专利名称：一种从植物药材柳杉叶马尾杉中提取高纯度石杉碱甲和石杉碱乙的方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物药材柳杉叶马尾杉中提取高纯度石杉碱甲和石杉碱乙的 方法，属于天然产物化学的技术领域。
背景技术：
石杉碱甲和石杉碱乙由石杉科植物中提取的一种生物碱，是一强效的胆碱酯酶可 逆性抑制剂，其作用特点与新斯的明相似，但作用维持时间比后者为长。对真性胆碱酯酶具 有选择性的抑制，抑制强度是假性胆碱酯酶的数千倍；抑制方式为竞争性和非竞争性的混 合型抑制，与单纯竞争性抑制剂有显著不同；易通过血脑屏障进入中枢，兼具有中枢及外周 治疗作用；有效时间长；从胃肠道吸收良好；安全指数大；稳定性好。它易透过血脑屏障，对 脑内乙酰胆碱脂酶经注射或ig该药，有明显促进学习、记忆过程或明显改善记忆障碍的作 用，且选择性分布在皮质海马等与学习、记忆有关的脑区.I(AchE)具有强效抑制作用，明 显提高脑内乙酰胆碱水平，是AchE —种可逆性的抑制剂石杉碱甲片用于治疗良性衰老性 遗忘症(BenigaSenescent Forgetfulners BSF)禾口阿尔米末病(Alzeheimers Disease,AD) 有良好疗效。到目前为止，已在多种植物中发现了石杉碱甲和石杉碱乙，如石杉科的千层塔、蛇 足石杉、皱边石杉、四川石杉、金丝条马尾杉、、闽浙马尾杉等。目前石杉碱甲和石杉碱乙的 来源主要是从千层塔，含量极为有限。千层塔中的石杉碱甲的含量被认为是最高的，也仅达 0. 9-2/ 万。。因此，公开号为 CN200710099907. 8、CN200410042760. 5、CN200710098440. 5、 CN200910014866. 7的中国专利介绍了一种从中药千层塔中提取石杉碱甲和石杉碱乙的方 法，是将千层塔粉碎，用酸水提取；过大孔树脂柱或者制备色谱分离，减压浓缩，萃取得石杉 碱甲和石杉碱乙精品。这些专利都是以千层塔为原材料进行提取石杉碱甲和石杉碱乙，现 在资源面临溃乏，价格从原来的20元/kg涨到了 160元/kg。原材料的成本增加，98%白藜 芦醇的价格从4000元/kg涨到了 10000元左右/kg。公开号为CN1448390的中国专利介绍了一种从中草药千层塔中提取石杉碱甲的 方法，它依次包括以下工艺步骤原料处理粉碎一浸渍一浓缩一萃取(反复)一柱层析一结 晶一高效液相色谱选段一浓缩干燥一成品。本方法由于其原料采用超微粉粉料，并利用制 备型高效液相色谱仪进行分离提纯，可使收率达到十万分之七至九，提高收率30 %，纯度也 得以提高，达到98%以上，受制于设备及其原料，不利于工业化大生产。柳杉叶马尾杉，石杉科小型蕨类。株高20 25厘米，茎簇生，直立，上部倾斜至下 垂，3 4回二叉分枝，叶螺旋状排列，斜展而外指，孢子叶与营养叶同大同形，孢子囊圆肾 形。全草入药，有活络祛瘀、清热解毒、解表透疹之功效。产于江西、浙江、台湾等省区。迄今 为止的文献对柳杉叶马尾杉中石杉碱甲和石杉碱乙的提取工艺没有研究。而且柳杉叶马尾 杉中石杉碱甲和石杉碱乙含量较高，约为9-20/万，是千层塔的10倍左右，其价格便宜，更 有利于替代千层塔。因而，对柳杉叶马尾杉进行深加工意义非凡。探索从柳杉叶马尾杉中石杉碱甲和石杉碱乙，其意义相当远大，不但可以解决石杉碱甲和石杉碱乙生产原料问题， 还可以增加农民收入，服务该中药的地方经济。
发明内容
种从植物药材柳杉叶马尾杉中提取高纯度石杉碱甲和石杉碱乙的方法。将经过前 处理的柳叶杉马尾杉干燥全株粗粉加入一定量的溶剂回流提取，采用离子交换树脂吸附操 作，浓缩，用有机溶剂萃取，反相柱层析，脱色处理后结晶和重结晶得到高纯度石杉碱甲和 石杉碱乙纯品。(1)粉碎干燥柳杉叶马尾杉干燥粉碎至1-10目，待用；(2)加去离子水配成饱和的酸水PH值=5，提取2次，溶剂用量按其体积配比分别 为原料的10倍、8倍，提取时间分别为2、1. 5小时，合并各次提取液，过滤得滤液；(3)将所得的滤液上阳离子交换树脂(型号001 X 3，长沙大禹化工有限公司)，吸 附30min后，用3倍上柱液体积的氨水洗脱，浓缩，调PH值在中性后静置10h，过滤得滤液， 浓缩至原体积的1/15 ；(4)将滤液上反相色谱柱(型号TSK_L，日本东曹株式会社)分离，分段收集液 体，得液体1，液体2 ；(5)分别用乙酸乙酯和石油醚(体积比=1 1)混合溶液萃取，得到石杉碱甲粗 品和石杉碱乙粗品；(6)分别往石杉碱甲和石杉碱乙粗品中加80%乙醇按其体积配比加入100-150倍 量，加热充分溶解后加0.1倍量的弱酸性活性炭，间歇搅拌脱色lh，趁热过滤，滤液浓缩至 原体积的1/15，结晶8h，过滤得粗结晶；(7)分别往粗结晶中加入95%乙醇按其体积比100-150倍量，加热溶解，浓缩至 1/15，放置析晶，析出白色针状结晶，过滤得到结晶，经真空干燥即得纯度大于95%的石杉 碱甲和石杉碱乙产品在一个实验要求1的方法，其中步骤1的酸水的PH值=5。在另外一个实验1或2的方法要求，其中步骤2的过滤过程是陶瓷膜过滤。在另一个实验方案要求1的方法，其中步骤5的混合溶剂为乙酸乙酯和石油醚 (1 1)混合溶剂。在一个实验方案中要求，其中步骤4中所加入的80%乙醇、活性碳，其体积(V)/重 量(kg)比=100-150 1。在另一个实验方案中，其中步骤5中必须添加95%以上的乙醇重结晶。技术效果1、本发明方法中所用的原料、设备均为常见的普通原料、设备，避免了工业化生产 过程中对于昂贵原材料、仪器的依赖，大大地降低了生产成本；2、柳杉叶马尾杉价格低，来源方便。使用柳杉叶马尾杉作为千层塔等药材的替代， 既大大提高了柳杉叶马尾杉的利用效率，提高柳杉叶马尾杉的附加值，又摆脱了对于千层 塔等药材的依赖，完全缓解了市场对千层塔等药材的大量需求，保护了千层塔等药用资源。3、本发明方法操作简单，所用柳杉叶马尾杉的石杉碱甲和石杉碱乙的含量是千层 塔的10倍左右，这极大的降低了石杉碱甲和石杉碱乙的生产成本，其技术路线根简短，简化了生产过程。4、本发明所用的试剂均为无毒、廉价、量产的化学试剂，整个过程中可利用成熟的 试剂回收的常规技术，这极大地降低了向环境排放废弃物。5、经过长期摸索，本发明确定了采用85-95 %的乙醇在室温条件下进行结 晶，一方面可以减少乙醇的损耗，另一方面石杉碱甲和石杉碱乙的纯度是最高，可达到 98. 57-99. 53%。
附图1 石杉碱甲的高效液相色谱图附图2 石杉碱乙的高效液相色谱图
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是 对本发明的进一步限定。实施例1粉碎干燥柳杉叶马尾杉50kg，两次提取加去离子水配成饱和的酸水(PH = 5)的量 分别为500L、400L，8(TC加热搅拌分别提取2h、l. 5h，微滤器过滤，将所得的滤液上离子交 换树脂，吸附30min后，用3BV上柱液氨水洗脱，浓缩，调PH值在中性后静置10h，过滤得滤 液，浓缩至原体积的1/15 ；将滤液上反相色谱柱分离，分段收集液体，得液体1 (石杉碱甲)， 液体2(石杉碱乙)；分别用乙酸乙酯和石油醚(体积比=1 1)混合溶液萃取两液，得到 石杉碱甲粗品和石杉碱乙粗品；分别往石杉碱甲和石杉碱乙粗品中加80%乙醇按其体积 配比加入100-150倍量，加热充分溶解后加0. 1倍量的弱酸性活性炭，间歇搅拌脱色lh，趁 热过滤，滤液浓缩至原体积的1/15，结晶他，过滤得粗结晶；分别往粗结晶中加入95%乙醇 按其体积比100-150倍量，加热溶解，浓缩至1/15，放置析晶，析出白色针状结晶，过滤得到 结晶，经真空干燥即得石杉碱甲30g和石杉碱乙35g样品，回收率分别为60%，50%。经检测，AgilentllOO高效液相色谱仪，色谱柱为 Hypersil 0DS(150mmX4. 6mm, 5μ)，流动相为乙腈磷酸盐缓冲液=14 86 ；检测波长为310nm ；流速为lml/min ；进样 量为20 μ L。石杉碱甲样品的纯度为98. 5% HPLC，石杉碱乙样品纯度为98. 12% HPLC。结 果如图1所示。实施例2粉碎干燥柳杉叶马尾杉100kg，两次提取加去离子水配成饱和的酸水(PH = 5)的 量分别为900L、700L，8(TC加热搅拌分别提取2h、l. 5h，微滤器过滤，将所得的滤液上离子 交换树脂，吸附30min后，用3BV上柱液氨水洗脱，浓缩，调PH值在中性后静置10h，过滤 得滤液，浓缩至原体积的1/15 ；将滤液上反相色谱柱分离，分段收集液体，得液体1(石杉 碱甲)，液体2(石杉碱乙)；分别用乙酸乙酯和石油醚(体积比=1 1)混合溶液萃取两 液，得到石杉碱甲粗品和石杉碱乙粗品；分别往石杉碱甲和石杉碱乙粗品中加80%乙醇按 其体积配比加入100-150倍量，加热充分溶解后加0. 1倍量的弱酸性活性炭，间歇搅拌脱 色lh，趁热过滤，滤液浓缩至原体积的1/15，结晶8h，过滤得粗结晶；分别往粗结晶中加入 95%乙醇按其体积比100-150倍量，加热溶解，浓缩至1/15，放置析晶，析出白色针状结晶，过滤得到结晶，经真空干燥即得石杉碱甲55g和石杉碱乙64g样品。
权利要求
1.一种从植物药材柳杉叶马尾杉中提取高纯度石杉碱甲和石杉碱乙的方法，步骤包括(1)粉碎干燥柳杉叶马尾杉干燥粉碎至1-10目，待用；(2)加去离子水配成饱和的酸水PH值=5，提取2次，溶剂用量按其体积配比分别为原 料的10倍、8倍，提取时间分别为2、1. 5小时，合并各次提取液，过滤得滤液；(3)将所得的滤液上离子交换树脂，，吸附30min后，用3BV上柱液氨水洗脱，浓缩，调 PH值在中性后静置10h，过滤得滤液，浓缩至原体积的1/15 ；(4)将滤液上反相色谱柱分离，分段收集液体，得液体1，液体2；(5)分别用乙酸乙酯和石油醚(体积比=1 1)混合溶液萃取，得到石杉碱甲粗品和 石杉碱乙粗品；(6)分别往石杉碱甲和石杉碱乙粗品中加80%乙醇按其体积配比加入100-150倍量， 加热充分溶解后加0. 1倍量的弱酸性活性炭，间歇搅拌脱色lh，趁热过滤，滤液浓缩至原体 积的1/15，结晶8h，过滤得粗结晶；(7)分别往粗结晶中加入95%乙醇按其体积比100-150倍量，加热溶解，浓缩至1/15， 放置析晶，析出白色针状结晶，过滤得到结晶，经真空干燥即得纯度大于95%的石杉碱甲和 石杉碱乙产品
2.权利要求1的方法，其中步骤1的酸水的PH值=5。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤2的过滤过程是陶瓷膜过滤。
4.权利要求1的方法，其中步骤5的混合溶剂为乙酸乙酯和石油醚(1 1)混合溶剂。
5.权利要求1或2的方法，其中步骤4中所加入的80%乙醇、活性碳，其体积(V)/重 量(kg)比=100-150 1。
6.权利要求5的方法，其中步骤5中必须添加95%以上的乙醇重结晶。
全文摘要
本发明提供了一种从植物药材柳杉叶马尾杉中提取分离高纯度石杉碱甲和石杉碱乙的方法，大大地增加了从新物种提取石杉碱甲和石杉碱乙的依据。提出了一整套从柳杉叶马尾杉分离提取得到高纯度的石杉碱甲和石杉碱乙，采用酸水提取，过离子交换树脂，浓缩，萃取，反相柱层析，活性炭脱色，结晶和重结晶，得到石杉碱甲和石杉碱乙纯品。整个分离过程中对环境条件要求不高，分离时间较短，纯度最高。分离材料易得便宜，分离操作过程简单，易控制，采用结晶和重结晶，纯化效率高，使用试剂无毒。
文档编号C07D221/22GK102070527SQ20111002648
公开日2011年5月25日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者赵勇彪 申请人:赵勇彪