专利名称：铬离子抗原及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及铬离子抗原及其制备方法与应用。
背景技术：
铬是国内外食品、药物、环境等样品中重要的污染物质之一。重金属铬在环境中主要以三价铬和六价铬的形式存在。其中，六价铬的毒性比三价铬高得多，对皮肤粘膜有刺激和腐蚀作用，并且更容易为人体吸收、蓄积，已被确认为致癌物，因此，重金属铬的摄入量及其价态对人体健康有很大影响。重金属铬的化合物广泛应用于制革、冶金、纺织品生产及镀铬等行业，环境中的铬含量在不断的增加，因此，重金属铬也成为各国环境监测中的必测元素，六价铬的测定方法也受到环境监测者的广泛关注。铬的测定方法较多，主要有分光光度法、化学发光法、原子吸收光谱法、荧光分析法、电化学分析法和离子色谱法等。这几种仪器检测方法检测重金属铬的含量不仅需要昂贵的仪器设备，而且检测费用高、检测时间长和检测步骤繁杂，不能用于现场的快速检测。 免疫检测技术已被广泛应用于毒素、杀虫剂、炸药等的环境污染和危险物的检测，与其他检测系统相比，免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏和特异的优点，可便携进行现场检测。免疫检测试剂盒可以快速检测某一特定物质的含量，但要将免疫分析法应用到检测重金属铬离子，必须制备相应的抗原和抗体。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备铬离子抗原的方法。本发明所提供的制备铬离子抗原的方法，包括如下步骤(1)将螯合剂进行重氮化反应，得到重氮化螯合剂；(2)将所述步骤(1)得到的重氮化的螯合剂与载体蛋白进行偶联反应，得到偶联产物；(3)将所述步骤(2)得到的偶联产物与铬离子进行络合反应，得到络合物，即得到铬离子抗原。所述步骤(1)中所述重氮化反应的方法包括以下步骤将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，得到溶液I ；再向所述溶液I中加入亚硝酸盐水溶液，得到溶液II ；将所述溶液II在温度为0°c -5°c或0°C或4°C或5°C、避光和反应时间为15min的条件下进行反应，即得到所述重氮化螯合剂。所述步骤O)中所述载体蛋白与所述重氮化螯合剂的投料摩尔比为1 (5-25) 或 1 10 或 1 5 或 1 25 ；所述偶联反应是在温度为4°C -10°C或4°C或7°C或10°C和反应时间为4h_24h或 12h或4h或24h的条件下进行；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白或人血清白蛋白或血蓝蛋白。所述步骤(3)中所述偶联产物与所述铬离子的投料摩尔比为1 (1-10)或1 3或 1 1 或 1 10 ；所述络合反应是在温度为4°C _25°C或25°C或4°C或15°C、pH值为7. 0-8. 0或7. 0 或7. 5或8. 0和反应时间为4h-24h或1 !或4h或Mh的条件下进行。所述步骤(1)中所述的螯合剂与所述酸的投料摩尔比为1 G-10)或1 10或 1 7 或 1 4 ；所述螯合剂与所述亚硝酸盐的投料摩尔比为1 (1- 或1 2或1 1或1 3;所述螯合剂为对氨基苯甲基乙二胺四乙酸；所述的酸为盐酸或硫酸或硝酸或过氯酸或氟硼酸；所述亚硝酸盐为亚硝酸钠。所述步骤O)中所述偶联反应还包括将所述偶联产物进行透析，得到纯化的偶联产物的步骤；所述进行偶联反应前，还包括将所述载体蛋白溶解于碳酸盐缓冲液中的步骤。所述步骤(3)中，还包括将所述络合物进行透析的步骤。根据所述方法制备得到的铬离子抗原也属于本发明的保护范围。由所述铬离子抗原制备得到的抗体也属于本发明的保护范围。所述铬离子抗原和/或所述抗体在检测铬离子中的应用也属于本发明的保护范围。本发明所提供的制备铬离子抗原的方法能够方便、快捷地获得铬离子抗原，且合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明方法制备的铬离子抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。因此，本发明所提供的制备铬离子抗原的方法以及由该方法获得的铬离子抗原，将在铬离子的酶联免疫检测中有广阔的应用前景。
图1为铬离子抗原的合成路线图。图2为以EDTA-Cr为标准样品建立的铬离子间接ELISA法标准曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。对氨基苯甲基乙二胺四乙酸(购自Sigma公司，商品目录号为A3473)；羊抗鼠 IgG-HRP(购自Jackson公司，商品目录号为79556)；弗氏完全佐剂(购自Sigma公司，商品目录号为F5881)；弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司，商品目录号为F5506) ；EDTA(购自 Sigma公司，商品目录号为E6758)；牛血清白蛋(购自Sigma公司，商品目录号为A7906)； 卵清白蛋白(购自Sigma公司，商品目录号为A5503)，CrCl3 · 6H20 (购自Sigma公司，商品目录号为27096)；其余HCl、K2C03、NaN02和甘油等常规试剂均购自北京化学试剂公司。实施例1、铬离子抗原及其制备一、铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白(Cr-对氨基苯甲基 EDTA-BSA)抗原的制备方法I
铬离子抗原的合成路线图如图1所示。1、对氨基苯甲基乙二胺四乙酸的重氮化(1)称取固体对氨基苯甲基乙二胺四乙酸1.985mg，充分溶解于0. 5mL 0. IM的 HCl水溶液中，得到溶液I。溶液I中，对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与HCl的投料摩尔比为 1 10。(2)将上述步骤(1)得到的溶液I在4°C避光条件下进行搅拌，每间隔30s向溶液 I中滴加30 μ L质量百分含量为1 %的NaNO2水溶液，得到溶液II。NaNO2的加入量是过量的，即对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与NaNO2W投料摩尔比为1 2。用淀粉-碘化钾试纸对上述步骤( 得到的溶液II进行检验，在试纸变蓝后，反应15分钟，得到重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸溶液。2、重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与载体蛋白进行偶联(1)称取牛血清白蛋(BSA) 33. Omg，充分溶解于2. OmL 0. 05M的碳酸盐缓冲液中， 得到溶液III。0. 05M的碳酸盐缓冲液配制方法如下将1. 5gNa2C03和2. 93gNaHC03溶解于蒸馏水中，用蒸馏水定容至lOOOmL，pH值为 9. 6。(2)将上述步骤1获得的重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸溶液逐滴加入上述步骤(1)的溶液III中，使BSA与重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸的投料摩尔比为1 10， 得到溶液IV。(3)偶联反应在4°C下，将上述步骤(2)的溶液IV搅拌过夜(12小时)，得到偶联产物溶液。(4)偶联反应12小时后，将上述步骤(3)得到的偶联产物溶液置于透析袋中，用 PH为7. 5的磷酸盐缓冲液透析2天，每天换3次透析液，得到纯化的重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与载体蛋白的偶联物。上述pH为7. 5磷酸盐缓冲液的配制方法如下将8. Og NaCUO. 2g KH2PO4 和 2. 96g Na2HPO4 · 12H20，溶解于蒸馏水中，再用蒸馏水定容至lOOOmL。3、铬离子的络合(1)称取4. OOmg CrCl3 · 6H20，用超纯水配制成0. IM CrCl3水溶液。将步骤2得到的纯化的重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与载体蛋白的偶联物溶液用IM的HCl将其 PH值调节到7. 5，得到调整pH值后的偶联物溶液。(2)将上述步骤(1)的CrCl3水溶液逐滴加入到上述步骤(1)获得的调整pH值后的偶联物溶液中，边滴加边搅拌，使重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与铬离子的投料摩尔比为1 3，得到溶液V。(3)将上述步骤O)的溶液V在25°C、pH值为7. 5的条件下搅拌12小时，用pH为 7. 5的磷酸盐缓冲液透析2天，每天换3次透析液，以除去未联结的铬离子及其它杂质，透析产物即为铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白(Cr-对氨基苯甲基EDTA-BSA) 抗原溶液。(4)将上述步骤(3)的透析产物分装，经_40°C冷冻后，真空干燥，置于_20°C冰箱中保存备用。方法II1、对氨基苯甲基乙二胺四乙酸的重氮化(1)称取固体对氨基苯甲基乙二胺四乙酸1. 985mg，充分溶解于0. 35mL 0. IM的 HCl水溶液中，得到溶液I。溶液I中，对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与HCl的投料摩尔比为 1 。(2)除以下方法外，其余方法均与方法I相同A、将上述步骤(1)得到的溶液I在0°C避光条件下进行搅拌；B、每间隔30s向溶液I中滴加15 μ L质量百分含量为1 %的NaNO2水溶液，得到溶液II。NaNO2的加入量是过量的，即对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与NaNO2的投料摩尔比为 1 I02、重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与载体蛋白进行偶联(1)与方法I相同。(2)除BSA与重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸的投料摩尔比为1 5外，其余方法均与方法I相同。(3)偶联反应在7°C下，将上述步骤(2)的溶液IV搅拌4h，得到偶联产物溶液。(4)与方法I相同。3、铬离子的络合(1)将步骤2得到的纯化的重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与载体蛋白的偶联物溶液用IM的HCl将其pH值调节到7. 0外，其余方法均与方法I相同。(2)除重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与铬离子的投料摩尔比为1 1外，其余方法均与方法I相同。(3)除将上述步骤O)的溶液V在4°C、pH值为7. 0的条件下搅拌4h，其余方法均与方法I相同。(4)与方法I相同。方法III1、对氨基苯甲基乙二胺四乙酸的重氮化(1)称取固体对氨基苯甲基乙二胺四乙酸1. 985mg，充分溶解于0. 2mL 0. IM的HCl 水溶液中，得到溶液I。溶液I中，对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与HCl的投料摩尔比为1 4。(2)除以下方法外，其余方法均与方法I相同A、将上述步骤(1)得到的溶液I在5°C避光条件下进行搅拌；B、每间隔30s向溶液I中滴加45 μ L质量百分含量为1 %的NaNO2水溶液，得到溶液II。NaNO2的加入量是过量的，即对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与NaNO2的投料摩尔比为 1 3。2、重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与载体蛋白进行偶联(1)与方法I相同。(2)除BSA与重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸的投料摩尔比为1 25外，其余方法均与方法I相同。(3)偶联反应在10°C下，将上述步骤O)的溶液IV搅拌Mh，得到偶联产物溶液。
(4)与方法I相同。3、铬离子的络合(1)将步骤2得到的纯化的重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与载体蛋白的偶联物溶液用IM的HCl将其pH值调节到8. 0外，其余方法均与方法I相同。(2)除重氮化对氨基苯甲基乙二胺四乙酸与铬离子的投料摩尔比为1 10外，其余方法均与方法I相同。(3)除将上述步骤O)的溶液V在15°C、pH值为8.0的条件下搅拌24h外，其余方法均与方法I相同。(4)与方法I相同。二、铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-卵清白蛋白(Cr-对氨基苯甲基EDTA-0VA) 抗原的制备方法同实验一中所述免疫原的制备方法相同，不同的是所用的载体蛋白为卵清白蛋白(OVA)。实施例2、铬离子抗原的应用一、利用铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白抗原制备抗体(1)取6-8周龄的Bal b/C小白鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)作为实验动物。(2)基础免疫用PBS将上述实施例1制备的铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白抗原稀释为lmg/ml的溶液，取Iml抗原溶液用无菌过滤器过滤，然后加入Iml 的弗氏完全佐剂，充分乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Bal b/C小鼠，注射剂量为0. Img抗原/只。(3)加强免疫基础免疫3周后，取Iml上述稀释好的铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白抗原溶液，用无菌过滤器过滤，然后加入Iml弗氏不完全佐剂，充分乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Balb/C小鼠，注射剂量为0. Img抗原/只。按照上述方法每隔2周加强免疫一次，共4次，并从第三次加强免疫开始，每次免疫后第5天，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，待效价大于1 8000后，采血，分离出铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白抗血清，即得到抗体。二、抗体效果检测下述实验中所用的各种缓冲液如下(1)包被缓冲液0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液；0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液的配制方法如下分别称取1. 5g Na2CO3和2. 93g NaHCO3，用蒸馏水充分溶解后，用蒸馏水定容至 1000mL。(2)磷酸盐缓冲液含有质量百分含量为0. 9%的NaCl的0. 1Μ、ρΗ7. 5磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液的配制方法如下分别称取8. Og NaCUO. 2g KH2PO4 和 2. 96g Na2HPO4 · 12H20，用蒸馏水充分溶解后， 用蒸馏水定容至lOOOmL。
(3)样品稀释液PBSTG 每IL样品稀释液中含有8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12Η20、1· OmL Tween-20 和 Ig 明胶，其余为水。(4)柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液含有0. OlM柠檬酸三钠和0. 03M Na2HPO4的pH5. 5 的水溶液。(5)底物缓冲液将20. Omg邻苯二胺(OPD)溶解于10. OmL柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，然后加入4μ L体积百分含量为30%的H2A得到的溶液；(6)终止缓冲液2. OM的硫酸水溶液；(7)洗涤液每 IL 洗涤液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 ·12Η2 和 1. OmL Tween-20，其余为水。(一)抗体抑制实验1、铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-卵清白蛋白包被抗原溶液的配制将上述实施例1制备的铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-卵清白蛋白抗原完全解冻后，用上述包被缓冲液按1 1000、1 2000,1 4000,1 8000,1 16000进行梯度稀释。2、EDTA-Cr螯合物标准品溶液的配制(1)称取14. 3ang EDTA-Na2，充分溶解于5mL蒸馏水中，得到浓度为2. 86%ig/mL的 EDTA水溶液。(2)称取10. 24mg CrCl3 ·6Η20，溶解于蒸馏水中，并逐滴加入到上述步骤(1)配制的EDTA水溶液中，磁力搅拌，充分鳌合，得到EDTA与Cr离子鳌合产物的溶液。(3)将步骤O)的EDTA与Cr离子鳌合产物的溶液定容至10. OmL,得到Cr离子浓度为lmg/mL的EDTA-Cr螯合产物的溶液。(4)用样品稀释液将上述步骤(3)的EDTA-Cr溶液配成浓度为2000ng/mL(以溶液中Cr离子实际含量计算)的EDTA-Cr螯合物标准品溶液。3、铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白抗血清稀释液的配制将上述步骤一制备的铬-对氨基苯甲基乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白抗血清用样品稀释液按 1 1000、1 2000,1 4000,1 8000,1 16000 进行梯度稀释。4、将羊抗鼠IgG-HRP用由PBS和甘油(PBS和甘油的体积比为1 1)组成的混合液稀释成0. lmg/mL，保存于-20°C冰箱中。使用时用样品稀释液按1 1000稀释。5、抗原、抗体的棋盘格实验(1)包被原的包被将上述步骤1制备的不同浓度的包被抗原溶液加入到酶标板中，每孔100μ 1，37°C温育3小时；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；(2)在步骤(1)的酶标板中加入上述步骤2制备的EDTA-Cr螯合物标准品溶液(实验孔)，每孔50 μ L，对照孔中不添加EDTA-Cr螯合物标准品溶液而加入50 μ L样品稀释液；(3)分别向上述实验孔和对照孔中加入上述步骤3制备的不同浓度的抗血清稀释液，每孔50 μ L ；37°C温育30分钟；倒掉酶标板中的溶液，用洗涤液洗板4次，甩干；(4)在实验孔和对照孔中分别加入100 μ L用样品稀释液稀释的IgG-HRP，37°C温育30分钟；用洗涤液洗板4次，倒掉酶标板中的溶液，甩干；(5)向实验孔和对照孔中分别加入100 μ L底物缓冲液，37°C温育15分钟后，再向每孔中加入50 μ L终止缓冲液终止反应；
(6)在492nm下测定吸光值。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，结果如表1所示。表1抗原和抗体棋盘格实验结果
权利要求
1.一种制备铬离子抗原的方法，包括如下步骤(1)将螯合剂进行重氮化反应，得到重氮化螯合剂；(2)将所述步骤(1)得到的重氮化的螯合剂与载体蛋白进行偶联反应，得到偶联产物；(3)将所述步骤(2)得到的偶联产物与铬离子进行络合反应，得到络合物，即得到铬离子抗原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述重氮化反应的方法包括以下步骤将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，得到溶液I ；再向所述溶液I中加入亚硝酸盐水溶液，得到溶液II ；将所述溶液II在温度为0°C -5°C或0°C或4°C或5°C、避光和反应时间为 15min的条件下进行反应，即得到所述重氮化螯合剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤O)中所述载体蛋白与所述重氮化螯合剂的投料摩尔比为1 (5-25)或 1 10 或 1 5 或 1 25 ；所述偶联反应是在温度为4。C -10°C或4°C或7°C或10°C和反应时间为4h_24h或1 或4h或Mh的条件下进行；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白或人血清白蛋白或血蓝蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中所述偶联产物与所述铬离子的投料摩尔比为1 (1-10)或1 3或 1 1 或 1 10 ；所述络合反应是在温度为4°C -25°C或25°C或4°C或15°C、pH值为7. 0-8. 0或7. 0或 7. 5或8. 0和反应时间为4h-24h或1 !或4h或Mh的条件下进行。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述的螯合剂与所述酸的投料摩尔比为1 G-10)或1 10或1 7 或 1 4;所述螯合剂与所述亚硝酸盐的投料摩尔比为1 (1- 或1 2或1 1或1 3;所述螯合剂为对氨基苯甲基乙二胺四乙酸；所述的酸为盐酸或硫酸或硝酸或过氯酸或氟硼酸；所述亚硝酸盐为亚硝酸钠。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述步骤O)中所述偶联反应还包括将所述偶联产物进行透析，得到纯化的偶联产物的步骤；所述进行偶联反应前，还包括将所述载体蛋白溶解于碳酸盐缓冲液中的步骤。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，还包括将所述络合物进行透析的步骤。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法制备得到的铬离子抗原。
9.由权利要求8所述的铬离子抗原制备得到的抗体。
10.权利要求8所述的铬离子抗原和/或权利要求9所述的抗体在检测铬离子中的应
全文摘要
本发明公开了铬离子抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的制备铬离子抗原的方法，包括如下步骤(1)将螯合剂进行重氮化反应，得到重氮化螯合剂；(2)将所述步骤(1)得到的重氮化的螯合剂与载体蛋白进行偶联反应，得到偶联产物；(3)将所述步骤(2)得到的偶联产物与铬离子进行络合反应，得到络合物，即得到铬离子抗原。本发明所提供的制备铬离子抗原的方法能够方便、快捷地获得铬离子抗原，且合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明方法制备的铬离子抗原进行免疫得到的抗体特异性好、最低检测限值低。因此，本发明所提供的制备铬离子抗原的方法以及由该方法获得的铬离子抗原，将在铬离子的酶联免疫检测中有广阔的应用前景。
文档编号C07K14/77GK102190723SQ201110090978
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者何丽珊, 南铁贵, 孙硕, 张炜, 曹振, 李召虎, 王保民, 王敏, 谭桂玉, 赵洪伟, 高巍 申请人:中国农业大学