专利名称：一种从霞水母刺丝囊毒素内分离致死毒素蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体的说是一种从霞水母(Cyanea nozakii)刺丝囊细胞毒素中分离纯化致死毒素蛋白的方法。
背景技术：
水母(jellyfish)是一种胶质状的浮游动物，主要包括四大类群刺胞动物门的水螅水母类、管水母类、钵水母类以及栉水母门的栉水母类。水母种类繁多，分布广泛，世界上已记录的水母种类大约有1000种左右，其中我国海域已知的约有400种。我国是海岸线非常长的国家之一，从北到南地跨寒温带、温带、亚热带和热带，而在我国的沿海地区几乎均有大量水母分布，其中以霞水母数量尤为丰富。近年来，水母经常暴发，造成众多游泳者被蜇伤，轻者皮肤出现皮疹、红肿、瘙痒，令被蜇伤者痛苦不堪，重者昏厥、休克甚至死亡。而水母之所以能够给人们带来如此大的危害，最主要的原因是存在于水母触手上的刺丝囊细胞内含有大量的水母毒素。水母毒素主要是蛋白类物质，其中包含多种具有不同生物活性的毒素蛋白，如溶血活性、酶活性、抗氧化活性、致死毒性、心脏血管毒性、肝脏毒性等，而水母毒素作为一类结构新颖的蛋白，为开发新型的海洋药物提供了重要的先导化合物。但是，到目前为止对水母毒素的研究主要集中在水母粗毒方面，其主要原因有以下几方面第一，水母粗毒素中含有许多种蛋白组分，其中某些组分之间的性质(如分子量、带电荷数、疏水性等)非常相近，这就给水母毒素的分离纯化带来了很大的麻烦；第二， 水母毒素是蛋白类物质，具有热敏感性，容易受到温度等环境因素的影响而致使其活性降低甚至丧失，这就造成在分离纯化过程中很难保持其活性。第三，水母种类的不同，其生理结构以及体内所含的毒素成分和活性也存在较大的差异，这就致使不同种类水母毒素的分离纯化工作难以直接效仿，只能通过繁杂的实验摸索才能获得。所以，水母毒素的分离纯化工作具有很大的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种从霞水母刺丝囊毒素内分离致死毒素蛋白的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法1)将霞水母刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后2 6°C离心，收集上清液，待用；2)将上述步骤1)上清液于2 6°C下用缓冲液透析过夜，然后低温离心，收集上清液，待用；3)将步骤2)所得上清液过滤，而后用含Con A Sepharose 4B亲和柱进行分离，分离时采用含有0. 1 0. 3M α -甲基-D-甘露糖苷和0. 1 0. 3MNaCl的pH7. 4，浓度10 30mM的Tris-HCl缓冲液进行洗脱并收集洗脱液，低温离心，收集上清液，待用；4)将步骤3)得到的上清液用强阴离子交换树脂Mono Q预装柱纯化分离，依次采
3用pH7. 8，浓度为10 30mM的Tris-HCl缓冲液和含IM NaCl的pH7. 8，浓度为10 30mM 的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为0. 2 0. SmLmin"1,收集约25 40min洗脱液，
即为从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白。所述步骤1)霞水母刺丝囊细胞为将置于-80 -20°c低温的霞水母触手于2 6°C自溶12 48h，自溶后利用20 60目的标准分样筛滤去触手残片，而后在2 6°C下 10000 15000g离心5 20min，收集下部沉淀，2 6°C冷冻干燥，待用。所述步骤1)向霞水母刺丝囊细胞加入pH7. 8，浓度10 30mM的2 6°C下预冷 Tris-HCl缓冲液中，而后将其置于冰浴下用超声波功率为200 400kw下破碎20 60min 中，工作/间隙为5s/30s。所述步骤2)离心条件为在2 6°C下，10000 15000g离心5 20min。所述步骤2)中缓冲液为含有1 3mM MnCl2U 3mM CaCl2禾Π 0. 1 0. 3Μ NaCl 的 ρΗ7. 4，浓度 10 30mM 的 Tris-HCl。所述步骤3)中的过滤时将步骤2)收集的上清液用孔径为0. 22 μ m的微孔滤膜过
滤ο所述步骤3)中将步骤2)所得上清液过滤，而后用含Con A Sepharose4B亲和柱进行分离，首先采用含1 3mM MnCl2,1 3mM CaCl2禾Π 0. 1 0. 3MNaCl的pH7. 4，浓度 10 30mM的Tris-HCl缓冲液洗掉未结合的蛋白，然后采用含0. 1 0. 3M α -甲基-D-甘露糖苷和0. 1 0. 3Μ NaCl的ρΗ7. 4，浓度10 30mM的Tris-HCl缓冲液进行洗脱并收集洗脱液，而后将收集的洗脱组分于2 6°C采用pH7. 8，10 30mM Tris-HCl缓冲液透析，低温离心，收集上清液，待用。本发明的优点1.本发明从霞水母中分离纯化霞水母致死毒素蛋白的方法，为水母毒素蛋白的纯化提供了方法指导。2.本发明采用阴离子交换剂Con A Sepharose 4B亲和柱和强阴离子Mono Q预装柱分离致死毒素蛋白，具有流速快、分辨率高、产率高的特点，而且分离步骤少，只经过两步柱层析分离就能够得到较纯的致死毒素蛋白，有效地缩短了分离时间，减少了致死毒素蛋白的活性损失。
图1为本发明实施例提供的Mono Q分离Con A Sepharose 4B洗脱液的层析图。图2本发明实施例提供的分子筛Mono Q致死毒素蛋白峰的SDS-PAGE电泳图。图3本发明实施例提供的采用Bradford法测定蛋白浓度的标准曲线
具体实施例方式实施例11)霞水母毒素刺丝囊细胞的制备将Ikg冰冻的霞水母触手于2°C下自溶过夜后，利用20目的标准分样筛滤去触手残片，然后取上清液并在10000g、4°C下冷冻高速离心 20mi η并收集下层沉淀，用0. 154mol ·L^lNaCl溶液的生理盐水于2V反复洗洚3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，"20 0C下冷冻保存备用。
2)霞水母毒素的提取取步骤1)霞水母刺丝囊细胞0. 5g和在2°C下预冷的20mL pH7. 810mM Tris-HCl缓冲液置于烧杯中，在冰浴下用超声波功率为200kw下破碎30min中， 工作/间隙为5s/30s。破碎完毕后在4°C下，IOOOOg离心20min，上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素，并用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，测定上清液中霞水母刺丝囊细胞毒素的蛋白浓度。3)亲和层析Con A Sepharose 4B分离霞水母毒素①上样前样品的预处理将提取到的霞水母刺丝囊毒素于2°C下采用含ImM MnCl2, ImM CaCl2 和 0. 15M NaCl 的 pH7. 4，IOmM Tris-HCl 缓冲液透析过夜，然后 IOOOOg 冷冻离心20min，弃沉淀，收集上清液。②上样和洗脱将上述处理好的样品上Con A Sepharose 4B柱(1. 0x5cm)，流速为 0. ZmLmirT1，然后以含 0. IM α -甲基-D-甘露糖苷和 0. IMNaCl 的 pH7. 4，IOmM Tris-HCl 缓冲液洗脱，收集洗脱液。4)强阴离子Mono Q分离①上样前样品的预处理将上述收集组分于2°C采用pH7. SlOmMTris-HCl缓冲液透析过夜，然后IOOOOg冷冻离心20min，弃沉淀，收集上清液。②上样和洗脱取上述处理好的样品上Mono Q预装柱(0. 5/5cm)纯化分离，依次采用pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液和含IM NaCl的pH7. 8IOmMTris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为0. ZmLmirT1，收集各洗脱峰并且利用截流分子量为3kDa的超滤管对pH7. 8 20mM Tris-HCl缓冲液进行浓缩脱盐(参见图1)。5) SDS-PAGE纯度检测将步骤4) Mono Q预装柱分离到的各个洗脱峰进行 SDS-PAGE电泳检测其纯度(参见图2)。6)致死活性的检测实验组是用微量注射器向斑马鱼尾部分别注射3、5、8、12、 15、20yL的上述检测后含单一蛋白的pH7.820mM Tris-HCl缓冲液，然后观察斑马鱼的行为及24小时内生存状况，同时分别向斑马鱼尾部注射3、5、8、12、15、20μ L pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液作为空白对照。其中实验组和对照组每个梯度均用10条斑马鱼平行实验。实验显示，分离纯化到的霞水母毒素蛋白对斑马鱼具有致死活性，其半致死量LD5tl为约 0. 56 μ g毒素蛋白/g.鱼，其中蛋白浓度的测定方法采用Bradford法，利用BSA做标准曲线 (参见图3)。实施例21)霞水母毒素刺丝囊细胞的制备将2kg冰冻的霞水母触手于4°C下自溶过夜后，利用40目的标准分样筛滤去触手残片，然后取上清液并在12000g、4°C下冷冻高速离心 IOmin并收集下层沉淀，用0. 154mol · L^lNaCl溶液的生理盐水于4°C反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，"20。C下冷冻保存备用。2)霞水母毒素的提取取步骤1)霞水母刺丝囊细胞1. Og和在4°C下预冷的30mL pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液置于烧杯中，在冰浴下用超声波功率为300kw下破碎30min中， 工作/间隙为5s/30s。破碎完毕后在4°C下，12000g离心lOmin，上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素，并用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，测定上清液中霞水母刺丝囊细胞毒素的蛋白浓度。3)亲和层析Con A Sepharose 4B分离霞水母毒素
①上样前样品的预处理将提取到的霞水母刺丝囊毒素于4°C下采用含有2mM MnCl2, 2mM CaCl2 核 0. 2M NaCl 的 pH7. 4,20mM Tris-HCl 缓冲液透析过夜，然后 12000g7令冻离心lOmin，弃沉淀，收集上清液。②上样和洗脱将上述处理好的样品上Con A Sepharose 4B柱(1. 6x10cm)， 流速为OJmLmirT1,然后以含有0.2M α -甲基-D-甘露糖苷和0. 2Μ NaCl的pH7. 4，20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱液。4)强阴离子Mono Q分离①上样前样品的预处理将上述组分4°C采用pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后12000g冷冻离心lOmin，弃沉淀，收集上清液。②上样和洗脱取上述处理好的样品上Mono Q预装柱(0. 5/5cm)纯化分离，依次采用pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液和含IM NaCl的pH7. 8IOmMTris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为0. 2mLmin-1,收集各洗脱峰并且利用截流分子量为3kDa的超滤管对pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液进行浓缩脱盐。5) SDS-PAGE纯度检测将步骤4) Mono Q预装柱分离到的各个洗脱峰进行 SDS-PAGE电泳检测其纯度。6)致死活性的检测实验组是用微量注射器向斑马鱼尾部分别注射3、5、8、12、 15、20μ L的上述含单一蛋白的pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液，然后观察斑马鱼的行为及24 小时内生存状况，同时分别向斑马鱼尾部注射3、5、8、12、15、20μ L ρΗ7· 820mM Tris-HCl缓冲液作为空白对照。其中实验组和对照组每个梯度均用10条斑马鱼平行实验。实验显示， 分离纯化到的霞水母毒素蛋白对斑马鱼具有致死活性，其半致死量LD5tl为约0. 58 μ g毒素蛋白/g.鱼，其中蛋白浓度的测定方法采用Bradford法，利用BSA做标准曲线。实施例31)霞水母毒素刺丝囊细胞的制备将3kg冰冻的霞水母触手于6°C下自溶过夜后，利用60目的标准分样筛滤去触手残片，然后取上清液并在15000g、6°C下冷冻高速离心 5min并收集下层沉淀，用0. 154mol ·L^lNaCl溶液的生理盐水于6°C反复洗涤3次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，"20。C下冷冻保存备用。2)霞水母毒素的提取取步骤1)霞水母刺丝囊细胞2. Og和在6°C下预冷的50mL pH7. 830mM Tris-HCl缓冲液置于烧杯中，在冰浴下用超声波功率为400kw下破碎60min中， 工作/间隙为5s/30s。破碎完毕后在6°C下，15000g离心5min，上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素，并用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，测定上清液中霞水母刺丝囊细胞毒素的蛋白浓度。3)亲和层析Con A Sepharose 4B分离霞水母毒素①上样前样品的预处理将提取到的霞水母刺丝囊毒素于6°C下采用含有3mM MnCl2, 3mM CaCl2 和 0. 3M NaCl 的 pH7. 4,30mM Tris-HCl 缓冲液透析过夜，然后 15000g7令冻离心5min，弃沉淀，收集上清液。②上样和洗脱将上述处理好的样品上Con A Sepharose 4B柱，流速为 0. 5mLmin_1,然后采用含有0. 3M α -甲基-D-甘露糖苷核0. 3M NaCl的ρΗ7. 4，30mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱液。4)强阴离子Mono Q分离
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①上样前样品的预处理将上述组分6°C对pH7. 830mM Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后15000g冷冻离心5min，弃沉淀，收集上清液。②上样和洗脱取上述处理好的样品上Mono Q预装柱(0. 5/5cm)纯化分离，依次采用pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液和含IM NaCl的pH7. 8IOmMTris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为0. 2mLmin-1,收集各洗脱峰并且利用截流分子量为3kDa的超滤管对pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液进行浓缩脱盐。5) SDS-PAGE纯度检测将步骤4) Mono Q预装柱分离到的各个洗脱峰进行 SDS-PAGE电泳检测其纯度。6)致死活性的检测实验组是用微量注射器向斑马鱼尾部分别注射3、5、8、12、 15、20μ L的上述含单一蛋白的pH7. 820mM Tris-HCl缓冲液，然后观察斑马鱼的行为及24 小时内生存状况，同时分别向斑马鱼尾部注射3、5、8、12、15、20μ L ρΗ7· 820mM Tris-HCl缓冲液作为空白对照。其中实验组和对照组每个梯度均用10条斑马鱼平行实验。实验显示， 分离纯化到的霞水母毒素蛋白对斑马鱼具有致死活性，其半致死量LD5tl为约0. 54 μ g毒素蛋白/g.鱼，其中蛋白浓度的测定方法采用Bradford法，利用BSA做标准曲线。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于1)将霞水母刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后2 6°C离心，收集上清液，待用；2)将上述步骤1)上清液于2 6°C下用缓冲液透析过夜，然后低温离心，收集上清液， 待用；3)将步骤2)所得上清液过滤，而后用含ConA Sepharose 4B亲和柱进行分离，分离时采用含有0. 1 0. 3M α -甲基-D-甘露糖苷和0. 1 0. 3MNaCl的pH7. 4，浓度10 30mM 的Tris-HCl缓冲液进行洗脱并收集洗脱液，低温离心，收集上清液，待用；4)将步骤3)得到的上清液用强阴离子交换树脂MonoQ预装柱纯化分离，依次采用 pH7. 8，浓度为10 30mM的Tris-HCl缓冲液和含IM NaCl的pH7. 8，浓度为10 30mM的 Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为0. 2 0. SmLmirT1，收集约25 40min洗脱液，即为从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白。
2.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步骤1)霞水母刺丝囊细胞为将置于-80 -20°C低温的霞水母触手于2 6°C自溶12 48h，自溶后利用20 60目的标准分样筛滤去触手残片，而后在2 6°C下10000 15000g离心5 20min，收集下部沉淀，2 6°C冷冻干燥，待用。
3.按权利要求1或2所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步骤1)向霞水母刺丝囊细胞加入PH7. 8，浓度10 30mM的2 6°C下预冷 Tris-HCl缓冲液中，而后将其置于冰浴下用超声波功率为200 400kw下破碎20 60min 中，工作/间隙为5s/30s。
4.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步骤2)离心条件为在2 6°C下，10000 15000g离心5 20min。
5.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步骤2)中缓冲液为含有1 3mM MnCl2U 3mM CaCl2禾Π 0. 1 0. 3Μ NaCl的 ρΗ7. 4，浓度 10 30mM 的 Tris-HCl。
6.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步骤3)中的过滤时将步骤2)收集的上清液用孔径为0. 22 μ m的微孔滤膜过滤。
7.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步骤3)中将步骤2)所得上清液过滤，而后用含ConA Sepharose 4B亲和柱进行分离，首先采用含1 3mM MnCl2,1 3mM CaCl2禾Π 0. 1 0. 3Μ NaCl的ρΗ7. 4，浓度10 30mM的Tris-HCl缓冲液洗掉未结合的蛋白，然后采用含0. 1 0. 3M α -甲基-D-甘露糖苷和0. 1 0. 3Μ NaCl的ρΗ7. 4，浓度10 30mM的Tris-HCl缓冲液进行洗脱并收集洗脱液，而后将收集的洗脱组分于2 6°C采用pH7. 8，10 30mM Tris-HCl缓冲液透析，低温离心，收集上清液，待用。
全文摘要
本发明涉及海洋生物技术领域，具体的说是一种分离纯化霞水母致死毒素蛋白的方法。其分离方法如下霞水母刺丝囊细胞经超声破碎提取得到水母粗毒素，透析除盐后先后依次经过亲和色谱层析分离和阴离子交换色谱技术分离纯化，最终得到一种具有致死活性水母毒素蛋白，测得其分子量为30kDa，并且测定其对斑马鱼的半致死量LD50为0.56μg毒素蛋白/g.鱼。本发明具快速、简便的特点，为获得霞水母致死毒素蛋白提供了重要的方法指导。
文档编号C07K14/435GK102174098SQ20111002766
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者于华华, 冯金华, 刘松, 孟祥涛, 崔金会, 李克成, 李荣锋, 李鹏程, 秦玉坤, 邢荣娥 申请人:中国科学院海洋研究所