一种裸眼和荧光增强检测含巯基氨基酸荧光分子探针的合成及应用的制作方法【专利摘要】本发明涉及一种裸眼识别荧光增强型含巯基氨基酸荧光探针的制备方法和应用，具体为一种基于二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物的制备和检测巯基氨基酸的应用。本发明的荧光探针是以二氟化硼-二吡咯甲烷醛衍生物和硝基甲烷直接反应而合成，经过柱层析分析得到探针纯品。合成简便、反应条件温和、易于纯化、合成收率高。本发明所述的探针分子最大吸收波长在519nm，在50％乙腈水溶液中溶解性较好，光学性能稳定；探针分子随含巯基氨基酸的加入，吸收波长由519nm蓝移到506nm，荧光光谱在520nm处强度不断增强，最大增强150倍，同时相应的溶液颜色由粉色变为黄色。本发明克服了现有荧光探针对含巯基氨基酸的响应仅基于荧光强度变化的不足。本发明所述的探针分子灵敏度较高，，对含巯基氨基酸识别能力强，响应速度快，响应范围为0-1000μM，对Cys，GSH和Hcy巯基氨基酸的检测限分别为0.45μM，0.21μM和0.12μM，检测范围宽，检测下限低，使得该类型探针在生物化学、环境科学等领域具有重要的实际应用价值。【专利说明】一种裸眼和荧光增强检测含巯基氨基酸荧光分子探针的合成及应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及的是化学分析检测【
技术领域：
】，具体涉及一种裸眼及荧光增强检测含巯基氨基酸荧光分子探针的制备方法以及该荧光分子探针在检测含巯基氨基酸方面的应用。【
背景技术：
】[0002]含有巯基的氨基酸和多肽在许多生理过程中扮演着重要的角色。例如，半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)被认为与一些疾病紧密相关，如肾功能衰竭，老年痴呆症和帕金森氏病，动脉粥样硬化性血管疾病，以及冠状动脉心脏疾病。还原性谷胱甘肽(GSH)是主要的内源性抗氧化剂，被视为氧化应激能力的指示剂，生物体内巯基含量也可能受到一些氧化应激反应的影响。同时，利用巯基探针识别生物体释放出的硫醇可以用于间接检测相关生物酶以及评价相应抑制剂的活性。因此，寻求快速，灵敏选择性检测生物巯基越来越受到人们的重视(GilesNM.,WattsAB，GilesGI,FryFH，LittlechildJA，JacobC.Metalandredoxmodulationofcysteineproteinfunction.[J]Chemistry&biology2003；10(8):677-693.WangW,Rusin0,XuX,KimKK，EscobedoJO,FakayodeSO,FletcherKA,LowryM，SchowalterCM，LawrenceCM,FronczekFR,WarnerIM，StronginRM.Detectionofhomocysteineandcysteine.[J]JournaloftheAmericanChemicalSociety2005；127(45):15949-15958.SeshadriS，BeiserA，SelhubJ，JacquesPF,RosenbergIH，D’AgostinoRB,WilsonPW,WolfPA.PlasmahomocysteineasariskfactorfordementiaandAlzheimerfsdisease.[J]NewEnglandJournalofMedicine2002；346(7):476-483.)0[0003]目前，已报道了一些分析方法来检测含巯基氨基酸，主要包括高效液相色谱，毛细管电泳，电化学检测，光分析和质谱鉴定技术。但这些方法都是限用于体外实验，不可以应用于在活体细胞中检测含`巯基氨基酸。荧光探针可以有效的，专一的在活体细胞里成像，具有较好的灵敏性。因此，一些基于化学反应型的荧光探针已被报道，主要是利用迈克尔加成反应，与醛的环化反应，裂解反应等完成化学转化实现荧光检测含巯基氨基酸。(ZhuJ，DhimitrukaI，PeiD.5-(2-Aminoethyl)dithio-2-nitrobenzoateasamorebase-stablealternativetoEllman!sreagent.[J]OrganicLetters2004:6(21):3809-3812.HuM，FanJ，LiH，SongK，WangS，ChengG，PengX.FluorescentchemodosimeterforCys/Hcywithalargeabsorptionshiftandimaginginlivingcells.[J]OrganicBiomolecularChemistry2011；9(4):980-983.LongL,LinW,ChenB,GaoWiYuanL.ConstructionofaFRET—basedratiometricfluorescentthiolprobe.[J]ChemicalCommunications2011；47(3):893-895.)。[0004]大多数已报道的荧光探针对含巯基氨基酸的响应只体现在荧光强度的改变。因此，研发一种兼具颜色变化和荧光增强的荧光探针对探讨含巯基氨基酸的生物学作用具有十分重要的意义。【
发明内容】[0005]对于上述情况，本发明的目的之一提供一种合成简便、反应条件温和、成本较低的荧光探针合成方法；目的之二是提供一种选择性好，灵敏度高，能够裸眼及荧光增强检测含巯基氨基酸的荧光探针。[0006]本发明使用的裸眼检测和荧光增强检测含巯基氨基酸荧光分子探针，采用二氟化硼-二吡咯甲烷醛衍生物和硝基甲烷在碱的作用下合成，硝基甲烷部分作为识别基团。[0007]本发明解决问题采取的技术方案为，一种裸眼检测和荧光增强检测含巯基氨基酸荧光分子探针，具有下列结构通式:[0008]【权利要求】1.本发明涉及一种裸眼及荧光增强检测含巯基氨基酸荧光分子探针的制备方法以及该荧光分子探针在检测含巯基氨基酸方面的应用，其特征是具有下列化学分子结构通式:2.根据权利要求1所述的基于二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物的裸眼识别和荧光增强检测含巯基氨基酸的荧光分子探针，其特征是=R1,R2,R3，R4为甲基，R5为H。3.权利要求1或2所述的荧光分子探针的合成方法，其制备方法是:1)将吡咯和芳香醛溶解在二氯甲烷中，加入三氟乙酸做催化剂，室温搅拌。将二氯二氰基苯醌溶于二氯甲烷中加入到上述反应体系中，之后将碱和三氟化硼乙醚一起加入到反应体系中，反应完成后，将反应液倒入水中二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析分离。得到产物即为二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物。2)将N，N-二甲基甲酰胺和三氯氧磷在冰浴下混合，恢复到室温后，向反应液中滴加溶于1，2_二氯乙烷中的二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物，升温搅拌。反应完毕后，降至室温，倒入到碳酸氢钠溶液中进行中和，继续搅拌后用二氯甲烷进行萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到产品即为二氟化硼-二吡咯甲烷醛衍生物。3)将二氟化硼-二吡咯甲烷醛衍生物和硝基甲烷溶于甲苯中，加入哌啶和醋酸，回流。反应完成后，降至室温，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到产品即为探针化合物。4.根据权利要求3所述的基于二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物的裸眼识别和荧光增强检测含巯基氨基酸的荧光分子探针合成方法，其特征在于:所述反应步骤I)中采用的吡咯包括2，4_二甲基吡咯，2，5_二甲基吡咯，1-甲基吡咯等。采用的芳香醛包括苯甲醛，对羟基苯甲醛，对氰基苯甲醛，对碘苯甲醛，对溴苯甲醛等芳香醛。5.根据权利要求3所述的基于二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物的裸眼识别和荧光增强检测含巯基氨基酸的荧光分子探针合成方法，其特征在于所述反应步骤2)中采用的无机碱中和可以为碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠，碳酸钾等无机碱。6.根据权利要求3所述的基于二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物的裸眼识别和荧光增强检测含巯基氨基酸的荧光分子探针合成方法，其特征在于所述反应步骤3)中采用溶剂可以为甲苯，二甲苯，邻二甲苯，邻二氯苯的有机溶剂。7.权利要求1或2所述的荧光分子探针的应用，用于裸眼或荧光增强检测巯基氨基酸。【文档编号】C07F5/02GK103804401SQ201210460219【公开日】2014年5月21日申请日期:2012年11月12日优先权日:2012年11月12日【发明者】宋相志,陈颂申请人:苏州罗兰生物科技有限公司