一种从苦丁茶冬青中分离苦丁苷a和苦丁苷d的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从苦丁茶冬青中分离苦丁苷A和D的方法，该方法以苦丁茶冬青(Ilex kudingcha C.J.Tseng)药材为原材料，经过醇液提取，氯仿除杂，正丁醇萃取，大孔树脂柱层析和反相高效液相精制分离及重结晶方法得到苦丁苷A(Kudinoside A)和苦丁苷D(Kudinoside D)的高纯度单体化合物。本发明技术方法简单可靠，原料易得，经济成本低，所得单体化合物纯度高，适用于大量制备苦丁苷A和苦丁苷D。
【专利说明】-种从苦丁茶冬青中分离苦丁苷A和苦丁苷D的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及皂苷类化合物，具体涉及苦丁苷A(Kudin〇Side A)和苦丁苷 D (Kudinoside D)。
【背景技术】
[0002] 苦丁茶冬青为冬青科（Aquifoliaceae)冬青属植物苦丁茶冬青Ilex kudingcha C. J. Tseng的干燥叶。苦丁茶冬青具有散风热、清头目、止头痛等功效，用于暑月外感风寒， 内伤生冷而致恶寒发热、头痛脘痞、呕恶泄泻等症。在我国主要分布在西南地区（四川、重 庆、贵州、湖南、湖北）及华南地区（江西、广东、福建、海南）等地。现代药理研究表明，苦 丁茶冬青具有改善心血管系统、降血脂、降血压、降血糖和提高免疫力等药理作用。
[0003] 近年来，文献报道苦丁茶冬青主要含三萜皂苷类、黄酮类、多酚类和挥发油类等化 学成分。1990年有学者从苦丁茶冬青中分离得到一种新的五环三萜苷元，并命名为苦丁茶 苷元，此后诸多学者在对苦丁茶冬青化学成分研究中发现了大量的三萜皂苷类化合物，并 通过实验证明三萜皂苷类化合物是苦丁茶冬青最主要的活性成分。现代药理研究表明苦丁 茶冬青改善心血管系统、降血脂、降血压等方面的药理作用都与其三萜皂苷类成分有关。日 本学者Nishimura等从苦丁茶冬青中分离得到的三廠阜苷类化合物是乙酰辅酶胆固醇酰 基转移酶（ACAT)抑制剂，可作为治疗动脉硬化的新药。在苦丁茶冬青皂苷类物质对离体兔 血管作用的实验中，KDC-TS可以使用去甲肾上腺素和氯化钙制作的离体血管收缩模型的量 效曲线非平行右移，最大效应降低，表明KDC-TS可对抗去甲肾上腺素和氯化钙所致血管收 缩。
[0004] 目前文献报道用于从苦丁茶冬青中分离三萜皂苷类单体的方法主要是综合运用 硅胶柱层析、凝胶柱层析法等多种常压柱层析法。例如专利CN101016328B从苦丁茶冬青 中分离纯化熊果酸和齐墩果酸，所采用的方法十分的复杂、步骤麻烦，而且纯度仅为90%左 右；专利CN101775061A采用95%乙醇热回流提取浸膏，再用石油醚、氯仿、正丁醇萃取得到 各部位浸膏，反复通过正相、反相硅胶柱色谱，葡聚糖凝胶柱色谱分离手段得到了一组苦丁 茶皂苷类化合物，包括苦丁酮A、B、D、E、F、G，苦丁皂苷LZ 11和LZ12，没有涉及到本发明针对 的苦丁苷A和苦丁苷D。文献报道的方法都要利用多种有机溶剂萃取及多种填料进行柱层 析进行分离纯化，不仅没有明确各步骤具体实施方法，而且所需步骤冗长、繁琐、耗时长、产 量低（仅为毫克级），且纯度低。目前尚未见同时针对苦丁苷A(Kudin 〇Side A)和苦丁苷 D (Kudinoside D)的快速分离纯化的文献报道，主要是两者结构相似、性质差异小和分离难 度大。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种从苦丁茶冬青中分离苦丁苷 A(Kudinoside A)和苦丁苷D(Kudinoside D)的方法，该方法具有简单可靠，原料易得，经济 成本低，所得单体化合物纯度高、适应于大量制备优点。
[0006] 本发明解决上述技术问题的方案如下：
[0007] -种从苦丁茶冬青中分离苦丁苷A和苦丁苷D的方法，该方法由以下步骤组成：
[0008] (1)取苦丁茶粉碎并过三号筛，加入8?20倍量体积浓度不低于75%的甲醇或乙 醇溶液，采用渗漉或加热回流法提取，回收溶剂得浸膏；将所得浸膏用蒸馏水分散，再依次 用氯仿、正丁醇萃取，回收并浓缩正丁醇萃取液至稠膏；
[0009] (2)将所得稠膏装入大孔树脂柱，先用5?7倍柱体积的蒸馏水洗脱除去杂质，再 依次用6?10倍柱体积的体积浓度为30%、60 %和80%的甲醇梯度洗脱，收集体积浓度为 60%的甲醇洗脱液流分，或者依次用6?10倍柱体积的体积浓度为25%、55 %和75%乙醇 梯度洗脱，收集体积浓度为60%的甲醇洗脱液流分，回收洗脱液，得皂苷粗品；
[0010] (3)将皂苷粗品用色谱甲醇溶解，并使皂苷粗品在色谱甲醇中的浓度为0. 1? 0. 3g/mL，然后用反相高效液相色谱法进行纯化；其中所述反相高效液相色谱法的色谱条件 为，色谱柱为 kromasil C18, 250 X 30mm, 5 μ m，或者为 YMC C18, 250 X 20mm, 5 μ m，UV 检测器的 波长为230nm，流速4?20mL/min，柱温35°C，流动相为体积浓度为65%的甲醇，或者为体 积浓度为35%的乙腈；分别收集最高峰和其后面流出的第一个主峰所对应的保留时间内 的制备液，浓缩回收后，再用体积浓度为80%的甲醇进行重结晶，得相应的产物苦丁苷A和 苦丁苷D。
[0011] 上述从苦丁茶冬青中分离苦丁苷A和D的方法具有以下优点：
[0012] 1、苦丁苷A和D两个化合物结构相似、性质差异小和分离难度大，本发明可通过一 次提取和制备过程，同时得到高纯度的苦丁苷A和D两个化合物。
[0013] 2、苦丁苷A和D具有独特的苦丁茶内酯型结构，具有抑制巨噬细胞摄取LDL的活 性和抗血小板凝聚的活性，开发利用前景大。本发明可以快速制备得到克级的苦丁苷A和 D，以用于研发新药。
[0014] 3、苦丁苷A和D均为苦丁茶冬青药材主要成分，但目前尚无文献报道两个化合物 的对照品制备方法。本发明可为苦丁茶冬青药材的质量控制提供含量测定用的对照品，有 助于建立苦丁茶冬青药材的质量控制方法。
[0015] 4、本发明所选用的有机溶剂均可以回收重复使用，对环境的污染小，而且在反相 色谱制备时可以优选甲醇-水作为洗脱系统，溶剂价格便宜，经济适用性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为下述实例1所得反相高效液相制备谱图。
[0017] 图2为下述实例2所得反相高效液相制备谱图。
[0018] 图3为下述实例3所得反相高效液相制备谱图。
[0019] 图4为下述实例4所得反相高效液相制备谱图。
[0020] 图5为下述实例1所得组分a的高效液相色谱图。
[0021] 图6为下述实例1所得组分a的紫外吸收曲线谱图。
[0022] 图7为下述实例1所得组分b的高效液相色谱图。
[0023] 图8为下述实例1所得组分b的紫外吸收曲线谱图。
[0024] 图9为下述实例1所得组分a的1H-NMR谱图。
[0025] 图10为下述实例1所得组分a的13C-NMR谱图。
[0026] 图11为下述实例1所得组分b的1H-NMR谱图。
[0027] 图12为下述实例1所得组分b的13C-NMR谱图。
[0028] 图13为苦丁茶冬青药材中苦丁苷A和D的HPLC含量测定色谱图。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1
[0030] 1、分离苦丁苷A和D
[0031] (1)称取苦丁茶冬青干燥叶500g，粉碎过三号筛，用20倍量的甲醇（IOL)渗漉提 取。回收甲醇得到苦丁茶冬青浸膏212g，加入300mL的蒸馏水使成分散系统。先用氯仿萃 取三次，每次350mL，再用水饱和正丁醇萃取3次，每次350mL。浓缩正丁醇萃取液至稠膏。
[0032] (2)将所得稠膏用214g大孔树脂吸附，用860g大孔树脂作为柱层析填料，先用纯 水冲洗6个柱体积，然后再用甲醇-水梯度洗脱（30% - 60% - 80% )，各梯度洗脱液为 8?10个柱体积。经TLC分析，目标化合物在60%甲醇洗脱液中，合并含目标化合物的组 分后回收溶液，得到含目标化合物的皂苷粗品24g。
[0033] (3)取上述皂苷粗品用色谱甲醇溶解成浓度为0. 2g/mL的溶液，用0. 45 μ m微孔滤 膜过滤，通过反相高效液相制备分离纯化。色谱条件：色谱柱为YMC C18, 250 X 20mm，5 μ m ; 检测波长230nm ;流速15mL/min ;柱温30°C ;流动相为甲醇-水（65:35);进样量为0. 4mL。 化合物a的保留时间为15. 7min，收集15. 4?17. 9min内的制备液；化合物b的保留时间 为18. 7min，收集18.0?19. 6min内的制备液，反相高效液相制备图谱见图1，减压浓缩回 收后得到化合物a和化合物b，再分别用甲醇-水（80:20)重结晶得到单体化合物a和b。
[0034] 2、化合物a和b的纯度检测
[0035] 精密称取适量上述化合物a和b，用色谱甲醇制备成浓度为2mg/mL的储备液， 精密吸取IOuL通过高效液相色谱仪进行纯度检测。色谱条件：色谱柱为（kromasil C 18, 250X4. 6mm，5 μ m) ;PDA检测器230nm波长监测；柱温35°C ;流速lmL/min ;流动相为甲 醇-水￠5:35)。化合物a纯度检测结果见图5,化合物b纯度检测结果见图7,应用归一化 法，按下述公式计算两个化合物的纯度，结果显示化合物a和b的HPLC纯度均大于98%。
[0036] X % = AiAAjAz) X 100%，公式中X i为待测组分i的百分含量Ai为待测组分i 的峰面积，Az为杂质的峰面积之和。
[0037] 3、化合物a和b的结构鉴定
[0038] 将上述两个化合物通过紫外全波长扫描、红外扫描和核磁共振及质谱验证其结 构。其中化合物a为羽状针晶，验证结果为：在TLC上用10%硫酸-乙醇显紫红色斑点，醋 酐-浓硫酸反应呈阳性，推测可能为皂苷类成分。红外IR(KBr) V ^:3452(31^1左右有OH强 吸收峰，并且在1729CHT1处有C = 0伸缩振动特征峰，1636CHT1有C = C伸缩振动特征峰出 现。ESI-MS显示其分子量为926。化合物a经9%盐酸水解，衍生化后的产物通过HPLC检 测出含有葡萄糖、鼠李糖及阿拉伯糖。 1H-NMR(400MHZ，pyridine-d5)谱中共显示8个-CH 3 信号：其中 7 个为甲基单峰质子信号，δΗ 1.65、1.64、1.52、1.23、1. 14、0. 92、0. 88(each 3H，s)，提示该化合物可能为三萜类化合物；1个甲基双峰质子信号，δΗ 1.67(3H，d，J = 5. 9Hz)，为典型的鼠李糖5位所连甲基信号。低场区观察到三个糖端基质子信号：δ η 5. 97(1H, brs, C-I-H of Rha), 5. 14 (1H, d, J = 8. 0Hz, C-I-H of Glc), 4. 67 (1H, d, J = 5. 6Hz, C-I-H of Ara)。
[0039] 13C-NMR(100MHz，pyridine-d5)共显示有 47 个碳信号，其中 δ。175.9 为羰基碳 信号，推断其为成内酯结构的28位羰基碳信号，δ。146. 7和137.7为典型的乌苏烷型三 萜C-13和C-18双键碳信号，δ c 105. 1、105. 0、102. 2为3个糖端基碳的信号，δ c 88. 6为 3位与糖相连成苷的碳信号，δ。86. 1为20位碳的信号。3位所连的阿拉伯糖上基碳信号 为3。105.1、82.5、75.0、68.5、65.2，另外5。105.0、78.9、78.5、75.3、71.7、62.7为葡萄 糖上碳的信号，S c 102. 2、74. 3、72. 8、72. 8、70. 4、18. 6为鼠李糖上碳的信号。δ。74. 6和 66. 4分别为12和19位羟基取代的碳信号。化合物a的核磁数据归属如下：
[0040] iH-MffiUOOMHz.pyridine-cQJHS.gTdH.brs.C-l-HofRhahS.SUlH， brt, H-ll), 5. 14(1H, d, J = 8. 0Hz, C-I-H of Glc), 4. 67 (1H, d, J = 5. 6Hz, C-I-H of Ara), I. 67 (3H, d, J = 5. 9Hz, C-5-CH3 of Rha), I. 65 (3H, s, CH3), I. 64 (3H, s, CH3), I. 52 (3H, s, CH3)，I. 23 (3H, s, CH3)，I. 14 (3H, s, CH3)，0· 92 (3H, s, CH3)，0· 88 (3H, s, CH3)。（图 9)
[0041] 13CMMR(100MHz，pyridine-d5):S c175.9(C-28)，146.7(C-13)，137.7(C-18) ,105. I (Ara C_l)，105. 01 (Glc C_l)，102. 2 (Rha C_l)，88. 6 (C_3)，86. I (C-20)，82. 5 ( Ara C-3) ,78.9 (Glc C-5) ,78.5 (Glc C-3) ,75.3 (Glc C-2) ,75.0 (Glc C-2) ,74.6 (Ara C-2)，74. 6 (C-19) ,74.3 (Rha C-4) ,72.8 (Rha C-3) ,72.8 (Rha C-2) ,71.7 (Glc C-4)，70. 4 (Rha C-5) ,68.5 (Ara C-4) ,66.4 (C-12) ,65.2 (Ara C-5) ,62.7 (Glc C-6) ,56.6 (C-5)，45. 3 (C-9)，44. 5 (C-17)，44. 3 (C-14)，42. I (C-8)，40. 0 (C-4)，39. 6 (C-I)，37. 3 (C-l 0)，35. 9 (C-7)，33. 2 (C-22)，29. 3 (C-15)，29. I (C-Il)，28. 8 (C-2)，28. 4 (C-21)，27. 0 (C-23 )，26. 6 (C-16)，25. 6 (C-29)，23. 9 (C-27)，19. 9 (C-30)，18. 9 (C-26)，18. 9 (C-6)，18. 6 (Rha C-6)，17. 3 (C-24)，17. I (C-25)。（图 10)
[0042] 由上述数据可确定化合物a为苦丁苷A，化学结构式为：
[0043]
【权利要求】
1. 一种从苦丁茶冬青中分离苦丁苷A和苦丁苷D的方法，该方法由以下步骤组成： (1) 取苦丁茶粉碎并过三号筛，加入8?20倍量体积浓度不低于75%的甲醇或乙醇溶 液，采用渗漉或加热回流法提取，回收溶剂得浸膏；将所得浸膏用蒸馏水分散，再依次用氯 仿、正丁醇萃取，回收并浓缩正丁醇萃取液至稠膏； (2) 将所得稠膏装入大孔树脂柱，先用5?7倍柱体积的蒸馏水洗脱除去杂质，再依次 用6?10倍柱体积的体积浓度为30 %、60 %和80 %的甲醇梯度洗脱，收集体积浓度为60 % 的甲醇洗脱液流分，或者依次用6?10倍柱体积的体积浓度为25%、55 %和75%乙醇梯度 洗脱，收集体积浓度为60%的甲醇洗脱液流分，回收洗脱液，得皂苷粗品； (3) 将皂苷粗品用色谱甲醇溶解，并使皂苷粗品在色谱甲醇中的浓度为0. 1?0. 3g/ mL,然后用反相高效液相色谱法进行纯化；其中所述反相高效液相色谱法的色谱条件为，色 谱柱为吐〇1^8丨1(：18,250\30111111，511111，或者为￥]\?：(：18,250\20111111，511111，淠检测器的波长 为230nm，流速4?20mL/min，柱温35°C，流动相为体积浓度为65%的甲醇，或者为体积浓 度为35%的乙腈；分别收集最高峰和其后面流出的第一个主峰所对应的保留时间段的制 备液，浓缩回收后，再用体积浓度为80%的甲醇进行重结晶，得相应的产物苦丁苷A和苦丁 苷D。
【文档编号】C07J71/00GK104402965SQ201410691043
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】赵钟祥, 杨滔, 周联, 向松涛, 张蕾, 朱锦萍, 杨宝, 谭庆龙 申请人:广州中医药大学