专利名称：从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取脱氧核糖核酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种从福尔马林固定的石蜡包埋组织中提取脱氧核糖核酸的方法，属 于生物中核酸应用技术领域。
背景技术：
福尔马林既是一种防腐剂，又对很多生物标本的形态有良好的保持作用。它在对 保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性方面均优于其他固定液。因此长 期以来在生物进化、系统发育、濒危物种保护、种群遗传学等多种学科的研究中，以及临床 检验、医学科学研究中得到广泛应用。因而建立一种相对简便有效、安全可行的从福尔马 林固定石蜡包埋组织(formalin fixed and paraffin embedded tissues，FFPE，以下简称 FFPE)中提取高质量基因组脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，以下简称DNA)，并通 过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，以下简称PCR)能扩增得到长片段DNA的 方法尤为重要。目前传统的石蜡包埋组织DNA提取多采用二甲苯脱蜡、蛋白酶K孵育的方法，该方 法整个抽提过程长，而且蛋白酶K价格昂贵，操作非常繁琐.费时费试剂，所得的DNA量还 较少。并且易出现DNA链降解成小片段的DNA。不适宜处理大量标本，同时在提取过程中所 使用的有机溶剂二甲苯试剂易造成环境的污染和对操作者身体的伤害。
发明内容
本发明的目的是提出一种从福尔马林固定的石蜡包埋组织中提取脱氧核糖核酸 的方法，采用特殊的提取工艺，高效、快速、经济、安全地进行脱氧核糖核酸的提取，以用于 各种标本的福尔马林固定的石蜡包埋组织中脱氧核糖核酸的提取。本发明提出的从福尔马林固定的石蜡包埋组织中提取脱氧核糖核酸的方法，包括 以下步骤(1)将2 4片10微米厚的石蜡包埋组织切片放在500微升、摩尔浓度为0. 1的 氢氧化钠溶液中，再加入50微升、质量百分比浓度为20%的十二烷基硫酸钠和50微升、摩 尔浓度为0. 001的二硫苏糖醇，充分混勻，100°C下孵育30分钟，得到裂解液；(2)对上述裂解液进行离心分层，离心分层的转速为1，3200转/分钟，离心分层 时间为5分钟，取出离心分层后的中间层，加入500微升无水乙醇，充分振荡混勻，得到混合 液；(3)将上述混合液加入硅膜吸附柱中，进行离心吸附，离心吸附的转速为8000转/ 分钟，离心吸附时间为3分钟，倒去废液；(4)向上述步骤(3)硅膜吸附柱中加入500微升去蛋白缓冲液，进行离心去蛋白， 离心去蛋白的转速为8000转/分钟，离心去蛋白的时间为3分钟，倒掉废液；(5)向上述步骤(4)的硅膜吸附柱中加入700微升去盐漂洗液，进行离心去盐，离 心去盐的转速为8000转/分钟，离心去盐时间为3分钟，倒掉废液；重复该步骤一次；
(6)对上述步骤(5)的硅膜吸附柱进行离心干燥，离心干燥的转速为1，2000转/ 分钟，离心干燥时间为2分钟；(7)向步骤(6)的 硅膜吸附柱中加入50微升洗脱缓冲液，室温下放置2 5分钟 后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为1，2000转/分钟，洗脱离心的时间为2分钟，得到脱
氧核糖核酸溶液。本发明提出的从福尔马林固定的石蜡包埋组织中提取脱氧核糖核酸的方法，其优 占是·1、本发明方法中，脱蜡裂解使用了高温高碱的方法，脱蜡彻底而且快速，省去了已 有技术的脱蜡过程中使用的有毒试剂二甲苯带来的危害，不会给实验人员带来身体上的伤害。2、本发明方法中，使用了高温高碱直接煮沸进行蛋白质消化的方法，省去了昂贵 的蛋白酶K长时间孵育消化的过程，操作简单、快速、提取基因组脱氧核糖核酸质量高，稳 定性好，可最大程度的节省成本和时间。3、本发明方法中，整个操作过程简单快速，只需经过高温煮沸，通过去蛋白缓冲液 和去盐漂洗液的作用，再用洗脱液洗脱，即可获得所需脱氧核糖核酸。4、本发明方法中，特制的裂解液中含十二烷基硫酸钠和二硫苏糖醇，不仅促进了 蛋白质的消化，而且极大程度的抑制了福尔马林所致的脱氧核糖核酸断裂效应。5、使用本发明方法提取的脱氧核糖核酸质量较高，经过聚合酶链式反应扩增可获 得750bp的片段，极大的方便了科研和生物医学等方面的工作。
图1是使用本发明方法的实施例中提取获得的脱氧核糖核酸进行小片段PCR扩增 的检测结果。图2是使用本发明方法的实施例中提取获得的脱氧核糖核酸进行长片段PCR扩增 的检测结果。
具体实施例方式本发明提出的从福尔马林固定的石蜡包埋组织样品中快速提取脱氧核糖核酸的 方法，包括以下步骤(1)将2 4片10微米厚的石蜡包埋组织切片放在500微升、摩尔浓度为0. 1的 氢氧化钠溶液中，再加入50微升、质量百分比浓度为20%的十二烷基硫酸钠和50微升、摩 尔浓度为0. 001的二硫苏糖醇，充分混勻，100°C下孵育30分钟，得到裂解液；(2)对上述裂解液进行离心分层，离心分层的转速为1，3200转/分钟，离心分层 时间为5分钟，取出离心分层后的中间层，加入500微升无水乙醇，充分振荡混勻，得到混合 液；(3)将上述混合液加入硅膜吸附柱中，进行离心吸附，离心吸附的转速为8000转/ 分钟，离心吸附时间为3分钟，倒去废液；(4)向上述步骤(3)硅膜吸附柱中加入500微升去蛋白缓冲液，进行离心去蛋白， 离心去蛋白的转速为8000转/分钟，离心去蛋白的时间为3分钟，倒掉废液；
(5)向上述步骤(4)的硅膜吸附柱中加入700微升去盐漂洗液，进行离心去盐，离 心去盐的转速为8000转/分钟，离心去盐时间为3分钟，倒掉废液；重复该步骤一次；(6)对上述步骤(5)的硅膜吸附柱进行离心干燥，离心干燥的转速为1，2000转/ 分钟，离心干燥时间为2分钟；(7)向步骤(6)的硅膜吸附柱中加入50微升洗脱缓冲液，室温下放置2 5分钟 后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为1，2000转/分钟，洗脱离心的时间为2分钟，得到脱
氧核糖核酸溶液。以下介绍本发明方法的实施例本发明方法的实施例中，所用的硅膜吸附柱、去蛋白缓冲液、去盐漂洗液和洗脱液 均由天根生化科技(北京)有限公司生产。所用引物由美国英俊公司合成。实施例对小鼠肝脏的福尔马林固定的石蜡包埋组织切片进行脱氧核糖核酸提 取。
一、福尔马林固定的石蜡包埋组织中脱氧核糖核酸的提取(1)分别取2 4片10微米厚的石蜡包埋组织切片(福尔马林浸泡时间分别为8 小时和24小时)，放在500微升、摩尔浓度为0. 1的氢氧化钠溶液中，再加入50微升、质量 百分比浓度为20%的十二烷基硫酸钠和50微升、摩尔浓度为0. 001的二硫苏糖醇，充分混 勻，100°C下孵育30分钟，得到裂解液；(2)对上述裂解液进行离心分层，离心分层的转速为1，3200转/分钟，离心分层 时间为5分钟，取出离心分层后的中间层，加入500微升无水乙醇，充分振荡混勻，得到混合 液；(3)将上述混合液加入硅膜吸附柱中，进行离心吸附，离心吸附的转速为8000转/ 分钟，离心吸附时间为3分钟，倒去废液；(4)向上述步骤(3)硅膜吸附柱中加入500微升去蛋白缓冲液，进行离心去蛋白， 离心去蛋白的转速为8000转/分钟，离心去蛋白的时间为3分钟，倒掉废液；(5)向上述步骤(4)的硅膜吸附柱中加入700微升去盐漂洗液，进行离心去盐，离 心去盐的转速为8000转/分钟，离心去盐时间为3分钟，倒掉废液；重复该步骤一次；(6)对上述步骤(5)的硅膜吸附柱进行离心干燥，离心干燥的转速为1，2000转/ 分钟，离心干燥时间为2分钟；(7)向步骤(6)的硅膜吸附柱中加入50微升洗脱缓冲液，室温下放置2 5分钟 后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为1，2000转/分钟，洗脱离心的时间为2分钟，得到脱
氧核糖核酸溶液。对用本发明实施例提取的脱氧核糖核酸进行聚合酶链式反应检测
检测实例对实施例得到的DNA进行PCR反应检测以实施例中得到的DNA为模板，以小鼠基因组DNA引物1 MN-RAS-5，TTGGGTTTGCAGGAATTGGAA,MN-RAS-3，GTTTCTAAGGCACCCATTCGATACAC 进行 192bp 片段扩增；以小鼠基因组DNA引物2 MCD 19-5，ACAGTGAACGTGGAGGATAGTGGTG,MCD19-3，CCCAAGGCTTAGGCTCAGTAGTGA 进行 750bp 片段的扩增。
PCR反应体系为快速脱氧核糖核酸聚合酶反应液10 μ 1快速脱氧核糖核酸聚合酶0. 4ul正向引物(10微摩尔每升，简称μ Μ) 1μ 1反向引物(10微摩尔每升，简称μ Μ) 1μ 1模板 DNA2 μ 1灭菌水补至20 μ 1试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。PCR反应程序为
94 0C 2分钟，1循环
940C 15 秒(second，以下简称 sec)、
55°C 5sec—35 循环
72°C (5sec-192bp； 21sec—750bp) >
72°C 2分钟，1循环结果检测PCR反应结束后取5微升反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为 用0. 5 X TBE电泳缓冲液分别配制2%和(W/V)的琼脂糖凝胶，凝胶融化后加入含量为 0. 5毫克/毫升的溴化乙锭。按比例将5微升的PCR反应产物与上样缓冲液均勻混合，然后 加入到凝胶孔中，以5V/cm的电压进行电泳，电泳时间为40-60分钟。电泳结束后将凝胶置 于凝胶成像仪上观察并照相。结果如图所示，图1是使用本发明方法的实施例中提取获得的脱氧核糖核酸进行 小片段PCR扩增的检测结果。点样顺序为泳道1 :DNA markerD2000 ；泳道2 阳性对照(以 小鼠基因组DNA为模板进行小片段引物-MN-RAS扩增的产物)；泳道3和4 福尔马林固定 8小时的小鼠肝脏石蜡组织切片以小片段引物-MN-RAS扩增的产物；泳道5和6 福尔马林 固定24小时的小鼠肝脏石蜡组织切片以小片段引物-MN-RAS扩增的产物。由图1可见，采 用本发明方法提取的小鼠肝脏FFPE DNA进行特异引物的PCR扩增，得到的扩增片段与预期 的扩增片段大小_192bp —致，且条带扩增特异性强，亮度高，能够满足基因检测的要求。图2是使用本发明方法的实施例中提取获得的脱氧核糖核酸进行长片段PCR扩增 的检测结果。点样顺序为泳道1 :DNA marker D2000 ；泳道2 阳性对照(以小鼠基因组 DNA为模板进行长片段引物-MCD19扩增的产物)；泳道3和4 福尔马林固定8小时的小鼠 肝脏石蜡组织切片以长片段引物-MCD19扩增的产物；泳道5和6 福尔马林固定24小时的 小鼠肝脏石蜡组织切片以长片段引物-MCD19扩增的产物。由图2可见，采用本发明方法提 取的小鼠肝脏FFPE DNA进行特异引物的PCR长片段扩增，得到的扩增片段与预期的扩增片 段大小-750bp —致，条带扩增特异性强，亮度高，能够满足基因检测的要 求。
权利要求
1. 一种从福尔马林固定的石蜡包埋的组织中提取脱氧核糖核酸的方法，其特征在于该 方法包括以下步骤(1)将2 4片10微米厚的石蜡包埋组织切片放在500微升、摩尔浓度为0.1的氢氧 化钠溶液中，再加入50微升、质量百分比浓度为20%的十二烷基硫酸钠和50微升、摩尔浓 度为0. 001的二硫苏糖醇，充分混勻，100°C下孵育30分钟，得到裂解液；(2)对上述裂解液进行离心分层，离心分层的转速为1，3200转/分钟，离心分层时间为 5分钟，取出离心分层后的中间层，加入500微升无水乙醇，充分振荡混勻，得到混合液；(3)将上述混合液加入硅膜吸附柱中，进行离心吸附，离心吸附的转速为8000转/分 钟，离心吸附时间为3分钟，倒去废液；(4)向上述步骤(3)硅膜吸附柱中加入500微升去蛋白缓冲液，进行离心去蛋白，离心 去蛋白的转速为8000转/分钟，离心去蛋白的时间为3分钟，倒掉废液；(5)向上述步骤的硅膜吸附柱中加入700微升去盐漂洗液，进行离心去盐，离心去 盐的转速为8000转/分钟，离心去盐时间为3分钟，倒掉废液；重复该步骤一次；(6)对上述步骤(5)的硅膜吸附柱进行离心干燥，离心干燥的转速为1，2000转/分钟， 离心干燥时间为2分钟；(7)向步骤(6)的硅膜吸附柱中加入50微升洗脱缓冲液，室温下放置2 5分钟后，进 行洗脱离心，洗脱离心的转速为1，2000转/分钟，洗脱离心的时间为2分钟，得到脱氧核糖 核酸溶液。
全文摘要
本发明涉及一种从福尔马林固定的石蜡包埋组织中提取脱氧核糖核酸的方法，属于生物中核酸应用技术领域。首先配制特制裂解液，将裂解液加入到石蜡切片组织中，高温煮沸30分钟，离心取清夜，再加入无水乙醇混匀，将混合液加到硅膜吸附柱中离心，再经过去蛋白液和去盐漂洗液漂洗，最后用洗脱缓冲液洗脱即可。本发明方法不用有毒试剂二甲苯脱腊，不会给实验人员带来身体上的伤害；不需要昂贵的蛋白酶K长时间孵育酶解，操作简单、快速、提取基因组脱氧核糖核酸质量高，稳定性好，可最大程度的节省成本和时间。提取产物进行PCR检测，可扩增得到约750bp的长片段，极大的方便了科研和生物医学等方面的工作。
文档编号C07H1/08GK102146112SQ201110027550
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者俞萍, 孙克非, 李晓晨, 韩典霖 申请人:天根生化科技(北京)有限公司