患有牛新生儿全血细胞减少症的小牛中的圆环病毒的检测的制作方法

专利名称：患有牛新生儿全血细胞减少症的小牛中的圆环病毒的检测的制作方法
患有牛新生儿全血细胞减少症的小牛中的圆环病毒的检测描述本发明涉及作为牛中的骨髓再生障碍伴出血性疾病的诱因剂的新的圆环病毒(CV)。本发明提供了用于诊断和治疗用途的新的核酸和蛋白序列。简介牛中的出血性疾病与多种诱因有关，包括病毒感染、遗传疾病、免疫介导的疾病、细菌性败血病和中毒。出血倾向和血小板减少症与非细胞病变2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染相关(Ellis等人，1998, Rebhun等人，1989)。描述了西门塔尔牛(Simmentalcattle)的遗传性出血体质。这种西门塔尔遗传性血小板病是由血小板功能紊乱引起的(Steficek等人，1993)。免疫介导的血小板减少症在牛中是罕见的状况。其可被分类为特发性血小板减少性紫癜或继发性实体(Yeruham等人，2003)。细菌感染的实例包括多杀巴 斯德菌(Pasteurella multocida),其是小牛中的出血性败血病的熟知的诱因，临床表现为瘀点性和瘀斑性出血、泛发性充血和肺炎(Rhoades等人，1967，Rimler, 1978)。有几种毒素可能是牛中的致命性出血体质的原因。由于喂给小牛的三氯乙烯提取的大豆油柏中的二氯乙烯基半胱氨酸(DCVC) (Lock等人，1996)以及抗生素呋喃唑酮(Hoffmann-Fezer等人，1974,Hofmann等人，1974)中度,产生致命性再生障碍性贫血,显著的骨髓非细胞性和广泛的出血。摄入羊齿植物[欧洲蕨(Pteridium aquiIinum)]引起牛急性中毒，还伴有不可逆转的骨髓低常增生(Maxie and Newman，2007，Valli，2007)。另外，已经描述了反会动物中Stachybotrys chartarum(atra)的真菌毒素中毒,导致全细胞减少疾病，其特征在于很多组织中的大出血和坏死(Harrach等人，1983，Valli, 2007)。鸡感染性贫血是与本文报告的小牛中的出血性疾病非常类似的疾病。诱因剂是鸡感染性贫血病毒(CIAV)。在感染了 CIAV的鸡中，一致性发现严重的贫血、严重的骨髓再生障碍、胸腺和法布里刘乌斯氏囊的萎缩，以及出血(Kuscu and Gurel, 2008, Yuasa等人，1979)。实验性接种了 CIAV的一日龄的SPF鸡显示出血细胞比容值的降低，变得瘦弱和抑郁并伴有贫血，特别是在接种后12-20天时(Goryo等人，1989)。CIAV在分类上属于圆环病毒科(Circoviridae) (Todd等人,2005)。其仅感染鸡，是环病毒属(Gyrovirus)的唯一成员。然而，在哺乳动物和禽类物种中已经检测到了另一个属，圆环病毒属(Circovirus)的数个成员，包括猪圆环病毒PCVl和PCV2。圆环病毒科的成员是无被膜的二十面体颗粒，具有环状的单链DNA(ssDNA)基因组，大小为1759至2319个核苷酸(nt) (Todd等人，2005)。圆环病毒属中的病毒具有双义基因组结构，从有意链编码复制相关(Itep)蛋白(开放阅读框[ORF]-VI)，从互补链编码衣壳蛋白(ORF-Cl)。在一些圆环病毒中已经认识到了另外的小的0RF，例如，在PCV2感染的细胞中编码调亡诱导性蛋白的0RF3 (Liu等人，2005，Timmusk等人,2008)。在非编码区，存在莖环结构，其含有保守性的九聚体序列并参与病毒基因组复制的起始(Steinfeldt等人，2001)。最近有人对圆环病毒的分子生物学进行了综述(Mankertz,2008) 除了 PCVl之外，所有已知的圆环病毒都是病原体，引起免疫抑制和淋巴网状组织的破坏(Mankertz, 2008, Segales 等人，2005, Segales and Mateu, 2006, Todd, 2000)。PCV2是与猪中的多种不同症状和疾病相关的病毒性病原体，例如断奶后多系统消瘦综合症(PMWS)、猪呼吸道病复合体(PRDC)、与PCV2相关的繁殖障碍，猪皮炎和肾病综合征(PDNS)。然而，通过PCV2接种在不哺喂母乳的仔猪和常规猪中仅证明了 PMWS的典型损伤(Ellis等人，1999，Kennedy等人，2000)，尚未完全研究透PCV2在除了 PMWS之外的猪疾病中的参与(Allan 等人，2003，Chae, 2005)。关于牛中的圆环病毒感染仅存在有限的数据。通过PCR证明了圆环病毒在100例牛呼吸道疾病中的6例、30例流产胎儿中的4例中的肺组织样品中的存在(Nayar等人，1999)。该病毒的基因组，临时命名为牛圆环病毒(BCV)，几乎与PCV2相同，具有99%的总体核苷酸序列同一性。已经报道了与人、小鼠和牛的血清中的猪圆环病毒反应的抗体的存在(Tischer等人，1995)。然而,在另一项研究中，在来自牛、绵羊、马和人的血清中未检测到针对PCV2的抗体(Allan等人，2000，Ellis等人，2001)。另外，实验性感染了 PCV2的I只血清阴性新生小牛和6只血清阴性的6月龄肉牛未产生针对该病毒的抗体(Ellis等人，2001)。
从2007年开始，在全德国的小牛中有了农场主和兽医关于无法解释的出血性疾病的报道。具有自发性出血的56只小牛被送到巴伐利亚动物健康服务中心以鉴定损伤并通过进一步的实验室研究来研究病因。在不同品种的幼牛出生头一个月内观察到该疾病。雄性和雌性小牛同样受影响。主要发现为出血，尤其是皮肤、皮下组织和胃肠道中的出血。其它零星发现有炎性损伤。组织学研究表明在所有的动物中存在严重的骨髓减少至再生障碍，在43%的受影响的小牛中存在淋巴细胞消减(lymphocytic depletion)。5只动物的血液分析揭示有再生障碍性全血细胞减少症。相信所产生的血小板减少症代表该出血性疾病综合征(HDS)、也称作出血体质(HD)的主要病理机理。同时，HDS/HD的更常见的和科学上接受的名称是牛新生儿全血细胞减少症(BNP)。不同的名称和缩写可以在本申请中相互替换地使用。细菌感染和牛病毒性腹泻病毒或蓝舌病毒感染被排除是该疾病的诱因。未检测到已知引起骨髓再生障碍的特定毒素。系谱分析没有给出该疾病的遗传性的指示。使用宽谱PCR，本发明人能够证明圆环病毒在受影响的小牛中的存在。全病毒基因组测序揭示了与2b型猪圆环病毒(PCV2b)的高度相似性。I只小牛的单个骨髓细胞显示出轻度PCV2抗原免疫反应。

发明内容
本发明涉及被鉴定为牛中的出血性疾病综合征(HDS)或出血体质(HD)、现在主要被称作牛新生儿全血细胞减少症(BNP)的诱因剂的新的圆环病毒(CV)的核酸分子。此外，本发明涉及由该病毒核酸编码的新的多肽和针对这些多肽的抗体。所述核酸、多肽和抗体适合于诊断和治疗用途，特别是用于开发针对HD的疫苗。在第一方面，本发明涉及圆环病毒(CV)核酸分子，其包含(a)如SEQ ID NO 1所示的序列或其片段，和/或(b)根据(a)的核苷酸序列的互补物。在另一方面，本发明涉及圆环病毒(CV)核酸分子，其包含(a)如SEQ ID NO 7所示的序列或其片段，和/或(b)根据(a)的核苷酸序列的互补物。
在另一方面，本发明涉及圆环病毒(CV)核酸分子，其包含(a)如SEQ ID NO 11所示的序列或其片段，和/或(b)根据(a)的核苷酸序列的互补物。所述核酸分子可以是DNA或RNA分子，其是单链或双链的、环状或线性的。在一些实施方式中，所述核酸分子可以这样存在，或连接于另外的核酸分子，例如可操作地连接于异源表达控制序列。核酸分子也可以封装于病毒衣壳中。本发明的核酸分子可以包含SEQ ID NO :1的完整序列和/或其互补物或其片段。同样，本发明的核酸分子可以包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :11的完整序列和/或其互补物或其片段。所述片段优选包含如SEQ ID NO :1、7或11所示的至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或至少50个连续核苷酸，或其互补物。优选地，本发明的CV核酸分子相对于相关的圆环病毒株、例如图6中所不的GeneBank登记号的圆环病毒株具有至少一个 核苷酸的差异。本发明还涉及以下核酸分子(a)与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性；(b)在严格条件下与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列杂交；或(c) (a)或(b)的互补物。本发明还涉及以下核酸分子(a)与SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列具有至少90%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性；(b)在严格条件下与SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列杂交；或(c) (a)或(b)的互补物。本发明还涉及以下核酸分子(a)与SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列具有至少90%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性；(b)在严格条件下与SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列杂交；或(c) (a)或(b)的互补物。给定核酸分子与参考核酸分子(即，例如，SEQ ID NO 1或其片段)的同一性可通过如下确定I = n/Lxl00,其中I是以百分率表示的同一性，n是给定核酸分子与参考物的相同核苷酸的数目；和L是给定核酸分子与参考物的序列重叠的长度。优选地，在严格条件下杂交的意思是以IXSSC缓冲液和0. I % SDS在50°C、优选55°〇、更优选621、最优选68°C洗涤I小时之后，尤其是以0. 2XSSC和0. 1% SDS在50°C、优选55°C、更优选62°C、最优选68°C洗涤I小时之后，观察到阳性杂交信号。杂交程序为，例如，公开于 Wahl 和 Berger (Methods Enzymol. 152 (1987), 399-407)以及 Kimmel (MethodsEnzymol. 152 (1987)，507-511)，其内容通过引用方式并入本文。本发明的另一方面涉及编码圆环病毒多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含(a)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的区域(i)核苷酸 51-995 (Itep)(ii)核苷酸 1034-1735 (Cap)(iii)核苷酸 357-671 (0RF3);或(b)在遗传密码简并性范围内对应于(a)的序列的核苷酸序列 ；或(c)根据(a)或(b)的核苷酸序列的片段。本发明的另一方面涉及编码圆环病毒多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含(a)如SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列的区域(i)核苷酸 51-995 (Itep)(ii)核苷酸 IOM-I735(Cap)(iii)核苷酸 357-671 (0RF3);或(b)在遗传密码简并性范围内对应于(a)的序列的核苷酸序列；或(c)根据(a)或(b)的核苷酸序列的片段。本发明的另一方面涉及编码圆环病毒多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含(a)如SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列的区域(i)核苷酸 51-995 (Itep)(ii)核苷酸 1033-1734(Cap)(iii)核苷酸 357-671 (0RF3);或(b)在遗传密码简并性范围内对应于(a)的序列的核苷酸序列；或(c)根据(a)或(b)的核苷酸序列的片段。优选地，核酸分子编码选自下列的CV多肽R印(SEQ ID NO 2) >Cap (SEQ ID NO 3)和0RF3(SEQ ID NO :4)，或其片段。核酸分子还可以编码选自下列的CV多肽R印(SEQ IDNOs 8 和 12)、Cap (SEQ ID NOs 9 和 13)和 0RF3 (SEQ ID NOs 10 和 14)，或其片段。上述CV多肽的片段可以例如包含如SEQ ID N0:2，3或4或SEQ ID NO :8_10或12-14所示氨基酸序列的至少6个、至少8个、至少10个、至少20个或至少30个连续氨基酸。另外，本发明涉及编码与SEQ ID NO :2，3或4所示的氨基酸序列的任意项具有至少90 %、至少92 %、至少94 %、至少96 %、至少98 %或至少99 %同一性的多肽的核酸分子。另外，本发明涉及编码与SEQ ID NO :8，9，10，12，13或14所示的氨基酸序列的任意项具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%同一性的多肽的核酸分子。给定多肽与参考多肽、例如SEQ ID NO :2，3或4之间的同一性程度可以根据上文就核酸分子所述的来确定。本发明的核酸分子可以可操作地连接于异源表达控制序列，例如允许在适当的宿主细胞中表达的表达控制序列。用于表达本发明的核酸序列的异源表达控制序列的实例，例如原核或真核的，包括哺乳动物表达控制序列，是本领域技术人员已知的，例如公开于Sambrook 等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Press,和 Ausubel 等人(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley andSons，其内容通过引用方式并入本文。本发明还包括以如上文所述的核酸分子转化或转染的非人宿主细胞，例如原核或真核宿主细胞，例如酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。以核酸分子、例如位于载体例如病毒载体或质粒上的核酸分子转化或转染宿主细胞是本领域技术人员熟知的，描述于例如Sambrook等人(见上文)或Ausubel等人(见上文)。本发明的另一方面是由如上文所述的核酸分子编码的圆环病毒(CV)多肽。CV多肽可以包含(a)选自下列的氨基酸序列⑴氨基酸序列SEQ ID NO 2 (Rep)，(ii)氨基酸序列 SEQ ID NO 3(Cap)，、(iii)氨基酸序列 SEQ ID NO 4(0RF3);或(b)其片段。本发明的另一方面是由如上文所述的核酸分子编码的圆环病毒(CV)多肽。CV多肽可以包含(a)选自下列的氨基酸序列(i)氨基酸序列 SEQ ID NO 8 和 12 (Rep)，(ii)氨基酸序列 SEQ ID NO 9 和 13 (Cap)，(iii)氨基酸序列 SEQ ID NO 10 和 14(0RF3);或(b)其片段。本发明包括CV多肽或片段，所述片段包含如SEQ ID N0:2，3或4或SEQ ID NO:8-10或12-14所示氨基酸序列的至少6个、至少8个、至少10个、至少20个或至少30个连续氨基酸。优选地，本发明的CV多肽相对于相关的圆环病毒株、例如图6中所示的GeneBank登记号的圆环病毒株具有至少一个氨基酸的差异。本发明还涉及与SEQ ID NO :2，3或4所示的氨基酸序列的任意项具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%同一性的多肽。本发明还涉及与SEQ ID NO :8，9，10，12，13或14所示的氨基酸序列的任意项具有至少90 %、至少92 %、至少94 %、至少96 %、至少98 %或至少99 %同一性的多肽。本发明的另一方面是针对如上文所述的多肽的抗体或此类抗体的抗原结合片段。产生抗体、例如多克隆或单克隆抗体的方法是本领域熟知的。例如,可以通过注射具有免疫原性的本发明的多肽免疫多种哺乳动物宿主，例如小鼠或兔子。如果需要，本发明的多肽可以偶联于载体，例如钥孔血蓝蛋白(KLH)。可以通过熟知的方法从经免疫的宿主获得多克隆抗体或产生抗体的细胞。可以通过已知的技术，例如B-细胞杂交瘤技术(KShler等人，Nature256 ;(1975)495-497)(其内容通过引用方式并入本文)或相关技术制备针对本发明的多肽的单克隆抗体。本发明还包括此类抗体的嵌合、人源化或人类抗体，或抗原结合片段，它们可通过已知技术获得。本发明的另一方面是包含如上文所述的核酸分子的圆环病毒。所述病毒可以是活性病毒。备选地，所述病毒可以是灭活的病毒或减毒的病毒。可以按照下文的详细描述进行灭活和减毒。本发明的核酸分子、多肽、病毒和抗体可用作诊断或药物试剂，例如，用于诊断或预防和/或治疗哺乳动物、特别是牛、更特别是小牛中的HD。在诊断性的实施方式中，核酸分子或多肽可以携带报告基团，例如任何适合用于诊断方法中的报告基团，例如荧光基团、发光基团、染料、酶、半抗原或生物素。特别地，对于诊断性实施方式，如本申请中使用的术语“核酸分子”还包括核酸类似物，例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或本领域已知的其它类型的核酸类似物。因此，本发明的其它方面是包含如上文所述的核酸分子、多肽、病毒或抗体以及可接受的载体的诊断组合物。 诊断组合物可用于诊断HD、特别是牛中的HD的方法，其中，将来自待诊断的受试者的样品与如上文所述的诊断组合物接触，从而测定该样品中CV的存在和/或数量，特别是PCV2-Ha08株、PCV2_Ha09株或PCV2_HalO株的存在和/或数量，或针对CV、特别是PCV2-Ha08株、PCV2_Ha09株或PCV2_HalO株的抗体的存在和/或数量。所述样品可以是体液样品，例如血液、血清、血浆、唾液、痰或淋巴液，或组织样品，例如，来自肝、肺、骨髓或淋巴组织的样品。在一个实施方式中，本发明的诊断方法可以包括在基于核酸的检验中测定CV核酸分子，所述检验可以涉及核酸杂交和扩增技术，例如PCR。另外，本发明的诊断方法包括在免疫检验中测定CV多肽，使用本发明的抗体作为诊断试剂并测定CV多肽与探测抗体的免疫复合物的存在。另一方面，本发明的诊断方法可以包括测定样品中的抗-CV抗体，例如使用如上文所述的CV多肽作为探测抗原。本发明的另一实施方式是如上文所述的核酸分子、多肽、病毒和抗体用于治疗性应用的用途，特别是用于治疗和/或预防哺乳动物生物、特别是牛中的HD。因此，本发明还包括用于治疗性用途的组合物，其包含如上文所述的核酸分子、多肽、抗体或病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。在优选实施方式中，组合物是疫苗或免疫原性组合物，例如，基于核酸的疫苗或免疫原性组合物，或基于多肽的疫苗或免疫原性组合物，或基于病毒的疫苗或免疫原性组合物，或基于抗体的疫苗。在特别优选的实施方式中，组合物是基于多肽的疫苗或免疫原性组合物，并包含能够在受试者中引发免疫应答的CV多肽，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。在另一个特别优选的实施方式中，组合物是基于病毒的疫苗或免疫原性组合物，并包含能够在受试者中引发免疫应答的圆环病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。本发明还包括预防或治疗HD、特别是哺乳动物受试者、例如牛中的HD的方法，其中向有此需要的受试者施用有效量的如上文所述的治疗性组合物。对于治疗性应用，核酸分子可以以下列形式使用基于核酸的疫苗或免疫原性组合物，或者核酸效应子分子、例如反义分子、或能够RNA干扰的分子。本发明的多肽或病毒可用于治疗性应用，用于制备如上文所述的基于多肽或基于病毒的疫苗或免疫原性组合物。抗体可用于治疗性应用，用于治疗已经存在的CV感染。发明详述以下定义可适用于本发明的实施方式的描述中使用的术语。以下定义取代每篇通过引用方式并入本文的各个参考文献中的任何矛盾定义。除非在本文中另有定义，否则本发明中使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文需要，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。如本文使用的术语“佐剂”是指任何作为免疫应答的非特异性刺激物的物质。合适的佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)，明矾氢氧化铝凝胶，水包油乳剂，油包水乳剂，例如弗氏完全佐剂和不完全佐剂，嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGa.), SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN 佐剂，离子多糖，阜苷，QuiI A, QS-21(Cambridge Biotech Inc. , Cambridge Mass.)，GPI-0100 (GalenicaPharmaceuticals, Inc. , Birming-ham, AL)或其它阜苷级份，Procision-A (包含 Quil A、AMPHIGEN 和胆固醇的混合物的佐剂)、单磷酰脂质A，阿夫立定脂质-胺佐剂，来自大肠杆菌的热不稳定性肠毒素(重组的或其它方式)，霍乱毒素，或胞壁酰二肽，等本领域 技术人员所知的。提及“离子多糖”应理解为任何带正电或负电的多糖或其衍生物或化学等同物。所述离子多糖可以是可溶或不可溶形式。优选地，所述离子多糖是离子葡聚糖。更优选地，所述离子葡聚糖是DEAE-葡聚糖，硫酸葡聚糖或QAE-葡聚糖。最优选地，所述离子葡聚糖是DEAE葡聚糖。优选地，所述离子葡聚糖的葡聚糖成分具有250，000至4，000，OOODa的分子量，更优选为 500, 000 至 I, 500，OOODa0皂苷的佐剂特性已长久为人所知，因为其具有增强针对免疫原的抗体效价的能力。如本文使用的术语“皂苷”是指一组植物来源的表面活性的糖苷，其由与留类或三萜类结构的疏水性区域结合的亲水性区域(通常是数个糖链)组成。皂苷可从多个不同来源获得，已经从南美树木阜树(Quillaja saponaria) (Molina)中得到了具有有用的佐剂活性的皂苷。来自该来源的皂苷被用于分离“均一的”级份，该级份被称作"Quil A" (Dalsgaard,1974)。剂量-位点反应性是在疫苗制备物中使用Quil A用于兽用和人类的一个主要考虑。避免Quil A的这种毒性的一种方式是使用免疫刺激复合物(称作Iscoms ，ImmunoStimulating COMplexes的缩写)。这是主要的，因为当掺入到免疫刺激复合物中时，QuilA的反应活性没那么高，因为其与复合物中的胆固醇的结合降低了其与细胞膜中的胆固醇结合的能力，因此降低了其细胞裂解效应。另外，产生相似水平的佐剂效应所需的Quil A的量较少。已经在多个公开物中描述了 Quil A皂苷的免疫调节性质和当把它们掺入免疫刺激复合物时将会从这些皂苷产生的额外益处，例如Cox和Coulter，1992 (Cox，J. C. and Coulter, A. R. , “Advances in Adjuvant Technology and Application，，，见Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology,第 4 章，编者Yong, ff. K. , CRCPress (1992)) ；Dalsgaard, 1974 ；Morein 等人，澳大利亚专利说明书号 558258、589915、590904 和 632067。本发明情境下有用的佐剂和添加剂的数量和浓度可由技术人员容易地确定。在一个实施方式中，本发明涉及包含大约50 ii g至大约2000 ii g佐剂的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施方式中，所包括的佐剂的量是大约IOOii g至大约1500ii g，或大约250ii g至大约IOOOiI g，或大约350i! g至大约750 i! g。在另一个实施方式中，包括的佐剂的量是大约500 u g/2ml剂量的免疫原性组合物或疫苗。如本文使用的术语“氨基酸”是指天然产生的和合成的氨基酸，以及按照类似于天然产生的氨基酸发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及那些后来被修饰的氨基酸，例如，羟基脯氨酸、羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，例如a和a-双取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸和其它非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的合适的成分。非常规氨基酸的实例包括4_羟基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、e -N, N，N-三甲基赖氨酸、e -N-乙酰基赖氨酸、0-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、O -N-甲基精氨酸，和其它类似的氨基酸和亚氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然产生的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳)的化合物。示例性的氨基酸类似物包括，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸) 或修饰的肽骨架，但是保持与天然产生的氨基酸基本上相同的化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但是按照类似于天然产生的氨基酸的方式发挥作用的化学化合物。在本文中可以通过它们通常已知的三字符或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字符来指称氨基酸。如本文使用的术语“抗体”是指能够通过识别表位的方式结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以是多克隆的混合物或单克隆的。抗体可以是来自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，或者可以是完整免疫球蛋白的免疫反应活性部分。抗体可以以多种形式存在，包括，例如，Fv, Fab’，F(ab’)2，以及单链。如本文使用的术语“抗原”是指包含一个或多个表位(线性、构象或二者)的分子，其在暴露于受试者之后将诱导特异于该抗原的免疫应答。如本文使用的术语“抗原”可以指减毒的、灭活的或修饰的活体细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它微生物。如本文使用的术语“抗原”还可以指亚基抗原，其相对于与抗原天然结合的整个生物体是分离的和离散的。如本文使用的术语“抗原”还可以指抗体，例如抗独特型抗体或其片段，以及指合成的肽模拟位，其可以模拟抗原或抗原决定簇(表位)。如本文使用的术语“抗原”还可以指在体内表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如在DNA免疫应用中的那些。在用于疫苗中之前，本发明的圆环病毒可以是“减毒的”或“灭活的”。减毒和灭活的方法是本领域技术人员熟知的。减毒方法包括但不限于在合适的细胞系的细胞培养物中连续传代，紫外光辐射，和化学诱变。灭活方法包括但不限于使用福尔马林、P -丙内酯(BPL)或二乙烯亚胺(BEI)处理，或本领域技术人员已知的其它方法。通过福尔马林灭活可以这样进行将病毒悬浮液与37%的甲醛混合至甲醛的最终浓度为0. 05%。通过在室温恒定搅拌大约24小时而混合病毒-甲醛混合物。然后通过检验在适当的细胞系中的生长而就残余活体病毒测试灭活的病毒混合物。通过BEI灭活可以这样进行将本发明的病毒悬浮液与0. IM BEI (2-溴代-乙胺，在0. 175N NaOH中)混合至BEI的最终浓度为ImM。通过在室温恒定搅拌大约48小时而混合病毒-BEI混合物，然后加入I. OM硫代硫酸钠至0. ImM的终浓度。再继续混合2小时。通过通过检验在适当的细胞系中的生长而就残余活体病毒测试灭活的病毒混合物。如本文使用的术语“细胞系”或“宿主细胞”意思是病毒在其中可复制和/或被维持的原核或真核细胞。如本文使用的术语“免疫原性组合物”意思是能够在受试者中诱导免疫应答或抗原性应答的组合物。如本文使用的术语“药学上可接受的载体”是指这样的物质在合理的医学判断范围内，适合用于与人或动物的组织接触而无不适毒性、刺激、变应性应答等，与合理的收益/风险比相称，并对于它们的意欲用途有效。本发明的疫苗可以包括一种或多种药学上可接受的载体，例如所有的溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。稀释剂可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖，等本领域技术人员已知的。稳定剂包括白蛋白等本领域技术人员已知的。防腐剂包括硫柳汞等本领域技术人员已知的。如本文使用的术语“多核苷酸或核酸分子”意思是由链中共价结合的核苷酸单体组成的有机聚合物分子。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有不同生物功能的多核苷酸的实例。如本文使用的术语“预防”意思是抑制微生物的复制、抑制微生物的传播或抑制微生物在其宿主中建立其自身。如本文使用的该术语也可意指抑制或阻断一个或多个感染迹象或症状。如本文使用的术语“治疗剂”意思是在其所施用至的受试者中引起免疫应答的微生物(或其部分)或亚基抗原或多肽或多核苷酸分子，以及它们的组合。所述免疫应答可以包括但不限于细胞和/或体液免疫力的诱导。如本文使用的术语“治疗”意思是减少或消除微生物引起的感染。如本文使用的该术语也可意指减少微生物的复制、减少微生物的传播或降低微生物在其宿主中建立其自身的能力。如本文使用的该术语还可以意指减少、缓解或消除微生物引起的感染的一个或多个迹象或症状，或加速从微生物引发的感染的复原。如本文使用的术语“疫苗”和“疫苗组合物”意思是预防或减少感染、或预防或减少感染的一个或多个迹象或症状的组合物。疫苗组合物针对病原体的保护性效应通常是通过在受试者中诱导免疫应答(细胞介导的或体液免疫应答或二者的组合)而实现。一般而言，感染的消除或降低的发生率，迹象或症状的缓解，或微生物从被感染的受试者的加速的消除，是疫苗组合物的保护性效应的指示。本发明的疫苗组合物提供针对圆环病毒(CV)引起的感染的保护性效应。提供了以下描述的附图和实施例以辅助本领域技术人员实施本发明。虽然如此，这些描述不应被解释为不恰当地限制本发明，因为本领域普通技术人员可以不脱离本发明的精神或范围而对本文讨论的实施方式进行修饰和改变。



图I.患病小牛中的出血位置。A :头部皮肤中的病灶性急性出血。干燥后的血液使小束毛发粘在一起。B :下唇和牙龈的粘膜中的瘀点性和瘀斑性出血。C :除了与注射位点和耳朵打标记相关的出血之外，无创伤性皮肤损伤的迹象。D :小肠和大肠的肠系膜中的中度病灶性出血。小肠的节段性暗红色变色是由于严重的管腔内的出血。E :腕骨的皮下组织。在骨突出物和身体的力学紧张部分最常见到皮下出血。图2.在患有全血细胞减少症和出血性疾病(BNP)的小牛中的额外发现的频率。一些动物显示出数个额外损伤。经常发现不同器官的炎症，但是所研究的动物中有30%不具有另外的损伤。GIT:胃肠道。图3.脱钙、HE染色之后骨髓(胸骨)的组织学研究，放大倍数100。A :具有造血组织、包括数个巨核细胞(箭头)的3周龄小牛的正常骨髓。B :严重损失了造血组织的受影响的小牛的骨髓。仅保留了间质成纤维细胞和脂肪细胞。图4.来自患有出血性疾病的小牛的样品中的圆环病毒DNA的检测。使用提取自小牛的骨髓(泳道3、5、9-12)、血液(泳道4和8)、肝(泳道6)或肾(泳道7)的DNA进行巢式宽谱PCR，在泳道上标示了数字。Neg :阴性分离对照；p0s :阳性PCR对照；M :分子量标记物，在左侧以bp标示了大小。在溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶中分离了大小为约350bp的、次级PCR产物。图5.用于检测PCV2-特异性抗原的免疫组织化学，胸骨，I号小牛。单一骨髓细胞显示出轻微至中度的细粒细胞质染色。比例尺100iim。图6.在具有2型猪圆环病毒株的德国小牛中检测到的圆环病毒PCV2_Ha08的系统发生关系。基于参考株PCV2a、PCV2b和PCV2c (黑体)、加拿大牛圆环病毒(BCV)和通过BLAST搜索发现的与PCV2-Ha08最密切相关的10种圆环病毒的完整核苷酸序列建立系统发生树。以箭头标示了 PCV2-Ha08。在括号中显示了序列的GenBank登记号。该树以核苷酸替换单兀(nucleotide substitution units)定标。图7.根据未公布的Gen Bank条目登记号FJ804417的PCV-2株Ha08的核苷酸和
氨基酸序列。图8.根据未公布的Gen Bank条目登记号HQ231329的PCV-2株Ha09的核苷酸和
氨基酸序列。图9.根据未公布的Gen Bank条目登记号HQ231328的PCV-2株HalO的核苷酸和
氨基酸序列。图10.在原型物种非依赖性PCV2酶联免疫吸附检验(ELISA)中分析血清。实线代表猪PCV2阴性血清，虚线代表猪PCV2阳性血清，点线代表牛BNP血清。
实施例材料和方法病史在2007年10月至2009年5月期间，对56头具有出血性疾病的小牛(产自德国巴伐利亚的45头奶牛)进行尸检。就年龄、性别和品种纵览医学记录。询问主人关于小牛的既往疾病和既往的医学处理、小牛饲养、饲料被霉菌或羊齿植物污染以及杀啮齿动物药的使用情况。根据表I对HDS (BNP)病例和对照组动物编号。对照组动物如文本中所指定。包括了由于出血性疾病之外的原因而被送去进行病理学检查的8头小牛作为圆环病毒特异性PCR的对照；它们被列举于表I中。I号对照属于与患出血性疾病的两个病例(11和15号)相同的家畜，于出生后不久由于不明原因死亡。在该例中没有可检出的感染性试剂。对照组中包括的7头小牛(由于它们年龄的缘故)患有严重的多关节炎或严重的肠炎，在出生后I个月内死亡。对照组动物均未显示任何骨髓消减的迹象。组织病理学所有动物均进行尸检，收集标准系列组织，包括股骨和胸骨的骨髓、肺、肝、肾、脾和淋巴结，以进行组织病理学检查。根据需要，根据其它病理学发现收集另外的样品。器官组织的样品固定于10%缓冲的福尔马林。胸骨骨髓样品在OssaFixona (Waldeck,Miinster, Germany)中进行过夜脱I丐。就石腊包埋进行处理之后，切取4 y m厚的切片并以苏木精和曙红01E)染色。免疫组织化学
在封片于Superfrost Plus载玻片上的4mm切片上进行免疫组织化学检查(IHC)。将针对 PCV2 的 VP2 蛋白(0RF2)的小鼠单克隆抗体 36A9 (Ingenasa, Madrid, Spain)应用于2头受影响的小牛的骨髓、脾和淋巴结的组织切片。在收集自确认具有PCV2感染(基于免疫组化和PCR分析)的猪的淋巴结和派尔斑(Payers Patch)的切片上在每次运行中检测抗体的反应活性。染色前处理包括二甲苯洗涤以使切片去石蜡化和连续乙醇洗涤以复水化，然后以3%过氧化氢处理以猝灭内源性组织过氧化物酶活性。根据生产商的说明书，使用Hist0stam -PlusBulkKit和色原试剂AEC Single Solution(Invitrogen ,Camarillo, CA, USA)进行染色。最后，以Mayer的苏木精对切片进行对比染色。被分类为PCV2阳性的玻片显示出胞质内的颗粒式样的亮红色信号。血液病学从5个病例(2和53-56号)可获得EDTA血液样品，在收集后48小时内进行血液分析。使用CELL-DYN 3500 (Abbott, Wiesbaden, Germany)设备进行全血计数,包括白细胞计数、血小板计数、血红蛋白水平和红细胞参数。使用显微镜方法测定血球计数器玻片上的血小板数目。毒理学就特定毒素测定以下样品使用特定方法分析21和22号病例的尿液和血液样品，以检测二氯乙烯基半胱氨酸(DCVC)及其代谢物。使用气相色谱-质谱(GC-MS)方法检测25号病例的尿液样品和8号病例的肾组织中的挥发性有机化合物、香豆素衍生物和化疗药物，例如磺酰胺。使用GC-MS方法和高效液相色谱(HPLC)方法测定3个病例(23、34和36号)的尿液和肝样品中的药物。从具有2例受影响病例(I号和2号小牛)的农场收集饲料样品(青贮饲料、枯草、大豆萃取粉和稻草)。稻草样品是可疑的，因为变灰色和生霉的味道。就黄曲霉毒素BI和葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)的毒素进行真菌毒理学研究以及细胞毒性检验。使用最近发表的LC-MS/MS分析法(Gottschalk等人，2008)尝试证明真菌毒素(烟曲致震颤毒素C、Verrucologen、黄曲霉毒素BI、夫马洁林、胶霉毒素、Verrucarol NH4+、脱氧瓜萎镰菌醇、瓜萎镰菌醇、玉米赤霉烯酮、黑葡萄穗霉毒素G、黑葡萄穗霉毒素H、疣孢菌素A、杆孢菌素A、杆孢菌素L、黑葡萄穗霉毒素F和疣孢菌素J)的存在。根据Reubel等人(1987)的方法进行细胞毒性(MTT)检验。微生物培养就细菌的存在情况检查本研究和对照组中的所有动物的标准器官组(肺、肝、脾、肾和小肠)以及另外的样品(取决于病理学发现)。通过接种含有5%去纤维的绵羊血液的哥伦比亚血琼脂和Water-blue-metachrome-yellow lactose agar来研究每个样品。使用脑心浸出液琼脂和巧克力琼脂检测肺中的微需氧微生物。对于厌氧检测，使用Zeissler琼脂。在缓冲的蛋白胨水和木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂中预富集之后，在Rappaport-Vassilioadis培养基中分离沙门氏菌属。病毒学根据生产商的说明书，使用诊断试剂盒(Bio-X Diagnostics, Jemelle,Belgium),通过直接免疫荧光法，就BVDV的存在检测所有受影响的动物的肾和甲状腺组织。为了分离 BVDV,将单层牛 KOP-R 细胞(RIE 244, CCLV Federal Research Centre for VirusDiseases of Animals, Island of Riems, Germany)接种器官勻衆物。每日筛选细胞的细胞病变方面的变化。在第二次细胞培养物传代之后，按照描述的方法通过直接免疫荧光检验法检测细胞并通过间接ELISA法检测BVDV特异性抗原(SERELISA BVD p80 Ag MonoIndirect, Synbiotics, Lyon,France)。为了显不BVDV特异性核苷酸序列，使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)从组织样品分离RNA,根据生产商的说明书使用商售的实时RT-PCR 程序(Virotype BVDV Kit ；Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig, Germany)。为了检测BTV特异性序列，使用分离自所有受影响小牛的脾组织的RNA进行实时RT-PCR程序，覆盖所有24个BTV血清型(Toussaint等人，2007)。在研究组中的总共56头小牛中，随机选择25头(病例号1，2，4-13，15-22, 31，34，41,42,45)以检测哺乳动物和禽类圆环病毒，包括PCV2 ;也研究了对照组中的所有小牛(称作对照I号、对照2号等)。使用高纯PCR模板制备试剂盒(Roche,Mannheim, Germany)从组织、包括血液、骨髓、脾、胸腺、肾和肝提取DNA，并根据最近的描述(Halami等人，2008)进行巢式宽谱PCR程序。根据Bogner等人(2005)进行另外的PCR程序，其常规被用于PCV2的特异性检测。在PCR分析过程中要小心以排除实验室DNA污染。使用不同组的移液抢和专用过滤枪头在另外的房间进行DNA分离、PCR标准混合物的制备和PCR产物的分析。使用阴性对照试剂和阴性DNA分离对照就污染情况筛选每组反应。在进行本研究之前，该实验室从未用于PCV2感染的常规PCR诊断。圆环病毒全基因组的扩增使用一对反向引物(inverseprimer) (5 ' -AGC TCC ACA CTC GATCAGTAAG-3' (SEQ ID NO :5)和 5' -CCT AGA TCT CAG GGA CAACGG AG-3' (SEQ ID NO :6))通过PCR扩增所检测的圆环病毒的完整基因组，所述引物是根据巢式宽谱PCR扩增的序列设计的。使用高保真PCR酶混合物(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany),使用下列循环条件进行扩增首先在95°C变性5分钟，然后是35个循环的“95°C，30sec ；58°C,30sec和70°C，4分钟”，最后在70°C延伸10分钟。DNA测序和系谱分析。使用GeneJET. PCR CloningKit (Fermentas, St. Leon-Rot,Germany)克隆 PCR 产物。使用引物 pjetl forward 和 pJetIreverse (Fermentas, St. Leon-Roth, Germany)或特异性引物在 ABI Prism 装置(AppliedBiosystems)中对质粒的插入物进行测序。使用Lasergene DNASTAR软件包(DNASTAR,Inc. , Madison, WI, USA)里的EditSeq模块从序列片段重新装配所检测的圆环病毒的完整基因组序列，然后存于GenBank数据库中，登记号为FJ804417。使用BLAST 2. 2. 14检索设施进行序列相似性检索。使用CLUSTAL W方法(Thompson等人，1994)，使用上述的软件包中的MegAlign模块进行序列比对和系统发生树的构建。株的命名和GenBank登记号显示于图6中。系谱分析通过它们的耳朵标记鉴定并追踪所有的小牛及其双亲。从用于德国和奥地利的联合繁殖评价的系谱构建所有病例的系谱。使用Pedigraph TM软件进行系谱的图形化呈现，鉴定出现一次以上的父系。
结果所检查的小牛有86%是西门塔尔牛(n = 48)，4%是荷兰乳牛(n = 2)，11%是混合或未知品种(n = 6)。死亡时的年龄是7-32天(平均为17天)。85%的小牛在生命的第2至第3周发病。雄性和雌性小牛以相同比例受影响。临床病史的回顾分析揭示小牛在出生时和出生后第一天是健康的。牛的主人和主诊兽医报告有自发性的经皮肤的出血，在数个粘膜表面无任何明显损伤和出血，以及与创伤或标准管理程序例如耳朵打标记或感染相关的过量出血。有的时候，记录另外的迹象，例如发烧、腹泻或呼吸困难。似乎仅在无规律的间隔在农场的单只或几只小牛中出现出血。医学治疗是不成功的。多数小牛在数天内死亡(n = 50)或者由于血液损失而需要被实施安乐死(n = 6)。所有的小牛在出生后第一天皆接受初乳。然后，多数农场主以来自他们自己的母牛的全奶喂养。一般地，保持小牛不被处理，直至出现出血的第一个迹象。一些小牛接受预防性药物，或者由于急性腹泻，以针对隐孢子虫的卤夫酮处理一些小牛。由于在德国羊齿植物仅在低程度上是牧草的成分，所以尚未报道由于羊齿植物污染而造成的任何问题。在农场上使用了杀啮齿动物药，但是牛的主人排除了母牛或小牛摄取它们的可能性。仅有一位农场主提到由于生霉的饲料而引起的牛中的健康问题。系谱分析构建了所有小牛的系谱。小牛的家系是各不相同的，未指示疾病的单基因(隐性或显性)遗传诱因。虽然一些父系被描述了数次，但小牛的数目太少，以致无法从此分析获得有意义的结果。总病理学在尸检时，研究组中的56头小牛的兽体处于良好的营养状态，体重为38_72kg，取决于年龄(平均为53kg)。在多数动物中，皱胃含有凝固的牛奶，在瘤胃中发现一些稻草。没有迹象表明摄取了有毒植物，例如羊齿植物。所有56个病例中的主要的病理形态学发现是在多个器官和组织中有严重急性出血。88%的动物显示出皮肤和皮下组织中的多病灶瘀点性至瘀斑性出血。在一些具有严重黑粪症的病例中，在胃肠道的浆膜和粘膜表面上的出血出现得非常频繁(98%)。此外，心脏、脑膜和骨骼肌中的出血是常见的(多达84%)。在图I中显示了出血的实例。长骨和胸骨的骨髓是淡红色。取决于出血的持续时间和强度，兽体出现贫血。炎性损伤是另外的散发性发现。最经常观察到的是纤维性或化脓性肺炎(合计27% )和口腔中的病灶性溃疡性至坏死性炎症(合计11% )。另外的病理学和组织学发现列举于图2。组织病理学主要的组织病理学发现是在56只动物中的每一个的骨髓中有造血组织的明显的低细胞至无细胞性(图3)。所有的造血谱系均以相同方式受影响。在一些病例中，仍然保持造血组织的一些岛状物。在这些位置偶然有前体细胞的病灶性退化和调亡。间质细胞之间的空间是充血的或填充有匀质嗜曙红性物质，或者造血组织被脂肪组织代替。56个病例中仅有5例(9%)显示出髓外造血迹象。出血位点未显示出另外的变化，这将解释由于之前的组织损伤、例如脉管炎、炎性反应或组织破裂而造成的出血倾向。在43%的病例中(n = 24)，随着淋巴样滤泡中的调亡淋巴细胞数目的增加或具有小滤泡的脾和淋巴结的低细胞性，淋巴组织中的损伤变得明显。这些变化总结为淋巴细胞消减型(lymphocyticdepletion)。偶然的和不常见的发现是在淋巴组织中存在极少的多核巨大细胞(n = 2)。口腔的一些溃疡性损伤中的细胞炎性反应主要由单核细胞与极少嗜中性粒细胞组成。同样，在纤维性肺炎的一些病例中，炎性渗出物由大量的纤维蛋白与极少嗜中性粒细胞组成。另外的组织学发现也列举于图2中。没有黄疸或溶血的迹象。在造血或淋巴组织中没有见到包涵体。血液病学 从5个病例(2、53_56号)可获得EDTA血液。在所有5个病例中，血液分析揭示出严重的血小板减少症(12. 5-82x103细胞/iil)、中度至严重的白细胞减少(285-1. 470细胞/ul)和中度的相对淋巴细胞增多(68-96%)。另外，这些病例中的4例显示出明显的嗜中性粒细胞减少(粒细胞减少，1-4% )。3个病例为贫血。2个病例的血细胞比容仍然介于生理限值。详细的血液学结果显示于表2。毒理学病例号8和25的尿和肾组织的毒理学筛选未显示没有诸如三氯乙烯、抗凝剂或磺胺的物质的摄取的迹象。使用HPLC方法在病例号23、34和36的尿和肝样品中未检出抗生素呋喃唑酮。然而，在病例号23和34中发现了安乃近(metamizol),在病例号36中发现了磺胺二甲嘧啶与甲氧苄啶的组合。分析这些结果是死亡前短时间内的药物施用造成的。另外，使用检测DCVC及其代谢物N-乙酰基-DCVC的特定方法分析收集自2个病例的尿和血液样品产生了阴性结果。收集自一个农场的稻草的状况提示可能有霉菌污染。然而，未检测到真菌毒素。细胞毒性检验也显示出阴性结果。微生物培养物就潜在的致病细菌的存在测试了所有患出血疾病的小牛病例。在一些病例中，检测到一种以上的试剂。在肠和其它器官中最常检测到的是大肠杆菌(n = 29)，其次是产气荚膜梭菌(C. perfringens) (n = 14)。在少数病例中发现多杀巴氏杆菌(P. multocida)(n = 3)和绿脓杆菌(P. aeruginosa) (n = 3)。仅在一只动物中发现溶血性曼氏杆菌(M. haemolytica)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、葡萄球菌属(Staphylococci)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)(每个都是n = 1)。在16个病例中未检测到细菌病原体。26例具有出血性疾病的小牛显示出另外的炎性损伤(图2)。最经常观察到的是肺炎(n = 15)。在9个病例的肺组织中分离了大肠杆菌。在I个病例的肺组织中检测到多杀巴氏杆菌(P. multocida)和绿脓杆菌(P. aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)和S. uberis,或诺卡氏菌属(Nocardia spp.)。在其它3例具有肺炎的肺组织中，未分离到病原体。在3个病例中诊断出由于大肠杆菌(n = 2)和产气荚膜梭菌(n = I)感染造成的肠炎。病毒学就BVDV和BTV测试了所有具有出血性疾病的动物。对于这些病毒试剂未显示出病毒抗原或病毒基因组的存在(数据未显示)。使用具有圆环病毒基因组的ORF-Vl中的结合位点的引物，通过巢式宽谱？0 ，就圆环病毒DNA的存在研究了从25个病例(第1，2，4-13，15-22，31，34，41，42，45号)收集的器官组织。在测定为阳性的样品中，琼脂糖凝胶电泳揭示了具有预期长度大约350bp的带。图4显示了 2号病例的阴性骨髓样品(泳道3)，当分析血液时，形成了具有预期大小的强烈的带(泳道4)。 在4号病例中，骨髓、肝、肾和血液是阳性的(泳道5-8)。当研究收集自其它小牛的样品时，检测到了较弱的带(泳道9、10和12);其它的保持为阴性(泳道11)。总计，研究组的25个病例中的5例(第2，4，5，717号)和8个对照中的I例在圆环病毒PCR中经测定为阳性。测序了 3个样品的PCR产物(小牛编号2，4和17)，当与GenBank数据库中存在的PCV2的核苷酸序列比较时，获得了 99%的同一性。在所研究的25个样品中，在圆环病毒特异性PCR中测定为阳性的5例样品以及从测定为阴性的样品中随机选择的4例被送往另一个实验室；常规使用的PCV2特异性PCR程序揭示所有病例均为阴性结果(数据未显示)。PCV2_Ha08株的全基因组序列分析基于PCR产物的序列，产生了反向引物，其能够扩增存在于4号病例(以骨髓、肝、肾和血液测定为阳性)的样品中的完整的圆环病毒基因组。这个株被称作PCV2-Ha08并进行了完整测序。PCV2-Ha08基因组的长度为1768个核苷酸。序列分析揭示出与PCV2 Rep和衣壳蛋白以及与0RF3的产物具有相似性的3个0RF。在非编码区I (NCRl)中存在茎环结构,大小为Ilbp并包含保守性九聚体的序列。PCV2_Ha08基因组序列与GenBank数据库序列的序列相似性搜索揭示出与PCV2分离体DK558control (EF565365)(源自丹麦的一头猪)的最高程度的同一性(99% )。推导的R印、Cap和0RF3产物的氨基酸序列与所选择的猪和牛圆环病毒的比较揭示出68. 5%至100%的同一性(表3)。在所有的病例中，PCV2-Ha08与PCV2b株密切相关并显示出与分离体DK558control (EF565365)的最高百分率的同一性。使用PCV2_Ha08、牛圆环病毒(AF109397)、10种具有最高序列相似性的圆环病毒(通过BLAST检索确定)和3个确定PCV2a、PCV2b和PCV2c亚型的参考株(Segales等人，2008)的全基因组序列进行了系统发生分析。如系统发生树所示(图6)，PCV2-Ha08在PCV2b亚型内明显地簇集；然而，其在该组内形成单独的分支。与此相反，牛圆环病毒(AF109397)，其之前被描述为感染加拿大的小牛，与PCV2a —起簇集。在图7和序列表中显示了 PCV2_Ha08的3个开放阅读框的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO :1，2，3 和 4)。PCV2-Ha09 和 PCV2_HalO 的分离根据上文描述的程序(见“圆环病毒全基因组的扩增”部分)获得了另外两个分离体。
从死于牛新生儿全血细胞减少症(BNP)症状的来自巴伐利亚的小牛的血液获得的分离体被称作PCV2-Ha09，并被完整测序。与PCV2_Ha08株相似，PCV2_Ha09基因组具有1768个核苷酸的长度并包含与PCV2-R印和衣壳蛋白以及与0RF3的产物具有相似性的3个ORF。也是死于BNP的来自Saxonia的小牛的肺和脑的分离体被称作PCV2_HalO，并被完整测序。PCV2-HalO基因组具有1767个核苷酸的长度，与PCV2_Ha08和PCV2_Ha09 —样，包含与PCV2-Rep和衣壳蛋白以及与0RF3的产物具有相似性的3个0RF。PCV2-Ha09和PCV-HalO的核苷酸序列以及PCV2_Ha09与PCV-HalO各自的3个开放阅读框的氨基酸序列显示于图8和9以及序列表中(PCV2-Ha09 SEQ ID NOs. 7，8，9和10 ；PCV2-HalO SEQ ID NOs. 11，12，13 和 14)。免疫组织化学
(IHC)，以检测PCV2抗原。I号病例的仅单一骨髓细胞显示出轻微的免疫反应活性(图5)。3号病例的所有组织和I号病例的淋巴组织对于PCV2抗原是阴性的。牛中的PCV2特异性抗体的检测通过聚合酶链式反应(PCR)对于受牛新生儿全血细胞减少症(BNP)影响的小牛中的PCV2的检测提出了关于其在BNP病理发生中的作用的问题。如果PCV2是BNP的病理发生中的主要参与者，则人们应该能够在受影响的兽群中检测到PCV2特异性抗体应答。我们尝试了通过竞争性方法检测牛中的PCV2特异性抗体将以PCV2-0RF2-抗原包被的ELISA平板与PBS中的血清稀释物(1/2，1/20，1/200，1/2000,1/20000)在37°C在湿室中温育90分钟。以PBS润洗测试板3次。在PBS中按1/500稀释缀合于辣根过氧化物酶的抗-PCV2单克隆抗体(mab)，并加入至测试板中。在湿室中在37°C再温育90分钟。以PBS润洗测试板之后，加入底物(TMB/H202)。通过加AH2SO4终止显色，在450nm测定光密度(OD)。作为参照，包括了两个商业化试剂盒(Synbiotics, Ingenasa)的阳性对照。不含血清的孔(PBS)作为阴性对照。其中包括了 2例PCV2阴性猪仔的血清、5例PCV2阳性猪仔的血清和3例来自受BNP影响的兽群的牛的血清。结果总结于图10。从1/20的稀释度开始，PCV2阴性和阳性的猪血清被清楚地分辨。来自受BNP影响的兽群的3例牛血清以剂量依赖性方式抑制PCV2特异性mab的结合。虽然没有观察到如猪血清那样的完全抑制，但是抑制超过了阳性对照物(例如Ingenasa PC OD = 0. 343)。这些数据高度指明了牛中的PCV2特异性免疫应答。讨论在此，我们描述了小牛的出血性疾病(HD，也称作出血性疾病综合征(HDS)和牛新生儿全血细胞减少症(BNP))，其可通过以下临床、病理和组织学标准与其它出血区别开最显著的临床迹象是自发性经皮肤的出血而无明显损伤，粘膜表面的出血和与标准管理程序相关的过量出血。与此一致，出血性疾病在幼牛出生的头一个月内显现。在所有病例中发现严重的骨髓低常增生(hypoplasia)，以至再生障碍(aplasia)。血液学结果在这些动物中的5只中表明了再生障碍性全血细胞减少症，这支持上述发现。由此造成的血小板减少症引起的出血性疾病被认为代表了疾病的主要致病机理。此外，血液学结果揭示了中度至严重的白细胞减少和粒细胞减少。该发现与所有动物中观察到的严重的骨髓枯竭和43%动物中的淋巴组织消减是一致的。推测增殖性淋巴细胞的缺乏引起了免疫抑制。这可以解释损伤的频发，例如肺炎和溃疡性口炎以及这些损伤中的一些中的炎性细胞的缺乏。在骨髓破坏之后，临床迹象的出现将很大程度上取决于血液细胞、尤其是血小板在循环中的半衰期。由于牛红细胞的寿命长，为120天，贫血不那么显著，除非并发出血(Loesch等人，2000，Valli，2007)。血小板的寿命仅有9天，嗜中性粒细胞在循环中的半衰期仅8_9h，更短(Paape等人，2003，Valli, 2007)。考虑到这些因素，我们假设破坏性损伤可能发生于新生小牛中。为了检测HD的病因学，研究了牛中的由于血小板减少造成的出血的数个诱因。在西门塔尔牛中描述了遗传性出血性体质，其被称作西门塔尔遗传性血小板病。其是由血小板的显著功能失调引起的(Steficek等人，1993)。在多数病例中西门塔尔牛受到影响，但是两头荷兰乳牛显示出等同的损伤。在德国南部，西门塔尔牛是最常见的品种，因此，在本研究中可能过度表现。不同品种中该疾病的不同的临床表现和系统发生分析结果表明没有常染色体显性或隐性遗传病。然而，该研究中的动物数目目前不足以达到确定性结论。、
由于血小板减少，非细胞病变2型BVDV感染可能导致严重的出血倾向(Ellis等人，1998，Rebhun等人，1989)。目前认为骨髓的成熟库的减少、循环的血小板数目的减少和改变的血小板功能造成出血(Ellis等人，1998，Walz等人，2001，Wood等人，2004)。然而，骨髓细胞构成在BVDV感染中不减少。与此相反，在本研究中报告的病例中持续发现严重的骨髓消减。此外，在所研究的任何小牛中未检测到BVDV。根据这一点，似乎可合理排除BVDV感染。已知数种毒素和真菌毒素在牛中引起出血。患病小牛的病史和关于动物饲养的信息给出了个体病例中可能的中度情况的一些指示，例如，真菌毒素或药物。然而，在适用于所有受影响的农场并对怀疑特定毒素给出理由的所给出的信息中没有一致性。但是，进行了毒素的一些随机测试，其保持阴性。特别地，S-(I，2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸(DCVC)或呋喃唑酮中毒(二者都引起骨髓再生障碍和出血)，适于所观察到的损伤。向小牛喂饲的以三氯乙烯提取的大豆油柏在较高剂量时产生致命性再生障碍性贫血和肾损伤。DCVC——三氯乙烯的代谢物，是该实体中的毒性因子。在实验中，施用10天的低剂量的DCVC (0. 4mg/kg/天，i.v.)导致骨髓的明显的非细胞性和广泛出血(Lock等人，1996)。目前，己烷被用于替代三氯乙烯用于提取大豆油。就三氯乙烯、DCVC及其代谢物N-乙酰基-DCVC检测总共4头小牛的血液、肾组织和尿，产生了阴性结果。抗生素呋喃唑酮用于治疗或预防人类和动物中的细菌和原虫感染。由于严重骨髓消减，在实验中，向喂奶小牛施用的每日剂量为4. 0至8. Omg/kg体重的呋喃唑酮产生致命性出血体质(Hoffmann-Fezer等人，1974,Hofmann等人，1974)。根据国家委员会的规定，向产生食物的动物施用呋喃唑酮被禁止。总之，研究了3头受影响的小牛，就呋喃唑酮而言被证明是阴性的。羊齿植物[欧洲蕨(Pteridium aquiIinum)]的摄取在食草动物中引起中毒症状。牛中的急性羊齿植物中毒产生不可逆的骨髓低常增生，导致再生障碍性全血细胞减少症。慢性摄取导致地方性动物血尿症并且与下尿道和消化道中的肿瘤相关(Maxie andNewman, 2007, Valli, 2007) 同样，在反刍动物和马中描述了蕨类真菌毒素中毒为全血细胞减少疾病(Harrach等人，1983，Valli，2007)。羊齿植物中毒和葡萄穗霉属中毒似乎在这些病例中是不可能的，因为症状应该在所有年龄的动物中出现，尤其是那些喂以含粗糙食物的食品的动物。在本研究中，饲料样品对于真菌毒素测定为阴性，也没有表明小牛或母牛对羊齿植物的摄取。特发性血小板减少性紫癜被描述为母牛中的罕见病况(Yeruham等人，2003)。该自身免疫疾病的诱因可能是免疫介导的血小板破坏(Lunn and Butler，1991)。已报告的血小板减少性紫癜与近期的多价肉毒中毒类毒素接种或分别针对乳头瘤病毒和梭状芽胞杆菌的灭活疫苗相关(Lunn and Butler, 1991, Yeruham等人,2003)。本研究中的小牛未经接种。此外，母牛中骨髓破坏的发生与所描述的免疫介导的血小板减少不相一致。已知B或E型多杀巴氏杆菌感染在小牛中引起出血性败血病(Rimler，1978)。内毒素在该感染的病理发生中发挥重要作用(Horadagoda等人，2001)。在本研究中，仅在3头小牛中存在多杀巴氏杆菌。未进行分型。在我们的研究中，器官样品的微生物研究揭示出患病小牛中的宽谱的潜在致病细菌。然而，未发现与出血性疾病相关的特定致病细菌的一致性证据。在29%的病例中(n= 16)，未检测到致病性细菌。在17头小牛中，分离的细菌与另外的炎性损伤、例如肺炎或肠炎相关。可以假设这些小牛中的淋巴组织和骨髓的消减导致了严重的与免疫抑制和次级感染相关的白细胞减少及粒细胞减少。
使用PCR，在一些临床患病的小牛中检测到了圆环病毒。目前，尚未令人信服地描述牛中的圆环病毒感染。关于圆环病毒特异性抗体的血清学研究产生了矛盾的结果(Allan等人，2000，Ellis等人，2001，Tischer等人，1995)。仅有一篇论文显示了可以在牛的肺组织和胎儿中检测到与PCV2密切相关的圆环病毒(Nayar等人，1999)。PCR结果的分析有时是困难的，尤其是就DNA污染而言。然而，在我们的研究中，我们使用了严格的方案以排除实验室的DNA污染。从I例样品成功扩增了完整PCV2基因组，这驳斥了短的PCR产物的污染。常规PCV2特异性PCR程序的阴性结果可以这样解释相对于宽谱PCR的巢式程序，该程序的灵敏性较低。圆环病毒PCV2_Ha08的全基因组序列分析揭示了与PCV2b的密切关系。源自牛组织的唯一圆环病毒序列(Nayar等人，1999)(可从GenBank数据库中获得)也与PCV2密切相关。然而，详细分析显示两个株簇集进入不同的亚型，因此，排除了能够感染牛的独特的PCV2株的存在。同时，分离了另外两个株PCV2-Ha09和PCV2-HalO。圆环病毒一般被认为具有窄的宿主范围，详细的系统发生分析表明了圆环病毒与它们的宿主的严格的共进化(Johne等人，2006)。然而，对于PCV2，已经描述了稍有不同的进化和流行病学式样，其与该病毒以前的有限传播的延长的时间段、然后是该病毒的最近的世界范围内的扩散是一致的(Hughes and Piontkivska, 2008)。可以推测PCV2已经获得了特定的允许迅速扩散的性质，并且在极少病例中，跨越物种屏障而传播。另外，在来自对照组的小牛之一中检测到了 PCV2。对照动物已经被送去进行病理学检查以确定除了出血性疾病以外的原因。PCV2与猪中的不同症状和疾病相关。据此可以推测圆环病毒造成小牛中的数种疾病。还可以想象具有HD的小牛中的免疫抑制增强对其它感染的易感性。在本例中，小牛中的PCV2检测可以反映出机会性感染。最后，众所周知的是，圆环病毒感染可能在不同的时间段、或甚至在被感染个体的终身维持临床隐性。圆环病毒感染将与很多所观察到的临床迹象一致，因为多数圆环病毒引起淋巴细胞消减，相关的CIAV也在被感染的鸡中引起再生障碍性贫血和出血。然而，在我们的研究中，使用可用的诊断方法，在所有临床病例中都未检出PCV2。同样，通过PCR进行的检测不一定意味着被复制性病毒感染。然而，在一些个体骨髓细胞中通过免疫组织化学方法检测到PCV2抗原指示着病毒基因组表达和复制。表格表I :动物病例和对照组的特性，包括通过PCR检测圆环病毒基因组序列和最终的
诊断
权利要求
1.圆环病毒(CV)核酸分子,其包含 (a)如SEQID NO 1所示的序列或其片段；和/或 (b)根据(a)的核苷酸序列的互补物。
2.权利要求I的核酸分子，其包含 (a)如SEQID NO 7所示的序列或其片段；和/或 (b)根据(a)的核苷酸序列的互补物。
3.权利要求I的核酸分子，其包含 (a)如SEQID NO 11所示的序列或其片段；和/或 (b)根据(a)的核苷酸序列的互补物。
4.权利要求1-3任一项的核酸分子，其中所述片段包含SEQID N0:l、7或11所示的至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或至少50个连续核苷酸，或其互补物。
5.权利要求1-4任一项的核酸分子 (a)与SEQID NO :1、7或11所示的核苷酸序列具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性； (b)在严格条件下与SEQID NO :1、7或11所示的核苷酸序列杂交；或 (c)(a)或(b)的互补物。
6.编码CV多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含 (a)如SEQID NO 1所示的核苷酸序列的区域(i)核苷酸51-995 (Itep)(ii)核苷酸1034-1735 (Cap) (iii)核苷酸357-671 (ORF3)； 和/或⑴、(ii)和/或(iii)的互补物； (b)在遗传密码简并性范围内对应于(a)的序列的核苷酸序列；或 (c)根据(a)或(b)的核苷酸序列的片段。
7.权利要求6的CV核酸,其中所述核酸分子包含 (a)如SEQID NO 7所示的核苷酸序列的区域(i)核苷酸51-995 (Itep)(ii)核苷酸1034-1735 (Cap) (iii)核苷酸357-671 (ORF3)； 和/或⑴、(ii)和/或(iii)的互补物 (b)如SEQID NO 11所示的核苷酸序列的区域(i)核苷酸51-995 (Itep) (ii)核苷酸1033-1734(Cap) (iii)核苷酸357-671 (ORF3);或 和/或⑴、(ii)和/或(iii)的互补物 (c)在遗传密码简并性范围内对应于(a)或(b)的序列的核苷酸序列；或 (d)根据(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的片段。
8.权利要求6或权利要求7的核酸分子，其中所述多肽或其片段包含如SEQID NO2-4,8-10或12-14所示任意氨基酸序列的至少6个、至少8个、至少10个、至少20个或至少30个连续氨基酸。
9.权利要求6-8任一项的CV核酸，其编码与SEQID NO =2-4,8-10或12-14所示的氨基酸序列的任意项具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%同一丨I"生的多肽。
10.权利要求1-9任一项的核酸分子，其可操作地连接于异源表达控制序列。
11.以权利要求1-10任一项的核酸分子转化或转染的非人宿主细胞。
12.权利要求1-10任一项的核酸分子，其用作诊断剂。
13.权利要求12的核酸分子，其携带报告基团。
14.权利要求12或13的核酸分子，其用于诊断出血性体质(HD)。
15.权利要求14的核酸分子，其用于诊断牛中的HD。
16.权利要求1-10任一项的核酸分子，其用作治疗剂。
17.权利要求16的核酸分子，用于预防和/或治疗HD。
18.权利要求16或17的核酸分子，用于预防和/或治疗牛中的HD。
19.权利要求16-18任一项的核酸分子,其作为基于核酸的疫苗或用于产生基于多肽的疫苗。
20.由根据权利要求1-10任一项的核酸分子编码的多肽。
21.圆环病毒(CV)多肽，其包含 (a)选自下列的氨基酸序列 ⑴氨基酸序列SEQ ID NO 2 (Rep)， (ii)氨基酸序列SEQ ID NO 3(Cap)， (iii)氨基酸序列SEQ ID NO 4(ORF3);或 (b)其片段。
22.权利要求21的圆环病毒(CV)多肽，其包含 (a)选自下列的氨基酸序列 ⑴氨基酸序列SEQ ID NO 8和12 (Rep)，(ii)氨基酸序列SEQ ID NO 9 和 13 (Cap)， (iii)氨基酸序列SEQ ID NO 10 和 14(ORF3);或 (b)其片段。
23.权利要求20-22任一项的多肽，其包含如SEQID NO :2-4、8_10或12-14所示任意氨基酸序列的至少6个、至少8个、至少10个、至少20个或至少30个连续氨基酸。
24.权利要求20-23的多肽，其与SEQID NO :2-4、8_10或12-14所示的氨基酸序列的任意项具有至少90 %、至少92 %、至少94%、至少96 %、至少98 %或至少99 %的同一性。
25.权利要求20-24任一项的多肽，其用作诊断剂。
26.权利要求25的多肽，其携带报告基团。
27.权利要求25或26的多肽，其用于诊断HD，特别是牛中的HD。
28.权利要求20-24任一项的多肽，其用作免疫原。
29.权利要求28的多肽，其用于产生抗-CV抗体。
30.权利要求20-24任一项的多肽，其用于预防和/或治疗HD，特别是牛中的HD。
31.权利要求30的多肽，其用作疫苗。
32.针对权利要求20-24任一项的多肽的抗体或其抗原结合片段。
33.权利要求32的抗体，其特异于CV株PCV2-Ha08。
34.权利要求32或33的抗体，其用作诊断剂。
35.权利要求32或33的抗体，其用于预防和/或治疗HD，特别是牛中的HD。
36.包含权利要求1-10任一项的核酸分子的圆环病毒。
37.权利要求36的病毒，其是灭活的圆环病毒。
38.权利要求37的病毒，其是减毒的圆环病毒。
39.包含权利要求1-10任一项的核酸分子、或权利要求20-24任一项的多肽、权利要求32或33的抗体、或权利要求36-38任一项的病毒，以及可接受的载体、稀释剂和/或佐剂的组合物。
40.权利要求39的组合物，其是疫苗。
41.权利要求40的组合物，其是基于多肽的疫苗。
42.权利要求40的组合物，其是基于病毒的疫苗。
43.权利要求39的组合物，其是免疫原性组合物。
44.权利要求43的组合物，其是基于多肽的免疫原性组合物。
45.权利要求43的组合物，其是基于病毒的免疫原性组合物。
46.权利要求39-45任一项的组合物，其用于诊断用途。
47.权利要求39-45任一项的组合物，其用于治疗用途。
48.诊断HD、特别是牛中的HD的方法，其包括 将来自待诊断的受试者的样品与权利要求46的诊断组合物接触，并测定所述样品中CV或抗-CV抗体的存在和/或数量。
49.预防或治疗HD、特别是牛中的HD的方法，其包括 向有此需要的受试者施用有效量的权利要求47的治疗组合物。
全文摘要
本发明涉及作为牛中的骨髓再生障碍伴出血性疾病的诱因剂的新的圆环病毒(CV)。本发明提供了用于诊断和治疗用途的新的核酸和蛋白序列。
文档编号C07K14/01GK102711816SQ201080047391
公开日2012年10月3日 申请日期2010年10月22日 优先权日2009年10月22日
发明者B·沙德, E·凯普, H·米勒, J·伯切尔, M·Y·哈拉米 申请人:动物健康服务拜恩非营利组织, 莱比锡大学