专利名称：通过调节tim－1、tim－2和tim－4功能从而调节免疫应答的方法
相关申请本申请对2004年3月12日提交的美国专利序列号第60/552,523，名为“通过调节TIM-1和TIM-2功能从而调节免疫应答的方法”，及2004年10月27日提交的美国专利序列号第60/622,559，名为“通过调节TIM-1和TIM-4功能从而调节免疫应答的方法”的权益提出要求。这些申请的全部教导都通过在此引述而全部合并于本文。
关于联邦-资助的研究和发展陈述这里描述的发明，全部或部分地，由国家健康基金协会号1RO1NS045937-01，2R01NS355685-06，2R37NS30843-11，1RO1AI44880-03，2P01AI39670-07，1PO1NS38037-04和1F31GM20927-01资助。美国政府拥有本发明的某些权益。
背景技术：
对外源或内源因子的过度免疫应答可能导致疾病，其可作为Th1-或Th2-介导的疾病的特征。Th2-介导的疾病实施例，哮喘，过敏性鼻炎(花粉热)，过敏性皮炎(湿疹)和食物过敏，是非常普遍的，可影响20-40％的普通人群并造成一个主要的公共健康问题。应对这些疾病的经济开支是巨大的。仅哮喘一项，1996年的健康保障费用估计为140亿美元。此外，过去20年工业国家中所有遗传性过敏疾病的流行极大地上升了，而原因仍未明。工业国家中哮喘的流行，其最为精确的数量，自从1982年以来已经增倍，并预期至2020年再次增倍。
风湿性关节炎(RA)，一种Th1疾病，是一种普遍的人自身免疫疾病，在高加索人中流行率为1％(Harris，B.J.et al.，1997，In Textbook of Rheumatology 898-932)，目前影响250万美国人。RA以滑动关节的慢性炎症和活性T细胞，巨噬细胞和浆细胞浸润为特征，导致关节软骨进行性破坏。这是关节疾病最严重的形式。多重硬化症(MS)，另一种Th1疾病，是最常见的中枢神经系统(CNS)神经脱髓鞘疾病，在北美影响350,000(0.1％)人，而全世界为110万。通常，MS被认为是一种部分由前炎症CD4 T(Th1)细胞介导的自身免疫疾病，该细胞识别与由抗原(Ag)递呈细胞(APC)表达的MHC class II分子相连的特异髓磷脂多肽。另一种Th1介导的疾病实施例，人类I型或胰岛素-依赖的糖尿病(IDDM)，以胰岛中beta细胞的自身免疫性破坏为特征。Beta细胞的损耗导致血液中葡萄糖水平调节能力的丧失。在人体出现糖尿病之前有一个长期的潜伏期。在此期间胰腺beta细胞的功能逐步消失。疾病的发展以出现拮抗胰岛素，谷氨酸脱羧酶，和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)的自身抗体为指示。
T辅助(Th)亚类以其产生不同细胞因子种类和提升特异免疫应答的能力进行区分。Th1细胞产生IFNγ并促进直接针对细胞内病原体的细胞-介导免疫。相反，Th2细胞产生细胞因子IL-4，IL-5，IL-13，激活针对细胞外病原体的肥大细胞和嗜曙红细胞和直接B细胞。
由极化Th细胞产生的特异细胞因子是促进前驱Th细胞分化的最初因子，但这些细胞也交联调控其他亚类的功能活性。例如具报道IL-4是一种促进Thp细胞分化为Th2效应细胞的有效因子。此外，IL-4拮抗IFNγ的生成。IL-10，另一种Th2细胞产生的细胞因子，也被报道可抑制Th1分化和IFNγ-介导的巨噬细胞功能。相反地，Th1产生的IFNγ可促进Th1的分化并抑制Th2细胞的增殖。这些细胞因子促进特异Th细胞亚类分化，同时抑制选择分化命运的能力，造成不断发展的极化应答结果。
相应地，需要一种促进或抑制Th1或Th2应答发展的新的治疗方法。这些新治疗方法可以用于治疗自身免疫和过敏性疾病，增强移植组织免疫耐受力或减少癌症患者的免疫耐受力。
发明概述此发明广义上涉及调控Th1或Th2细胞活性从而调控免疫应答的药物、组合物和方法。此发明部分基于这里描述的意外的发现，即tim-1和tim-4形成多肽复合物，并且此复合物的形成可调节T细胞活性和免疫应答。在某些方面，此方法提供了一种在需要治疗的病人中进行治疗或防止Th1-介导的失调的方法，该方法包括给予病人治疗有效剂量的药物，其可减少tim-1，tim-2，或tim-4表达或活性。一些实施方案中，该病人患有自身免疫疾病。此发明的相关方面提供了在有需要的病人中引发Th1应答的方法，如患有增生疾病如癌症的病人。此发明的相关方面也提供对患有Th2失调的病人进行治疗的方法，如哮喘或过敏性疾病，或在病人中引发Th2应答，而其应答将是有益的，如患有自身免疫疾病的病人。
此发明进一步提供了在病人中调控免疫/移植耐受的方法，包括给予病人治疗有效剂量的药物，调控tim-1，tim-2，或tim-4活性，从而调控免疫耐受性。一些实施方案中，该药物通过减少tim-1，tim-2，或tim-4表达或活性从而增加免疫/移植耐受性。在另一实施方案中，该药物通过增加tim-1，tim-2，或tim-4表达或活性从而减少免疫耐受性。
此发明进一步提供了在有需要的病人中增强或抑制T-细胞增殖的方法，该方法包括给予病人能有效增加或抑制T-细胞增殖数量的tim-4多肽。
此发明的其他方面提供了一种在有需要的病人中进行治疗，预防或减少A型肝炎感染的方法。某一实施方案中，A型肝炎感染的治疗或预防是通过给予病人治疗有效剂量的(i)包括tim-4IgV区域的多肽，或(II)包括与tim-4IgV区域和/或tim-4粘液素区域具有高度同源的氨基酸序列，或相似的氨基酸序列的多肽。此发明的相关方面提供了一种通过给予病人治疗有效剂量的包括tim-4IgV区域的多肽或包括与tim-4IgV区域，tim-4粘液素区域，或与其两者具有高度同源，或相似的氨基酸序列的多肽，在病人中进行遗传性过敏症的预防或减少其发生可能性的方法。在另一个实施方案中，多肽包括tim-4粘液素区域或具有与tim-4粘液素区域高度同源，或相似的氨基酸序列区域。
此发明也提供了鉴定调控tim-1/tim-4复合物形成的药物的方法，如鉴定促进或抑制复合物形成，或阻止tim-1结合tim-4的活性的药物的方法。此发明的另一方面提供了鉴定模拟tim-4结合tim-1的药物的方法，如作为tim-4的替代物激活tim-1活性从而调控免疫应答的药物。
此发明也提供了新的tim-4多肽，包括这些多肽的组合物，和其编码核酸。在一个特别方面提供了可溶的非膜锚定tim-4多肽。合适的可溶性多肽包括那些由粘液素区域的IgV和N-末端部分组成，但不包含tim-4跨膜区域的多肽。在一些实施方案中，可溶tim-4多肽还包含tim-4胞内区域。可溶tim-4多肽可作为结合tim-1并调控免疫应答的药物使用。
图1显示Tim-2mRNA适合于在Th2细胞中表达。(A)由Th1(AE7)和Th2(D10G4)克隆制备的cDNA用tim-2和Tim-3引物进行RT-PCR。产物用1.2％琼脂糖凝胶分析。(B)D011.10TCR转基因CD4 T细胞在Th1或Th2极性条件下用OVA323-339刺激。在每轮刺激结束时提取RNA并制备cDNA。用特异的Tim-2引物对cDNA进行循环-样品PCR。产物用1.5％琼脂糖凝胶分析。
图2显示Tim-2配基在活性APCs中表达。树突状细胞系，D2SC/1，和巨噬细胞系，RAW 264，在20ng/ml LPS和5ng/ml IFNγ的条件下孵育。激活-后48小时，收集细胞并用生物素标记Tim-2Ig，生物素标记Tim-1Ig，生物素标记Tim-3Ig，或生物素标记hIgG进行染色并用生物亲和素-PC作为第二种检测试剂。细胞用流式细胞计数分析。
图3 Tim-2Ig的治疗引发Th2细胞因子的应答和增殖。SJL小鼠用PLP 139-151免疫，并用Tim-2Ig，或hIgG或作为对照的PBS进行处理。免疫后10天收集器官并评估增殖和细胞因子的产生。Tim-2Ig(空心三角形)；PBS(实心圆形)；hIgG(实心方形)。(A)全部的脾细胞在缺失抗原的条件下培养48小时。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行评估。(B)全部的脾细胞在系列浓度的PLP139-151多肽存在下培养48小时。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行测定。(C)收集3(A)和(B)中描述的上清，用ELISA评估IL-2，IFNγ，IL-4和IL-10表达情况。
图4显示Tim-1Ig的治疗引发增殖和Th2细胞因子的应答。SJL小鼠用PLP 139-151免疫，并用Tim-1Ig，或hIgG或作为对照的PBS进行处理。免疫后10天收集器官并评估增殖和细胞因子的产生。Tim-1Ig(空心圆形)；PBS(实心菱形)；hIgG(实心方形)。(A)全部的脾细胞在缺失抗原的条件下培养48小时。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行评估。(B)全部的脾细胞在系列浓度的PLP139-151多肽存在下培养48小时。通过H3-胸腺嘧啶脱氧核苷的结合对增殖进行测定。(C)收集4(A)和(B)中描述的上清，用ELISA评估IL-2，IFNγ，IL-4和IL-10表达情况。
图5显示在引发EAE期间用Tim-2Ig进行治疗可以延缓疾病的发作和严重性。用溶于CFA的75μg PLP139-151多肽免疫SJL/J小鼠，并静脉内注射百日咳毒素。从0天至8天的每个交替日用Tim-2Ig，或作为对照的hIgG或PBS进行处理。根据EAE临床征兆对小鼠进行监控。
图6显示在引发EAE期间用Tim-1Ig进行治疗可以延缓疾病的发作和严重性。用溶于CFA的75μg PLP139-151多肽免疫SJL/J小鼠，并静脉内注射百日咳毒素。从0天至8天的每个交替日用Tim-1Ig，或作为对照的hIgG或PBS进行处理。根据EAE临床征兆对小鼠进行监控。
图7显示活性抗原递呈细胞表达的Tim-1和tim-2配基，从Ba1b/c小鼠脾细胞纯化出CD11b(巨噬细胞和树突状细胞)和CD11c(树突状细胞)并用LPS和gamma干扰素激活。激活-后24小时细胞用hIgG(红线)，Tim-1Ig生物素标记(绿色线)，或Tim-2Ig生物素标记(黄色线)进行染色。抗生物素-PE被用于第二种检测试剂。所用样本用流式细胞仪分析。Tim-1和tim-2配基的表达在活性抗原递呈细胞中都是上调的。
图8显示在Th1和Th2极化细胞系中Tim-2的表达情况。来源于C57BL/6和Balb/c小鼠的初始T细胞在存在IL-12和抗-IL-4(Th1)或IL-4和抗-IL-12(Th2)的条件下用抗-CD3/CD28刺激进行极化。从细胞中提取RNA并制备cDNA。用特异的Taqman引物和探针对Tim-2相对于GAPDH的表达进行测定。与Th1细胞相比，Tim-2的表达更倾向于在Th2细胞中进行上调。
图9显示Tim1/Fc单一-治疗可以使微小错配的胰岛移植得到存活。Balb/c小鼠按240mg/kg的剂量用streptocotocin进行单一注射而患上糖尿病。来源于DBA/2的胰岛移植物被移植到右肾的肾囊下。受体鼠在移植的0，2，4天按0.25mg/小鼠的剂量用Tim1/Fc进行治疗。
图10显示Tim2/Fc单一-治疗延缓排斥并使微小错配的胰岛移植得到存活。Balb/c小鼠按240mg/kg的剂量用streptocotocin进行单一注射而患上糖尿病。来源于DBA/2的胰岛移植物被移植到右肾的肾囊下。受体鼠在移植的0，2，4天按0.25mg/小鼠的剂量用Tim2/Fc进行治疗。
图11显示Tim2/Fc与抗-CD154协同增效可以引发MHC错配移植耐受性。C57BL/6小鼠按260mg/kg的剂量用streptocotocin进行单一注射而患上糖尿病。来源于DBA/2的胰岛移植物被移植到右肾的肾囊下。受体鼠在移植的0，2，4天按0.25mg/小鼠的剂量用Tim2/Fc进行治疗，并在移植的0，2天按0.25mg/小鼠的剂量用MR1进行治疗。
图12显示Tim-4在巨噬细胞和成熟树突状细胞中，而非T细胞中表达。(a)利用Taqman定量PCR对Clontech多组织cDNA芯片进行重复试验分析小鼠不同组织中Tim4 mRNA的情况。(b)DO11010TcR转基因T细胞在体外分化为TH1或TH2系，在每轮再刺激后从静息细胞中制备RNA。RNA也可以由长-期T细胞克隆AE7(TH1)和D10.G4(TH2)，及CHO-Tim-4稳定转化系进行制备。显示了两次试验的数据。(c)SJL/J脾和淋巴节细胞被纯化为CD11b+，CD11c+，B220+，和CD3+细胞群。显示了超过5次试验的数据。(d)用GM-CSF或Flt3L从骨髓细胞中制备体外培养的树突状细胞，一部分细胞用LPS刺激。Flt3L-制备的细胞转变为浆细胞形式。显示了2次试验的数据。(e)用CMS5 Flt3L-引发的肿瘤细胞注射CB6F1小鼠并制备体外培养的树突状细胞。转化T细胞和B细胞的脾细胞按照类型进行分离。所有细胞类型用Tim-4 Taqman RT-PCR对Tim-4mRNA表达进行定量。所有数据都以tim-4相对于GAPDH的表达量进行表示，并重复三孔。
图13显示Tim-4配基在B细胞和活性T细胞中表达。全部的SJL/J脾细胞，无论经LPS和IFN-γ(用于B细胞)，或ConA(用于T细胞)激活或未激活的，都用B220-FITC或CD3-FITC和Tim-4-Ig进行染色(用抗-人IgG-PE测定)。数据表明了四次单独试验的结果。
图14显示Tim-4与Tim-1特异交互作用。(a)经Tim-1，Tim-3，或Tim-4 cDNA转染的CHO细胞用Tim-1-Ig(用抗-mIgG2a-PE检测，用单独的二抗作为对照)，Tim-2-Ig，或Tim-4-Ig(都用抗-hIgG-PE检测，用hIgG作为对照)染色。分别用单克隆抗-Tim-1或抗-Tim-3可在细胞表面检测到Tim-1和Tim-3，而用生物素标记的抗-HA对Tim-4进行检测(用抗生物素-PE可见；所有都与同型对照进行比较)。数据表明了超过10次试验的结果。(b)经Tim-1或Tim-4转染的HEK293细胞按前述方法用Tim-1-Ig或Tim-4-Ig染色。为评估特异的染色情况，Tim-1-Ig预先与抗-Tim-1或抗-Tim-3共孵育，并用于Tim-4转染细胞的染色。此外，Tim-1转染细胞用抗-Tim-1或抗-Tim-3预先孵育并用Tim-4-Ig染色。数据表明了超过5次试验的结果。
图15显示可在正常T细胞中观察到Tim-4-Tim-1的交互作用。(a)从全部脾细胞中分离CD3+细胞并用抗-CD3和抗-CD28刺激。按前述用抗-Tim-1或Tim-4-Ig染色。(b)全部脾细胞用ConA刺激并按前述用抗-CD3或Tim-4-Ig染色。细胞在经Tim-4-Ig染色之前预先与抗-Tim-1或抗-Tim-3孵育从而评估Tim-1与Tim-4-Ig结合的特异性。(c，d)DO11.10 TCR转基因T细胞在体外分化为TH1和TH2细胞系并用PMA+Ionomycin+golgi Stop激活3小时，并按前述用抗-Tim-1或Tim-4-Ig染色。激活的细胞用抗-CD4进行体外染色并用细胞因子抗体进行体内染色以确定其分化为TH1和TH2细胞系。数据表明了超过4次试验的结果。
图16显示Tim-1-Ig在体外特异结合活性CD11b+和CD11c+细胞。来源于DO110.10TcR转基因小鼠或Balb/c小鼠的脾细胞用LPS和IFN-γ刺激。CD11b+和CD11c+细胞通过MACS柱进行纯化并在存在或缺失抗Tim-1或抗Tim-3单克隆抗体的情况下用生物素标记的Tim-1-Ig染色。抗生物素-PE被用于第二种检测试剂。数据表明了2次试验的结果。
图17显示Tim-1-Ig的治疗引发T细胞的增殖。(a)来源于免疫SJL/J小鼠的脾细胞在体内用Tim-1-Ig，或hIgG或PBS对照处理，并用PLP 139-151多肽再刺激在体外培养48小时。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定增殖情况，试验重复三孔。(b)按6a试验中叙述的经PLP 139-151抗原刺激48小时的体外培养上清被用于细胞因子ELISAs；显示了IL-2，IL-4，IL-10和INF-γ的表达情况。单独分析来源于单独小鼠(6只)的脾细胞，并显示了所有小鼠的平均数值。误差栏表示S.E.M值。数据表明4次独立试验的结果。黑色菱形，PBS；黑色方形，hIgG；空心三角形，Tim-1-Ig处理。
图18显示Tim-4-Ig引发体内的T细胞增殖及体外促进T细胞的增殖。
(a)来源于经Tim-4-Ig，或hIgG或PBS对照体内免疫的SJL/J小鼠的脾细胞，在缺失多肽再刺激的情况下体外培养48小时。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定增殖情况，试验重复三孔。缺失多肽再刺激的情况下体外培养48小时后收获培养上清，并用于细胞因子ELISAs以测定在缺失抗原再刺激的情况下自然细胞因子的产生数量。来自于2个不同小鼠的脾细胞被分别测试三次，并显示了其平均值。(b)来源于2只经Tim-4-Ig(T4)或hIgG(Hu)体内免疫的SJL/J小鼠的脾细胞被分离为CD11b+(Mac)，B220+(B)，和CD3+(T)细胞群并在缺失多肽再刺激的情况下进行重组。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定增殖情况。(c)用包被有特定浓度的抗-CD3，抗-CD28，和Tim-4-Ig或对照Igs的板对纯化的SJL/JT细胞进行刺激。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定增殖情况，试验重复三孔。数据表明了2个相同试验(左列)或5个相同试验(右列)的结果。所有误差栏表明重复孔的S.E.M.值。
图19显示体内的Tim-1-Ig给药在TH2-偏倚系统中引发了TH2应答的增强和增殖。雌性Balb/c小鼠注射50μg OVA 323-339和4mg Imject alum(Pierce)并在7天后用50μg OVA 323-339和2mg alum加强注射。在免疫前4小时及7天加强免疫前4小时，及免疫后2，4，10天，小鼠用100μgTim-1-Ig，hIgG，或250μlPBS注射5次。第14天，处死小鼠，脾细胞被用于分析增殖和细胞因子。(a)存在OVA 323-339多肽条件下体外培养脾细胞48小时。48小时后用3[H]胸腺嘧啶脱氧核苷共孵育以测定增殖情况，试验重复三孔。OVA 323-339多肽体外刺激48小时后收集培养上清并用于细胞因子ELISAs；显示了IL-2，IL-4，IL-10的表达情况。未得到明显的IFN-γ表达。源于单独小鼠(3只)的脾细胞分别重复三孔进行分析，并显示了所有3只小鼠的平均值。黑色菱形，PBS；黑色方形，hIgG；空心三角形，Tim-1-Ig体内注射。
图20显示了鼠tim-4位点的选择性拼接图，产生两种可溶的tim-4形式。
发明详述I.综述本发明通常提供了新的调节免疫应答的方法和药物。本发明的方法可以调控主体中针对Th1和Th2应答的免疫应答。Th1和Th2应答，某种程度上，是互斥的，正如初始 CD4+T辅助细胞分化为Th1和Th2效应细胞，其每种都可分泌不同的细胞因子。相应地，本发明诱导Th1-介导的失调的方法可以用于患有Th2-介导失调的主体，而诱导Th2-介导的失调的方法可以用于患有Th1-介导失调的主体。
本发明一个方面提供了对具有需要的主体进行免疫应答的调控的方法，该方法包括给予主体治疗有效剂量的药物，其可以调节tim-1和tim-4之间的结合。在此所述的某一实施方案中，以Th1免疫应答的提高作为免疫应答，并且药物将增加tim-1，tim-2或tim-4的活性或表达，例如那些提高tim-1和tim-4之间的结合的药物。在此所述方法的另一个实施方案中，以Th2免疫应答的提高作为免疫应答，并且药物将减弱tim-1，tim-2或tim-4的活性或表达，例如那些减弱tim-1和tim-4之间的结合的药物。
本发明进一步提供了在需要治疗的主体中进行治疗或防止或减少遭受Th-1介导的疾病可能性的方法，该方法包括给予主体治疗有效剂量的药物，其可以减少tim-1，tim-2或tim-4的活性或表达。Th1-介导的疾病包括自身免疫疾病，如多发性硬化，1-型糖尿病，Hashinoto’s甲状腺炎，Crohn’s疾病，类风湿关节炎，系统性红斑狼疮，胃炎，自身免疫性肝炎，溶血性贫血，自身免疫血友病，自身免疫淋巴细胞增生综合症(ALPS)，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，肾小球肾炎，Guillain-Barre综合症，银屑病和重症肌无力。Th1-介导的疾病也包括宿主排斥移植物疾病(HVGD)和抑制物排斥宿主疾病。
本发明进一步提供了在需要治疗的主体中进行治疗或防止或减少遭受Th-2介导的疾病可能性的方法，该方法包括给予主体治疗有效剂量的药物，其可以增加tim-1，tim-2或tim-4的活性或表达。在某一实施方案中，Th2-介导的疾病是哮喘，过敏，过敏性鼻炎，胃肠过敏，食物过敏，嗜曙红细胞增多，结膜炎或肾小球肾炎。
在某一特别实施方案中，这里所述方法中使用的调节免疫应答的药物包括多肽(1)SEQ ID NO331-133位氨基酸；(2)SEQID NO431-134位氨基酸；(3)与SEQ ID NO3 31-133位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ IDNO4 31-134位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90％相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO9，SEQID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12中挑选的氨基酸序列。
在另一个特别的实施方案中，这里所述方法中使用的调节免疫应答的药物包括多肽(1)SEQ ID NO121-126位氨基酸；(2)SEQ ID NO221-129位氨基酸；(3)与SEQ ID NO121-126位氨基酸至少具有90％相同或相似氨基酸序列；或(4)与SEQID NO221-129位氨基酸至少具有90％相同或相似氨基酸序列。在另一个实施方案中，药物包括与SEQ ID NO1 130-237位氨基酸，SEQ ID NO2 127-288位氨基酸，SEQ ID NO3 134-318位氨基酸或SEQ ID NO4 136-281位氨基酸至少具有80％，85％或90％相同或相似的氨基酸序列。
这里所述方法的一个实施方案中，这里所述方法使用的调节免疫应答的药物包括抗体，或其抗原-结合片段，其结合tim-1，tim-2或tim-4。在一个特别实施方案中，该药物是一种结合tim-4的抗体；抗体或片段可以结合，例如，tim-4 IgV和/或粘蛋白区域。另一个实施方案中，药物是一种针对tim-1和tim-2，或tim-2和semaphorin-4A的双特异抗体。减少tim-1，tim-2或tim-4活性的药物包括反义RNA药物。在另一个实施方案中，药物包括与SEQ ID NO1 130-237位氨基酸，SEQ ID NO2127-288位氨基酸，SEQ ID NO3 134-318位氨基酸或SEQ IDNO4 136-281位氨基酸至少具有80％，85％或90％相同或相似的氨基酸序列。药物也包括peptidomimetica和小分子，如小于2kDa的非多肽复合物。
本发明进一步提供药物研究的方法，部分基于未预料的发现，即tim-1，tim-2或tim-4形成物理复合物，而这种作用将调节免疫应答。本发明的一个方面提供了鉴定可调节tim-1多肽和tim-4多肽之间结合的药物的方法，包括(a)在测试药物存在的条件下将tim-1多肽和tim-4多肽相结合；(b)鉴定测试药物对于tim-1多肽和tim-4多肽相结合的影响；从而鉴定调节tim-1多肽和tim-4多肽相结合的药物。本发明也提供了调节免疫应答的药物的方法，该方法包括(a)在测试药物存在的条件下将tim-1多肽和tim-4多肽相结合；(b)鉴定测试药物对于tim-1多肽和tim-4多肽相结合的影响；从而鉴定调节免疫应答的药物。在某一实施方案中，步骤(b)包括在存在测试药物的合适的对照情况下，比较tim-1/tim-4复合物的形成。在特别实施方案中，合适的对照包括在缺失测试药物的情况下，第一种多肽和第二种多肽间复合物的形成。
在另一实施方案中，第一种多肽或第二种多肽或其两者在细胞中都有表达。在另一实施方案中，测定复合物的形成包括测试报告基因的表达，其中报告基因的表达依赖于复合物的形成。在另一实施方案中，第一种多肽或第二种多肽或其两者都标记荧光素分子。在另一实施方案中，tim-4多肽包括(1)SEQ ID NO331-133位氨基酸；(2)SEQ ID NO4 31-134位氨基酸；(3)与SEQ ID NO3 31-133位氨基酸至少具有90％相同或相似氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO4 31-134位氨基酸；或(5)与tim-4多肽至少具有90％相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12中挑选的氨基酸序列。而在另一实施方案中，tim-1多肽包括(1)SEQ ID NO12 1-126位氨基酸；(2)SEQ ID NO2 21-129位氨基酸；(3)与SEQ IDNO1 21-126位氨基酸至少具有90％相同或相似氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO2 21-129位氨基酸至少具有90％相同或相似氨基酸序列。在另一个实施方案中，tim-1多肽包括与SEQID NO1 130-237位氨基酸，SEQ ID NO2 127-288位氨基酸至少具有80％，85％或90％相同或相似的氨基酸序列。
鉴定调节tim-1和tim-4结合的药物的方法可以用于鉴定增加tim-1和tim-4结合的药物，或减弱tim-1和tim-4结合的药物。本方法并非限制于鉴定任何特定单个药物类型。药物可以是，例如，小复合物，抗体，多肽，核酸，或碳水化合物。
此外，本发明的一个方面提供了鉴定tim-4中对于tim-1和tim-4结合起关键作用的氨基酸残基的方法，该方法包括(a)将以下两种物质相结合(1)包含tim-4 IgV区域的多肽，其中所述的tim-4 IgV区域与SEQ ID NO3 31-133残基或SEQID NO4 31-134残基中所列的tim-4 IgV区域具有一个和10个氨基酸之间的位点相关性；(2)tim-1多肽，其中所述的tim-1多肽可以结合tim-4多肽；(b)测定多肽和tim-1多肽间复合物的形成；并且(c)若复合物的形成与合适的对照不同，则将形成的复合物与合适的对照相比较，其中一个氨基酸被鉴定为对于结合tim-1至关重要。
本发明的相关方面提供了鉴定tim-4中对于tim-4与tim-1结合起关键作用的氨基酸残基的方法，该方法包括(a)将以下两种物质相结合(1)包括tim-4粘蛋白区域的多肽，其中所述的tim-4粘蛋白区域与SEQ ID NO3 134-318残基或SEQID NO4 136-281残基中所列的tim-4粘蛋白区域具有一个和10个氨基酸之间的位点相关性；(2)tim-1多肽，其中所述的tim-1多肽可以结合tim-4；(b)测定多肽和tim-1多肽间复合物的形成；并且(c)若复合物的形成与合适的对照不同，则将形成的复合物与合适的对照相比较，其中一个氨基酸被鉴定为对于结合tim-1至关重要。
在鉴定tim-4中对于tim-4与tim-1结合至关重要的氨基酸的方法中的一个实施方案中，合适的对照包括(1)tim-1多肽，和(2)包括SEQ ID NO3 31-133氨基酸和/或SEQ ID NO3134-318氨基酸的对照多肽间形成的复合物。在另一个实施方案中，tim-1多肽包括(1)SEQ ID NO121-126氨基酸；(2)SEQID NO2 21-129氨基酸；(3)与SEQ ID NO1 21-126氨基酸或SEQ ID NO1 130-237氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO2 21-129氨基酸或SEQ ID NO2 127-288氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列。
本发明的另一个方面提供了测定所测多肽是否结合tim-1多肽的方法，其中所测多肽包括那些与SEQ ID NO3 31-133氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列，该方法包括(a)将所测多肽与tim-1多肽相接触；并且(b)测定多肽和tim-1多肽间复合物的形成；其中若检测到复合物的形成则所测多肽被鉴定为与tim-1多肽相结合。在一个示范性实施方案中，tim-1多肽包括(1)SEQ ID NO1 21-126氨基酸；(2)SEQ ID NO221-129氨基酸；(3)与SEQ ID NO1 21-126氨基酸或SEQ IDNO1 130-237氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO2 21-129氨基酸或SEQ ID NO2 127-288氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列。
本发明的另一个方面提供了测定所测多肽是否结合tim-4多肽的方法，其中所测多肽包括那些与SEQ ID NO1 21-126氨基酸或SEQ ID NO1 130-237至少具有90％相同或相似的氨基酸序列，该方法包括(a)将所测多肽与tim-4多肽相接触；并且(b)测定多肽和tim-4多肽间复合物的形成；其中若检测到复合物的形成则所测多肽被鉴定为与tim-1多肽相结合。在一个实施方案中，tim-4多肽包括(1)SEQ ID NO3 31-133位氨基酸；(2)SEQ ID NO4 31-134位氨基酸；(3)与SEQ IDNO3 31-133位氨基酸或SEQ ID NO3 134-318位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ ID NO431-134位氨基酸或SEQ ID NO4 136-281位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90％相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含从SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12中挑选的氨基酸序列。
本发明的另一个方面提供了防止或减少主体中患遗传性过敏症的方法，该方法包括给予主体治疗有效性剂量的多肽，所述多肽包括(1)SEQ ID NO3 31-133位氨基酸；(2)SEQ IDNO4 31-134位氨基酸；(3)与SEQ ID NO3 31-133位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ IDNO4 31-134位氨基酸或SEQ ID NO4的136-281位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90％相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含从SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12中挑选的氨基酸序列。
本发明的另一个方面提供了治疗或防止或减少主体中遭受A型肝炎感染的可能性的方法，该方法包括给予主体治疗有效性剂量的多肽，所述多肽包括(1)SEQ ID NO3 的31-133位氨基酸；(2)SEQ ID NO4的31-134位氨基酸；(3)与SEQ IDNO3的31-133位氨基酸或SEQ ID NO3的134-318位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(4)与SEQ IDNO4的31-134位氨基酸或SEQ ID NO4的136-281位氨基酸至少具有90％相同或相似的氨基酸序列；或(5)与tim-4多肽至少具有90％相同的氨基酸序列，该tim-4多肽包含从SEQID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQID NO11，SEQ ID NO12中挑选的氨基酸序列。在一个实施方案中，主体并未患有A型肝炎。在另一实施方案中，主体并未感染A型肝炎病毒。而在另一实施方案中，主体中抗A型肝炎抗体血清呈阴性。在另一实施方案中，主体是儿童。在另一实施方案中，遗传性过敏症的疾病包括哮喘，鼻炎，湿疹和花粉热。
本发明的另一个方面提供了一种新的可溶性tim-4多肽。一个方面提供了一种包括一种tim-4 IgV区域，tim-4胞内区域，和一个缩短了的tim-4粘蛋白粘液素区域的分离多肽，其中该多肽不包括tim-4跨膜区域。本发明的另一个方面提供了一种包括一种tim-4 IgV区域，和一个截短的tim-4粘蛋白区域的分离多肽，其中该多肽不包括tim-4跨膜区域或tim-4胞内区域。在一种优选的实施方案中，可溶性tim-4多肽是一种哺乳动物多肽，如人类或小鼠多肽。在一种特别的实施方案中，可溶性的tim-4多肽包括SEQ ID NO3 31-133氨基酸或SEQ IDNO4 31-134氨基酸。在另一个实施方案中，可溶性tim-4多肽包括SEQ ID NO9，10，11，12中所列的序列，虽然在其他实施方案中可溶的tim-4多肽不包括信号序列。在一些实施方案中，可溶性tim-4多肽与其他多肽融合，如增加其体内稳定性的多肽。在一些实施方案中，融合多肽包括免疫球蛋白Fc区域或一种血清白蛋白多肽。本发明进一步提供了编码这里所述的可溶性tim-4多肽的核酸以及包括tim-4可溶性多肽和一种药物可接受载体的组合物。
II定义出于方便，在此集合了说明书、实施例、和权利要求中使用的某些术语。除非另有定义，所有这里使用的技术和科学术语具有本发明所属领域中的普通技术人员通常理解上的相同含义。
这里使用的词“一个”和“一个”指一个或多于一个(例如，至少一个)主体。根据实施例，“一个元素”指一个或多于一个元素。
这里使用的术语“包括”，可以与术语“包括但不限于”交换使用。
这里使用的术语“或”，可以与术语“和/或”交换使用，除非文中清楚地指明其他意义。
这里使用的术语“例如”，可以与术语“例如但不限于”交换使用。
术语“核酸”指多聚核酸如脱氧核糖核酸(DNA)，及在适用的地方，指核糖核酸(RNA)。该术语应理解为也包括，作为等同物的，由核酸类似物形成的RNA或DNA类似物，及，如所述实施方案中所应用的，单链(正义或反义)和双-链多聚核酸。
术语“防止”是专业-公认的，当涉及某些情况下使用时，如局部复发(例如，疼痛)，一种疾病如癌症，一种复合症状如心脏病或其他任何医学疾病，在此领域中是熟知的，并包括在情况发生之前给予复合物治疗，使得与未接受复合物治疗的主体相比，可使主体减少发病频率，减弱严重性，或延缓医学疾病的发作。这样，癌症的防止包括，例如，通过统计的和/或具有临床意义的计数，与未接受治疗的对照群体相比，接受预防疾病治疗的病人群体中可检测到的癌症生长的数量有所下降，并且/或者与未接受治疗的对照群体相比，接受治疗的群体中可检测到的癌症生长的发生将延缓。感染的防止包括，例如，与未接受治疗的对照群体相比，接受治疗的群体中感染诊断的数量将减少，并且/或者与未接受治疗的对照群体相比，延缓接受治疗的群体中感染症状的发作。疼痛的防止包括，例如，与未接受治疗的对照群体相比，对于接受治疗的群体遭受的疼痛，其发生频率将减少，严重性将减弱，或可选地有所延缓。
这里使用的术语“有效数量”指达到预期结果所需的预先给予的一定剂量的有效数量。本发明的化合物的有效剂量可以根据各种因素而变化，如疾病的阶段，年龄，性别，及动物的体重。剂量方案可以进行调整以提供最优的治疗反应。例如，可以按天注射一些分离的剂量，或根据治疗情况的紧急情况所显示剂量可以适当地减少。
这里使用的术语“主体”指任何脊椎动物，适宜地为哺乳动物，更适宜地为人类。主体的实施例包括人类，非-人类灵长类，啮齿动物，豚鼠，兔，绵羊，猪，山羊，牛，马，狗，猫，鸟，和鱼。
这里使用的多肽的“变体”指具有一个或更多氨基酸替换的一段氨基酸序列。变体可以具有“保守的”变化，其中替换的氨基酸具有相似的结构或化学特性(例如，将亮氨酸替换为异亮氨酸)。更罕见的，变体可以具有“非保守的”变化(例如，将氨基乙酸替换为色氨酸)。相似的次要辅基改变还包括氨基酸删除或插入，或两种兼有。此领域中熟知的计算机程序可以作为指南找出被替换，插入，或删除后将不会扰乱生物或免疫活性的氨基酸残基，例如，DNASTAR软件。
这里使用的“Th1-相关的失调”是一种异常相关的疾病或情况，例如，与参考相比，如，一种正常对照，Th1细胞的活性增强(例如，Th1细胞的应答增强)或数量增加。Th1失调的实施例包括，例如，自身免疫失调(如多发硬化症、风湿性关节炎、I型糖尿病和Crohn氏病)。
这里使用的“Th2-相关的失调”是一种异常相关的疾病或情况，例如，与参考相比，如，一种正常对照，Th2细胞的活性增强(例如，Th2细胞的应答增强)或数量增加。Th2失调的实施例包括，例如，哮喘，过敏，和抗体成分相关的失调(例如，风湿性关节炎)。
这里使用的术语“类似物”包括，但不局限于，与参考序列相比，具有一个或多个氨基酸替换，插入，和/或删除的氨基酸序列。氨基酸替换可以是保守或非保守特性。保守的氨基酸替换包括将本发明的多肽的一个或多个氨基酸替换为具有相似电荷，大小，和/或亲水性特性的氨基酸。只有保守替换形成的类似物是功能等同的。非-保守氨基酸替换包括将多肽的一个或多个氨基酸替换为具有非相似电荷，大小，和/或亲水性特性的氨基酸。氨基酸插入可由单一氨基酸残基或2到15个氨基酸组成的序列组成。删除可以是一个或多个氨基酸的移除，或氨基酸序列的不连续部分。删除的氨基酸可以是连续的或非连续的。
III.Tim氨基酸和核酸序列人类和小鼠的tim多肽序列描述于SEQ ID NOs1-14和PCT公开No.WO 03/002722，美国专利号6066498，6204371，6288218，6084083，6414117，6562343，及美国专利申请
发明者维杰伊·K·库查鲁, 修蒙尼·查克瓦替, 特丽·斯特罗姆, 郑心校, 詹尼弗·梅耶斯 申请人:布赖汉姆妇女医院, 贝斯以色列护理医疗中心