专利名称：一种川芎提取物，其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于中药化学领域，具体涉及一种川芎提取物、其制备方法和用途。
背景技术：
冠状动脉粥样硬化性心脏病主要由冠状动脉粥样硬化、炎症(风湿性、梅毒性、川崎病和血管闭塞性脉管炎等)、冠状动脉痉挛、栓塞、结缔组织疾病、创伤和先天性畸形等多种原因导致心肌缺血、缺氧，主要症状为心绞痛和心肌梗死心脏病发作。由于冠心病绝大多数(95-99%)由冠状动脉粥样硬化引起。传统理念认为动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种因脂质积累疾病，因而降脂治疗一直是抗动脉粥样硬化药物研发及动脉粥样硬化治疗的重点。临床常用的他汀类药物其作用机制为通过抑制HMG-CoA还原酶(HMG-CoAreductase)而阻断胆固醇的生物合成，发挥降脂作用，从而实现抗动脉粥样硬化作用。川弯为伞形科植物川弯Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖,其性味辛，温。归肝、胆、心包经。活血祛瘀作用广泛，适宜瘀血阻滞各种病症，可治头风头痛、风湿痹痛等症。现代药理学研究表明，川芎提取物对离体豚鼠心脏有剂量依赖性抑制作用，对离休大鼠或豚鼠心脏均具有显著的增加冠脉流量作用，其主要活性成分川芎嗪能扩张大鼠肺血管，抑制缺氧性肺血管收缩反应和右心室肥大。此外，川芎还具有中枢神经系统抑制作用，对动物大脑的活动具有抑制作用，而对延脑呼吸中枢、血管运动中枢及脊髓反射中枢具有兴奋作用。但目前研究大都集中在川芎嗪和阿魏酸等成分，对于川芎内酯提取物是否具有降脂及抗动脉粥样硬化活性尚不清楚。本发明提供了一种川芎(拉丁名=RhizomaChuanxiong)提取物，该提取物具有较好的降血脂及抗动脉粥样硬化效果。
发明内容
本发明的第一方面提供一种川芎提取物，其含有质量百分比约为30 90%的藁本内酯，优选地，该提取物中含有质量百分比为37 85%的藁本内酯，更优选地，该提取物中含有质量百分比约为37%的藁本内酯，更优选地，该提取物中含有质量百分比约为85%的藁本内酯。本发明的第二方面提供一种第一方面所述的川芎提取物的制备方法，包括以下步骤I)川芎经乙醇浸泡后，用乙醇加热回流提取，然后将提取液浓缩，得浓缩液；2)将步骤I)获得的浓缩液加至水中分散成混悬液，经石油醚萃取合适的次数，合并萃取液，回收溶剂至干；可选择地，按照以上步骤重复萃取一次，回收溶剂至干，得到萃取浓缩物；3)将步骤2)获得的萃取浓缩物过硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯的混和液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩后得到淡黄色液体。在本发明的一个实施方案中，步骤3)中所述的洗脱液进一步经过薄层色谱紫外分析，合并在365nm紫外线灯照射下蓝色荧光斑点的洗脱液，减压浓缩得到淡黄色液体；优选地，步骤3)中石油醚与乙酸乙酯的体积比为50 I ；优选地，步骤3)中薄层色谱的展开剂为石油醚与乙酸乙酯的混合物，优选地，石油醚与乙酸乙酯的体积比为25 I。在本发明的一个实施方案中，上述制备方法，其中，步骤I)中所用的乙醇浓度为90% -100%，优选为 95% ；优选地，步骤I)中所述的浸泡时间为8 12小时，优选为10小时；优选地，步骤I)中提取时间为1-3小时，提取次数为I至5次，更优选地，提取时间为2小时,提取次数为3次；优选地，步骤I)中所述的浓缩液相对水的密度为I. I I. 5 ;优选地，步骤I)或步骤3)中所述的浓缩方式为减压浓缩，更优选地浓缩方式为采用旋转蒸发仪减压浓缩。本发明的第三方面提供一种药物组合物，其含有本发明第一方面所述的川芎提取物，以及任选的药学可接受的辅料。所述的药学可接受的辅料是本领域技术人员公知的。所述的药物组合物可根据需要，按照本领域技术人员公知的技术制成各种常用剂型，优选制成胶囊剂、片剂、滴丸剂等剂型。本发明的第四方面提供本发明第一方面所述的川芎提取物或第二方面所述的药物组合物在制备用于抗动脉粥样硬化的药物中的用途。本发明的第五方面提供本发明第一方面所述的川芎提取物或第二方面所述的药物组合物在制备用于降血脂的药物中的用途。发明的有益效果本发明的药物组合物中含有质量百分比约为30 90%的藁本内酯，能够有效地降血脂、有效抑制动脉粥样硬化斑块的形成，能够用于降血脂、抗动脉粥样硬化。本发明公开的药物组合物制备方法高效简便，能够获得纯度较高的)I丨芎提取物。
图I川芎提取物液相色谱-质谱联用分析谱图；图2ApoE-/_小鼠动脉粥样硬化斑块病理切片图。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I川芎提取物的制备I)称取Ikg川弯，95%乙醇浸泡10小时后，用4000ml 95%乙醇加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，旋转蒸发仪减压浓缩至相对水的密度为I. 5的浓缩液。2)将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液，500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干，再按照以上步骤重复萃取一次，回收溶剂至干，得到萃取浓缩物。
3)取步骤2)获得的萃取浓缩物，经200-300目正向硅胶柱分离(粗孔硅胶购自青岛海洋化工厂分厂)，柱高50cm，柱径4. 45cm。以石油醚和乙酸乙酯的混和液为洗脱剂进行洗脱，洗脱液的用量为6倍柱体积，其中石油醚乙酸乙酯=50 1(体积比)，然后进行薄层色谱紫外分析。薄层色谱展开剂为石油醚乙酸乙酯比例为25 1(体积比)，检测仪器为YOKO-ZS紫外线分析摄影仪(购自武汉药科新技术开发有限公司)，合并具有相同斑点的洗脱液(在365nm紫外线灯照射下处可见蓝色荧光斑点)，旋转蒸发仪减压浓缩，得到淡黄色液体11. 3g，即本发明的川芎提取物。实施例2川芎提取物的制备I)称取Ikg川芎，95%乙醇浸泡10小时后，用4000ml 95%乙醇加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，旋转蒸发仪减压浓缩至相对水的密度为I. 5的浓缩液。2)将浓缩液加至500ml水中分散成混悬液，500ml石油醚萃取3次，合并萃取液，回收溶剂至干，再按照以上步骤重复萃取一次，回收溶剂至干，得到萃取浓缩物。3)取步骤2)获得的萃取浓缩物，经300-400目正向硅胶柱填充的中压制备柱进行分离(硅胶购自青岛海洋化工厂分厂)，柱高50cm，柱径7cm。以石油醚乙酸乙酯=50 I (体积比)为洗脱剂进行洗脱，弃去前2个柱体积洗脱得到的洗脱液，收集第3个柱体积洗脱得到的洗脱液，旋转蒸发仪减压浓缩，得到淡黄色液体3. 2g，即本发明的川芎提取物。本实施例用更细的硅胶柱，填中压制备柱后，可获得量少、纯度高的川芎提取物。实施例3川芎提取物的分析称取实施例I制备的川芎提取物4. 32mg，加O. 5ml乙酸乙酯溶解，取适量转移至棕色液相进样瓶，用于液相色谱质谱联用分析。分析条件为进样量5ul ;流速0. 8ml/min，柱温30°C;质荷比100-1000m/z。液相色谱流动相组成为O. 01 % (体积比)甲酸-水溶液(A)和乙腈溶液(B)，液相色谱梯度为Omin 30%乙腈；O 45min，乙腈浓度从30%上升到95%，上升速度为1.44% /min ;45 50min,保持乙腈浓度为95%。分析谱图如附图I所示。液相色谱-质谱联用分析显示实施例I制备的川芎提取物在29min有I个明显的分子离子峰，其对应的质谱检测结果显示其质荷比(m/z)为191. 23，质荷比191. 23对应的分子离子峰为[M+H]+，质荷比231. 76对应的分子离子峰为[M+H+CH3CN]+，因此推断该峰分子量为190. 24，经与标准品比对后鉴定该峰代表的化合物为藁本内酯。分析结果显示，川芎提取物中主要成分为藁本内酯。2.川芎提取物中藁本内酯含量测定精确称取Z-蒿本内酯标准品2. IOmg(上海融禾医药科技有限公司，批号110825，纯度> 98%。)，加乙酸乙酯420ul溶解得到5mg/ml的标准品溶液，用乙酸乙酯依次稀释成lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml、0. lmg/ml、0. 05mg/ml等五个浓度的标准品液。采用上述液相色谱分析方法进行对不同浓度的标准品溶液进行分析，建立标准曲线。以藁本内酯标准品对实施例I和实施例2制备的川芎提取物中藁本内酯含量进行准确定量，结果表明实施例I所得提取物中藁本内酯含量为37. 32% (质量比)，实施例2所得提取物中藁本内酯含量为85. 25% (质量比)。实施例4片剂制备取实施例I制备的川芎提取物120g、淀粉180g、糊精IOg混和均匀，用10%预胶化淀粉浆粘合，湿法制粒，烘干，加适量硬脂酸镁混和，压成片剂1000片，包衣即得。实施例5胶囊的制备取实施例I制备的川芎提取物200g与羟丙基纤维素60g及微粉硅胶30g混和，用适量70%乙醇做湿润剂，湿法制粒，挥发油用环糊 精包合，两者混合过筛烘干后加入硬脂酸镁，混匀后装胶囊，制成1000粒。实施例6软胶囊的制备取实施例I制备的川芎提取物300g，加入2倍量的橄榄油作为稀释剂混合均匀后，装入软胶囊，制成1000粒。实施例7滴丸的制备取实施例I制备的川芎提取物200g研磨过筛(100目)，加聚乙二醇6000350g和硬脂酸25g混匀，加热至90°C，搅拌至熔化，保持在80-85°C，控速滴入甲基硅油冷却成丸，制得1000粒。 实施例8抗动脉粥样硬化药效评价采用经Apo-E基因敲除(ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化模型，观察给药12周对ApoE-/-小鼠高血脂症的调节作用及动脉粥样硬化斑块形成的抑制作用。I.动脉粥样硬化模型的建立Apo-E基因敲除(ApoE-/-)小鼠及C57BL/6J小鼠购自北京大学医学部，饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心(室温24±2°C，相对湿度58-65% )。ApoE-/-小鼠经正常饲料(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)喂养4周后，改用高脂饲料喂养12周，高脂饲料配方为基料77. 8%、蛋黄粉10%、猪油10%、胆固醇1.0%、猪胆盐O. 2 %，造成动脉粥样硬化模型。2.分组及给药方法将小鼠分为模型组、高剂量组和低剂量组、阳性药组、以及空白对照组。所有供试药品均用O. 5%的羧甲基纤维素钠溶液助溶后，口服灌胃给药，每日一次。其中模型组给予O. 5%的羧甲基纤维素钠溶液，给药体积为lml/100g鼠重；分别取实施例I制备的川芎提取物O. 6g和O. 3g，加入IOOml O. 5%的羧甲基纤维素钠溶液溶解，混匀后配制成6mg/ml (高剂量组)和3mg/ml (低剂量组)的溶液，口服灌胃给药，给药体积为lml/100g鼠重；阳性药给予3mg/kg鼠重的辛伐他汀；空白对照组为C57BL/6J小鼠，给予O. 5 %的羧甲基纤维素钠溶液，给药体积为lml/100g 鼠重；连续给药12周，给药期间各组动物均自由饮水，期间喂饲高脂饲料，每隔10天称体重I次。观察给药12周对Ap0E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的抑制作用。3.实验方法连续给药12周后,处死小鼠，小鼠处死前24小时禁食禁水,称重。剥离主动脉固定于10%甲醒中，石腊包埋切片后进行HE染色(苏木精-伊红染色，hematoxylin-eosinstaining，简称HE染色)，光学显微镜观察、拍照动脉粥样硬化斑块病变情况。分别检测主动脉弓部、主动脉胸段及主动脉腹段中的斑块面积，用Image J软件计算该三部分斑块面积与管腔面积的比值。
摘眼球取血，滴至I. 5ml离心管中，3500转/分离心lOmin，得血清样本，4°C保存，用半自动生化测定仪(荷兰威图公司型号Vital Scientific7-0416)测定血清中各相关生化指标，其中，血清总胆固醇(TC)含量测定采用中生北控生物科技股份有限公司提供的总胆固醇(TC)测定试剂盒(批号111281);血清甘油三酯(TG)含量测定采用中生北控生物科技股份有限公司提供的甘油三酯(TG)测定试剂盒(批号115011);直接低密度脂蛋白胆固醇(LDL)含量测定采用中生北控生物科技股份有限公司提供的直接低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(批号110321)，直接高密度脂蛋白胆固醇(HDL)含量测定中生北控生物科技股份有限公司提供的直接高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(批号110321)。4.实验结果结果表明，提取物高、低剂量组对ApoE-/-小鼠体重无明显影响，对整个主动脉斑块的形成有明显的抑制作用，其中高低剂量组对主动脉胸段斑块的形成具有显著抑制作用(P < O. 05)，低剂量组对主动脉弓部斑块的形成具有显著抑制作用(P < O. 05)，高低剂量组对主动脉腹段斑块的形成无显著影响。具体数据见表I及附图2。表I中药提取物对动脉粥样硬化斑块形成的抑制作用
斑块/管腔面积比主动脉弓部斑块主动脉胸段斑块主动脉■腹段斑块 模型组 1.49±0.581.62±1.062.75±0.82
提取物低剂量组 0.52±().4}{*0.33+0.58*2.73±3.37
提取物高剂量组 1.19士 1.060.13±0,10** 1.27 士 1.48注与模型组相比，*P < O. 05，**p < O. Ol血脂分析结果表明，经高脂饮食(12周)后，与正常对照组(C57BL/6J小鼠)相比，模型组TC、LDL的血清含量均显著上升(P < O. 01)。该结果表明高脂喂养的ApoE-/-小鼠血脂显著升高。与模型组相比，阳性药辛伐他汀等显著降低TC和LDL的血清含量，川芎提取物高剂量组TG、TC的血清含量均显著降低(P < O. 05);并且，川芎提取物低剂量组能显著降低LDL的血清含量(P < O. 01)，表明川芎提取物具有降血脂效果。表2川芎提取物对大鼠血脂的影响(X 土SD )mmol/L
体重变化 TGTCLDLIIDL
组别物
(g) (nimoI/L) (nimol/L) (mniol/L) (nimoi/L)
_(η)_
空白对照61.25 土2.230.73±0.091,98^0.570.82±0.421.14±0.29
模型100.45±3.25 0.77±0.188.8±1.63##3.53±1.06##1.76+0.31##
辛伐他汀82.25±t.00 0.66±0. 35.7 ±1.06Λ*2.49± .04Α1.7±0.16
川芎提取物(高)91.6 ±1.520·62±0·12*6,4±2,4*3.0 ±1.551.82±0.66
川芎提取物(低 >90.90±l.fi10.67±0.167.52±0.872.03±0.98** 1.72±0.24注模型组与正常对照组比较#p < 0. 05，##p < 0. 01 ；与模型组相比，*P < O. 05，* * P < O. 01
综合分析上述结果发现，实施例I制备的川弯提取物在60mg/kg鼠重和30mg/kg鼠重给药量下能够显著降低Apo-E基因敲除小鼠血清中TC和TG含量，减少主动脉弓部和主动脉胸段的动脉粥样硬化斑块面积，表现出良好的降脂及抗动脉粥样硬化效果。与阳性药辛伐他汀相比，本发明提供的提取物不仅能够降低ApoE-/-小鼠血清中TC和LDL含量，高剂量组还能显著降低血清甘油三酯(TG)含量，这一药效作用是他汀类降脂药物所不具备的。此外，该提取物对于小鼠体重的影响也小于辛伐他汀，表明其对机体的
影响较小。因此该提取物在预防和治疗动脉粥样硬化方面具有一定的优势。
权利要求
1.一种川芎提取物，其含有质量百分比为30 90%的藁本内酯， 优选地，该提取物中含有质量百分比为37 85%的藁本内酯， 更优选地，该提取物中含有质量百分比约为37%的藁本内酯， 更优选地，该提取物中含有质量百分比约为85%的藁本内酯。
2.—种权利要求I所述的川芎提取物的制备方法，包括以下步骤 1)川芎经乙醇浸泡后，用乙醇加热回流提取，然后将提取液浓缩，得浓缩液； 2)将步骤I)获得的浓缩液加至水中分散成混悬液，经石油醚萃取合适的次数，合并萃取液，回收溶剂至干；可选择地，按照以上步骤重复萃取一次，回收溶剂至干，得到萃取浓缩物； 3)将步骤2)获得的萃取浓缩物过硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯的混和液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩后得到淡黄色液体。
3.权利要求2所述的制备方法，步骤3)中所述的洗脱液进一步经过薄层色谱紫外分析，合并在365nm紫外线灯照射下具有蓝色荧光斑点的洗脱液，减压浓缩后得到淡黄色液体； 优选地，步骤3)中石油醚与乙酸乙酯的体积比为50 I ； 优选地，步骤3)中薄层色谱的展开剂为石油醚与乙酸乙酯的混合物，优选地，石油醚与乙酸乙酯的体积比为25 I。
4.权利要求I或2所述的制备方法，其中，步骤I)中所用的乙醇浓度为90%-100%，优选为95% ； 优选地，步骤I)中所述的浸泡时间为8 12小时，优选为10小时； 优选地，步骤I)中提取时间为1-3小时，提取次数为I至5次，更优选地，提取时间为2小时，提取次数为3次； 优选地，步骤I)中所述的浓缩液相对水的密度为I. I I. 5 优选地，步骤I)或步骤3)中所述的浓缩方式为减压浓缩，更优选地浓缩方式为采用旋转蒸发仪减压浓缩。
5.一种药物组合物，其含有权利要求I所述的川芎提取物，以及任选的药学可接受的辅料。
6.权利要求5所述的药物组合物，该中药组合物的剂型为胶囊剂、片剂、滴丸剂。
7.权利要求I所述的川芎提取物或权利要求5至6任一项所述的药物组合物在制备用于抗动脉粥样硬化的药物中的用途。
8.权利要求I所述的川芎提取物或权利要求5至6任一项所述的药物组合物在制备用于降血脂的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种川芎提取物、其制备方法和用途。该川芎提取物中含有质量百分比约为30～90％的藁本内酯，可以用于制备抗动脉粥样硬化的药物或降血脂的药物。
文档编号C07D307/88GK102872175SQ201210306968
公开日2013年1月16日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者程翼宇, 王怡, 刘二伟 申请人:天津中医药大学