突变了的特应性皮炎(S2889X或K4022X)的皮肤切片。该皮肤切片的免疫组织化学染色通过 Kamata et al (J.B1l.Chem., Vol.284, Issuel9, 12829-12836, May8, 2009)中记载的方法进行。丝聚合蛋白原C末端结构域特异性抗体通过将具有CKASAFGKDHPRYYATYINKDP的氨基酸序列的合成肽作为免疫原免疫兔而得到(Sigma社制)。
[0044]将丝聚合蛋白原基因没有观察到异常的正常皮肤以及特应性皮炎的皮肤进行苏木精曙红染色而得的结果、和用丝聚合蛋白原C末端结构域特异性抗体和生色底物DAB(3，3’-二氨基联苯胺)染色而得的结果示于图2。丝聚合蛋白原局部存在于颗粒层，丝聚合蛋白原基因没有观察到异常的特应性皮炎的皮肤与正常皮肤相比，颗粒层中的DAB染色的生色降低(参照FLG-C的免疫染色图)。即，由图2的结果可知，即使在丝聚合蛋白原基因没有异常的情况下，在特应性皮炎的皮肤中丝聚合蛋白的表达也降低。
[0045]接着，对于丝聚合蛋白原基因之中在S2889X与K4022X有突变的特应性皮炎的皮肤进行免疫染色。与图2的结果同样地，将对各皮肤进行苏木精曙红染色而得的结果(左侧:HE染色)、用丝聚合蛋白原C末端结构域特异性抗体和生色底物DAB(3，3’ - 二氨基联苯胺)染色而得的结果(右侧=FLG-C)示于图3。与图2的结果不同，颗粒层没有被DAB染色。即可知，具有上述突变的特应性皮炎的皮肤中由于该突变而未形成丝聚合蛋白原C末端。
[0046]由以上结果，利用本发明的丝聚合蛋白原基因C末端结构域特异性抗体，可以无需通过测序逐一确认而简便地检测出 许多已知的丝聚合蛋白基因有无异常，进而可以对于对象的皮肤是否患有特应性皮炎、或患特应性皮炎的可能性是否高进行判断。
【权利要求】
1.抗体，是对人丝聚合蛋白原基因的C末端结构域为特异性的抗体，该C末端结构域是包含序列号I所记载的氨基酸序列的肽，或者是包含该氨基酸序列的I个或数个氨基酸缺失或被替换了的氨基酸序列、或对该氨基酸序列添加了 I个或数个氨基酸的氨基酸序列的肽。
2.用于检测丝聚合蛋白基因的异常的方法，该方法包括以下工序:利用权利要求1的抗体，检测对象的皮肤试样中有无该C末端结构域的工序；以及在没有检测到该C末端结构域的情况下，判断为该对象的丝聚合蛋白基因存在异常的工序。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，在没有检测到所述C末端结构域的情况下，判断为所述对象患有特应性皮炎、或患特应性皮炎的可能性高。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述皮肤试样是通过胶带剥离而得的角质层试样。
5.用于检测丝聚合 蛋白基因的异常的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的抗体。
【文档编号】C07K16/18GK104039827SQ201280066201
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年11月8日 优先权日:2011年11月9日
【发明者】日比野利彦, 山本真实, 高木雅哉, 坂部纯一, 户仓新树 申请人:株式会社资生堂