专利名称：具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法
技术领域：
本发明涉及具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，属于生物医药领域。
背景技术：
银杏叶为银杏科银杏属植物银杏(Ginkgo biloba L.)的叶，近年来国内外学者对银杏叶中黄酮类、萜内酯、多糖、聚戊烯醇、挥发油及留醇的化学成分进行了广泛研究。银杏叶类脂成分主要有烃类、聚戊烯醇类、萜烯醇类、留醇类等化合物，它们极性相似，较难分离；银杏叶类脂成分主要是以油状物形态存在，在低温下通常有白色结晶物析出，根据报道主要是留醇类成分。银杏叶留醇的报道主要是通过气质联用(GC-MS)技术来对其混合物的各自化学结构进行研究。我们利用分子蒸馏技术，将银杏叶类脂成分分离后得到的轻馏分，通过裂解-气质联用(Py-GC-MS)分析，其中单萜、倍半萜类化合物GC含量约为23%，长链醇(酮、酯)及二萜类相对含量约为47%，烷基酚、留体类GC含量约为30%;重馏分中主要成分为聚戊烯醇，含量在80%以上。一些分子量大、沸点高的化合物以及受到色谱分离条件和质谱分析等限制，通过GC-MS、HPLC-MS不能完全准确的确定其各自化学结构，因此对银杏叶类脂成分的分离，以及利用核磁共振(NMR)等技术对其结构鉴定，对弄清楚该化学部位的化学成分是十分有必要的。已报道的银杏叶抑菌活性成分主要是黄酮、酚酸类等成分，即主要为水溶性和醇溶性的化学部位，脂溶性成分特别是类脂成分抑菌活性报道甚少。
发明内容
为实现上述目的，发明了具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，由以下步骤组成:第一步，银杏叶类脂软膏的制备:取干燥粉碎银杏叶粉(直径0.25 5毫米以下)，加入丙酮或石油醚(60 90°C)或乙酸乙酯或无水乙醇的任一种溶剂，银杏叶粉与溶剂质量比为1: 5 50 ;30 75°C加热回流提取，时间2 8h，重复3次或以上提取；合并提取液，回收溶剂，得银杏叶脂溶性成分软膏；加I 15% NaOH或KOH的甲醇或乙醇溶液，软膏与溶剂比1: 2 15 (kg: L)，采用30 75°C热回流搅拌，搅拌速度为20 200r/min,时间0.5 5h，得到皂化液；加入丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯的任一种溶齐U，皂化液与溶剂比1: 2 10 (V/V)，合并提取液，回收溶剂，从而得到银杏叶类脂总不皂化物。第二步，银杏叶类脂成分的分子蒸馏分离方法:取银杏叶类脂总不皂化物，放于O _40°C下冷冻结晶I 5h，取出后迅速抽滤，得到结晶物；滤过的油状物通过刮膜式分子蒸馏装置分离，刮膜转速100 300r/min，蒸馏温度120 250°C，在高真空条件下(真空度大于等于1.0 X IO5)，轻组分以气体状态径直飞向中间冷凝器并凝结成液体，进入轻馏分收集器，得到轻馏分；重组分沿筒体内壁进入重馏分收集器，得到重馏分。第三步，银杏叶类脂成分的色谱分离方法:将第二步中所得的结晶物与硅胶G按质量比1:1充分混合磨细，上硅胶柱(粒径0.04 0.1mm)，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇(100% 85%: O 15%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪；100%三氯甲烷馏分，挥干溶剂后用异丙醇或无水乙醇或乙腈在5 -20°C下，反复重结晶得到化合物4(β-谷甾醇乙酸酯)；三氯甲烷/甲醇(99%: 1%, V/V)馏分，挥干溶剂后上Sephadex LH-20柱，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇(30 50%: 70 50%，VN)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取三氯甲烷/甲醇(30 35%: 70 65%，V/V)馏分，挥干溶剂后用环己酮或丙酮在O -20°C下，反复重结晶得到化合物5(β -谷留醇)，剩余物挥干溶剂后用正戊醇或正丁醇在5 -10°C下，反复重结晶得到化合物6 (豆留醇)，剩余物挥干溶剂后用乙醚在O -20°C下，反复重结晶得到化合物7 (麦角留醇)；三氯甲烷/甲醇(90%: 10%, V/V)馏分，挥干溶剂后用三氯甲烷或无水乙醇在O -20°C下，反复重结晶得到化合物8(胡萝卜苷)；第二步中所得的轻馏分与硅胶G按质量比1:1充分混合磨细，上硅胶柱(粒径0.04 0.1mm)，用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯(100% 90%: O 10%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%,V/V)馏分，挥干溶剂后用荧光(GF254)硅胶薄层制备板制备，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(100% 85%: O 15%，￥八)，36511111紫外光下显色，取1^值在0.50 0.65处硅胶，用乙酸乙酯或无水乙醇萃取，低温挥干溶剂得到化合物I (异植物醇)；石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%，V/V)馏分，挥干溶剂后上S印hadex LH-20柱，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇(40 50%: 60 50%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取三氯甲烷/甲醇(40 45%: 60 55%，V/V)馏分，低温挥干溶剂得到化合物2 (橙花叔醇)；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%, V/V)馏分，挥干溶剂后用荧光(GF254)硅胶薄层制备板制备，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(95% 75%: 5 25%，￥八)，36511111紫外光下显色，取1^值在
0.40 0.55处硅胶，用乙酸乙酯或无水乙醇萃取，低温挥干溶剂得到化合物3 (芳樟醇)；将第二步中所得的重馏分与硅胶G按质量比1:1充分混合磨细，上硅胶柱(粒径0.04
0.1mm)，用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯(100% 95%: O 5%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取石油醚/乙酸乙酯(99% 97%:1 3%，V/V)馏分，挥干溶剂后加入质量比为1: 5 15丙酮或乙酸乙酯，室温搅拌溶解；然后将其与活性炭与硅藻土按质量比1:1 5混合的吸 附剂，按固液质量比为1: 10 100混合，在-40°C 30°C搅拌4 20小时，1000 10000转/分钟离心后过滤，上清液回收溶剂后即为纯化后的聚戊烯醇类脂。本发明中所得的化合物I 8，依次为异植物醇(抑菌圈范围9.9-13.4μ g/mL，MIC, MBC 和 MFC 值依次为 31.3 μ g/mL, 62.5-125 μ g/mL, 125 μ g/mL)、橙花叔醇(抑菌圈范围 16.2-20.1 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次为 3.9-15.6 μ g/mL, 31.3-5-62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)、芳樟醇(抑菌圈范围 14.9-17.9 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次为 7.8-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 31.3 μ g/mL)、β -谷甾醇乙酸酯(抑菌圈范围10.9-11.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次为 62.5 μ g/mL，250 μ g/mL)、β-谷甾醇(抑菌圈范围12.1-14.1 μ g/mL, MIC和MBC值依次为31.3 μ g/mL，125 μ g/mL)、豆甾醇(抑菌圈范围
7.7-9.2 μ g/mL, MIC和MBC值依次为125μ g/mL，> 250 μ g/mL)、麦角甾醇(抑菌圈范围
8.1-10.0 μ g/mL，MIC和 MBC 值依次为 62.5-125 μ g/mL,彡 250 μ g/mL)和胡萝卜苷(抑菌圈范围 11.1-12.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次为 62.5 μ g/mL, 125-250 μ g/mL)对于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。化合物I和5与银杏叶聚戊烯醇有协同抑菌作用。化合物I (异植物醇)与银杏叶聚戊烯醇协同抑菌作用表现为抑菌圈范围14.1-17.1mm,MIC值为7.8-15.6 μ g/mL，FIC指数范围为0.25-0.5 ;化合物5(β -谷甾醇)与银杏叶聚戊烯醇协同抑菌作用表现为10.4-16.3mm，MIC值为15.6-31.3 μ g/mL，FIC指数为0.5。银杏叶类脂总不皂化物(抑菌圈范围14.4-16.9 μ g/mL,MIC,MBC和MFC值依次为15.6-31.3 μ g/mL，62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、类脂结晶物(抑菌圈范围 12.3-12.8 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次为 62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、类脂轻馏分(抑菌圈范围 12.9-14.8 μ g/mL，MIC，MBC 和 MFC值依次为31.3μ g/mL，125y g/mL，125y g/mL)、类脂重馏分(抑菌圈范围15.0-16.8 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次为 15.6-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)对于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
具体实施例方式以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。实施例1银杏叶类脂成分的提取分离方法具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，由以下步骤组成:第一步，银杏叶类脂软膏的制备:取干燥粉碎银杏叶粉(直径0.5毫米以下)IOkg,加入石油醚(60 90°C ) 30L, 60°C加热回流提取，时间4h，重复3次提取；合并提取液，回收溶剂，得银杏叶脂溶性成分软膏500g ;加5% NaOH甲醇溶液6L，采用65°C热回流搅拌，搅拌速度为60r/min，时间2h，得到皂化液；加入石油醚(60 90°C ) 30L萃取3次，合并提取液，回收溶剂，从而得到银杏叶类脂总不皂化物350g。第二步，银杏叶类脂成分的分子蒸馏分离方法:取银杏叶类脂总不皂化物350g，放于-20°C下冷冻结晶5h，取出后迅速抽滤，得到结晶物35g;滤过的油状物通过刮膜式分子蒸馏装置分离，刮膜转速200r/min，蒸馏温度180°C，在高真空条件下(真空度
1.0 X IO5)，轻组分以气体状态径直飞向中间冷凝器并凝结成液体，进入轻馏分收集器，得到轻馏分44g ;重组分沿筒体内壁进入重馏分收集器，得到重馏分168g。第三步，银杏叶类脂成分的色谱分离方法:将第二步中所得的结晶物与硅胶G按质量比1:1充分混合磨细，上硅胶柱(粒径0.05 0.1mm)，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇(100% 85%: O 15%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪；100%CHCl3馏分，挥干溶剂后用异丙醇在-10°C下，反复重结晶得到化合物4(β-谷甾醇乙酸酯)290mg ;三氯甲烷/甲醇(99%: I %, V/V)馏分，挥干溶剂后上S印hadex LH-20柱，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇(30 50%: 70 50%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取三氯甲烷/甲醇(35%: 65%, V/V)馏分，挥干溶剂后用环己酮_20°C下，反复重结晶得到化合物5(β-谷留醇)29g，剩余物挥干溶剂后用正戊醇在-10°C下，反复重结晶得到化合物6 (豆甾醇)116mg，剩余物挥干溶剂后用乙醚在_20°C下，反复重结晶得到化合物7(麦角甾醇)105mg;三氯甲烷/甲醇(90%: 10%,V/V)馏分，挥干溶剂后用三氯甲烷_20°C下，反复重结晶得到化合物8 (胡萝卜苷)203mg ;第二步中所得的轻馏分44g与娃胶G按质量比1:1充分混合磨 细，上娃胶柱(粒径0.05 0.1mm),用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯(100% 90%: O 10%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%, V/V)馏分，挥干溶剂后用荧光(GF254)硅胶薄层制备板制备，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%, V/V)，365nm紫外光下显色，取Rf值在0.65处硅胶，用乙酸乙酯萃取，低温挥干溶剂得到化合物I (异植物醇)178mg ;石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%, V/V)馏分，挥干溶剂后上S印hadex LH-20柱，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇(40 50%: 60 50%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取三氯甲烷/甲醇(40%: 60%,V/V)馏分，低温挥干溶剂得到化合物2 (橙花叔醇)51mg ；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%,V/V)馏分，挥干溶剂后用荧光(GF254)硅胶薄层制备板制备，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(85%: 15%，￥八)，36511111紫外光下显色，取1^值在0.40处硅胶，用乙酸乙酯萃取，低温挥干溶剂得到化合物3 (芳樟醇)20mg ;将第二步中所得的重馏分IOg与硅胶G按质量比1:1充分混合磨细，上硅胶柱(粒径0.05 0.1mm)，用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯(100% 95%: O 5%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取石油醚/乙酸乙酯(98%: 2%,V/V)馏分，挥干溶剂后加入IOOml丙酮，室温搅拌溶解；然后将其与活性炭与硅藻土按质量比1:1混合的吸附剂20g，在0°C搅拌5小时，5000转/分钟离心后过滤，上清液回收溶剂后即为纯化后的聚戊烯醇类脂7.2g。实施例2银杏叶类脂成分的抑菌活性考察方法1.实验菌种、原料1.1供试菌种沙门氏菌ATCC14028、金黄色葡萄球菌ATCC25923和黑曲霉菌ATCC164041.2待测样品实施例1中所得化合物I 8以及聚戊烯醇等样品2实验方法2.1滤纸片法测定 样品的抑菌活性(I)培养基的配制热溶解，冷却后，调节pH至7.0 7.2，此为液体培养基，在其中添加2.0g琼脂粉，此为固体培养基，121°C灭菌20min。(2)液体培养基接种与活化菌种打开净化工作台的紫外灭菌灯，杀菌半小时后，打开净化台的操作开关，用灭菌后的接种环取一环菌种溶入液体培养基中，轻轻摩擦锥形瓶壁，让菌落与接种环上分离，取出接种环，封好锥形瓶，轻轻振荡培养基，使菌种分散均匀，放于生化培养箱中，370C (沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)，28°C (黑曲霉菌)下活化24h。(3)实验所需仪器的灭菌倒平板所用培养皿和装有6_滤纸片的培养皿用牛皮纸包好，塞好胶塞的试管、装有移液枪头的盒子分别用牛皮纸包好，将配制好的生理盐水、固体培养基分别用纱布和牛皮纸封好。将其在121°C，IOOPa下高压灭菌20min。(4)调节菌落浓度将溶化的固体培养基倒入20mL左右于培养皿中，置于净化操作台上，自流平冷却。取7支试管，依次稀释活化好的菌悬液，I号试管为原液经生理盐水稀释10倍后的菌悬液，2号试管为稀释100倍的菌悬液，依次稀释后，第七号试管为稀释IO7倍的菌悬液。移取100 μ LI 7号试管中的菌悬液涂布固体培养基,静置使其渗透于培养基中，后倒置培养皿，于生化培养箱中37°C (沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)，280C (黑曲霉菌)培养 24h。根据菌落计算法则:菌落形成单位CfuX稀释倍数=菌落数，计数可数菌落平皿，推算每皿菌落数，选择菌落涂布浓度为105cfu/mL。(5)测试样品的配制用正己烷分别将样品配制成500 μ g/mL溶液，将经过灭菌的滤纸片浸于样品溶液中，半小时后测定其抑菌活性。(6)滤纸片法测定供试样品的抑菌活性用移液器移取100 μ L菌悬液涂布于液体培养基,放置一段时间后待菌液渗透于培养基后，以浸有待测样品的滤纸片轻轻贴服于皿中，注意不要用力过猛，将其陷于固体培养基中，3片滤纸片等距均匀，以两皿对照平行试验，37°C (沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)，280C (黑曲霉菌)下倒置生化培养24h，测量样品对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌的抑菌圈直径。2.2样品MIC (最小抑菌浓度)、MBC (最小杀细菌浓度)和MFC (最小杀真菌浓度)值的测定以及FIC分级抑菌浓度指数的计算(I)按上法配制培养基、液体培养基接种与活化菌种，调节菌落浓度和配制测试样品，将样品配置成不同浓度250，125,62.5,31.3，15.6,7.8,3.9 μ g/mL的溶液。(2)各样品的MIC、MB C和MFC值的测定将混合了样品的培养基倒平皿，自流平冷却凝固，以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌为检测菌种，涂布平板，放置一段时间待菌悬液渗入，37°C (沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)，28°C (黑曲霉菌)下倒置生化培养24h。观察无菌生长的最低浓度平皿，记为此浓度为样品对于该菌种的MIC值；100%无菌生长的最高浓度即为MBC和MFC。(3) FIC指数的计算:FIC指数=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用2.3样品抑囷圈的考察(I)培养基的配制按要求配制沙门氏菌和金黄色葡萄球菌用培养基；黑曲霉菌用培养基按照查氏培养基配制，为 IOOmL 水，3.0g 蔗糖，2.0g 琼脂，0.2g NaNO3,0.1g K2HPO470.05g KCl，0.05gMgSO4.7H20,0.0Olg FeSO4 ;以上培养基均置于121°C下高压灭菌20min。(2)滤纸片法测定抗菌谱用正己烷将样品配制成500 μ g/mL的溶液，测定其对于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌的抑菌圈直径。2.4抗菌实验结果所得的化合物I 8，依次为异植物醇(抑菌圈范围9.9-13.4 μ g/mL, MIC,MBC 和 MFC 值依次为 3L 3 μ g/mL, 62.5-125 μ g/mL, 125 μ g/mL)、橙花叔醇(抑菌圈范围 16.2-20.1 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次为 3.9-15.6 μ g/mL, 31.3-5-62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)、芳樟醇(抑菌圈范围 14.9-17.9 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次为 7.8-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 31.3 μ g/mL)、β -谷甾醇乙酸酯(抑菌圈范围10.9-11.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次为 62.5 μ g/mL, 250 μ g/mL), β-谷甾醇(抑菌圈范围12.1-14.1 μ g/mL, MIC和MBC值依次为31.3 μ g/mL，125 μ g/mL)、豆甾醇(抑菌圈范围
7.7-9.2 μ g/mL, MIC和MBC值依次为125μ g/mL，> 250 μ g/mL)、麦角甾醇(抑菌圈范围
8.1-10.0 μ g/mL，MIC和 MBC 值依次为 62.5-125 μ g/mL,彡 250 μ g/mL)和胡萝卜苷(抑菌圈范围 11.1-12.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次为 62.5 μ g/mL, 125-250 μ g/mL)对于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。化合物I和5与银杏叶聚戊烯醇有协同抑菌作用。化合物I (异植物醇)与银杏叶聚戊烯醇协同抑菌作用表现为抑菌圈范围14.1-17.1mm,MIC值为7.8-15.6 μ g/mL，FIC指数范围为0.25-0.5 ;化合物5(β -谷甾醇)与银杏叶聚戊烯醇协同抑菌作用表现为10.4-16.3mm，MIC值为15.6-31.3 μ g/mL，FIC指数为0.5。银杏叶类脂总不皂化物(抑菌圈范围14.4-16.9 μ g/mL,MIC,MBC和MFC值依次为15.6-31.3 μ g/mL，62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、类脂结晶物(抑菌圈范围 12.3-12.8 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次为 62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、类脂轻馏分(抑菌圈范围 12.9-14.8 μ g/mL，MIC，MBC 和 MFC值依次为31.3μ g/mL，125y g/mL，125y g/mL)、类脂重馏分(抑菌圈范围15.0-16.8 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次为 15.6-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)对于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。详见表格1、2和3。表格1.不同样品抑菌圈值的大小比较(Tukey检验P = 0.05).
权利要求
1.有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，其特征包括银杏叶类脂总不皂化物、类脂结晶物、类脂轻馏分和类脂重馏分以及化合物I 8 (依次为异植物醇、橙花叔醇、芳樟醇、β_谷留醇乙酸酯、β_谷留醇、豆留醇、麦角留醇、胡萝卜苷)和聚戊烯醇类脂成分的制备及抑菌活性。
2.根据权利要求1所述具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，其特征在于化合物I 8制备方法包括下几个步骤: 第一步，银杏叶类脂软膏的制备:取干燥粉碎银杏叶粉(直径0.25 5毫米以下)，加入溶剂Al，银杏叶粉与溶剂质量比为1: 5 50 ;30 75°C加热回流提取，时间2 8h，重复3次或以上提取；合并提取液，回收溶剂，得银杏叶脂溶性成分软膏；加1 15%溶液BI，软膏与溶剂比1: 2 15 (kg: L)，采用30 75°C热回流搅拌，搅拌速度为20 200r/min,时间0.5 5h，得到皂化液；加入溶剂Cl，皂化液与溶剂比1: 2 10(V/V)，合并提取液，回收溶剂，从而得到银杏叶类脂总不皂化物。 第二步，银杏叶类脂成分的分子蒸馏分离方法:取银杏叶类脂总不皂化物，放于O _40°C下冷冻结晶1 5h，取出后迅速抽滤，得到结晶物；滤过的油状物通过刮膜式分子蒸馏装置分离，刮膜转速100 300r/min，蒸馏温度120 250°C，在高真空条件下(真空度大于等于1.0 X IO5)，轻组分以气体状态径直飞向中间冷凝器并凝结成液体，进入轻馏分收集器，得到轻馏分；重组分沿筒体内壁进入重馏分收集器，得到重馏分。
第三步，银杏叶类脂成分的色谱分离方法:将第二步中所得的结晶物与填料A按质量比1:1充分混合磨细，上填料A柱，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪；100%三氯甲烷馏分，挥干溶剂后用溶剂B在5 _20°C下，重结晶得到化合物4(β- 谷甾醇乙酸酯)；馏分三氯甲烷/甲醇(99%: 1%, V/V)，挥干溶剂后上C色谱柱，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇体系洗脱，挥干溶剂后用溶剂D在O -20°C下，重结晶得到化合物5(β -谷甾醇)，剩余物挥干溶剂后用溶剂E在5 -10°C下，重结晶得到化合物6 (豆留醇)，剩余物挥干溶剂后用溶剂F在O _20°C下，重结晶得到化合物7 (麦角甾醇)；三氯甲烷/甲醇(90%: 10%,V/V)馏分，挥干溶剂后用溶剂G在O -20°C下，重结晶得到化合物8(胡萝卜苷)；第二步中所得的轻馏分与填料A按质量比1:1充分混合磨细，上填料A柱(粒径0.04 0.1mm)，用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%, V/V)馏分，挥干溶剂后用填料H薄层制备板制备，Rf值在I处，得到化合物I (异植物醇)；石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%,V/V)馏分，挥干溶剂后上C色谱柱，得到化合物2 (橙花叔醇)；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%，V/V)馏分，挥干溶剂后用填料H薄层制备板制备，Rf值在J处，得到化合物3(芳樟醇)；将第二步中所得的重馏分与填料A按质量比1:1充分混合磨细，上填料A柱，用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取石油醚/乙酸乙酯(99% 97%:1 3%，V/V)馏分，挥干溶剂后加入质量比为1: 5 15溶剂K，室温搅拌溶解；然后将其与吸附剂L，按固液质量比为1: 10 100混合，在_40°C 30°C搅拌4 20小时，1000 10000转/分钟离心后过滤，上清液回收溶剂后即为纯化后的聚戊烯醇类脂。
3.根据权利要求2所述具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，其特征在于第一步中溶剂Al为丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯或无水乙醇；溶液BI为NaOH或KOH的甲醇或乙醇溶液；溶剂Cl为丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯。
4.根据权利要求2所述具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，其特征在于第三步中填料A为硅胶G，溶剂B为异丙醇或无水乙醇或乙腈；C色谱柱为S^hadex LH-20填料；溶剂D为环己酮或丙酮；溶剂E为正戊醇或正丁醇；溶剂F为乙醚或正己烷；溶剂G为三氯甲烷或无水乙醇；填料H为荧光(GF254)硅胶；Rf值I处在0.50 0.65 ；Rf值J处在`0.40 0.55 ;溶剂K为丙酮或 乙酸乙酯；吸附剂L为质量比1:1 5混合的活性炭与硅藻土。
5.根据权利要求1所述的银杏叶类脂成分具有抑菌活性，其特征在于所得的化合物I 8，依次为异植物醇(抑菌圈范围9.9-13.4 μ g/mL，MIC，MBC和MFC值依次为31.3 μ g/mL,62.5-125μ g/mL，125μ g/mL)、橙花叔醇(抑菌圈范围 16.2-20.1 μ g/mL, MIC, MBC 和MFC 值依次为 3.9-15.6 μ g/mL, 31.3-5-62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)、芳樟醇(抑菌圈范围`14.9-17.9 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次为 7.8-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 31.3 μ g/mL)、β-谷甾醇乙酸酯(抑菌圈范围10.9-11.7yg/mL，MIC和MBC值依次为62.5 μ g/mL，`250 μ g/mL)、β-谷甾醇(抑菌圈范围 12.1-14.1 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次为 31.3μ g/mL, 125 μ g/mL)、豆甾醇(抑菌圈范围 .7-9.2 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次为 125 μ g/mL, >`250 μ g/mL)、麦角甾醇(抑菌圈范围8.1-10.0 μ g/mL, MIC和MBC值依次为62.5-125 μ g/mL,≥250 μ g/mL)和胡萝卜苷(抑菌圈范围11.1-12.7 μ g/mL, MIC和MBC值依次为`62.5 μ g/mL, 125-250 μ g/mL)对于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
6.根据权利要求1所述的银杏叶类脂成分具有抑菌活性，还表现在化合物I和5与银杏叶聚戊烯醇有协同抑菌作用；化合物I (异植物醇)与银杏叶聚戊烯醇协同抑菌作用表现为抑菌圈范围14.1-17.lmm, MIC值为7.8-15.6 μ g/mL, FIC指数范围为0.25-0.5 ；化合物5(β-谷甾醇)与银杏叶聚戊烯醇协同抑菌作用表现为10.4-16.3mm, MIC值为`15.6-31.3 μ g/mL, FIC 指数为 0.5。
7.根据权利要求1所述的银杏叶类脂成分具有抑菌活性，还表现在银杏叶类脂总不皂化物(抑菌圈范围 14.4-16.9μ g/mL，MIC，MBC 和 MFC 值依次为 15.6-31.3ug/mL, 62.5 μ g/mL, 125 μ g/mL)、类脂结晶物(抑菌圈范围12.3-12.8 μ g/mL，MIC和MBC值依次为62.5 μ g/mL，125 μ g/mL)、类脂轻馏分(抑菌圈范围12.9-14.8 μ g/mL, MIC, MBC和MFC值依次为`31.3 μ g/mL, 125 μ g/mL, 125 μ g/mL)、类脂重馏分(抑菌圈范围 15.0-16.8 μ g/mL,MIC,MBC和MFC值依次为15.6-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)对于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
全文摘要
本专利公开具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，以银杏叶为原料，通过非极性溶剂提取，分子蒸馏分离，再经柱层析，重结晶，纯化得到8个化合物(依次为异植物醇、橙花叔醇、芳樟醇、β-谷甾醇乙酸酯、β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、胡萝卜苷)和聚戊烯醇以及银杏叶类脂总不皂化物、类脂结晶物、类脂轻馏分和类脂重馏分。本专利制备的8个化合物和聚戊烯醇以及银杏叶类脂总不皂化物、类脂结晶物、类脂轻馏分和类脂重馏分对于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。
文档编号C07C33/02GK103083368SQ201310044569
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者王成章, 陶冉 申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所