专利名称：一种巯基化改性的胶原钙复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种巯基化改性的胶原钙复合物制备方法，属于功能食品及医药技术领域。
背景技术：
钙是人体终生所需的营养元素，同时又是人体内含量最高的矿物质，健康人体的总钙量约为1000 g，其中99%存在于骨髓和牙齿中，其余1%对维持体内细胞的正常代谢起着必不可少的作用。人体几乎所有的生理代谢与钙元素的存在密切相关，钙是骨骼生长、神经传递、肌肉收缩所必需的，对维持正常的心、肾、肺和凝血功能以及细胞膜和毛细管的通透性起着非常重要的作用，同时钙也是许多酶的激活剂，因此钙在人体的生长发育过程中扮演者举足轻重的作用，缺钙或钙不足都会影响机体的正常代谢甚至诱发病变。缺钙是世界卫生组织确认的世界四大营养缺乏症之一，缺钙严重的人群主要集中在儿童、孕妇以及老人等。据第四次“中国居民营养与健康现状”调查结果显示，我国居民膳食中钙摄入量严重偏低，人均钙摄入量为398 mg/d，仅达到每日钙推荐量的50%，完全达到推荐量者只占人群的3 4%。机体钙质的缺乏是一个严重的健康隐患，可产生骨质疏松、佝偻症、小儿抽搐症等多种疾病，甚至对心血管也会产生极大的负作用。通过摄入钙制剂改善人体钙营养状况被认为是解决钙营养缺乏症的主要手段。目前，市场上常见的钙制剂达400多种，但是按其化学组成主要包括以下两种:1)以无机钙盐为主(包括碳酸钙、磷酸氢钙、氯化钙和以动物鲜骨、珍珠粉、贝壳加工而成的钙制剂等)，此类钙制剂虽然钙含量高，但水溶性差、吸收效率低，且易在肾脏停留，容易引起肾结石；2)以有机钙盐为主(包括乳酸钙、醋酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙以及氨基酸钙等)，这类钙制剂虽然吸收较好，但却存在不同程度的毒副作用(如醋酸钙存在急性毒性较大，容易导致肾结石和心脏痉挛而致死、血管 钙化和软组织钙化症等缺点；乳酸钙由于在补钙同时给体内引入使人体疲劳的乳酸，所以不宜长期服用)。可见，传统的小分子钙制剂并不能从根本上解决钙营养缺乏症。
发明内容
本发明目的是提供一种钙结合量大、稳定性好及补钙活性高的巯基化改性的胶原钙复合物。本发明另一目的是提供一种制备工艺简单、条件温和的上述巯基化改性的胶原钙复合物的制备方法。本发明还有一个目的是提供上述巯基化改性的胶原钙复合物作为钙营养补充剂和补钙药物的应用。本发明实现过程如下:
一种巯基化改性的胶原钙复合物(Ca)5_3(l-HS4_25-HLC，其中Ca表示钙离子，HS代表巯基，HLC为类人胶原蛋白或胶原水解多肽，(Ca)5_30-HS4_25-HLC表示I分子的HLC结合有4 25个巯基和5 30个钙离子。所述胶原蛋白或胶原水解多肽的分子量为1000-350000道尔顿；胶原水解多肽为动物胶原或类人胶原的水解产物。上述巯基化改性的胶原钙复合物的制备方法，包括以下步骤:
(1)类人胶原蛋白或胶原水解多肽的巯基化改性；
(2)巯基化改性类人胶原蛋白或巯基化改性胶原水解多肽与钙离子反应；
(3)纯化反应产物除去未与钙结合的蛋白和游离钙离子。上述步骤(I)中，将类人胶原蛋白或胶原水解多肽溶于pH为7.0 8.0的缓冲液中制成0.2 0.4%的溶液，加入S-乙酰巯基丁二酸酐(SAMSA)，使SAMSA与类人胶原蛋白或胶原水解多肽的质量比为1:4 2.5:1，反应得到巯基化类人胶原蛋白或巯基化胶原水解多肽。上述步骤(2)中，将巯基化类人胶原蛋白或巯基化胶原水解多肽溶于pH为7.0
8.0的缓冲液中，加入可溶性钙盐反应，巯基化类人胶原蛋白或巯基化胶原水解多肽与钙盐的摩尔比为1:125-1250。所述可溶性钙盐为氯化钙、硝酸钙、醋酸钙等。所述缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、磷酸盐(PBS)或3_(N_吗啡啉)丙磺酸(MOPS)。上述步骤(3)中，反应液用凝胶层析、超滤或透析除去未与钙结合的蛋白和游离钙离子及缓冲液成分，冷冻干燥后制得巯基化改性的胶原钙复合物。上述巯基化改性的 胶原钙复合物作为钙营养补充剂或制备补钙药物中的应用。本发明的优点与积极效果:(1)胶原蛋白对于人体有非常重要的功能，经过巯基化改性的胶原蛋白仍保持了原有蛋白的优良特性，并且其上含有的活化巯基使蛋白与钙离子的结合能力大幅增强。(2)本发明巯基化改性的类人胶原钙复合物克服了目前无机钙和有机钙存在的缺点，能显著增加机体对钙的吸收，且无毒副作用、无沉积、不损害消化系统，化学及生化稳定性良好，具有高度的生物安全性。(3)本发明制备工艺简单，设备要求低，并且制备过程安全无毒，适于食品工业的应用。(4)本发明巯基化改性的类人胶原钙复合物含钙量高、稳定性好，补钙效果明显优于市售的葡萄糖酸钙口服液。
图1为S-乙酰巯基丁二酸酐与类人胶原蛋白在不同质量比条件下改性制得的改性蛋白与荧光胺作用后的荧光强度。
具体实施例方式实施例1巯基化胶原蛋白或多肽的制备
将类人胶原蛋白溶于50mM的3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)缓冲液(pH 7.8)中制成
0.2%的溶液，在常温下搅拌，并向蛋白溶液中加入S-乙酰巯基丁二酸酐(SAMSA)溶液，使SAMSA与胶原蛋白的质量比为1: 1，充分混匀后反应2h。将反应后的反应混合液利用凝胶层析纯化后再经过冷冻干燥，即得到巯基化类人原蛋白。采用胶原水解多肽代替类人胶原蛋白，相同巯基化方法可得巯基化胶原水解多肽。
巯基化类人胶原蛋白改性程度的检测(荧光胺检测)
蛋白巯基化改性的程度可以通过检测引进的乙酰巯基的多少或者检测氨基减少的个数来表示，利用荧光胺与蛋白中的氨基侧键结合而产生的荧光对蛋白与乙酰巯基的结合进行考察。因为当乙酰巯基结合上蛋白后会封闭一部分的游离氨基而使荧光强度下降。通过对荧光强度的分析可以得到蛋白与乙酰巯基结合的信息。荧光胺(4-苯基螺[呋喃-2(3H)，1- 二氢异苯并呋喃]_3，3’ - 二酮)本身不具有荧光活性，可以在pH 8.5-9.5的条件下与蛋白质、多肽或氨基酸上的氨基反应生成具有高荧光活性的衍生物，样品与荧光胺反应之后所测得荧光强度越小，说明样品分子中的氨基被改性试剂修饰的越多，反之，样品分子中的氨基被修饰的越少。取S-乙酰巯基丁二酸酐与类人胶原蛋白按照不同质量比(I: 4^2.5:1)改性后的巯基化类人胶原蛋白溶液(10 μ M，pH 9.0)2mL,然后加入50 μ L荧光胺(50mM)溶液，充分反应10 min，在激发波长为390 nm下，发射波长为420 600 nm下进行扫描，由图1可知，当S-乙酰巯基丁二酸酐与HLC质量比为1:1时改性程度最高。经过发明人多批次不同实验条件合成巯基化类人胶原蛋白或胶原多肽，荧光胺检测结果表明:1分子的类人胶原蛋白或胶原水解多肽可结合Γ25个巯基。实施例2 巯基化改性的胶原钙复合物的制备
将巯基化类人胶原蛋白溶于100 mL 50mM MOPS缓冲液(pH 7.5)中制成0.4%的溶液，将无水氯化钙溶于蒸馏水中制成5%的溶液，然后将其滴加进上述蛋白溶液中，使得蛋白与钙盐的最终摩尔比为1: 125-1250，混合均匀。在室温下搅拌Ih后将反应液用凝胶层析除去未反应的钙盐及缓冲液成分，冷冻干燥后制得巯基化胶原钙蛋白产物。巯基化胶原钙中钙离子的检测(原子吸收色谱法)
将冷冻干燥的巯基化类人胶原钙溶于双蒸水中制成20 μ M的溶液，取5mL加入IOmL王水消化过夜，蒸掉 王水稀释成10mL，再分别用0.45 μ m的水体系滤膜将反应液过滤。在室温条件下于原子吸收色谱仪上测试各样品，每个样品重复测试三次，测得每分子巯基化类人胶原钙中钙离子的结合量为23。经过发明人多批次不同实验条件合成巯基化类人胶原蛋白或，原子吸收色谱法检测结果表明:1分子的巯基化类人胶原或胶原水解多肽结合有5 30个钙离子。实施例3
依照实施例1和2方法，选用分子量为12000道尔顿的牛骨胶原胶原水解多肽代替类人胶原蛋白，在不同缓冲溶液中，不同浓度下均可获得巯基化改性的胶原水解多肽钙复合物，其中I分子的胶原水解多肽能够结合7个巯基和11个钙离子。实施例4 巯基化胶原钙蛋白的补钙功能试验(使用实施例2巯基化类人胶原蛋白)
ICR小鼠称体重，分笼单独饲养，动物自由饮食和饮水。经过一周的适应期后，分组进行建模。先以维甲酸灌胃的方法来诱导产生骨质疏松症的动物模型。正常对照组的小鼠按照15mL/kg(体重)的剂量经口灌胃生理盐水(0.9% w/v)，其余小鼠经口灌胃维甲酸(剂量为70 mg/kg体重)。14天后分组进行试验，分别为正常对照组(group I )，模型对照组(group II ),葡萄糖酸韩组(group III),胶原韩组(group IV)及巯基化胶原韩组(group V )。本实验中选择111、1￥、乂组小鼠经口灌胃钙的剂量为10!^/1^，以钙元素计。正常对照组和模型对照组小鼠经口灌胃生理盐水(剂量为15mL/kg体重)。
血清中碱性磷酸酶来自于骨和肝，在一些疾病状态释入血清当中，使其含量增高。在高骨转换的骨质疏松时，碱性磷酸酶明显升高。由于维甲酸作用骨钙溶出，使血钙含量升高，由表I数据可知，建模成功。补钙20天后，两组碱性磷酸酶活性均有所降低，胶原钙组明显低于葡萄糖酸钙组。40天后，胶原钙仍是下降最多已接近正常水平而葡萄糖酸钙组距正常水平还有一定差距。经过20天的钙补充，葡萄糖酸钙组由于钙的沉积和钙吸收处于平衡状态，所以血钙没有发生多大改变，而胶原钙组血钙水平降低稍高于正常水平，这可能是由于胶原对骨骼重建有一定的促进作用引起的。40天后，葡萄糖酸钙处于正常水平，说明还在处于骨骼重建过程中，而胶原钙组血钙浓度出现了升高，说明骨骼重建已基本完成，由于钙补充使血钙浓度升高。由表2可知，相同补钙天数下，胶原钙组的骨密度明显高于葡萄糖酸钙组，其骨钙和骨羟脯氨酸含量无论从上升速度还是上升高度均优于葡萄糖酸钙组。综上所述巯基化类人胶原钙产品的补钙效果要明显优于市售的葡萄糖酸钙口服液。
权利要求
1.一种巯基化改性的胶原钙复合物(Ca)5_3(l-HS4_25-HLC，其中Ca表示钙离子，HS代表巯基，HLC为类人胶原蛋白或胶原水解多肽，(Ca)5_30-HS4_25-HLC表示I分子的HLC结合有4 25个巯基和5 30个钙离子。
2.根据权利要求1所述巯基化改性的胶原钙复合物，其特征在于胶原蛋白或胶原水解多肽的分子量为1000-350000道尔顿。
3.根据权利要求1所述巯基化改性的胶原钙复合物，其特征在于所述的胶原水解多肽为动物胶原或类人胶原的水解产物。
4.权利要求1所述巯基化改性的胶原钙复合物的制备方法，包括以下步骤: (1)类人胶原蛋白或胶原水解多肽的巯基化改性； (2)巯基化改性类人胶原蛋白或巯基化改性胶原水解多肽与钙离子反应； (3)纯化反应产物除去未与钙结合的蛋白和游离钙离子。
5.根据权利要求4所述巯基化改性的胶原钙复合物的制备方法，其特征在于:步骤(I)中，将类人胶原蛋白或胶原水解多肽溶于pH为7.0 8.0的缓冲液中制成0.2 0.4%的溶液，加入S-乙酰巯基丁二酸酐，使S-乙酰巯基丁二酸酐与类人胶原蛋白或胶原水解多肽的质量比为1:4 2.5:1，反应得到巯基化类人胶原蛋白或巯基化胶原水解多肽。
6.根据权利要求4所述的巯基化改性的胶原钙复合物的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，将巯基化类人胶原蛋白或巯基化胶原水解多肽溶于pH为7.0 8.0的缓冲液中，加入可溶性钙盐反应，巯基化类人胶原蛋白或巯基化胶原水解多肽与钙盐的摩尔比为1:125-1250。
7.根据权利要求5或6所述的巯基化改性的胶原钙复合物的制备方法，其特征在于:所述缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷盐酸、磷酸盐或3-(N-吗啡啉)丙磺酸。
8.根据权利要求4所述的巯基化改性的类人胶原钙复合物的制备方法，其特征在于:步骤(3)中，反应液用凝胶层析、超滤或透析除去未与钙结合的蛋白和游离钙离子及缓冲液成分，冷冻干燥后制得巯基化改性的胶原钙复合物。
9.权利要求1所述巯基化改性的胶原钙复合物作为钙营养补充剂的应用。
10.权利要求 1所述巯基化改性的胶原钙复合物在制备补钙药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种巯基化改性的胶原钙复合物(Ca)5-30-HS4-25-HLC，其中Ca表示钙离子，HS代表巯基，HLC为类人胶原蛋白或胶原水解多肽，(Ca)5-30-HS4-25-HLC表示1分子的HLC结合有4～25个巯基和5～30个钙离子。本发明巯基化改性的胶原钙复合物克服了目前无机钙和有机钙存在的缺点，能显著增加机体对钙的吸收，且无毒副作用、无沉积、不损害消化系统，化学及生化稳定性良好，具有高度的生物安全性，补钙效果明显优于市售的葡萄糖酸钙口服液。
文档编号C07K1/16GK103232538SQ20131015233
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者范代娣, 邓建军, 孙岩, 朱晨辉, 马晓轩 申请人:西北大学