一种合成胸腺法新的方法
【专利摘要】本发明公开了一种固相合成胸腺法新的制备方法。本发明涉及Fmoc策略固相法制备胸腺法新的一种新型工艺。包括以下步骤：（1）由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的RinkAmideMBHA树脂开始合成Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu。（2）将Fmoc-Asp(RinkAmideMBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联或是片段法偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，其中Glu18、Lys19两个氨基酸的偶联采用片段法一步接肽，其余的氨基酸采用逐一偶联；在Asp6、Thr12、Leu16、Lys17、Glu18-Lys19等偶联之前的去保护采用混合去保护试剂进行去保护；在偶联Asp2之前对肽树脂进行特殊的酰化试剂进行封端。（3）对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化、转盐、冻干得到胸腺法新。本发明提供了一种产品纯度高、易于纯化的胸腺法新固相合成方法。
【专利说明】一种合成胸腺法新的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胸腺法新的固相合成方法。
【背景技术】
[0002]胸腺法新(Thymosin α 1，也称胸腺肽α I)是胸腺素主要生物活性成分，为体内重要免疫调节物质，是氮端乙酰化的28个氨基酸组成的多肽。研究表明，胸腺法新促进骨髓干细胞发育分化为原淋巴细胞及前淋巴细胞；诱导T淋巴细胞分化与成熟，使已成熟的T细胞进一步分化为几个不同的亚群，如杀伤细胞、记忆细胞、效应细胞、辅导T淋巴细胞等，并产生各种可溶性介质；增强淋巴细胞对有丝分裂素的反应,并可增加淋巴组织的蛋白质和核酸的合成；增加r-1FN、a-1FN、IL_2、IL-3和淋巴毒素的生成，增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应；抑制自身免疫反应；恢复抑制性T细胞的功能。目前胸腺法新已被广泛应用于临床，治疗多种疾病，如用于慢性乙型肝炎的治疗；用于丙型肝炎、肝细胞癌、恶性黑色素瘤的治疗；用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗。
[0003]US4517119采用全液相法合成、纯化胸腺法新。氨基酸氮端采用苄基保护，每次去保护都采用Pd催化加氢进行，操作极其繁杂，未给出总收率。US4504415采用全液相法合成、反相HPLC纯化胸腺法新。以18肽片段(11-28肽段)为起始原料计算总收率为12%。US5856440以MBHA树脂为载体，采用氮端保护为Moz(4-甲氧基苄氧甲酰基)的氨基酸进行胸腺法新固相合成。相比Boc法合成,Moz比Boc更容易脱去。因此Moz法合成多肽过程中，可降低因多次去保护造成肽链从树脂上的流失。从而提高总合成收率。Moz法合成胸腺法新收率35%，比Boc法的25%高。CN101484467采用CTC树脂合成胸腺法新。合成时，在序列11-12处的Ile-Thr采用假脯氨酸二肽形式进行合成。最终合成收率40%。CN102199205采用Wang树脂合成胸腺法新，其采用逐步法合成胸腺法新，其粗肽纯度为69.6%，合成收率为
56.6%。若采用PEG衍生后的Wang树脂进行合成，则粗肽纯度为57.2%，合成收率为64.4%。未报道总收率。CN1291031采用生物工程法合成胸腺法新，并与商品胸腺法新进行了活性对比。
[0004]这些现有的合成方法存在的共有技术难点为:(I)液相合成胸腺法新工艺操作复杂，费时费力，不利于工业化生产；(2)现有固相合成法，多通过逐一偶联方式获得胸腺法新肽树脂。由于多个困难点(Leul6、LyS17、Glul8、LyS19等)的存在使粗肽纯度较低，容易包含与胸腺法新保留性质相近的杂质而造成HPLC纯化难度增大，总收率不高。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种胸腺法新的固相合成方法。本发明需要解决的技术问题是:选择一条合适的工艺路线，解决以下技术问题:(1)液相合成胸腺法新工艺操作复杂，费时费力，不利于工业化生产；(2)现有固相合成法后期纯化难度大，产品纯度低、收率不闻。
[0006]本发明的制备方法如图1所示，首先由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的RinkAmide MBHA 树脂开始合成Fmoc-Asp (Rink Amide MBHA树脂)-OtBu,然后将Fmoc-Asp (RinkAmide MBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，再采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化；最后对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化得到高纯度胸腺法新溶液、再经RP-HPLC转盐、冷冻干燥得到胸腺法新成品。
[0007]本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
Ac20:醋酸酐 Pyridine:吡啶 Boc:叔丁氧羰基 Fmoc:9_荷甲氧羰基 tBu:叔丁基
Fmoc-AA-OH:9_荷甲氧羰基保护的氨基酸
Cl-HOBt:6_氯-1-羟基苯并三唑
DIC:N, N1- 二异丙基碳化二亚胺
Asp:天冬氨酸
Glu:谷氨酸
Ala:丙氨酸
Val:缬氨酸
Lys:赖氨酸
Leu:亮氨酸
Thr:苏氨酸
Ser:丝氨酸
Ile:异亮氨酸
DMF:N，N' - 二甲基甲酰胺 Piperidine:六氢吡唳 TFA:三氟醋酸 TIS:三异丙基硅烷 MeOH:甲醇 DCM:二氯甲烷
Kniser test检测试剂为:却三酮 HOAc:乙酸 ACN:乙腈
为此，本发明提供一种固环合成胸腺法新的方法，所述方法步骤如下:
步骤1，应用Fmoc/tBu方法，在树脂上以固相合成胸腺法新肽树脂；
步骤2，以二肽片段形式引入GlulS、Lysl9两个氨基酸残基；
步骤3,在Asp6、Thrl2、Leul6、Lysl7、Glul8-Lysl9等偶联之前的去保护采用混合去保护试剂DBU /哌啶/DMF溶液进行2次去保护反应，且去保护反应时间为第一次15min，第二次去保护反应30min ；
步骤4，在偶联完Asp2并洗涤之后，对肽树脂进行特殊酰化试剂丙酰氯等进行封端操作。[0008]步骤5，对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化、转盐、冻干得到胸腺法新。
[0009]其中，步骤I所述胸腺法新树脂，结构如下:
Ac-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Ser(tBu)-GIu (OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu) -Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(NH-Resin)-OtBu
其中，步骤2所述二肽片段形式通过Fmoc-Glu(OtBu) -Lys (Boc) -OH进行偶联；
其中，步骤3所述混合去保护试剂为如哌啶/DMF溶液、DBU/DMF溶液或DBU /哌啶/DMF溶液等，优选DBU /哌啶/DMF=l/5/20 (体积比)。且去保护采用2次进行，第一次反应15min，温度25°C ;第二次反应30min，温度25°C ；
其中，步骤4所述酰化试剂为丙酰氯、丁酰氯、对甲苯磺酰氯，优选丙酰氯。反应条件为酰氯采用IOeq投料，20°C下反应15min。
[0010]其中，步骤5所述裂解采用裂解剂:TIS和TFA，其配置比例为TIS/TFA=5/95，且裂解剂的体积数为胸腺法新肽树脂质量数的10倍。反应时间为I小时，反应温度为25°C。裂解剂配制方法为:将5体积TIS加入到95体积的TFA中。
[0011]本发明通过筛选得到特定合成方式的组合，即将片段法、加强去保护反应条件、特殊试剂封端等条件联合使用，得到一种高收率且易于纯化的胸腺法新合成方法。
[0012]以下通过实验数据说明本发明的有益效果:
逐步法与片段法筛选:由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的Rink Amide MBHA树脂开始合成 Fmoc-Asp (Rink Amide MBHA 树脂)-OtBu,然后将 Fmoc-Asp (Rink Amide MBHA 树脂)-OtBu采用逐一偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，再采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化；最后对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到胸腺法新粗肽。对粗肽进行取样检测。其中在
18、19两个位置残基偶联时分别采用了以下两种方式:先偶联Fmoc-Lys (Boc) -OH,再偶联Fmoc-Glu (OtBu) -OH 的逐步法；以及 Fmoc- Glu (OtBu) -Lys (Boc) -OH 片段法。
[0013]使用上述条件制备目的肽，分别得到不同收率和纯度的胸腺法新，结果数据如下:
【权利要求】
1.一种合成胸腺法新的方法，所述方法步骤如下: 步骤I，由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的Rink Amide MBHA树脂开始合成Fmoc-Asp (Rink Amide MBHA 树脂)-OtBu ; 步骤2,根据胸腺法新肽序碳端到氮端的次序,在树脂Fmoc-Asp (Rink Amide MBHA树脂)-OtBu上采用逐一偶联方式或是片段法进行所有氨基酸的连接，得到胸腺法新肽树脂；步骤3，对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化、转盐、冻干得到胸腺法新。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是: 其中，步骤I所述的合成，其特征是: Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA 树脂)-OtBu 是由 Fmoc-Asp-OtBu 与替代度0.40-0.50mmol/g 的 Rink Amide MBHA 树脂在 DIC/Cl_HOBt 作用下生成的其中，步骤2所述胸腺法新肽树脂，结构如下:
Ac-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Glu (OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide MBHA 树脂)-OtBu 其中步骤2所述的偶联方式，其特征是: 在Glul8、Lysl9两个氨基酸的偶联时，采用片段法一步偶联完成 其中步骤2所述的偶联方式，其特征是: 在Asp6、Thrl2、Leul6、Lysl7、Glul8-Lysl9等偶联之前的去保护采用混合去保护试剂如哌啶/DMF溶液、DBU/DMF溶液或DBU /哌啶/DMF溶液进行2次去保护反应，且去保护反应时间为第一次15min，第二次去保护反应30min ； 其中步骤2所述的偶联方式，其特征是: 在偶联完Asp2并洗涤之后，对肽树脂进行特殊酰化试剂如丙酰氯、丁酰氯、对甲苯磺酰氯等进行封端操作； 其中步骤2所述的偶联方式，其特征是: 偶联完所有氨基酸得到胸腺法新28肽树脂，采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化 其中，步骤3所述裂解方式，其特征是: 使用的裂解剂选自:三异丙基硅烷和三氟乙酸，其配置比例为三异丙基硅烷:三氟乙酸=5: 95 (体积比)，反应时间为I小时，反应温度为25°C; 其中，步骤3所述RP-HPLC纯化、转盐操作，其特征是: RP-HPLC纯化、转盐采用反相C18填料制备色谱柱，TFA/乙腈、HOAc/乙腈体系做为流动相进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是:在Glul8、Lysl9两个氨基酸的偶联时，采用二肽片段法一步偶联完成，可选用的二肽为:Fmoc-Glu (OtBu) -Lys (Boc)-OH。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是:在偶联完Asp2并洗涤之后，对肽树脂进行特殊酰化试剂进行封端，其中酰化试剂为非乙酰化的其它酰化试剂，如:丙酰氯、丁酰氯、对甲苯磺酰氯等。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是:将片段法、加强去保护反应条件、特殊试剂封端等条件联合使用后， 显著提高了纯度和收率。
【文档编号】C07K1/04GK103980357SQ201310412012
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】杨东晖, 路杨, 陈晓航, 沈珂 申请人:杭州诺泰制药技术有限公司