从鸡粪发酵沼液中提取雌马酚的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从鸡粪发酵沼液中提取雌马酚的方法。本发明的方法条件温和，纯度高。而且本方法是从沼液中直接提取所得，所以操作方法简单,萃取剂可以循环往复多次利用，成本低。
【专利说明】从鸡粪发酵沼液中提取雌马酚的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及养殖和化工【技术领域】，特别地，涉及一种从鸡粪发酵沼液中提取雌马 酚的方法。
【背景技术】
[0002] 选用优质新鲜的鸡粪，在背风向阳处，将粪便和猪圏污泥以7:3的比例拌均匀，盖 塑料布堆放7天左右。经池外堆怄的发酵原料，在晴天午后气温高时，趁料温高投入沼气池 中，然后加入自来水，边加边搅拌，避免出现浮料，装料量占池容量的80 %，干物质（即发酵 原料）含量为4-6%。要注意加盖保温，及时封口。选取正常运转3个月时候的沼渣液进行 分离提取。
[0003] 雌马酚是1932年Marrian等人在怀孕雌马的尿液中分离羟雌酮时发现的，并确 定他的分子式为C 15H1403。由于雌马酚的发现源于马（equine)的代谢产物，且属于有雌 激素作用的二元酚（diphenol)，所以被命名为'equol'雌马酚。纯品为白色粉末，熔点 ： 189-190°C，分子量：242. 27。
[0004] 雌马酚是大豆异黄酮（S I )的主要成分之一一大豆素的代谢产物，可以代谢 为具有一对对映异构体的外消旋化合物雌马酚。雌马酚较其原型具有更为有效的生物学作 用。研究表明，雌马酚的一对对映异构体具有不同的生物学活性，其中S-型雌马酚远高于 R-型雌马酚。关于雌马酚的合成，文献报道步骤较为繁琐，使用原料液较为昂贵，不适于工 业化放大。
[0005] 提取方法：肠粪链球菌HY-1，HY-2发酵豆芽中产物雌马酚的提取。
[0006] HY-1 :屎肠球菌属，分离自人体新鲜粪样，GenBank数据库登录号JQ768054 ;
[0007] HY-2 :Slackia属，分离自人体新鲜粪样，GenBank数据库登录号JQ796697。
[0008] 取一定量的发酵豆芽粉，加入正己烷脱脂处理，离心过滤后取不溶物干燥，得到脱 脂的豆芽粉。取脱脂发酵豆芽粉适量置于圆底烧瓶中水浴加热浸提，条件为乙醇体积分数 80%，料液比1 : 20(g/mL)，提取温度为50°C，提取时间4h。浸提完成后将其离心过滤取 滤液，旋转蒸发，得到无醇的浓缩液，真空干燥，除去余下水分，加入甲醇溶液溶解萃取物， 即得到雌马酚粗提取物。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种提取雌马酚的方法，在本发明的另一方面，还涉及从鸡 粪发酵沼液中提取雌马酚的方法。为实现上述发明目的，本发明拟采用如下技术方案： [0010] 本发明涉及一种从鸡粪发酵沼液中提取雌马酚的方法，其特征在于包括如下步 骤：
[0011] 鸡粪发酵沼液在室温下50-70°C减压浓缩去掉70-85%水分得到沼液浓缩液，将 沼液浓缩液与萃取溶剂按1 :2进行萃取；先用石油醚进行萃取6次，合并浓缩后得石油醚 萃取物；其次用乙酸乙酯对沼液浓缩液进行萃取6次，合并浓缩后得到乙酸乙酯萃取物；再 次用正丁醇（NBA)对沼液浓缩液进行萃取6次，收集、浓缩得到正丁醇萃取物；
[0012] 将沼液正丁醇萃取部分部分经300-400目硅胶柱层析，依次以 30:1 - 25:1 - 20:1 - 15:1 - 10:1 - 5:1 - 1:1体积比氯仿/甲醇溶液梯度洗脱，洗脱 液根据薄层色谱（TLC)检测结果合并、浓缩；搜集25:1和20:1洗脱部分F-(NBA) II ;
[0013] 将F-(NBA) II浓缩后经凝胶LH-20层析，以100%甲醇溶液进行等度洗脱，得到雌 马酚。
[0014] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的萃取剂石油醚、乙酸乙酯和/或正丁醇 重复使用。
[0015] 本发明的方法条件温和，纯度高。而且本方法是从沼液中直接提取所得，所以操 作方法简单，萃取剂可以循环往复多次利用，成本低。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是本发明的从鸡粪发酵沼液中提取雌马酚的方法流程示意图。
【具体实施方式】：
[0017] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
[0018] 实施例1
[0019] 鸡粪发酵沼液在室温下60°C减压浓缩去掉80%水分得到沼液浓缩液，将沼液浓 缩液与萃取溶剂按1 :2进行萃取。先用石油醚进行萃取6次，合并浓缩后得石油醚萃取物； 其次用乙酸乙酯对沼液浓缩液进行萃取6次，合并浓缩后得到乙酸乙酯萃取物；再次用正 丁醇（NBA)对沼液浓缩液进行萃取6次，收集、浓缩得到正丁醇萃取物。
[0020] 将沼液正丁醇萃取部分部分经300-400目硅胶柱层析，依次以氯仿/甲醇溶液（3 0:1 - 25:1 - 20:1 - 15:1 - 10:1 - 5:1 - 1:1)梯度洗脱，洗脱液根据薄层色谱（TLC)检测结 果合并、浓缩，得F-(NBA) I?V五个部分。I :30:1洗脱部分；II :25:1和20:1洗脱部分； III : 15:1洗脱部分；IV 10:1洗脱部分；V :5:1和1:1洗脱部分。
[0021] F-(NBA)II(2.38g)直接经凝胶LH-20层析，以100%甲醇溶液进行等度洗脱，得 到化合物经过高分辨电离喷雾质谱和核磁共振分析即为雌马酚，最终从lkg干沼渣中获得 36mg雌马酚。
[0022] 所得雌马酚质谱结果：
[0023] HR-ESI-MS 在 243. 1023m/z 处出现[M+H] + (C15H1503)和 265. 0838m/z 出现 [M+Na] + (C15H14Na03)的尚子峰，提不分子量为242。
[0024] 核磁共振结果如下：
[0025] 其 lH-NMR(CD30D，600MHz)数据如下：S7.08(2H，d，8.5，H-2'，H-6'），6.8 6(1H, d, 8. 3, H-5), 6. 74 (2H, d, 8. 6, H-3, , H-5, ), 6. 31 (1H, dd, 8. 2, 2. 5, H-6), 6. 23 (1H, d, 2. 4, H-8), 4. 86(2H, br s, OH), 4. 18 (1H of 2H-2, ddd, 10. 5, 3. 6, 2. 0), 3. 90 (1H of 2H-2，t，10.5),3.04(m，lH，H-3)，2.80 - 2.89(m，2H，H-4) ;13C NMR(CD30D,600MHz)数据如 下：δ 157. 6 (s, C-7)，156. 2 (s, C-4,），156. 2 (s, C-9)，133. 8 (s, C-Γ )，131. 1 (d, C-5)，129. 3 (d，C-2，，6，），116.4(d，C-3，，5，），114.5(s，C-10)，109. l(d，C-6)，103.8(d，C-8)，72.2(t，C-2)，39. 4(d，C-3)，33. 0(t，C-4)。
[0026] 以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来 说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种从鸡粪发酵沼液中提取雌马酚的方法。
2. -种从鸡粪发酵沼液中提取雌马酚的方法，其特征在于包括如下步骤： 鸡粪发酵沼液在室温下50-70°C减压浓缩去掉70-85%水分得到沼液浓缩液，将沼液 浓缩液与萃取溶剂按1 :2进行萃取；先用石油醚进行萃取6次，合并浓缩后得石油醚萃取 物；其次用乙酸乙酯对沼液浓缩液进行萃取6次，合并浓缩后得到乙酸乙酯萃取物；再次用 正丁醇（NBA)对沼液浓缩液进行萃取6次，收集、浓缩得到正丁醇萃取物； 将沼液正丁醇萃取部分部分经300-400目硅胶柱层析，依次以 30:1 - 25:1 - 20:1 - 15:1 - 10:1 - 5:1 - 1:1体积比氯仿/甲醇溶液梯度洗脱，洗脱 液根据薄层色谱（TLC)检测结果合并、浓缩；搜集25:1和20:1洗脱部分F-(NBA) II ; 将F-(NBA) II浓缩后经凝胶LH-20层析，以100%甲醇溶液进行等度洗脱，得到S-雌马 酚。
3. 根据权利要求2所述的方法，所述的萃取剂石油醚、乙酸乙酯和/或正丁醇重复使 用。
【文档编号】C07D311/58GK104151281SQ201410348604
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】许剑锋, 吴慧斌, 侯媛媛, 吕留庄 申请人:上海海洋大学