一种片段缩合制备曲普瑞林的方法
【专利摘要】本发明公开了一种片段缩合制备曲普瑞林的方法，固相制备曲普瑞林的全保护的第一肽片段序列；液相制备曲普瑞林的全保护的第二肽片段序列并脱除其氨基端保护基；液相中，脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与第一肽片段序列缩合，得到全保护的曲普瑞林；脱去全保护的曲普瑞林的侧链保护基得到曲普瑞林粗肽，高效液相纯化换盐得到醋酸曲普瑞林；其中，所述的第一肽片段序列为曲普瑞林序列中的第1～7位氨基酸，所述的第二肽片段序列为曲普瑞林序列中的第8～10位氨基酸。本发明利用固液相结合片段缩合的方法制备曲普瑞林，提高了产率和纯度，成本低，利于大规模生产。
【专利说明】一种片段缩合制备曲普瑞林的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及制药领域，具体涉及一种片段缩合制备曲普瑞林的方法。
【背景技术】
[0002] 曲普瑞林，英文名：Triptorelin，商品名：达菲林、达必佳，肽序列为：H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pr〇-Gly-NH2，分子式：C64H82N18013，分子量：1310. 63。
[0003] 曲普瑞林作为一种促性腺激素释放激素类似物，主要作用于垂体前叶，临床用于 治疗相关性激素病症，包括晚期前列腺癌、子宫内膜异位、子宫肌瘤、体外受精、中枢性性早 熟症等。
[0004]目前曲普瑞林的制备方法主要以逐个缩合为主。例如专利US4010125使用 Benzhydrylamine树脂为起始原料，以Boc保护的氨基酸为单体，专利CN200710044419. 7 和CN201310013712.2 以及CN201310014882.2,均以RinkAmideMBHA树脂或者RinkAmide AM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次逐个接上氨基酸，裂解获得曲普瑞 林粗品，最后HPLC进行分尚纯化，获得目标广物。
[0005] 以上方法有如下一些问题：a)曲普瑞林序列中存在Arg-Pro,在常规条件下用固 相方法缩合需要过量氨基酸，且缩合效率低，容易出现缺陷肽。这是由于氨基酸自身结构导 致的立体位阻使得缩合反应极为困难。b)使用Rink树脂羧基端氨基酸取代值不能太高，合 成不经济；并且相对于2-氯-三苯甲基氯树脂价格不菲。c)全液相合成时，需要良好的后 处理技术。
[0006] 所以本领域技术人员仍然期待以高收率、低成本获得具有良好品质的产品。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有制备方法收率低，而且产品纯化困难，不易得到高纯度的曲普瑞 林的问题，提供一种固液相结合片段缩合的方法制备曲普瑞林，提高产率和纯度；由于采用 2_氯-三苯甲基氯树脂使得成本降低，利于大规模生产。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0009]方案一：
[0010] 一种片段缩合制备曲普瑞林的方法，固相制备曲普瑞林的全保护的第一肽片段序 列；液相制备曲普瑞林的全保护的第二肽片段序列并脱除其氨基端保护基；液相中，脱除 了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与第一肽片段序列缩合，得到全保护的曲普瑞 林；脱去全保护的曲普瑞林的侧链保护基得到曲普瑞林粗肽，高效液相纯化换盐得到醋酸 曲普瑞林；
[0011] 其中，
[0012] 所述的第一肽片段序列为曲普瑞林序列中的第1?7位氨基酸，
[0013] 所述的第二肽片段序列为曲普瑞林序列中的第8?10位氨基酸。
[0014] 上述片段缩合制备曲普瑞林的方法优选包括以下步骤：
[0015] (1)固相制备曲普瑞林的全保护的第一肽片段序列树脂，
[0016] 所述的全保护第一肽片段序列为：
[0017] Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D~Trp(Boc)-Leu-〇H,
[0018] 将全保护第一肽片段序列从固相载体上裂解；
[0019] ⑵液相合成曲普瑞林的全保护的第二肽片段序列，
[0020] 所述的全保护的第二肽片段序列为：
[0021] Fmoc-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly-NH2 ；
[0022] 脱除全保护的第二肽片段序列的氨基端保护基；
[0023] (3)液相中将步骤⑵得到的脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与 步骤（1)得到的全保护的第一肽片段序列缩合得到全保护曲普瑞林；
[0024] (4)将全保护曲普瑞林裂解脱去侧链保护基得到曲普瑞林粗品；
[0025] (5)曲普瑞林粗品经纯化转盐得到醋酸曲普瑞林。
[0026] 步骤⑴中，全保护的第一肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相载体上获 得；其中，所用的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂。
[0027] 固相制备曲普瑞林全保护第一肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试 剂为体积百分含量为20 %的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1 %的DBU的DMF溶液； 优选体积百分含量为20 %哌啶的DMF溶液。
[0028] 所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按 摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。优选HBTU与HOBt 与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1:1。
[0029] 使用的裂解剂为体积百分含量为0. 5?1 %的TFA的DCM溶液、体积百分含量为 20 %的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。优选体积百 分含量为〇. 5?1 %TFA的DCM溶液。
[0030] 步骤（2)中，液相合成全保护的第二肽片段序列的方法是，首先Fmoc-Pro-OH与 H_Gly_NH2反应得到Fmoc-Pr〇-Gly-NH2,脱去Fmoc保护后与Fmoc-Arg(Pbf)-〇H反应得到 Fmoc-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly_NH2。
[0031] 所述脱除全保护的第二肽片段序列的氨基端保护基也就是脱去 Fmoc-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly_NH2 的Fmoc保护，得到H_Arg(Pbf)-Pr〇-Gly_NH2。
[0032] 氨基脱保护试剂为体积百分含量16 %的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为 1 %的DBU的DMF溶液，或者体积百分含量为50 %的二乙胺的DCM溶液；优选体积百分含量 为50 %二乙胺的DCM溶液。缩合反应使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2 的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1 的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2 的组合，优选DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合；缩合反应的溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和 DMS0中的任意一种或几种的组合，优选THF。
[0033] 步骤（3)中，将步骤⑵得到的脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列 与步骤（1)得到的全保护的第一肽片段序列缩合得到全保护曲普瑞林过程中，使用的缩合 剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比 1:1:2的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组 合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合，优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔 比1:1:2的组合；缩合反应的溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和DMS0中的任意一种或几种的组 合，优选DMF。
[0034] 步骤⑷中，全保护曲普瑞林裂解使用的裂解液为TFA与H20按体积比95:5的混 合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H20按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H20按体积比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。优选TFA与EDT与TIS与 H20按体积比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。
[0035] 步骤（5)中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐，即色谱柱为C18柱；流动相为 0. 25%v/v醋酸水溶液和80%v/v乙腈水溶液。
[0036]方案二：
[0037] -种片段缩合制备曲普瑞林的方法，固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序 列树脂，然后将全保护的第三肽片段序列从树脂上裂解下来，液相中与H-Gly_NH2缩合得到 全保护的曲普瑞林，然后脱去侧链保护得到曲普瑞林粗品，纯化转盐得到醋酸曲普瑞林；
[0038] 其中，所述的第三肽片段序列为曲普瑞林序列中的第1-9位氨基酸。
[0039] 上述片段缩合制备曲普瑞林的方法，优选包括以下步骤：
[0040] (a)固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂，
[0041] 所述的曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列为：
[0042] Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D~Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pr〇-〇 H,
[0043] 将全保护的第三肽片段序列从固相载体上裂解；
[0044] (b)液相中全保护第三肽片段序列与H-Gly_NH2缩合得到全保护的曲普瑞林；
[0045] (c)将全保护的曲普瑞林裂解脱去侧链保护基得到曲普瑞林粗品；
[0046] (d)曲普瑞林粗品经纯化转盐得到醋酸曲普瑞林。
[0047] 步骤（a)中，曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固 相载体上获得肽树脂；其中，所用的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树 脂。
[0048] 固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保 护试剂为体积百分含量为20%的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1 %的DBU的DMF溶液；优选体积百分含量为20 %哌啶的DMF溶液。
[0049] 所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按 摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。优选HBTU与HOBt 与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1:1。
[0050] 使用的裂解剂为体积百分含量为0. 5?1 %的TFA的DCM溶液、体积百分含量为 20 %的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。优选体积百 分含量为〇. 5?1 %TFA的DCM溶液。
[0051] 步骤（b)中曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列与H-Gly_NH2缩合的缩合剂为 HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的 组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者 PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合，优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2 的组合；缩合反应的溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选DMF。待偶联的羧基端与HOBt的摩尔比是1:1。
[0052] 步骤（c)中，全保护曲普瑞林裂解使用的裂解液为TFA与H20按体积比95:5的混 合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H20按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA 与EDT与TIS与H20按体积比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。优选TFA与EDT与TIS与 H20按体积比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。
[0053] 步骤（d)中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐，即色谱柱为C18柱；流动相为醋 酸水溶液和乙腈水溶液。
[0054] 有益效果：本发明相对现有技术具有以下优点：
[0055] 1、本发明利用较高荷载量的酸敏感树脂为起始原料，先采用标准的固相肽合成技 术合成选定结构的高纯度肽片段，液相合成困难序列，再采用液相偶联技术使肽片段缩合， 从而获得高纯度（>98. 5% )、高收率（>40% )的目标肽。
[0056] 2、在合成存在"困难序列"的多肽时，往往采用片段缩合法。相比较连续固相与全 液相合成曲普瑞林的工艺，本发明：
[0057] a. 2-氯-三苯甲基氯树脂重复使用方法简便，价格低廉；每个片段可使用高荷载 量（>0. 8mmol/g树脂）的固相载体，物料通量增加；
[0058] b.避开困难序列的肽片段合成中氨基酸及试剂投量为1. 5-2倍量，远低于固相肽 合成常规的3-4倍甚至5倍、6倍过量，节约物料成本；
[0059] c.相比较全液相合成，固液相结合片段缩合技术取二者之优点，兼有固相合成工 艺简便和液相合成的低物料投入。
[0060] 3、采用超酸敏感型树脂合成的较短氨基酸的侧链保护肽片段序列纯度非常高，不 必用色谱技术纯化，只需要进行沉淀、研磨即可使用；片段液相偶合，其杂质主要为未偶合 的片段，而不是缺少一个或数个氨基酸的缺陷肽，在最终高效液相色谱纯化中容易得多，从 而减少制备次数，降低了曲普瑞林的制备成本，有利于实现规模化、产业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0061] 图1为本发明制备的曲普瑞林纯肽分析色谱图；
[0062] 图2为本发明制备的曲普瑞林纯肽质谱图。
【具体实施方式】
[0063] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0064] 本发明中，合成曲普瑞林所涉及的目的肽及中间体的肽片段氨基酸序列见表1。本 发明中肽片段组合方式见表2。所使用的物料缩写的含义见表3。
[0065] 表1曲普瑞林相应的编码氨基酸序列
[0066]
【权利要求】
1. 一种片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，固相制备曲普瑞林的全保护的第 一肽片段序列；液相制备曲普瑞林的全保护的第二肽片段序列并脱除其氨基端保护基；液 相中，脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与第一肽片段序列缩合，得到全保 护的曲普瑞林；脱去全保护的曲普瑞林的侧链保护基得到曲普瑞林粗肽，高效液相纯化换 盐得到醋酸曲普瑞林； 其中， 所述的第一肽片段序列为曲普瑞林序列中的第1?7位氨基酸， 所述的第二肽片段序列为曲普瑞林序列中的第8?10位氨基酸。
2. 根据权利要求1所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，它包括以下步 骤： (1) 固相制备曲普瑞林的全保护的第一肽片段序列树脂， 所述的全保护第一肽片段序列为： Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-〇H, 将全保护第一肽片段序列从固相载体上裂解； (2) 液相合成曲普瑞林的全保护的第二肽片段序列， 所述的全保护的第二肽片段序列为： Fmoc-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly-NH2 ； 脱除全保护的第二肽片段序列的氨基端保护基； (3) 液相中将步骤（2)得到的脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与步骤 (1)得到的全保护的第一肽片段序列缩合得到全保护曲普瑞林； (4) 将全保护曲普瑞林裂解脱去侧链保护基得到曲普瑞林粗品； (5) 曲普瑞林粗品经纯化转盐得到醋酸曲普瑞林。
3. 根据权利要求2所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤（1)中，全 保护的第一肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相载体上获得；其中，所用的固相载 体为酸敏感树脂； 固相制备曲普瑞林全保护第一肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试剂为 体积百分含量为20%的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1 %的DBU的DMF溶液； 所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者PyBOP与 HOBt与DIEA的组合； 使用的裂解剂为体积百分含量为〇. 5?1%的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20% 的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。
4. 根据权利要求2所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤（2) 中，液相合成全保护的第二肽片段序列的方法是，首先Fmoc-Pro-OH与H-Gly-NH2反应得到Fmoc-Pro_Gly-NH2,脱去Fmoc保护后与Fmoc-Arg(Pbf)-〇H反应得至lj Fmoc-Arg(Pbf)-Pr〇-Gly-NH2 ； 所述脱除全保护的第二肽片段序列的氨基端保护基也就是脱去 Fmoc-Arg (Pbf)-Pr〇-Gly_NH2 的 Fmoc 保护，得到 H_Arg (Pbf)-Pr〇-Gly_NH2 ; 氨基脱保护试剂为体积百分含量16%的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1%的 DBU的DMF溶液，或者体积百分含量为50 %的二乙胺的DCM溶液；缩合反应使用的缩合剂为 HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、 或者EDC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；缩合反应使用的反应溶剂为 THF、DMF、DCM、NMP和DMS0中的任意一种或几种的组合。
5. 根据权利要求2所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤（3)中，将 步骤（2)得到的脱除了氨基端保护基的全保护的第二肽片段序列与步骤（1)得到的全保护 的第一肽片段序列缩合得到全保护曲普瑞林过程中，使用的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA 的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者DIC与HOBt的组 合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；缩合反应的溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和DMS0中的 任意一种或几种的组合。
6. -种片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，固相制备曲普瑞林的全保护 的第三肽片段序列树脂，然后将全保护的第三肽片段序列从树脂上裂解下来，液相中与 H-Gly-NH2缩合得到全保护的曲普瑞林，然后脱去侧链保护得到曲普瑞林粗品，纯化转盐得 到醋酸曲普瑞林； 其中，所述的第三肽片段序列为曲普瑞林序列中的第1-9位氨基酸。
7. 根据权利要求6所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，它包括以下步 骤： (a) 固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂， 所述的曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列为： Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pr〇-〇H, 将全保护的第三肽片段序列从固相载体上裂解； (b) 液相中全保护第三肽片段序列与H-Gly-NH2缩合得到全保护的曲普瑞林； (c) 将全保护的曲普瑞林裂解脱去侧链保护基得到曲普瑞林粗品； (d) 曲普瑞林粗品经纯化转盐得到醋酸曲普瑞林。
8. 根据权利要求7所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤（a)中，曲 普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂是由氨基酸依次偶联在固相载体上获得肽树脂；其 中，所用的固相载体为酸敏感树脂； 固相制备曲普瑞林的全保护的第三肽片段序列树脂的过程中，所使用的氨基脱保护试 剂为体积百分含量为20 %的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1 %的DBU的DMF溶液； 所用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者PyBOP与 HOBt与DIEA的组合； 使用的裂解剂为体积百分含量为〇. 5?1 %的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20% 的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。
9. 根据权利要求7所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤（b)中曲普 瑞林的全保护的第三肽片段序列与H-Gly-NH2缩合的缩合剂为HBTU与HOBt与DIEA的组 合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者EDC与HOBt的组合、 或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；缩合反应的溶剂为THF、DMF、DCM、NMP和DMS0中的任 意一种或几种的组合。
10. 根据权利要求7所述的片段缩合制备曲普瑞林的方法，其特征在于，步骤（c)中，全 保护曲普瑞林裂解使用的裂解液为TFA与H20按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT 与TIS与PhOH与H20按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H20按体 积比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。
【文档编号】C07K1/02GK104387454SQ201410743707
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】彭雅丽, 常民, 王锐, 薛宏祥, 贺真 申请人:兰州大学