针对全血的卵巢癌细胞检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了针对全血的卵巢癌细胞检测试剂盒。所述试剂盒主要包含能够特异性识别卵巢癌细胞人附睾蛋白（HE4）抗原的HE4山羊多克隆抗体及生物素化的牛血清蛋白（BSA）-叶酸（FA），链霉亲和素化的纳米磁珠（SA-IO）、链霉亲和素化的QDs（SA-QDs）、生物素化抗HE4兔抗羊IgG以及连接试剂等。所述试剂盒可利用免疫磁珠的可富集特性高效分离卵巢癌患者全血中的癌细胞，并通过SA-QDs与生物素化的HE4抗原抗体复合物特异性结合靶向卵巢癌细胞，实现多重信号协同放大。该试剂具有较强的灵敏性和特异性，在卵巢癌的早期检测中具有极广阔的应用前景。
【专利说明】针对全血的卵巢癌细胞检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术与生物医学领域。具体地，本发明提供了一种检测卵巢癌的 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，其发病率位于女性生殖系统肿瘤中第三位，病死率 却居于首位。大多数卵巢癌被确诊时已是晚期，其5年生存率仅为30%，早期诊断和治疗卵 巢癌是改善患者预后，提高其生存率的重要因素。目前，临床上卵巢癌常见的筛选方法有2 种：1)经阴道超声检查；2)血清CA125检测。二者都存在其局限性。研究表明，肿瘤患者外 周血中循环肿瘤细胞（CTCs)的出现早于可见实体瘤，因此，寻找一种高特异性富集人体外 周血中CTCs的方法是目前研究的热点。
[0003] 免疫磁分离技术是CTCs快速分离富集技术的重要组成部分之一，该技术涉及的 免疫磁珠既可以结合活性蛋白质或配体又可以被磁铁吸引，经过一些处理，抗体或配体与 磁珠结合后，可特异性地与靶抗原结合形成磁珠-抗体(配体）-抗原复合物，然后在外加 磁场的作用下将含有靶抗原的目的细胞与其他细胞分离，从而达到分离纯化目的细胞的作 用。该技术已广泛应用于各种肿瘤的诊断、治疗及预后研究，但在卵巢癌早期检测中却鲜少 研究。由于叶酸受体（FR)在大多数正常组织中表达水平极低，而在卵巢癌细胞表面表达高 为95%，FA与FR的结合亲和力为0· 19 nM，因此，本发明将FA连接到Fe2O3及Fe3O4复合纳 米晶体表面，使磁珠具有靶向识别和磁性分离双重功能，从而实现卵巢癌细胞的富集，有效 提高检测灵敏度实现早期检测卵巢癌。
[0004] 人附睾蛋白4 (HE4)是一种乳清酸性4-二硫化中心（WFDC)蛋白，此蛋白大概为 2(T25Kd。HE4在卵巢癌细胞质内表达量高为93%。一项对卵巢癌相关的大量生物标志物 的评价研究表明HE4检测在早期诊断卵巢癌中具有最高的灵敏度，其敏感度是82. 7%而 CA125却仅有45. 9%。因此，HE4作为一种新的肿瘤标志物，能够帮助进行卵巢癌的早期检 测及风险评估。
[0005] 量子点（QDs)作为一种新型荧光纳米晶，具有一些独特的荧光性能，如量子产率 高、光化学稳定性高好，不易光解等。目前将QDs与抗体结合制备荧光免疫探针的报道很 多，但是QDs免疫荧光探针在对非常微量的物质进行检测时仍存在信号低、检测灵敏度低 等问题。生物素-亲和素系统是一种新型信号放大标记技术，利用亲和素修饰QDs后，QDs 可以很容易的与生物素化的抗体结合，有效放大其荧光信号，从而实现超灵敏性卵巢癌细 胞检测。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的关键技术问题在于针对目前尚无的全血中卵巢癌细胞快速检 测试剂盒提供一种基于磁性分离和QDs免疫荧光标记检测卵巢癌细胞的试剂盒。利用免疫 磁珠的可富集特性和QDs荧光信号强度变化，组建多重信号协同放大，具有超高灵敏度的 全血中快速检测卵巢癌细胞的试剂盒。该试剂盒可以提高卵巢癌检测的分辨率、灵敏度及 特异性，更为有效进行卵巢癌的早期检测及风险评估。
[0007] 本发明公开的针对全血的卵巢癌细胞检测试剂盒包括：HE4山羊多克隆抗体，生 物素化的牛血清蛋白（BSA)-叶酸（FA)，链霉亲和素化的纳米磁珠（SA-I0)，链霉亲和素化 的QDs (SA-QDs )，生物素化兔抗羊（HE4) IgG。
[0008] 所述的纳米磁珠是Fe2O3及Fe3O 4复合物纳米磁珠，粒径为25nm，表面羧基功能化。 HE4山羊多克隆抗体及生物素化BSA-FA分别可特异性识别卵巢癌细胞质中HE4抗原及细胞 膜表面的FR，其中HE4为过表达于卵巢癌细胞质高尔基体上（93%)的抗原，其在正常组织中 表达量较低。FR在卵巢癌细胞表面的表达量高达95%，而在大多数正常组织中表达量极低。
[0009] 所述的SA-QDs，其制备方法如下：1)100 yL 8 ymol/L QDs溶于100 yL pH为 5. 5的BB，按照QD:EDC摩尔比1:1 000, QD:NHS摩尔比1:2 000加入EDC/NHS，室温反应 5?10 min ;2)调整溶液pH到8?8. 5,加入SA L 056 mg，持续混匀2 h后，加入10 μ L含5% BSA的PBS封闭10 min终止反应；3) SA-QDs复合物10 000 r/min，离心5 min除去沉淀 后，使用2 mL pH为7的BB在100K超滤管中洗漆，最后重悬于0· I mL pH为7的BB中。
[0010] 所述的生物素化BSA-FA，其制备方法如下：1) FA-PEG-NH2的偶联：FA 6 mg溶解 于600 μ L二甲基亚砜中，加入N, N-二环己基碳二亚胺（DCC) 3 mg、N, N-轻基琥拍酰亚胺 (NHSS) 3 mg及三乙胺60 μ L共同暗室反应4 h，加入双氨基聚乙二醇30 mg暗室反应过 夜；反应完全后离心，使用_20°C丙酮沉淀，乙酸乙酯洗涤3次，置于通风柜中干燥并避光保 存；2)FA-PEG-BSA的偶联=FA-PEG-NH 2 5 mg、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐 酸盐（EDC) 2. 5 mg、NHSS 2. 5 mg溶于500 μ L pH为7的硼酸缓冲液（BB)中共同室温反 应10 min ;加入BSA 8. 35 mg，室温反应2 h，透析纯化3次后于4°C冰箱保存；3)生物素化 BSA-FA的制备：按长链生物素：FA-PEG-BSA摩尔比20:1混合后室温孵育30 min，将混合 溶液于4°C超纯水透析3 d，4°C保存备用。
[0011] 所述的生物素化BSA-FA主要是利用大分子BSA上丰富的氨基活性基团，将多量生 物素及FA富集在BSA上，从而增加 FA与细胞结合几率及生物素与IO-SA结合数量实现放 大。
[0012] 所述的生物素化抗HE4兔抗羊IgG，其制备方法如下：1)取生物素15 mg、EDC 2. 4mg、NHSS 3. 6mg溶解于2 mL (λ 02 M pH为6. 5磷酸盐缓冲液（PBS)中；2)加入抗HE4 兔抗羊IgG 5.3 mg，室温置于混匀仪上搅拌30 min ;3)上述溶液减压旋干溶剂，去离子水 溶解，在PBS和去离子水中透析I d，-20°C储存。
[0013] 所述SA-IO通过SA与IO经由共价键偶联制备；其制备方法如下：1)400 μ L 5mg/ mL IO 溶于 400 μ L pH 为 5· 5 的 BB，按照 I0:EDC 摩尔比 1:1 000，I0:NHS 摩尔比 1:2 000 加入EDC/NHS，室温反应5?10 min ;2)调整溶液pH到8?8. 5,加入SA 0. 08 mg，持续混匀2 h后，加入20 μ L含5% BSA的PBS封闭10 min终止反应；3)加入适量pH为7的BB混匀， 于1. 〇特斯拉磁分离器中分离纯化IO-SA 1(T24 h，重复2次后重悬于I mL pH为7的BB 中，新制磁珠浓度为2 mg/mL。其中，5%BSA /PBS可通过BSA上的活性氨基与偶联产物中IO 或QDs表面残留的羧基结合，减少偶联产物的非特异性吸附。
[0014] 所述试剂盒还包括固定液（4%多聚甲醛/三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液（TBS) pH 7. 6)、渗透液（TBS+0. 1%吐温-20 pH 7. 6)、封闭液（0. 1%酪蛋白+5%BSA+TBS pH 7. 6)，洗涤 液（TBS pH 7· 6)。
[0015] 所述的检测样品为全血。
[0016] 所述的QDs为CdSSe/ZnS，发射波长为550nm。
[0017] 本发明公开了上述试剂盒在全血中富集卵巢癌细胞的应用，并通过特异性抗体修 饰化的QDs进行荧光标记，通过倒置荧光显微镜观察计数分离效率及荧光信号采集系统定 量分析获得最终检测结果。
[0018] 有益效果：卵巢癌在妇科恶性肿瘤中病死率高居第一位，建立简便、快速的卵巢癌 细胞检测方法不仅对肿瘤的早期发现，还对肿瘤患者化疗药物的快速评估、个体化治疗（临 床筛药、耐药性的检测)、肿瘤复发的监测以及肿瘤新药的开发具有重要指导意义。
[0019] 本发明将抗体分子与生物素偶联，避免了常规方法中将抗体分子偶联于QDs或磁 珠表面导致抗体活性降低和空间位阻大的缺点。
[0020] 本发明利用大分子BSA上丰富的氨基活性基团，将多量生物素及FA富集在BSA 上，从而增加 FA与细胞结合几率及生物素与IO-SA结合数量实现放大。
[0021] 本发明根据荧光免疫的双抗体夹心原理，利用免疫磁珠分离速度快、效率高、操作 简便等优点，结合QDs光化学稳定性高，不易光解等优良的光学特性，分别以免疫磁珠和 QDs为载体连接生物素化的BSA-FA和抗HE4兔抗羊IgG，使得快速、准确地全血中癌细胞的 检测得以实现。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1基于磁性分离的SK0V3细胞及A549细胞的分离效率图，其中SK0V3-2为未加 入生物素化BSA-FA反应的单纯IO-SA磁分离时SK0V3细胞的分离效率。
[0023] 图2 SK0V3细胞和A549细胞的QDs免疫荧光标记染色结果。
【具体实施方式】
[0024] 通过以下实施例进一步说明本发明，但本发明的权利要求不仅限于实施例。
[0025] 下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。
[0026] 实施例中用到的磁性纳米粒子SHP-05-25与QD550购自美国Ocean NanoTech公 司，生物素、SA购于上海华蓝化学公司。HE4山羊多克隆抗体（C-12)购于圣克鲁斯生物技 术公司，兔抗羊（HE4)IgG (BA1040)购于博士德生物技术公司，DCC，NHSS，NHS，EDC购买 于美国Sigma-Aldrich公司，BSA购自Biosharp公司，叶酸购自郑州嵩椎商贸有限公司，倒 置荧光显微镜为日本Nikon公司产品，荧光信号采集系统定量分析为网上下载ImageJ 2x 软件分析所得。
[0027] 纳米磁珠是Fe2O3及Fe3O 4复合物纳米磁珠，粒径为25nm，表面羧基功能化。
[0028] 所述的QDs为CdSSe/ZnS，发射波长为550nm。
[0029] 实施例中简写： 量子点（QDs)、卵巢癌细胞人附睾蛋白（HE4)、牛血清蛋白（BSA)、叶酸（FA)、链霉亲和 素化的纳米磁珠（SA-I0)、链霉亲和素化的QDs (SA-QDs)、叶酸受体（FR)。
[0030] 固定液（4%多聚甲醛/三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液（TBS) pH 7. 6)、渗透液 (丁85+0.1%吐温-20?!17.6)、封闭液（0.1%酪蛋白+5%85六+了85?!17.6)，洗涤液（了85?!1 7· 6)。
[0031] 实施例1针对全血的卵巢癌细胞检测试剂盒检测卵巢癌SK0V3细胞 1制备生物素化BSA-FA I) FA-PEG-NH2的偶联：FA 6 mg溶解于600 μ L二甲基亚砜中，加入DCC 3 mg、NHSS 3 mg及三乙胺60 μ L共同暗室反应4 h，加入双氨基聚乙二醇30 mg暗室反应过夜；反应 完全后离心，使用-20°C丙酮沉淀，乙酸乙酯洗涤3次，置于通风柜中干燥并避光保存；2) FA-PEG-BSA 的偶联：FA-PEG-NH2 5 mg、EDC 2. 5 mg、NHS 2. 5 mg 溶于 500 μ L pH 为 7 的 BB中共同室温反应10 min ;加入BSA 8. 35 mg，室温反应2 h，透析纯化3次后于4°C冰箱 保存；3)生物素化BSA-FA的制备：按长链生物素：FA-PEG-BSA摩尔比20:1混合后室温孵 育30 min，将混合溶液于4°C超纯水透析3 d，4°C保存备用。
[0032] 2制备生物素化抗HE4兔抗羊IgG 1)取生物素 15 mg、EDC 2. 4mg、NHSS 3. 6mg 溶解于 2 mL 0· 02 M pH 为 6. 5 PBS 中；2) 加入抗HE4兔抗羊IgG 5.3 mg，室温置于混匀仪上搅拌30 min ;3)上述溶液减压旋干溶剂， 去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析I d，-20°C储存。
[0033] 3 制备 SA-IO 1)400 yLI0(浓度为 5mg/mL)溶于 400 yLpH 为 5.5 的 BB，按照 I0:EDC 摩尔比 1:1 000，I0:NHS摩尔比l:2 000 加入EDC/NHS，室温反应5?10min;2)调整溶液pH到8?8·5， 加入SA 0· 08 mg，持续混匀2 h后，加入20 μ L含5% BSA的PBS封闭10 min终止反应； 3)加入适量pH为7的BB混匀，于I. 0特斯拉磁分离器中分离纯化IO-SA 1(Γ24 h，重复2 次后重悬于I mL pH为7的BB中，新制磁珠浓度为2 mg/mL。
[0034] 4 制备 SA-QDs 1)100 μ L QDs(浓度为 8 μ M)溶于 100 μ L pH 为 5. 5 的 BB，按照 QD:EDC 摩尔比 1:1 000，QD:NHS摩尔比l:2 000 加入EDC/NHS，室温反应5?10min。2)调整溶液pH到8?8·5， 加入SA 1. 056 mg，持续混匀2 h后，加入10 μ L含5% BSA的PBS封闭10 min终止反应。 3 )QD-SA复合物10 000 r/min，离心5 min除去沉淀后，使用2 mL pH为7的BB在100K超 滤管中洗涤，最后重悬于〇. I mL pH为7的BB中。
[0035] 5制备FA功能修饰的10 (IO-FA) I) FA-PEG-NH2的偶联：FA 6 mg溶解于600 μ L二甲基亚砜中，加入DCC 3 mg、NHSS 3 mg及三乙胺60 μ L共同暗室反应4 h，加入双氨基聚乙二醇30 mg暗室反应过夜，；2) IO 与 FA-PEG-NH2 的偶联：200 μ L IO (浓度为 5mg/mL)溶于 200 μ L pH 为 5. 5 的 BB，按 照I0:EDC摩尔比1:1 000, I0:NHS摩尔比1:2 000加入EDC/NHS，室温反应5?10 min。2) 加入500 μ L pH为8?8. 5 BB，加入FA-PEG-NH2 7 mg，持续混匀2 h后，加入10 μ L含5% BSA的PBS封闭10 min终止反应；3)加入适量pH为7的BB混勻，于I. 0特斯拉磁分离器 中分离纯化IO-FA 1(Γ24 h，重复2次后重悬于500 μ L pH为7的BB中，新制磁珠浓度为 2 mg/mL〇
[0036] 6 SK0V3细胞的染色及计数 1)获取对数生长期的卵巢癌SK0V3细胞4 mL，加入8 yL Hoechest核染料，置于37°C、 5% C02培养箱内孵育30 min;l 000 r/min，离心30 s后弃上清，加入PBS 10 mL清洗，1 000 r/min I min (重复清洗2次）；用4 mL 3%BSA /PBS重悬。2)用细胞计数板计数（25 大格*16小格)SK0V3细胞的数量，荧光显微镜下计数原则为：压线细胞数左不数右、数上不 数下。
[0037] 7 IO-FA磁性纳米粒子全血分离SK0V3细胞 1)按照1:1〇7 HiL将预染色的SK0V3细胞添加到I mL全血中，混匀仪上室温充分混匀 I h后，按照IO-FA与FR摩尔比20:1加入IO-FA磁性纳米粒子，持续混匀30 min，形成复 合物IO-FA-细胞；2)将IO-FA-细胞复合物置于I. OT磁分离器中磁分离I h，小心弃上清， 用50 μ L PBS重悬置于24孔细胞培养板内。
[0038] 8基于生物素-SA及BAS介导的磁性纳米粒子磁信号放大全血分离SK0V3细胞 1)按照1: 1〇7 mL将预染色的SK0V3细胞添加到I mL全血中，充分混匀后，按照生物 素化BSA-FA与FR摩尔比为5:1加入生物素化BSA-FA，混匀仪上室温混匀I h，形成的复 合物为生物素化BSA-FA-细胞；2)按照IO-SA与生物素化BSA-FA摩尔比4:1加入I0-SA， 持续混匀30 min，形成的复合物为IO-SA-生物素化BSA-FA-细胞；3)将IO-SA-生物素化 BSA-FA-细胞复合物置于I. OT磁分离器中磁分离I h，小心弃上清，用50 μ L PBS重悬置 于24孔细胞培养板内。
[0039] 9 SK0V3细胞的量子点免疫荧光染色 1)采用固定液在常温下固定细胞15min，立即用洗涤液漂洗3次；2)用渗透液常温下 渗透细胞20min，洗涤液冲洗3次后用封闭液封闭细胞上的非特异性结合位点Ih ;3)除去 封闭液，加入适量HE4山羊多克隆抗体与细胞在常温下共孵育2h。洗涤液冲洗3次(每次 5min)后，加入生物素化-抗HE4兔抗羊IgG复合物与细胞在常温下共孵育Ih ;4)洗涤液 冲洗3次(每次5min)，加入适量SA-QDs复合物反应30min，冲洗3次脱去背景色后于倒置 荧光显微镜下观察荧光信号并通过荧光信号采集系统进行定量分析及计算分离效率。
[0040] 10磁珠非特异性对照实验 1)选用SK0V3细胞，步骤1-4同前；2)细胞计数同步骤6, SK0V3细胞全血磁分离过程 不加入生物素化BSA-FA，其余操作步骤同8、9。
[0041] 11 QDs非特异性对照实验 1)选用SK0V3细胞，步骤1-8同前。2)全血磁分离后的SK0V3细胞的量子点免疫荧光 染色过程中不加入HE4山羊多克隆抗体及生物素化-抗HE4兔抗羊抗体复合物，其余步骤 同9。
[0042] 12同期对照组实验 选用FR表达阴性及HE4低表达的肺癌A549细胞，其余操作步骤同前1-9。
[0043] (上述步骤7、8、10、12为同等条件下同时进行的实验，且实验次数不少于3次；步 骤9和11为同时进行的鉴定实验） 11结果： I) Hoechst核染料可充分定位卵巢癌SK0V3细胞，经由生物素化-BSA-FA/I0-SA和 IO-FA免疫磁分离及QDs-生物素化-抗HE4兔抗羊抗体-抗原复合物标记的SK0V3,细胞 数目均较多，其中，生物素化BSA-FA/I0-SA对SK0V3细胞的分离效率经多次实验可高达 87. 1%，而IO-FA的分离效率最高为43%，同等反应条件下A549细胞捕获数目稀少，其捕获效 率仅有23. 3%及23. 1%。此外，磁珠的非特异性实验表明，在没有FA参与的情况下，IO-SA 的分离效率均不高，其对SK0V3细胞的分离效率约为8. 7%左右。而对A549细胞的分离效 率也在8. 6%左右（图1)。结果表明，FA可特异性识别卵巢癌SK0V3细胞，经生物素-SA及 BAS介导的磁性纳米粒子磁信号放大系统可明显提高细胞捕获效率，提高细胞检测灵敏性。 (图1) 2) 经由生物素化-BSA-FA/IO-SA和IO-FA免疫磁分离及QDs-生物素化-抗HE4兔抗 羊抗体-抗原复合物标记的SK0V3细胞，细胞质内均可见明显的绿色荧光，而磁分离捕获的 A549细胞经标记后未见明显绿色荧光，不加入HE4山羊多克隆抗体及生物素化-抗HE4兔 抗羊抗体复合物由SA-QDs非特异性标记的SK0V3细胞，细胞质内未见明显绿色荧光。（图 2) 3) 临床实际样本中，20例卵巢癌患者外周血和100例健康女性外周血使用该试剂盒检 测后表明，16例卵巢癌患者外周血中发现循环肿瘤细胞，而在健康女性外周血中未发现循 环肿瘤细胞。（表1) 表1
【权利要求】
1. 针对全血的卵巢癌细胞检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括I) HE4山羊多克 隆抗体；2)生物素化的BSA-FA ;3)链霉亲和素化的纳米磁珠SA-IO ;4)链霉亲和素化的QDs 即SA-QDs ;5)生物素化抗HE4兔抗羊IgG ;所述的SA-QDs，其制备方法如下：1) 100 ii L 8 iimol/LQDs 溶于 100 iiLpH 为 5.5 的 BB，按照 QD:EDC 摩尔比 1:1 000，QD:NHS 摩尔比 1:2 000加入EDC/NHS，室温反应5?10 min ;2)调整溶液pH到8?8. 5,加入SA 1.056 mg，持 续混匀2 h后，加入10 ii L含5% BSA的PBS封闭10 min终止反应；3) SA-QDs复合物10 000 r/min，离心5 min除去沉淀后，使用2 mL pH为7的BB在100K超滤管中洗涤，最后重 悬于0? I mL pH为7的BB中。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的纳米磁珠是Fe2O3及Fe3O 4复合 物纳米磁珠，粒径为25nm，磁珠表面为羧基功能化。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的生物素化BSA-FA，其制备方法如 下：I) FA-PEG-NH2的偶联：FA 6 mg溶解于600 ii L二甲基亚砜中，加入N，N-二环己基碳 二亚胺（DCC)3 mg、N，N-羟基琥珀酰亚胺（NHSS)3 mg及三乙胺60 ii L共同暗室反应4 h， 加入双氨基聚乙二醇30 mg暗室反应过夜；反应完全后离心，使用-20°C丙酮沉淀，乙酸乙 酯洗涤3次，置于通风柜中干燥并避光保存；2)FA-PEG-BSA的偶联=FA-PEG-NH 2 5 mg、l-乙 基-3_[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC)2.5 mg、NHSS 2.5 mg溶于500 iiL pH 为7的硼酸缓冲液（BB)中共同室温反应10 min ;加入BSA 8. 35 mg，室温反应2 h，透析纯 化3次后于4°C冰箱保存；3)生物素化BSA-FA的制备：按长链生物素：FA-PEG-BSA摩尔比 20:1混合后室温孵育30 min,将混合溶液于4°C超纯水透析3 d,4°C保存备用。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的生物素化抗HE4兔抗羊IgG,其 制备方法如下：1)取生物素15 mg、EDC 2. 4mg、NHSS 3. 6mg溶解于2 mL 0. 02 M pH为6. 5 磷酸盐缓冲液（PBS)中；2)加入抗HE4兔抗羊IgG 5. 3 mg，室温置于混匀仪上搅拌30 min ; 3)上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析I d，-20°C储存。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述SA-IO通过SA与IO经由共价键偶 联制备；其制备方法如下：1)400 UL 5mg/mL IO溶于400 iiL pH为5.5的88，按照1050〇 摩尔比1:1 000，I0:NHS摩尔比1:2 000加入EDC/NHS，室温反应5?10 min;2)调整溶液pH 到8?8. 5,加入SA 0? 08 mg，持续混匀2 h后，加入20 ii L含5% BSA的PBS封闭10 min终 止反应；3)加入适量pH为7的BB混匀，于I. 0特斯拉磁分离器中分离纯化IO-SA KT24 h，重复2次后重悬于I mL pH为7的BB中，新制磁珠浓度为2 mg/mL。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括固定液、渗透液、封 闭液，洗涤液。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的检测样品为全血。
8. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的QDs为CdSSe/ZnS，发射波长为 550nm〇
【文档编号】G01N33/574GK104316683SQ201410538494
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】许恒毅, 傅芬, 聂丽菊, 叶称连, 张婉怡, 李福来 申请人:南昌大学