专利名称：一种将含巯基肽从树脂上切落的试剂及切落方法
技术领域：
本发明涉及一种切肽试剂，具体是指一种将含巯基肽从树脂上切落的试剂；另外， 本发明还涉及将含巯基多肽从树脂上的切落的方法，本方法适合于含巯基多肽的工业化生产。
背景技术：
目前，多肽合成主要分为化学合成与酶促肽键合成。化学合成又分为液相多肽合 成与固相多肽合成。近年来固相多肽合成占主导地位，这主要是由于它运用了洗涤、过滤等 分离技术来纯化反应中间体和最终产物。传统的液相多肽合成既麻烦又费时，而固相多肽 合成作为一种日趋成熟的技术越来越受到关注。固相多肽合成一般以树脂为起始原料，逐个连接氨基酸得到多肽树脂，为了防止 副反应的发生，通常参加反应的氨基酸侧链都是被保护的。而反应物的羧基端是游离的，并 且在反应之前必须活化。现阶段本领域大多采用固相合成法，其优点主要表现在最初的反 应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自 动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。在固相多肽合成中，氨基酸的极性以及空间位阻和缩合位置都会对多肽的合成难 易程度造成影响。一般情况下，在缩合位置相同的条件下，氨基酸极性越大，缩合难度越小； 空间位阻越大，缩合难度越大；氨基酸极性越小，缩合难度越大；空间位阻越小，缩合难度越 小。因此在多肽合成过程中，要充分综合考虑氨基酸的极性以及空间位阻和缩合位置。在缩 合反应过程中，反应时间和反应温度决定着最终产物的纯度和收率。反应时间过长，氨基酸链 可能从固相树脂中脱落，导致收率降低。反应时间过短，又不能达到反应终点，导致最终产物 纯度降低。反应温度过低，也会造成反应到不了终点，反应温度过高，较易发生消旋等副反应。目前，在我国固相多肽合成方法有较多应用，已在国内上市的多肽药物中，有许 多是含巯基的多肽药物通常均采用固相多肽合成方法生产。如醋酸奥曲肽(英文名 Octreotide)、生长抑素(英文名Somatostatin)、依替巴肽(英文名Eptifibatid)、特利 加压素(英文名Terlipressin)、鲑降钙素(英文名=CalcitoninSalmon)、阿托西班(英文 名Atosiban)、缩宫素(英文名0xytocin)、去氨加压素(英文名desmopressin)、卡贝缩 宫素(英文名=Carbetocin)等。如采用固相合成方法进行生产，则在缩合反应完成后，均 需使用“切肽试剂”将肽链从树脂上切落下来得到粗肽即还原型粗肽。然后，再将切落的还 原型粗肽，进行氧化环合反应、分离纯化、冷冻干燥等工艺过程，得到药用多肽。然而，这些含巯基的多肽从树脂上的切落时，所采用的“切肽试剂”大多采用TFA/ EDT/TIS/H20等混合溶液(简称EDT法切肽)，其中EDT (中文名为乙二硫醇)是一种无国 内生产的化学试剂，其价格昂贵，且反应时气味恶臭。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种将含巯基多肽从树脂上切落的试剂，该试剂应具有原料来源方便、价格低廉、切肽收率高的特点。本发明还提供了一种制备上述含巯基多肽从树脂上切落的试剂的方法，该方法具 有得率高、无污染、简单实用的特点。
本发明采用的技术方案是一种将含巯基多肽从树脂上切落的试剂，包括以下重 量份的试剂三氟乙酸85-95份；三异丙基硅烷1_5份；巯基烷酸1_4份；苯酚1_4份； 水1-2份。所述的将含巯基多肽从树脂上切落的试剂，包括以下重量份的试剂三氟乙酸85_93份；三异丙基硅烷2_5份；巯基烷酸2_4份；苯酚1_3份；水 1-2 份。所述的将含巯基多肽从树脂上切落的试剂，包括以下重量份的试剂三氟乙酸90份；三异丙基硅烷4份；巯基烷酸3份；苯酚2份；水1份。所述的巯基烷酸为巯基丙酸、2-巯基丙酸、3-巯基丙酸、β -巯基丙酸、巯基乙酸 中的任意一种。作为本发明的进一步改进，所述的巯基烷酸也可以由巯基烷酸盐代替，即巯基丙 酸、2-巯基丙酸、3-巯基丙酸、β -巯基丙酸、巯基乙酸的钠盐、铵盐、钙盐。所述的将含巯基多肽从树脂上切落的方法，按以下步骤进行1)将上述比例的三氟乙酸、三异丙基硅烷、巯基烷酸、苯酚和水混合均勻，冷却至 0-15°C ；2)在含有巯基多肽的树脂中，加入上述切肽试剂；3)将上述溶液在室温下搅拌1-3小时，用砂芯漏斗过滤除去树脂，树脂用50份三 氟乙酸分二次洗涤。4)在上述得到的滤液与洗涤液中，加入500-1000份冷乙醚，0_10°C静置0. 5-5小 时；5)过滤上述制备得到的白色沉淀，并收集该沉淀；6)将收集到的沉淀用200份乙醚分数次洗涤后，真空干燥至恒重，得到多肽粗品。所述的将含巯基多肽从树脂上切落的方法，步骤2)中加入含巯基多肽的树脂中 的切肽试剂，其温度不能高于20°C ；优选5°C。所述的将含巯基多肽从树脂上切落的方法，步骤4)中加入的冷乙醚温度在 0-10°C，用量为切肽试剂的5-10倍，沉淀30分钟以上。此处乙醚最佳采用无水乙醚，也可 采用甲基叔丁基醚等醚类溶剂。由于三氟乙酸溶液与乙醚的混合过程是一个放热过程，为避免含巯基肽遇高温破 坏，故沉淀用乙醚需低温。所述的将含巯基多肽从树脂上切落的方法，步骤5)中白色沉淀用漏斗过滤收集 或离心收集。所述的将含巯基多肽从树脂上切落的方法，步骤6)将上述收集得到的沉淀用乙 醚充分洗涤，除去“切肽试剂”及副产物。此处乙醚优选无水乙醚，也可采用丙酮、乙酸乙酯、 甲基叔丁基醚等溶剂。在真空条件下干燥至恒重，其中优选P2O5真空条件下干燥。本发明中，最后一步的裂解是固相合成中最重要的步骤，肽链上的许多侧链保护基，在用三氟乙酸处理时也被同时除去。此步反应中产生的烷基正离子会使有些氨基酸的 侧链烷基化，因而同样需要加入正离子清除剂如Tis，H2O,苯酚等。含巯基的多肽，如“-Cys (Trt)-，，从树脂上的切落时，通常采用的“切肽试剂”大多 含“乙二硫醇”，利用“乙二硫醇”的巯基(-SH)来保护Cys上的巯基(-SH)不被氧化，同时 也可清除正离子(Trt+)。目前，常用的切肽试剂是TFA/EDT/TIS/H20等混合溶液，其中乙二 硫醇(1)在三氟乙酸环境中会产生环硫乙烷(2)和硫化氢气体，所以此反应特别臭，给环保 带来很大的压力；此外，整个切肽反应的效果也不够理想。本发明采用巯基丙酸(英文名=Mercaptopropionic acid，分子式=C3H6O2S,分子 量106. 14)替代EDT。巯基丙酸(3)在三氟乙酸环境中会产生丙硫内酯(4)和水。该反应 是一个可逆反应，即丙硫内酯和水会开环成巯基丙酸。此反应过程中不会产生硫化氢气体，
大大减少了环保污染；同时切肽反应的效果也好。
OH+I^
十 H2。
SH ^^ OH HO
⑶ ⑷本发明的有益效果是由于乙二硫醇是一种国内无生产的化学试剂，其价格昂贵、 且反应时气味恶臭；本发明选用巯基丙酸代替现常用的乙二硫醇，不仅能降低生产成本，大 大减少了环保污染；同时还能提高切肽反应的效果。同时具有采购成本低、三废减少、粗肽 质量佳等特点，非常适合于含巯基多肽的工业化生产。本文所涉及的试剂之间的重量份均为体积份。以下通过表格形式将缩写对应的英文名和中文名进行详细说明
英文名中文名
EDTEthanedithiol乙二硫醇
TFATrifluoroacetic acd三氟醋酸
TISTriisopropylsilane三异丙基娃烧
MPAMercaptopropionic acid 巯基丙酸
MAAMercaptoacetic acid巯基乙酸
权利要求
一种将含巯基多肽从树脂上切落的试剂，包括以下重量份的试剂三氟乙酸85 95份；三异丙基硅烷1 5份；巯基烷酸1 4份；苯酚1 4份；水1 2份。
2.根据权利要求1所述的将含巯基多肽从树脂上切落的试剂，其特征在于包括以下 重量份的试剂三氟乙酸85-93份；三异丙基硅烷2-5份；巯基烷酸2-4份；苯酚1_3份；7K 1~2份。
3.根据权利要求1或2所述的将含巯基多肽从树脂上切落的试剂，其特征在于包括 以下重量份的试剂三氟乙酸90份；三异丙基硅烷4份；巯基烷酸3份；苯酚2份；水1份。
4.根据权利要求3所述的将含巯基多肽从树脂上切落的试剂，其特征在于所述的巯 基烷酸为巯基丙酸、2-巯基丙酸、3-巯基丙酸、β-巯基丙酸、巯基乙酸中的任意一种。
5.权利要求1所述的将含巯基多肽从树脂上切落的方法，按以下步骤进行1)将上述比例的三氟乙酸、三异丙基硅烷、巯基烷酸、苯酚和水混合均勻，冷却至 0-15°C ；2)在含有巯基多肽的树脂中，加入上述切肽试剂；3)将上述溶液在室温下搅拌1-3小时，用砂芯漏斗过滤除去树脂，树脂用50份三氟乙 酸分二次洗涤。4)在上述得到的滤液与洗涤液中，加入500-1000份冷乙醚，0-10°C静置0.5-5小时；5)过滤上述制备得到的白色沉淀，并收集该沉淀；6)将收集到的沉淀用200份乙醚分数次洗涤后，真空干燥至恒重，得到多肽粗品。
6.权利要求5所述的将含巯基多肽从树脂上切落的方法，所述步骤2)中加入含巯基多 肽的树脂中的切肽试剂，其温度不能高于20°C ；优选5°C。
7.权利要求6所述的将含巯基多肽从树脂上切落的方法，所述步骤4)中加入的冷乙醚 温度在0-10°C，用量为切肽试剂的5-10倍，沉淀30分钟以上。
8.权利要求7所述的将含巯基多肽从树脂上切落的方法，所述步骤5)中白色沉淀用漏 斗过滤收集或离心收集。
9.权利要求8所述的将含巯基多肽从树脂上切落的方法，所述步骤6)将上述收集得到 的沉淀用乙醚充分洗涤，除去多余的切肽试剂和杂质。
全文摘要
本发明涉及一种切肽试剂，具体是指一种将含巯基肽从树脂上切落的试剂；另外，本发明还涉及将含巯基多肽从树脂上的切落的方法，本方法适合于含巯基多肽的工业化生产。一种将含巯基多肽从树脂上切落的试剂，包括以下重量份的试剂三氟乙酸85-95份；三异丙基硅烷1-5份；巯基烷酸1-4份；苯酚1-4份；水1-2份。本发明的有益效果是由于乙二硫醇是一种国内无生产的化学试剂，其价格昂贵、且反应时气味恶臭；本发明选用巯基丙酸代替现常用的乙二硫醇，不仅能降低生产成本，大大减少了环保污染；同时还能提高切肽反应的效果。同时具有采购成本低、三废减少、粗肽质量佳等特点，非常适合于含巯基多肽的工业化生产。
文档编号C07K1/00GK101967179SQ20101027287
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月2日 优先权日2010年9月2日
发明者周又佳 申请人:周又佳