专利名称：通过调节tim-1、tim-2和tim-4功能从而调节免疫应答的方法
通过调节TIM-1、TIM-2和TIM-4功能从而调节免疫应答的
方法本申请是2005年3月14日递交的申请号为200580014074. X，发明名称为“通过调节TIM-I、TIM-2和TIM-4功能从而调节免疫应答的方法”的分案申请。相关申请本申请对2004年3月12日提交的美国专利序列号第60/552，523，名为“通过调节TIM-I和TIM-2功能从而调节免疫应答的方法”，及2004年10月27日提交的美国专利序列号第60/622，559，名为“通过调节TIM-I和TIM-4功能从而调节免疫应答的方法”的权益提出要求。这些申请的全部教导都通过在此引述而全部合并于本文。关于联邦-资助的研究和发展陈述这里描述的发明，全部或部分地，由国家健康基金协会号1R01NS045937-01，2R01NS355685-06,2R37NS30843-11，1R01AI44880-03，2P01AI39670-07，1P01NS38037-04 和1F31GM20927-01资助。美国政府拥有本发明的某些权益。
背景技术：
对外源或内源因子的过度免疫应答可能导致疾病，其可作为Thl-或Th2_介导的疾病的特征。Th2-介导的疾病实施例，哮喘，过敏性鼻炎(花粉热)，过敏性皮炎(湿疹)和食物过敏，是非常普遍的，可影响20-40%的普通人群并造成ー个主要的公共健康问题。应对这些疾病的经济开支是巨大的。仅哮喘ー项，1996年的健康保障费用估计为140亿美元。此外，过去20年エ业国家中所有遗传性过敏疾病的流行极大地上升了，而原因仍未明。エ业国家中哮喘的流行，其最为精确的数量，自从1982年以来已经增倍，并预期至2020年再次增倍。风湿性关节炎(RA)，ー种Thl疾病，是ー种普遍的人自身免疫疾病，在高加索人中流行率为 I % (Harris, B. J. et al. , 1997, In Textbook of Rheumatology 898-932),目前影响250万美国人。RA以滑动关节的慢性炎症和活性T细胞，巨噬细胞和浆细胞浸润为特征，导致关节软骨进行性破坏。这是关节疾病最严重的形式。多重硬化症(MS)，另ー种Thl疾病，是最常见的中枢神经系统(CNS)神经脱髓鞘疾病，在北美影响350，000(0. 1%)人，而全世界为110万。通常，MS被认为是ー种部分由前炎症⑶4T(Thl)细胞介导的自身免疫疾病，该细胞识别与由抗原(Ag)递呈细胞(APC)表达的MHC class II分子相连的特异髓磷脂多肽。另ー种Thl介导的疾病实施例，人类I型或胰岛素-依赖的糖尿病(IDDM)，以胰岛中beta细胞的自身免疫性破坏为特征。Beta细胞的损耗导致血液中葡萄糖水平调节能力的丧失。在人体出现糖尿病之前有一个长期的潜伏期。在此期间胰腺beta细胞的功能逐步消失。疾病的发展以出现拮抗胰岛素，谷氨酸脱羧酶，和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)的自身抗体为指示。T辅助(Th)亚类以其产生不同细胞因子种类和提升特异免疫应答的能力进行区分。Thl细胞产生IFN Y并促进直接针对细胞内病原体的细胞-介导免疫。相反，Th2细胞产生细胞因子IL-4，IL-5，IL-13，激活针对细胞外病原体的肥大细胞和嗜曙红细胞和直接B细胞。由极化Th细胞产生的特异细胞因子是促进前驱Th细胞分化的最初因子，但这些细胞也交联调控其他亚类的功能活性。例如具报道IL-4是ー种促进Thp细胞分化为Th2效应细胞的有效因子。此外，1し-4拮抗正^^的生成。IL-10，另ー种Th2细胞产生的细胞因子，也被报道可抑制Thl分化和IFN Y-介导的巨噬细胞功能。相反地，Thl产生的IFNy可促进Thl的分化并抑制Th2细胞的増殖。这些细胞因子促进特异Th细胞亚类分化，同时抑制选择分化命运的能力，造成不断发展的极化应答結果。相应地，需要一种促进或抑制Thl或Th2应答发展的新的治疗方法。这些新治疗方法可以用于治疗自身免疫和过敏性疾病，增强移植组织免疫耐受カ或減少癌症患者的免疫耐受力。发明概述 此发明广义上涉及调控Thl或Th2细胞活性从而调控免疫应答的药物、组合物和方法。此发明部分基于这里描述的意外的发现，即tim-1和tim-4形成多肽复合物，并且此复合物的形成可调节T细胞活性和免疫应答。在某些方面，此方法提供了ー种在需要治疗的病人中进行治疗或防止Thl-介导的失调的方法，该方法包括给予病人治疗有效剂量的药物，其可减少tim-1, tim-2,或tim-4表达或活性。一些实施方案中，该病人患有自身免疫疾病。此发明的相关方面提供了在有需要的病人中引发Thl应答的方法，如患有增生疾病如癌症的病人。此发明的相关方面也提供对患有Th2失调的病人进行治疗的方法，如哮喘或过敏性疾病，或在病人中引发Th2应答，而其应答将是有益的，如患有自身免疫疾病的病人。此发明进ー步提供了在病人中调控免疫/移植耐受的方法，包括给予病人治疗有效剂量的药物，调控tim-1, tim-2,或tim_4活性,从而调控免疫耐受性。一些实施方案中，该药物通过减少tim-1, tim-2,或tim_4表达或活性从而增加免疫/移植耐受性。在另ー实施方案中，该药物通过增加tim-1, tim-2,或tim_4表达或活性从而减少免疫耐受性。此发明进ー步提供了在有需要的病人中增强或抑制T-细胞増殖的方法，该方法包括给予病人能有效增加或抑制T-细胞増殖数量的tim-4多肽。此发明的其他方面提供了一种在有需要的病人中进行治疗，预防或減少A型肝炎感染的方法。某一实施方案中，A型肝炎感染的治疗或预防是通过给予病人治疗有效剂量的(i)包括tim-4IgV区域的多肽,或(II)包括与tim-4IgV区域和/或tim_4粘液素区域具有高度同源的氨基酸序列，或相似的氨基酸序列的多肽。此发明的相关方面提供了ー种通过给予病人治疗有效剂量的包括tim-4IgV区域的多肽或包括与tim-4IgV区域，tim-4粘液素区域，或与其两者具有高度同源，或相似的氨基酸序列的多肽，在病人中进行遗传性过敏症的预防或減少其发生可能性的方法。在另ー个实施方案中，多肽包括tim-4粘液素区域或具有与tim-4粘液素区域高度同源，或相似的氨基酸序列区域。此发明也提供了鉴定调控tim-l/tim-4复合物形成的药物的方法，如鉴定促进或抑制复合物形成，或阻止tim-1结合tim-4的活性的药物的方法。此发明的另一方面提供了鉴定模拟tim-4结合tim-1的药物的方法，如作为tim_4的替代物激活tim_l活性从而调控免疫应答的药物。此发明也提供了新的tim-4多肽，包括这些多肽的组合物，和其编码核酸。在ー个特别方面提供了可溶的非膜锚定tim-4多肽。合适的可溶性多肽包括那些由粘液素区域的IgV和N-末端部分组成，但不包含tim-4跨膜区域的多肽。在一些实施方案中，可溶tim-4多肽还包含tim-4胞内区域。可溶tim-4多肽可作为结合tim_l并调控免疫应答的药物使用。
图I显示Tim-2mRNA适合于在Th2细胞中表达。⑷由Thl (AE7)和Th2(D10G4)克隆制备的cDNA用tim-2和Tim_3引物进行RT-PCR。产物用I. 2%琼脂糖凝胶分析。(B)D011. 10TCR转基因⑶4T细胞在Thl或Th2极性条件下用0VA323-339刺激。在每轮刺激结束时提取RNA并制备cDNA。用特异的Tim-2引物对cDNA进行循环-样品PCR。产物用
I.5%琼脂糖凝胶分析。·图2显示Tim-2配基在活性APCs中表达。树突状细胞系，D2SC/1，和巨噬细胞系，RAff 264，在 20ng/ml LPS 和 5ng/ml IFNy的条件下孵育。激活-后48小吋，收集细胞并用生物素标记Tim_2Ig，生物素标记Tim-1 Ig，生物素标记Tim-3Ig，或生物素标记hlgG进行染色并用生物亲和素-PC作为第二种检测试剂。细胞用流式细胞计数分析。图3Tim-2Ig的治疗引发Th2细胞因子的应答和増殖。SJL小鼠用PLP 139-151免疫，并用Tim-2Ig，或hlgG或作为对照的PB S进行处理。免疫后10天收集器官并评估増殖和细胞因子的产生。Tim-2Ig(空心三角形)；PBS(实心圆形)；hIgG(实心方形)。(A)全部的脾细胞在缺失抗原的条件下培养48小吋。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行评估。(B)全部的脾细胞在系列浓度的PLP139-151多肽存在下培养48小吋。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行測定。(C)收集3 (A)和(B)中描述的上清，用ELISA评估 IL-2，IFN y，IL-4 和 IL-10 表达情况。图4显示Tim-IIg的治疗引发增殖和Th2细胞因子的应答。SJL小鼠用PLP139-151免疫，并用Tim-llg，或hlgG或作为对照的PB S进行处理。免疫后10天收集器官并评估增殖和细胞因子的产生。Tim-IIg(空心圆形)；PBS(实心菱形)；hIgG(实心方形)。(A)全部的脾细胞在缺失抗原的条件下培养48小吋。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对増殖进行评估。(B)全部的脾细胞在系列浓度的PLP 139-151多肽存在下培养48小时。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行測定。(C)收集4 (A)和(B)中描述的上清，用ELISA 评估 IL-2, IFN y，IL-4 和 IL-10 表达情况。图5显示在引发EAE期间用Tim_2Ig进行治疗可以延缓疾病的发作和严重性。用溶于CFA的75iig PLP 139-151多肽免疫SJL/J小鼠，并静脉内注射百日咳毒素。从0天至8天的每个交替日用Tim-2Ig，或作为对照的hlgG或PB S进行处理。根据EAE临床征兆对小鼠进行监控。图6显示在引发EAE期间用Tim-IIg进行治疗可以延缓疾病的发作和严重性。用溶于CFA的75iig PLP 139-151多肽免疫SJL/J小鼠，并静脉内注射百日咳毒素。从0天至8天的每个交替日用Tim-llg，或作为对照的hlgG或PB S进行处理。根据EAE临床征兆对小鼠进行监控。图7显示活性抗原递呈细胞表达的Tim-I和tim_2配基，从Balb/c小鼠脾细胞纯化出CD Ilb (巨噬细胞和树突状细胞)和CD Ilc (树突状细胞)并用LPS和gamma干扰素激活。激活-后24小时细胞用hlgG (红线)，Tim-IIg生物素标记(绿色线)，或Tim-2Ig生物素标记(黄色线)进行染色。抗生物素-PE被用于第二种检测试剂。所用样本用流式细胞仪分析。Tim-I和tim-2配基的表达在活性抗原递呈细胞中都是上调的。图8显示在Thl和Th2极化细胞系中Tim_2的表达情況。来源于C57BL/6和Balb/c小鼠的初始T细胞在存在IL-12和抗-IL-4 (Thl)或IL-4和抗-IL_12(Th2)的条件下用抗-CD3/CD28刺激进行极化。从细胞中提取RNA并制备cDNA。用特异的Taqman引物和探针对Tim-2相对于GAPDH的表达进行測定。与Thl细胞相比，Tim_2的表达更倾向于在Th2细胞中进行上调。图9显示Timl/Fc単一-治疗可以使微小错配的胰岛移植得到存活。Balb/c小 鼠按240mg/kg的剂量用streptocotocin进行单一注射而患上糖尿病。来源于DBA/2的胰岛移植物被移植到右肾的肾囊下。受体鼠在移植的0，2，4天按0. 25mg/小鼠的剂量用Tim1/Fc进行治疗。图10显示Tim2/Fc単一-治疗延缓排斥并使微小错配的胰岛移植得到存活。Balb/c小鼠按240mg/kg的剂量用streptocotocin进行单一注射而患上糖尿病。来源于DBA/2的胰岛移植物被移植到右肾的肾囊下。受体鼠在移植的0，2，4天按0. 25mg/小鼠的剂量用Tim2/Fc进行治疗。图11显示打!112/^(3与抗-0) 154协同增效可以引发MHC错配移植耐受性。C57BL/6小鼠按260mg/kg的剂量用streptocotocin进行单一注射而患上糖尿病。来源于DBA/2的胰岛移植物被移植到右肾的肾囊下。受体鼠在移植的0，2，4天按0. 25mg/小鼠的剂量用Tim2/Fc进行治疗，并在移植的0，2天按0. 25mg/小鼠的剂量用MRl进行治疗。图12显示Tim-4在巨噬细胞和成熟树突状细胞中，而非T细胞中表达。(a)利用Taqman定量PCR对Clontech多组织cDNA芯片进行重复试验分析小鼠不同组织中Tim4mRNA的情況。(b)DOllOlOTcR转基因T细胞在体外分化为ThI或TH2系，在每轮再刺激后从静息细胞中制备RNA。RNA也可以由长-期T细胞克隆AE7 (ThI)和D 10. G4 (TH2)，及CHO-Tim_4稳定转化系进行制备。显示了两次试验的数据。(c) SJL/J脾和淋巴节细胞被纯化为⑶11b+，CD llc+，B220+，和CD3+细胞群。显示了超过5次试验的数据。(d)用GM-CSF或Flt3L从骨髓细胞中制备体外培养的树突状细胞，一部分细胞用LPS刺激。Flt3L-制备的细胞转变为浆细胞形式。显示了 2次试验的数据。(e)用CMS5 Flt3L-引发的肿瘤细胞注射CB6F1小鼠并制备体外培养的树突状细胞。转化T细胞和B细胞的脾细胞按照类型进行分离。所有细胞类型用Tim-4Taqman RT-PCR对Tim_4mRNA表达进行定量。所有数据都以tim_4相对于GAPDH的表达量进行表示,并重复三孔。图13显示Tim-4配基在B细胞和活性T细胞中表达。全部的SJL/J脾细胞，无论经LPS和IFN- Y (用于B细胞)，或ConA(用于T细胞)激活或未激活的，都用B220-FITC或⑶3-FITC和Tim-4-Ig进行染色(用杭-人IgG-PE測定)。数据表明了四次単独试验的结果。图14 显不 Tim-4 与 Tim-I 特异交互作用。(a)经 Tim_l, Tim_3,或 Tim_4cDNA 转染的CHO细胞用Tim-I-Ig(用抗-mIgG2a-PE检测，用单独的ニ抗作为对照)，Tim-2-Ig，或Tim-4-Ig (都用抗-hlgG-PE检测，用hlgG作为对照)染色。分别用单克隆抗-Tim-I或抗-Tim-3可在细胞表面检测到Tim-I和Tim_3，而用生物素标记的抗-HA对Tim_4进行检测(用抗生物素-PE可见；所有都与同型对照进行比较)。数据表明了超过10次试验的结果。(b)经Tim-I或Tim-4转染的HEK293细胞按前述方法用Tim-I-Ig或Tim-4-Ig染色。为评估特异的染色情况，Tim-I-Ig预先与抗-Tim-I或抗-Tim_3共孵育，并用于Tim_4转染细胞的染色。此外，Tim-I转染细胞用抗-Tim-I或抗-Tim_3预先孵育并用Tim-4-Ig染色。数据表明了超过5次试验的結果。图15显示可在正常T细胞中观察到Tim-4-Tim-l的交互作用。(a)从全部脾细胞中分离⑶3+细胞并用抗-⑶3和抗-⑶28刺激。按前述用抗-Tim-I或Tim-4-Ig染色。(b)全部脾细胞用ConA刺激并按前述用抗-CD3或Tim-4-Ig染色。细胞在经Tim-4-Ig染色之前预先与抗-Tim-I或抗-Tim-3孵育从而评估Tim-I与Tim-4-Ig结合的特异性。(c,d)D0
11.IOTCR转基因T细胞在体外分化为ThI和TH2细胞系并用PMA+Ionomycin+golgi Stop激活3小吋，并按前述用抗-Tim-I或Tim-4-Ig染色。激活的细胞用抗-CD4进行体外染色并用细胞因子抗体进行体内染色以确定其分化为ThI和Th2细胞系。数据表明了超过4次试 验的結果。图16显示Tim-I-Ig在体外特异结合活性⑶Ilb+和⑶Ilc +细胞。来源于DO110. IOTcR转基因小鼠或Balb/c小鼠的脾细胞用LPS和IFN-y刺激。CDllb+和CDllc+细胞通过MACS柱进行纯化并在存在或缺失抗Tim-I或抗Tim-3单克隆抗体的情况下用生物素标记的Tim-I-Ig染色。抗生物素-PE被用于第二种检测试剂。数据表明了 2次试验的结果。图17显示Tim-I-Ig的治疗引发T细胞的増殖。(a)来源于免疫SJL/J小鼠的脾细胞在体内用Tim-1-Ig，或hlgG或PBS对照处理，并用PLP 139-151多肽再刺激在体外培养48小吋。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定増殖情况，试验重复三孔。
(b)按6a试验中叙述的经PLP 139-151抗原刺激48小时的体外培养上清被用于细胞因子ELISAs ;显示了 IL-2，IL-4，IL-10和INF-Y的表达情況。单独分析来源于单独小鼠(6只)的脾细胞，并显示了所有小鼠的平均数值。误差栏表示S.E.M值。数据表明4次独立试验的結果。黑色菱形，PBS ;黑色方形，hlgG ;空心三角形，Tim-I-Ig处理。图18显示Tim-4-Ig引发体内的T细胞增殖及体外促进T细月包的増殖。(a)来源于经Tim-4-Ig，或hlgG或PBS对照体内免疫的SJL/J小鼠的脾细胞，在缺失多肽再刺激的情况下体外培养48小吋。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定増殖情况，试验重复三孔。缺失多肽再刺激的情况下体外培养48小时后收获培养上清，并用于细胞因子ELISAs以测定在缺失抗原再刺激的情况下自然细胞因子的产生数量。来自于2个不同小鼠的脾细胞被分别测试三次，并显示了其平均值。(b)来源于2只经Tim-4-Ig(T4)或hlgG(Hu)体内免疫的SJL/J小鼠的脾细胞被分离为CDllb+(Mac),B220+(B)dPra3+(T)细胞群并在缺失多肽再刺激的情况下进行重组。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定増殖情況。(c)用包被有特定浓度的抗-CD3，抗-CD28，和Tim-4-Ig或对照Igs的板对纯化的SJL/JT细胞进行刺激。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定増殖情况，试验重复三孔。数据表明了 2个相同试验(左列)或5个相同试验(右列)的結果。所有误差栏表明重复孔的S.E.M.值。图19显示体内的Tim-I-Ig给药在TH2_偏倚系统中引发了 TH2应答的增强和增Mo 雌性 Balb/c 小鼠注射 50 y gOVA323_339 和 4mg Imject alum (Pierce)并在 7 天后用50 u gOVA323-339和2mg alum加强注射。在免疫前4小时及7天加强免疫前4小时，及免疫后2，4，10天，小鼠用1001^11111-1-18，11186，或 250iilPB S 注射 5 次。第 14 天，处死小鼠，脾细胞被用于分析增殖和细胞因子。(a)存在OVA 323-339多肽条件下体外培养脾细胞48小吋。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定増殖情况，试验重复三孔。OVA 323-339多肽体外刺激48小时后收集培养上清并用于细胞因子ELISAs ;显示了 IL-2，IL-4，IL-10的表达情況。未得到明显的IFN-Y表达。源于单独小鼠(3只)的脾细胞分别重复三孔进行分析，并显示了所有3只小鼠的平均值。黒色菱形，PBS ;黑色方形，hlgG ；空心三角形，Tim-I-Ig体内注射。图20显示了鼠tim-4位点的选择性拼接图，产生两种可溶的tim_4形式。发明详述I.综述
本发明通常提供了新的调节免疫应答的方法和药物。本发明的方法可以调控主体中针对Thl和Th2应答的免疫应答。Thl和Th2应答，某种程度上，是互斥的，正如初始⑶4+T辅助细胞分化为Thl和Th2效应细胞，其每种都可分泌不同的细胞因子。相应地，本发明诱导Thl-介导的失调的方法可以用于患有Th2-介导失调的主体，而诱导Th2-介导的失调的方法可以用于患有Thl-介导失调的主体。本发明ー个方面提供了对具有需要的主体进行免疫应答的调控的方法，该方法包括给予主体治疗有效剂量的药物，其可以调节tim-1和tim-4之间的结合。在此所述的某一实施方案中，以Thl免疫应答的提高作为免疫应答，并且药物将增加tim-1，tim-2或tim_4的活性或表达，例如那些提高tim-1和tim-4之间的结合的药物。在此所述方法的另ー个实施方案中，以Th2免疫应答的提高作为免疫应答，并且药物将减弱tim-1，tim-2或tim_4的活性或表达，例如那些减弱tim-1和tim-4之间的结合的药物。本发明进一歩提供了在需要治疗的主体中进行治疗或防止或減少遭受Th-I介导的疾病可能性的方法，该方法包括给予主体治疗有效剂量的药物，其可以减少tim-1，tim-2或tim-4的活性或表达。Thl-介导的疾病包括自身免疫疾病，如多发性硬化，I-型糖尿病，HashinotoJ s甲状腺炎，Crohn’ s疾病，类风湿关节炎，系统性红斑狼疮，胃炎，自身免疫性肝炎，溶血性贫血，自身免疫血友病，自身免疫淋巴细胞增生综合症(ALPS)，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，肾小球肾炎，Guillain-Barre综合症，银屑病和重症肌无カ。Thl-介导的疾病也包括宿主排斥移植物疾病(HVGD)和抑制物排斥宿主疾病。本发明进一歩提供了在需要治疗的主体中进行治疗或防止或減少遭受Th-2介导的疾病可能性的方法，该方法包括给予主体治疗有效剂量的药物，其可以增加tim-1，tim-2或tim-4的活性或表达。在某一实施方案中，Th2-介导的疾病是哮喘，过敏，过敏性鼻炎，胃肠过敏，食物过敏，嗜曙红细胞增多，結膜炎或肾小球肾炎。在某一特别实施方案中，这里所述方法中使用的调节免疫应答的药物包括多肽(I)SEQ ID NO :331-133 位氨基酸；(2) SEQID NO :431-134 位氨基酸；(3)与 SEQ ID NO:331-133位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ IDNO :431-134位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90%相同的氨基酸序列，该 tim-4 多肽包含 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12中挑选的氨基酸序列。在另ー个特别的实施方案中，这里所述方法中使用的调节免疫应答的药物包括多肽(I)SEQ ID NO :121-126 位氨基酸；(2) SEQ ID NO :221-129 位氨基酸；(3)与 SEQ ID NO:121-126位氨基酸至少具有90%相同或相似氨基酸序列；或(4)与SEQID NO :221-129位氨基酸至少具有90%相同或相似氨基酸序列。在另ー个实施方案中，药物包括与SEQ ID NO1130-237 位氨基酸，SEQ ID NO :2127-288 位氨基酸，SEQ ID NO :3134-318 位氨基酸或 SEQID NO :4136-281位氨基酸至少具有80%，85%或90%相同或相似的氨基酸序列。这里所述方法的一个实施方案中，这里所述方法使用的调节免疫应答的药物包括抗体，或其抗原-结合片段，其结合tim-1, tim-2或tim_4。在一个特别实施方案中，该药物是ー种结合tim-4的抗体；抗体或片段可以结合，例如，tim-4IgV和/或粘蛋白区域。另ー个实施方案中，药物是一种针对tim-1和tim-2,或tim-2和semaphorin_4A的双特异抗体。减少tim-1，tim-2或tim-4活性的药物包括反义RNA药物。在另ー个实施方案中，药物包
括与 SEQ ID NO :1130-237位氨基酸，SEQ ID NO :2127-288位氨基酸，SEQ ID NO :3134-318位氨基酸或SEQ IDNO :4136-281位氨基酸至少具有80%，85%或90%相同或相似的氨基酸序列。药物也包括peptidomimetica和小分子,如小于2kDa的非多肽复合物。本发明进ー步提供药物研究的方法,部分基于未预料的发现，即tim-1, tim-2或tim-4形成物理复合物，而这种作用将调节免疫应答。本发明的ー个方面提供了鉴定可调节tim-1多肽和tim-4多肽之间结合的药物的方法，包括(a)在测试药物存在的条件下将tim-1多肽和tim-4多肽相结合；(b)鉴定测试药物对于tim_l多肽和tim_4多肽相结合的影响；从而鉴定调节tim-1多肽和tim-4多肽相结合的药物。本发明也提供了调节免疫应答的药物的方法，该方法包括(a)在测试药物存在的条件下将tim-1多肽和tim-4多肽相结合；(b)鉴定测试药物对于tim-1多肽和tim-4多肽相结合的影响；从而鉴定调节免疫应答的药物。在某一实施方案中，步骤(b)包括在存在测试药物的合适的对照情况下，t匕较tim-l/tim-4复合物的形成。在特别实施方案中，合适的对照包括在缺失测试药物的情况下，第一种多肽和第二种多肽间复合物的形成。在另ー实施方案中，第一种多肽或第二种多肽或其两者在细胞中都有表达。在另ー实施方案中，测定复合物的形成包括测试报告基因的表达，其中报告基因的表达依赖于复合物的形成。在另ー实施方案中，第一种多肽或第二种多肽或其两者都标记突光素分子。在另ー实施方案中，tim-4多肽包括(I)SEQ ID NO :331-133位氨基酸；(2) SEQ ID NO:431-134位氨基酸；(3)与SEQ ID NO :331-133位氨基酸至少具有90%相同或相似氨基酸序列；或⑷与SEQ ID NO =431-134位氨基酸；或(5)与tim_4多肽至少具有90%相同的氨基酸序列，该 tim-4 多肽包含 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12中挑选的氨基酸序列。而在另一实施方案中，tim-1多肽包括(I)SEQ ID NO :121-126 位氨基酸；(2) SEQ ID NO :221-129 位氨基酸；(3)与 SEQ IDNO 121-126位氨基酸至少具有90%相同或相似氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO :221-129位氨基酸至少具有90%相同或相似氨基酸序列。在另ー个实施方案中，tim-1多肽包括与SEQID NO :1130-237 位氨基酸，SEQ ID NO :2127-288 位氨基酸至少具有 80%，85%或 90%相同或相似的氨基酸序列。鉴定调节tim-1和tim-4结合的药物的方法可以用于鉴定增加tim_l和tim_4结合的药物，或减弱tim-1和tim-4结合的药物。本方法并非限制于鉴定任何特定单个药物类型。药物可以是，例如，小复合物，抗体，多肽，核酸，或碳水化合物。此外，本发明的ー个方面提供了鉴定tim-4中对于tim-1和tim_4结合起关键作用的氨基酸残基的方法，该方法包括(a)将以下两种物质相结合⑴包含tim-4IgV区域的多肽，其中所述的tim-4IgV区域与SEQ ID NO :331-133残基或SEQID NO :431-134残基中所列的tim-4IgV区域具有ー个和10个氨基酸之间的位点相关性；(2) tim-1多肽，其中所述的tim-1多肽可以结合tim-4多肽；(b)測定多肽和tim-1多肽间复合物的形成；并且
(c)若复合物的形成与合适的对照不同，则将形成的复合物与合适的对照相比较，其中ー个氨基酸被鉴定为对于结合tim-1至关重要。
本发明的相关方面提供了鉴定tim-4中对于tim_4与tim_l结合起关键作用的氨基酸残基的方法，该方法包括(a)将以下两种物质相结合(I)包括tim-4粘蛋白区域的多肽，其中所述的tim-4粘蛋白区域与SEQ ID NO :3134-318残基或SEQID NO :4136-281残基中所列的tim-4粘蛋白区域具有ー个和10个氨基酸之间的位点相关性；(2) tim-1多肽，其中所述的tim-1多肽可以结合tim-4 ； (b)測定多肽和tim-1多肽间复合物的形成；并且
(c)若复合物的形成与合适的对照不同，则将形成的复合物与合适的对照相比较，其中ー个氨基酸被鉴定为对于结合tim-1至关重要。在鉴定tim-4中对于tim-4与tim_l结合至关重要的氨基酸的方法中的ー个实施方案中，合适的对照包括(l)tim-l多肽，和(2)包括SEQ ID NO :331-133氨基酸和/或SEQ ID N03 134-318氨基酸的对照多肽间形成的复合物。在另ー个实施方案中，tim-1多肽包括(I)SEQ ID NO :121-126 氨基酸；(2) SEQID NO :221-129 氨基酸；(3)与 SEQ ID NO:121-126氨基酸或SEQ ID N01 130-237氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO :221-129氨基酸或SEQ ID NO :2127-288氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列。本发明的另ー个方面提供了測定所测多肽是否结合tim-1多肽的方法，其中所测多肽包括那些与SEQ ID NO :331-133氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列，该方法包括(a)将所测多肽与tim-1多肽相接触；并且(b)測定多肽和tim-1多肽间复合物的形成；其中若检测到复合物的形成则所测多肽被鉴定为与tim-1多肽相结合。在一个示范性实施方案中，tim-1 多肽包括(I)SEQ ID NO :121-126 氨基酸；(2) SEQ ID NO :221-129 氨基酸；(3)与SEQ ID NO :121-126氨基酸或SEQ IDNO :1130-237氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或⑷与SEQ ID NO :221-129氨基酸或SEQ ID NO :2127-288氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列。本发明的另ー个方面提供了測定所测多肽是否结合tim-4多肽的方法，其中所测多肽包括那些与SEQ ID NO :121-126氨基酸或SEQ ID NO 1 130-237至少具有90%相同或相似的氨基酸序列，该方法包括(a)将所测多肽与tim-4多肽相接触；并且(b)測定多肽和tim-4多肽间复合物的形成；其中若检测到复合物的形成则所测多肽被鉴定为与tim-1多肽相结合。在一个实施方案中，tim-4多肽包括(I)SEQ ID NO :331-133位氨基酸；(2) SEQID NO :431-134 位氨基酸；(3)与 SEQ IDNO :331-133 位氨基酸或 SEQ ID NO :3134-318 位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO 4 31-134位氨基酸或SEQ ID NO :4136-281位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim_4多肽至少具有90%相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含从SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :11，SEQ ID NO 12 中挑选的氨基酸序列。本发明的另ー个方面提供了防止或减少主体中患遗传性过敏症的方法，该方法包括给予主体治疗有效性剂量的多肽，所述多肽包括(I)SEQ ID NO :331-133位氨基酸；(2)SEQ IDNO :431-134位氨基酸；(3)与SEQ ID NO :331-133位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或⑷与SEQ IDNO =431-134位氨基酸或SEQ ID NO 4的136-281位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90%相同的氨基酸序列，该 tim-4 多肽包含从 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :12中挑选的氨基酸序列。本发明的另ー个方面提供了治疗或防止或減少主体中遭受A型肝炎感染的可能性的方法，该方法包括给予主体治疗有效性剂量的多肽，所述多肽包括(I)SEQ ID N0:3的31-133 位氨基酸；(2) SEQ ID NO 4 的 31-134 位氨基酸；(3)与 SEQ IDNO 3 的 31-133 位氨基酸或SEQ ID NO 3的134-318位氨基酸至少具有90%相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ IDNO :4的31-134位氨基酸或SEQ ID NO :4的136-281位氨基酸至少具有90%相 同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90%相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含从 SEQID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQID NO : 11，SEQ IDNO : 12中挑选的氨基酸序列。在一个实施方案中，主体并未患有A型肝炎。在另ー实施方案中，主体并未感染A型肝炎病毒。而在另一实施方案中，主体中抗A型肝炎抗体血清呈阴性。在另ー实施方案中，主体是儿童。在另ー实施方案中，遗传性过敏症的疾病包括哮喘，鼻炎，湿疹和花粉热。本发明的另ー个方面提供了一种新的可溶性tim-4多肽。ー个方面提供了ー种包括ー种tim-4IgV区域，tim-4胞内区域,和一个缩短了的tim_4粘蛋白粘液素区域的分离多肽，其中该多肽不包括tim-4跨膜区域。本发明的另ー个方面提供了ー种包括ー种tim-4IgV区域,和一个截短的tim-4粘蛋白区域的分离多肽,其中该多肽不包括tim-4跨膜区域或tim-4胞内区域。在一种优选的实施方案中，可溶性tim-4多肽是ー种哺乳动物多肽，如人类或小鼠多肽。在一种特别的实施方案中，可溶性的tim-4多肽包括SEQ ID NO:331-133氨基酸或SEQ IDNO :431-134氨基酸。在另ー个实施方案中，可溶性tim_4多肽包括SEQ ID NO :9，10，11，12中所列的序列，虽然在其他实施方案中可溶的tim-4多肽不包括信号序列。在一些实施方案中，可溶性tim-4多肽与其他多肽融合，如増加其体内稳定性的多肽。在一些实施方案中，融合多肽包括免疫球蛋白Fe区域或ー种血清白蛋白多肽。本发明进ー步提供了编码这里所述的可溶性tim-4多肽的核酸以及包括tim-4可溶性多肽和ー种药物可接受载体的组合物。II.定义出于方便，在此集合了说明书、实施例、和权利要求中使用的某些术语。除非另有定义，所有这里使用的技术和科学术语具有本发明所属领域中的普通技术人员通常理解上的相同含义。这里使用的词“ー个”和“一个”指一个或多于ー个(例如，至少ー个)主体。根据实施例，“ー个元素”指一个或多于ー个元素。这里使用的术语“包括”，可以与术语“包括但不限干”交換使用。
这里使用的术语“或”，可以与术语“和/或”交換使用，除非文中清楚地指明其他意义。这里使用的术语“例如”，可以与术语“例如但不限干”交換使用。术语“核酸”指多聚核酸如脱氧核糖核酸(DNA)，及在适用的地方，指核糖核酸(RNA)。该术语应理解为也包括，作为等同物的，由核酸类似物形成的RNA或DNA类似物，及，如所述实施方案中所应用的，单链(正义或反义)和双-链多聚核酸。术语“防止”是专业-公认的，当涉及某些情况下使用时，如局部复发(例如，疼痛)，ー种疾病如癌症，一种复合症状如心脏病或其他任何医学疾病，在此领域中是熟知的，并包括在情况发生之前给予复合物治疗，使得与未接受复合物治疗的主体相比，可使主体減少发病频率，减弱严重性，或延缓医学疾病的发作。这样，癌症的防止包括，例如，通过统计的和/或具有临床意义的计数，与未接受治疗的对照群体相比，接受预防疾病治疗的病
人群体中可检测到的癌症生长的数量有所下降，并且/或者与未接受治疗的对照群体相比，接受治疗的群体中可检测到的癌症生长的发生将延缓。感染的防止包括，例如，与未接受治疗的对照群体相比，接受治疗的群体中感染诊断的数量将减少，并且/或者与未接受治疗的对照群体相比，延缓接受治疗的群体中感染症状的发作。疼痛的防止包括，例如，与未接受治疗的对照群体相比，对于接受治疗的群体遭受的疼痛，其发生频率将减少，严重性将减弱，或可选地有所延缓。这里使用的术语“有效数量”指达到预期结果所需的预先给予的一定剂量的有效数量。本发明的化合物的有效剂量可以根据各种因素而变化，如疾病的阶段，年龄，性別，及动物的体重。剂量方案可以进行调整以提供最优的治疗反应。例如，可以按天注射ー些分离的剂量，或根据治疗情况的紧急情况所显示剂量可以适当地減少。这里使用的术语“主体”指任何脊椎动物，适宜地为哺乳动物，更适宜地为人类。主体的实施例包括人类，非-人类灵长类，啮齿动物，豚鼠，兔，绵羊，猪，山羊，牛，马，狗，猫，鸟，和鱼。这里使用的多肽的“变体”指具有一个或更多氨基酸替换的一段氨基酸序列。变体可以具有“保守的”变化，其中替换的氨基酸具有相似的结构或化学特性(例如，将亮氨酸替换为异亮氨酸)。更罕见的，变体可以具有“非保守的”变化(例如，将氨基こ酸替换为色氨酸)。相似的次要辅基改变还包括氨基酸删除或插入，或两种兼有。此领域中熟知的计算机程序可以作为指南找出被替换，插入，或删除后将不会扰乱生物或免疫活性的氨基酸残基，例如，DNASTAR软件。这里使用的“Thl-相关的失调”是一种异常相关的疾病或情况，例如，与參考相比，如，ー种正常对照，Thl细胞的活性增强(例如，Thl细胞的应答增強)或数量増加。Thl失调的实施例包括，例如，自身免疫失调(如多发硬化症、风湿性关节炎、I型糖尿病和Crohn氏病)。这里使用的“Th2_相关的失调”是一种异常相关的疾病或情况，例如，与參考相比，如，ー种正常对照，Th2细胞的活性增强(例如，Th2细胞的应答增強)或数量増加。Th2失调的实施例包括，例如，哮喘，过敏，和抗体成分相关的失调(例如，风湿性关节炎)。这里使用的术语“类似物”包括，但不局限于，与參考序列相比，具有ー个或多个氨基酸替换，插入，和/或删除的氨基酸序列。氨基酸替换可以是保守或非保守特性。保守的氨基酸替换包括将本发明的多肽的ー个或多个氨基酸替换为具有相似电荷，大小，和/或亲水性特性的氨基酸。只有保守替换形成的类似物是功能等同的。非-保守氨基酸替换包括将多肽的一个或多个氨基酸替换为具有非相似电荷，大小，和/或亲水性特性的氨基酸。氨基酸插入可由单ー氨基酸残基或2到15个氨基酸组成的序列组成。删除可以是ー个或多个氨基酸的移除，或氨基酸序列的不连续部分。删除的氨基酸可以是连续的或非连续的。III. Tim氨基酸和核酸序列人类和小鼠的tim多肽序列描述于SEQ ID NOs :1_14和PCT公开No. WO03/002722，美国专利号 6066498，6204371，6288218，6084083，6414117，6562343，及美国专利申请公开号2003/0069196和2003/0124114，其教导通过在此引述全部整合于本文中。本发明的Tim-1, tim-2和tim_4的核酸和多肽根据进ー步的理解包括下列描述的核酸和变体的序列。变体核酸序列包括那些具有ー个或多个核酸差异的序列，如替换，插入或删除，例如等位基因的变体；并且将，因此，包括与编码野生-型tim-1，tim-2和tim-4核酸序列不同的编码序列，例如，归因于遗传密码的退化。例如，编码tim-1的IgV区域的核酸可以是 与野生-型tim-1具有90%，95%，99%，或100%—致性的核酸序列。小鼠和人类tim-1多肽和核酸序列见美国专利申请公开号2003/0124114，其内容通过在此引述全部整合于本文中。人类tim-1多肽见Genbank Deposit No. NP_036338 (SEQID勵1)，并且。0嫩核酸序列见匪_012206(5￡0 ID NO :5)。小鼠的tim-1氨基酸和核酸(cDNA)序列分别见 Genbank DepositNo. NP_599009 (SEQ ID NO :2)及 NM_134248 (SEQ IDNO 6) o tim-1 在科技文献中也指 HAVCRl，KMl，HAVCR，KM-I，TMD I。自然发生的人类tim-1等位基因变体氨基酸和核酸序列见美国专利申请公开号2003/0124114SEQ ID NOs :17-28。这些序列通过引述在此被整合。人类tim_lIgV区域跨越SEQ ID N0:1的21-126位残基，而小鼠tim-lIgV区域跨越SEQ ID NO :2的21-129位残基。人类tim-1粘蛋白区域跨越130-237位残基。小鼠tim_l粘蛋白区域跨越127-288位残基。人类和小鼠tim-1的额外区域，如信号序列，跨膜区域和胞内区域描述于McIntireet. al. , Nat. Immunol. (2001) ；2(12) :1109_16，其内容通过在此引述被合并于本文。小鼠TIM-2，一种类似的305个氨基酸的膜蛋白，与小鼠tim_l具有64%的一致性，与大鼠KIM-I具有60%—致性，与hHAVcr-1具有32%—致性。与TIM-1类似，TIM-2具有两个胞外N-连接糖基化位点和ー个带有多个0-连接糖基化位点的丝氨酸，苏氨酸-富足粘蛋白区域。TIM-2也具有一个胞内酪氨酸激酶磷酸化模体，RTRCEDQVY。小鼠TIM-2多肽和核酸序列分别见美国专利申请公开号2003/0124114的序列5和8。额外的小鼠tim_2序列见 Genbank Deposit No. NP_599009 及 NM_134249。小鼠 tim_2 的 IgV 区域大约从 SEQID NO 13 的 25-127 位置。小鼠和人tim-4多肽和核酸的序列见美国专利申请公开号2003/0124114中描述，其内容通过在此引述而全部合并于本文。人tim-4的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)和核酸(cDNA) (SEQID NO 7)序列分别见美国专利申请公开号2003/0124114, SEQ IDNOs 33和34中描述，同样的，tim-4的等位基因变量氨基酸和核酸(cDNA)序列也分别在SEQ ID NOs 35和36中被描述。小鼠tim-4的两种氨基酸序列在SEQ ID NO 4(NP 848874)和SEQ IDNO : 12中被描述。对应于SEQ ID NO : 12的核酸序列见SEQ ID NO :3 (NM_178759)。人tim_4的IgV区域横跨SEQID NO 3的31-133位残基，小鼠tim_4的IgV区域横跨SEQID NO 4的31-134位残基。人tim-4的粘蛋白区域横跨SEQID NO 3的134-318位残基。小鼠tim_4的粘蛋白区域横跨SEQ ID NO 4的134-281位残基。本发明也提供了变异tim-4多肽和编码核酸。在本发明的一方面，变异tim-4多肽缺少ー个或多个外显子，导致多肽缺少N-末端，C-末端或中间序列，或因为外显子删除而具有一个移码的阅读框。在某一实施方案中，本发明提供了缺失横跨膜区域的可溶性tim-4多肽。在另ー实施方案中，本发明提供了缺失横跨膜的区域和缺失所有或部分粘蛋白区域的可溶性tim-4多肽。在某一实施方案中，可溶性tim-4多肽缺失粘蛋白区域C-末端的10-40个氨基酸，15-30个氨基酸，或更适宜地18-25个氨基酸。在某一实施方案中，变异的可溶性tim-4多肽包括的氨基酸序列见SEQ ID NOs :9，10，或11。在另ー实施方案中，可溶性人tim-4多肽缺失SEQ ID NO :3的282-337残基。本发明也提供了编码所述的可溶性tim-4多肽的核酸。本发明的核酸进ー步被理解为包括上述多肽的变异体的核酸。变异体核酸序列包括的序列有ー个或多个核酸差异，比如，通过替换，増加或删减，如等位基因变异体；并且将，因此包括不同于野生型tim-1或tim-4核酸序列的编码序列，例如由于基因编码退化所导致。例如，编码tim-lIgV区域的核酸可以是与野生型tim-lIgV区域的序列至少有80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%，100%等同或相似的核酸序列。人和小鼠的tim 多肽序列在 PCT
发明者维杰伊·K·库查鲁, 修蒙尼·查克瓦替, 特丽·斯特罗姆, 郑心校, 詹尼弗·梅耶斯 申请人:布赖汉姆妇女医院, 贝斯以色列护理医疗中心