专利名称：抗登革热的多价疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗黄病毒科病毒特别是抗诸如登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒的黄病毒或其他黄病毒科病毒或像丙型肝炎病毒的类黄病毒以及它们的混合体(18)的多价亚单位疫苗。
黄病毒是虫媒病毒家族的病毒(旧称B组虫媒病毒)。它们是一般由嗜血节肢动物(蚊、啤、白蛉)传播的脊椎动物病毒，病毒在传播前在这些节肢动物中复制。传播循环的保持因而涉及脊椎动物、节肢动物和一个储库。某些虫媒病毒可能与人有关并导致疾病，这些虫媒病毒尤其见于热带地区。虽然从1930年就已存在抗黄热病的疫苗，最近又有了抗日本脑炎和蜱传脑炎的疫苗，但对其他黄病毒现在还没有任何疫苗；对登革热尤其如此。
现在有几千万人感染登革热，特别是这种疾病以不间断的大流行横行于热带地区。登革热的病因病毒与其载体埃及伊蚊同时复制。该疾病的特征是严重发热，伴有头痛、恶心和关节及肌肉疼痛，几天后消失。但是当这种病与血容量减少性休克相关联时，这些症状会加重，导致出血现象，有时导致死亡，尤其在儿童身上。登革热的病源体是一种黄病毒科的RNA黄病毒，如同黄热病病毒或日本脑炎病毒。已知有4个血清型。出血性登革热可能是一种已知的不良免疫现象的结果，其中可能涉及一种与细胞毒性细胞免疫诱导相关的细胞因子级联反应，可造成多种血清型的相继感染。缺乏动物模型阻碍了疫苗的设计，因为这样就不可能详细探测这种病的严重症状中所涉及的因素。
抗登革热的第一种疫苗现正在试验中。这是一种基于在细胞培养中病毒连续传代而减毒的4种活血清型的疫苗。这种疫苗的主要缺陷是减毒病毒毒性回复的可能性，这是因为遗传回复或基因组间的重组。它还对新生儿和免疫低下者有潜在的危险。另外，用四价疫苗接种的某些儿童并未显示出对抗四种血清型的保护。
V.Deubel等(1)描述了登革热病毒的基因组结构和氨基酸序列(特别是血清型2的)。
登革热病毒是一种约50纳米的包被RNA病毒。正如黄热病病毒，所有病毒蛋白是由约10.5kb的片段编码的，该片段的结构如下5′C-pre M/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 3′结构蛋白是C(壳体)、前基质/基质(pre M/M)和包膜蛋白(E)。
这些蛋白是由5′片段编码的，随后是由基因组其余部分编码的非结构蛋白(NS)。这些蛋白是通过由细胞信号酶和细胞及病毒的其他蛋白酶介导的蛋白水解加工而产生的。
包膜糖蛋白(E)是主要表面蛋白。Mason等(2)已描述了血清型1的结构。
文献(1)中描述了血清型2，这是4种血清型中了解较多的；Osatomi K.等(3)描述了血清型3，Zhao等(4)描述了血清型4。
已利用在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体进行了许多偿试，以开发一般以重组肽或蛋白表达的亚单位疫苗。
实际上，杆状病毒对这种疫苗生产是很有吸引力的，因为它们能达到高水平地遗传表达而在人体中又无致病性。杆状病毒已用于黄病毒蛋白的表达登革热血清型1(5)、登革热血清型4(DEN-4)(6)和血清型2(DEN-2)已有描述(7)、(8)、(9)，Delenda等(10)描述了血清型2和3。
该病毒4个血清型相应的4种基因组间的序列同源性是较高的；例如这些病毒的蛋白E具有下表1所示的同源百分率
尽管如此，现有技术中描述的结构没有一种能诱导对抗4种血清型的有效免疫应答所得滴度一般较低，而且所产生的抵抗毒性病毒攻击产生感染的能力不能认为是令人满意的。
但某些结构产生了良好的免疫原性，特别是如在(11)中所述，包膜糖蛋白在羧基部分缺失100个氨基酸，获得了更高的免疫原性。但这对登革热的其他血清型无效。
最后，Delenda等(9，10)已充分说明在蛋白羧基端部分截短倾向于提高免疫应答。
在异源系统中表达所获的重组蛋白的纯化常常产生所追求的收率和保持所述蛋白结构(特别是这些糖基化基元)之间的兼容性问题。一种有效的技术是蛋白或肽的亲和纯化，这些肽或蛋白与起标记作用的短氨基酸序列(tag)偶联。实施这种方法的技术实例有谷脱苷肽-S-转移酶(GST)，在Sepharose-谷胱苷肽珠上纯化(12)；蛋白MalE与麦芽糖及其衍生物结合(13)；蛋白A与免疫球蛋白柱融合(14)；或组氨酸标记，后者与络合金属柱有亲和力(15)。Schmidt等(16)在最近的一篇文章中描述了这种技术的优点和局限性。但应注意，本领域技术人员一直寻求在纯化步骤后消除组氨酸残基，特别是利用羧肽酶A。
本发明源自这样的发现一种黄病科病毒即登革热病毒的一种蛋白中羧基端的缺失用选自组氨酸、色氨酸或半胱氨酸的氨基酸残基替代，由这样产生的多肽或糖蛋白构成的多肽或糖肽具有比没有加入这种氨基酸的相同多肽或糖肽大得多的免疫原性特征，所述残基具有改善抗原提呈的效果，从而引起比没有这些残基时大得多的细胞和体液应答。
在上文和下文中，“多肽”一词应从广义上理解，即包括含有或不含有糖基或糖脂基的至少15个氨基酸的序列，无论其一级、二级或三级结构如何。
本发明更广泛地讲涉及源自黄病毒科的免疫原性提高的多肽，其特征在于其羧基端存在的氨基酸残基，所述氨基酸残基含有选自组氨酸、色氨酸或半胱氨酸的2-8个氨基酸。
在本申请中，所述氨基酸残基可以是同质的，如它由2-8个组氨酸、2-8个色氨酸或2-8个半胱氨酸组成；它还可以由这些氨基酸中的2-3种的混合物组成；最后，它还可以含有一些除组氨酸、色氨酸或半胱氨酸以外的氨基酸，只要其数目不超过所述残基的25％。
这些结构能解决源自所述病毒的某些肽缺乏免疫原性的问题，例如登革热病毒的某些血清型，现有技术不能制造对抗它们的亚单位疫苗。
本发明涉及这样的免疫原性肽，其由源自登革热病毒蛋白E，蛋白pre M、蛋白NS1或NS3的一种多肽构成，并且在来自蛋白E的所述多肽中羧基端已缺失70-105个氨基酸，并由2-8个选自组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的氨基酸残基替代。对于蛋白preM、同样由可以在其羧基端缺失30-50个氨基酸并由相同类型的氨基酸残基替代。对其他蛋白，这种缺失是没有必要的；源自NS1或NS3的本发明多肽含有2-8个选自组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的氨基酸残基。
有利的是，本发明多肽源自蛋白E并缺失约100个氨基酸；如果所述氨基酸残基含有2-8个组氨酸，这赋予所述肽以在二价或三价或三价阳离子上固定的特性。本发明的多肽或肽可源自4种血清型登革热病毒的每一种，这4种血清型间的同源性百分率很高，对于蛋白E在67％到80％之间，如上表1中所示。
本发明还涉及由本发明的多肽混合物构成的组合物。这些混合物可构成多价疫苗的活性成分，该疫苗对抗同一病毒(如登革热病毒)的不同血清型，或对抗属于同一黄病毒科或类黄病毒科并倾向感染相同人群的不同病毒。
本发明还涉及适于刺激易感染登革热病毒个体的免疫力的组合物，其特征在于它包含至少3种本发明的多肽或糖肽。一种优选的组合物将含有源自4种血清型登革热病毒每一种的一种蛋白的至少一种本发明多肽；蛋白E是良好的选择它具有病毒感染必需的功能，还是病毒和细胞受体间的中介，蛋白E似乎还是被感染宿主中保护性免疫应答的必要靶子，其中它诱导中和性抗体和免疫细胞的反应。
本发明的组合物特别有利地为3种4种如上所述的多肽或糖肽的混合物，所述肽部分来自4种血清型每一种的蛋白E，其中缺失一些氨基酸并以共价形式连接含2-8个组氨酸的残基，优选来自所述病毒每种已知血清型的肽之混合物。
为了使本发明的免疫原性组合物对所述3种或4种血清型或甚至出现新血清时都有效，其中所含的每种肽或糖肽占组合物总肽的重量比为10-50％，优选每种肽的百分比基本相同。
本发明的免疫原性组合物还可以由内源自蛋白E、preM、NS1或NS3的多肽的混合物组成，其中至少含有登革热病毒3种亚型的3种抗原，每种都带有所述羧基端氨基酸残基。
更广义的讲，本发明涉及由源自登革热病毒蛋白E、preM、NS1或NS3的多肽或糖肽的混合物构成的免疫原性组合物，其中含有该病毒3种血清型的至少3种抗原，更广义地为相应于每一已知血清型的一种抗原，不一定在羧基端包含所述的氨基酸残基，但其特征在于每一肽、多肽或糖肽都具有诱导宿主免疫应答的能力。
本发明的组合物另外可含有来自其他黄病毒的多肽、糖肽或蛋白，如来自黄热病病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、丙型肝炎病毒或更广义地非洲、亚洲或美洲热带地区中出现的出血热的其他黄病毒科病毒、以及必要时源自其他病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原的肽，只要它们在其羧基末端具有如上所定义的氨基酸残基。
本发明还涉及编码黄病毒科的尤其是登革热病毒的免疫原性肽的重组核酸序列，其中3′端缺失210-315个核苷酸，并在3′端加入了编码上文所述的2-8个选自组氨酸、色氨酸或半胱氨酸的氨基酸的序列。本发明的核酸序列更具体地讲编码来自登革热病毒血清型1、2、3或4之蛋白E的糖肽，且3′端加入的序列优选为编码含6个组氨酸的序列。
本发明还涉及适用于在真核细胞中表达外源基因的核酸载体；这种载体除含如上所述的一种核酸序列外，还含有与蛋白编码序列同源或异源的信号序列，并一起处于能在所述真核细胞内被活化的一启动子的控制之下。一种优选的真核细胞是昆虫细胞，尤其是草地夜蛾SF9细胞。所述载体是一种穿梭载体pVLD，其可与杆状病毒进行同源重组，并在信号序列上游带有杆状病毒内源基因启动子，如polyédrine的启动子。
所述杆状病毒可通过本领域技术人员已知的各种技术获得，但特别有利的技术是利用大肠杆菌和杆状病毒之间穿梭载体的同源重组技术。
按在以下实验部分更详细描述的这种技术获得的表达载体已保存在CNCM，其中-一重组杆状病毒于1994年12月1日以I-1497号保存在CNCM，其带有编码下述肽的序列该肽由羧基端缺失100个氨基酸并由6个组氨酸取代的第2血清型登革热病毒蛋白E构成；-一重组杆状病毒于1995年10月11日以I-1624号保存在CNCM，其带有编码下述肽的序列该肽由羧基端缺失100个氨基酸并由6个组氨酸取代的第4血清型登革热病毒蛋白E构成；-一重组杆状病毒于1995年10月11日以I-1625号保存在CNCM，其带有编码下述肽的序列该肽由羧基端缺失100个氨基酸并由6个组氨酸取代的第3血清型登革热病毒蛋白E构成；-一重组杆状病毒于1995年10月11日以I-1626号保存在CNCM，其带有编码下述肽的序列该肽由羧基端缺失100个氨基酸并由6个组氨酸取代的第1血清型登革热病毒蛋白E构成。
本发明还涉及用于在易感染登革热病毒的宿主中诱导细胞或体液免疫应答的组合物，其含有分别编码本发明多肽的核酸的混合物，所述本发明多肽即为源自登革热病毒蛋白如蛋白E、preM、NS1或NS3并在其羧基端带有选自组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的2-8个氨基酸的残基的多肽，或更广义的讲所述核酸编码源自其他黄病毒科病毒如黄热病病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒或其他类黄病毒如丙型肝炎病毒的多肽。事实上，人们已证明给动物注射含有蛋白或多肽表达必需序列的质粒可在宿主中引发细胞和体液免疫应答，在某些动物模型中保护了动物对抗致死性病毒攻击；这种结果已由J.A.Wolff等(1990)，在《科学》(Science)2471465-1468或由E.F.Fynan等(1993)，在《DNA细胞生物学》(DNA cell biol.)12785-789中做了描述。包含这种核酸序列的这些免疫原性组合物和这些组合物必要时与佐剂一起形成的疫苗也构成本发明的一部分。
本发明还涉及抗登革热病毒、特别是抗所述病毒4种血清型的多价亚单位疫苗，其含有如上所述的免疫原性组合物，和必要时的免疫接种佐剂，后者特别为带有二价或三价离子的佐剂如氢氧化铝或磷酸钙，或弗氏佐剂型的佐剂，胞壁酰肽衍生物或“ISOM”(免疫刺激复合物)(19)。本发明组合物的免疫原效应可能是本发明多肽或糖肽被二价或三价离子捕获的结果以及可能的多聚体形成的结果，它们具有比文献中描述(参考文献3、7、8、9)的源自登革热病毒的多肽有更高的致免疫能力。
本发明的亚单位疫苗也可以由适于引导抗其他黄病毒科病毒之免疫反应的组合物构成。它们可用于预防或治疗一种病毒的感染或多种病毒的同时感染。
含有1-4种本发明的免疫原性多肽或糖肽并必要时与源自其他黄病毒或出血热病毒之免疫原性糖肽结合的本发明的亚单位多价疫苗，同时具有与免疫原活性成分抗病毒不同血清型之效果相关的多价的优点，和完全接种的优点。实际上，现存在基于病毒培养连续传代而减毒的4种血清型活病毒的抗登革热疫苗，但如我们在上文所看到的，这种疫苗有时对免疫低下的人或新生儿有危险，并且对登革热的不同血清型特别是4种血清型不总有效。向现在临床试验中的疫苗中加入1、2、3或4的种本发明多肽，也构成本发明的疫苗。
下文详细描述一种利用血清型1-4蛋白E(DEN1-DEN4)的具体实施方案，用于非限定性地说明本发明多肽、多肽组合物和疫苗的结构和功能特性。
图1代表感染的Sf9细胞上清中分泌的重组多肽E DEN1到DEN4的电泳图。放免沉淀的蛋白用内切葡糖苷酶F(F)或H(H)处理或不处理(O)。
I.重组杆状病毒的构建
1.制备编码登革热病毒包膜蛋白E的基因片段已用于E基因克隆的登革热病毒株记载在下表2中表2<
2.制备表达登革热病毒截短蛋白的重组杆状病毒用从不同病毒感染的Aedes pseudoscutellaris AP61蚊细胞提取的RNA进行逆转录/聚合酶链式反应(RT/PCR)，制备E基因。蛋白E在其C末端缺失100个氨基酸后(EΔ100)所具有的氨基酸长度示于表2最左边一拦中。
位于待扩增基因5′端的寡核苷酸引物具有一个限制性位点(除登革热2之外)，起始密码子ATG，其后有编码每一蛋白的15氨基酸信号序列中前6个氨基酸的核苷酸。位于待扩增基因3′端的寡核苷酸的引物具有相应于蛋白E6个氨基酸的序列和其后的6个组氨酸密码子，一个终止码子和一个限制位点。这些寡核苷酸的序列如下所示5′末端(有义)登革热15′CGGGATCCATGGGGATCATTTTCATTTTGCTGATG-3′登革热25′-GGCCTTGATTTTCATCTTAC-3′登革热35′-CGGGATCCATGGTGGTTATTTTTATACTATTAATG-3′登革热45′-CGGGATCCATGACTGTCTTCTTTGTCCTAATG-3′3′末端(反义)登革热15′-CGGAGCTCAATGATGATGATGATGATGTCCTTTCTTGAACCAGCTTAG-3′登革热25′-GGAGCTCAATGATGATGATGATGATGTCCTTTCTTAAACCAGTTG-3′登革热35′-CGGAGCTCAATGATGATGATGATGATGTCCCTTCTTGTACCAGTTAAT-3′登革热45′-CGGAGCTCAATGATAATGATAATGATACCCTTTCCTGAACCAATGGAG-3′然后将从Aedes pesudoscutellaris AP61细胞提取的病毒RNA所扩增的片段克隆到穿梭载体pVL-poly(17)中。
D(1、2、3或4)EΔ100 His6指在其羧基端已缺失100个氨基酸并加入了6个组氨酸残基的血清型1、2、3或4的蛋白E。
这样就将编码蛋白D(1、2、3或4)EΔ100His6和其信号序列的基因置于polyédrine启动子的控制之下，含于启动子末尾和起始密码子之间的核苷酸数目为42(登革热1、3或4)或50(登革热2)个核苷酸。
通过穿梭载体pVL.D(1、2、3或4)EΔ100 His6和在单Bsu361位点线性化的杆状病毒AcRP231acZ之间在草地夜蛾Sf9中的同源重组获得了重组杆状病毒Ac.D(1、2、3或4)EΔ100His6。通过平板(plage)方法连续进行3次克隆，筛选了这些重组杆状病毒。
3.所得重组蛋白的结构特征图1显示了相应于登革热病毒1、2、3或4的4种重组蛋白的电泳图。用内切葡糖苷酸F或H处理的蛋白的迁移表明均在一个或两个糖基化位点含有糖基，因为分子量之差不超过4000道尔顿。
II.蛋白DEΔ100His6的表达和纯化1)Sf9细胞的感染100亿个Sf9悬浮细胞由重组杆状病毒AcD(1、2、3或4)EΔ100His6以感染复数2-5感染。感染时间为28℃下1小时。然后取接种物，细胞在2升无胎牛血清的TC100培养基(GIBCO)中28℃培养3天。
2)感染细胞上清液的制备感染后3天，于4℃ 2500rpm离心30分钟，收集2升细胞培养上清液。4℃搅拌下3-14小时内向上清液中加入400克/升醋酸铵。4℃ 10000rpm 20分钟离心沉淀，重溶在含有终浓度20μg/ml的抑蛋白酶肽和终浓度1mM的苯基甲磺酰氟的1/20原始体积(100ml)的色谱缓冲液中(0.5MNaCl；20mM Tris-HCl pH7.9)。然后将浓缩的上清液对100体积的色谱缓冲液透析2次。
3)层析透析液中加入终浓度5mM的咪唑，然后在实验室温度下在5ml TALON树脂(Clontech)存在下温育30分钟(温和搅拌下)。用含有10mM咪唑的层析缓冲液30ml洗涤树脂三次。然后将树脂装入柱中，用10体积的层析缓冲液洗涤，用10ml含50mM咪唑的层析缓冲液洗脱蛋白。用部分收集仪收集各1ml的级份。用含有100mM咪唑的层析缓冲液进行第二次洗脱。合并的含蛋白E级份用小鼠抗E抗体和与碱性磷酸酶偶联的抗小鼠联合抗体、或用与碱性磷酸酶偶联的Ni-NTA联合抗体(Qiagen)进行斑点印迹来测定。
4)纯度检查将每个级份的样品上载于聚丙烯酰胺凝胶上。通过Western印迹在用硝酸银染色后验证目的蛋白的存在。
免疫原将5μg纯蛋白浓度的病毒蛋白与100μg氢氧化铝(Alu-gel-S，Serva)混合，并通过腹膜内途径接种瑞士小鼠。用于免疫接种的登革热病毒株在AP61细胞上测定滴度(通过免疫细胞化学测定病毒灶)并以每只小鼠103个空斑形成单位(PFU)的比例接种。以含有蛋白E最后三个氨基酸(KKG)后接6个组氨酸的肽(KKG His6)作为对照抗原注射给小鼠。每次注射的接种量含有与Alu-gel混合的100μg肽。
攻击剂量(does d’épreuve)的计算给5天龄的幼鼠脑内接种0.02ml不同稀释度的病毒悬液，分析登革热病毒的致死性。用Reed-Muench的方法计算杀死50％小鼠的致死剂量(LD 50)。
小鼠的免疫接种给三周龄的小鼠在第3周、4周和6周时腹膜内注射相应于登革热4种血清型之产物(DEΔ100His6或病毒)的混合物进行接种，最后一次注射后一周从每只动物采血。阴性对照的接种肽与4种血清型相同。对每种同源病毒滴定这些血清的中和抗体。这些血清在被动转入幼鼠后用于保护试验。
中和试验在存在Vero细胞上的50PFU同源病毒的24孔板中，通过血清中和测定接种小鼠的抗体滴度。借助抗病毒蛋白抗体和用过氧化物酶标记的抗小鼠IgG偶合抗体进行免疫细胞化学检测，中和抗体滴度相当于中和80％病毒灶的稀释度。
幼鼠保护试验给前夜接受了0.05ml免疫小鼠血清腹膜内注射(被动转移)的一组5天龄幼鼠接种100 LD50的病毒。每组被动转移的幼鼠接受病毒4种血清型之一的攻击剂量。观察这些小鼠三周，记录麻痹症状或死亡。
结果所得结果列于下表3中。
该表中综合了中和抗体滴度和上述条件下毒性病毒攻击后存活幼鼠百分率的结果。
对于每种血清型，比较用含组氨酸残基的本发明肽、用活病毒、和用含组氨酸残基的肽KKG His6所得的结果，抗原剂量分别为5μg、103Pfu和100μg。
对注射三次抗原后7周时采集的血清测定中和滴度。中和滴度相当于导致VERO细胞上同源病毒株的成灶单位(UFF)减少80％的血清稀释度的倒数。这些同源病毒用于中和试验和攻击试验。
在所示3种情形下，小鼠用四价混合物免疫接种。
表3
这些结果显示这种含有4种重组蛋白的制品诱导针对病毒所有4种血清型的中和抗体。
因而这种混合物可构成抗登革热多价亚单位疫苗的基本成分或活性成分。
注射5μg蛋白3天后所产生的中和抗体的高滴度是引人注目的。以前制备的无组氨酸重组蛋白中没有一种能诱导如此高的中和抗体滴度。提出了两种解释这些结果的假说一种是以前的蛋白纯度不好，含有免疫抑制成分；另一种是含于本发明蛋白中的6个组氨酸的序列在由二价或三价离子形成的微粒存在下，使其以多聚体形式空间呈现，从而具有特别的免疫原性。
III.四种血清型之一的重组包膜蛋白对中和抗体的诱导1.每一病毒血清型的包膜蛋白缺失(Δ)其C末端100个氨基酸并由6个组氨酸片段(His6)构成其C末端，它们通过杆状病毒系统表达并由于其组氨酸尾而在钴柱上层析纯化。将接种抗原以单价形式注射给小鼠，并且为了进行比较，将注射四价形式后所获得的结果列在下表III中的4×DEΔ100 His6一行中。PBS一行代表PBS缓冲液的对照组。
小鼠的免疫接种
每组10只的各组三周龄BALB/c小鼠D1、D7和D21天用与100μg普通佐剂氢氧化铝联合的5μg重组抗原免疫接种。在D28天从小鼠采血，并测定对200成灶单位的每种参照毒株的血清中和(登革热1夏威夷1944；登革热2新几内亚C，1944；登革热3H87，菲律宾1956；登革热4H251，菲律宾1951)。滴度相应于中和50％以上灶的稀释度的倒数。
列于下表4中的结果显示免疫原D2EΔ100His6和D3EΔ100His6都诱导抗登革热血清型2的中和抗体的形成，而登革热血清型3和4分别只被重组蛋白D3EΔ100His6和D4EΔ100His6所中和。最后，D1EΔ100His6没有任何中和作用。
表4<
源自血清型D2、D3和D4的重组蛋白看来特别令人感兴趣，用一种纯化重组包膜蛋白免疫的猴血清中中和抗体的滴度与用减毒病毒所得的滴度进行了比较，结果列在下表5中。
表5对登革热2免疫接种并用一种野生病毒株感染的cynomolgus猴的免疫应答
>
每组2只的各组猴接受了各种免疫原制剂日本脑炎疫苗(A)；九肽KKG H6(B)；重组包膜蛋白D2EΔ100His6(C)；PBS(D)；减毒登革热2疫苗(E)。PRNT空斑减少中和试验(参考文献10)。这些制剂在D0天(A和E)或在采血样后D0、D28、D56天注射。然后在D83天给猴子皮内注射登革热2病毒(牙买加1983株)的2×105个感染性颗粒进行攻击。然后在D98天采血。
免疫原的获取试验猴按月接受三次接种，每次为使用1mg铝佐剂的100μg肽(B组)。接种三次与1mg铝佐剂混合的100μg登革热2重组包膜蛋白(C组)；接种三次与佐剂混合的PBS缓冲液(D组)或接种一次由巴斯德梅奥血清和疫苗公司(PASTEUR MERIEUXSERUM & VACCINS)制造的THAI型减毒的登革热2活疫苗0.5ml(E组)。
最后一次接种后4周收集血清，并测定其对200空斑形成单位(PFU)的牙买加登革热2同源株的中和抗体。其滴度相应于中和50％空斑的血清稀释度。表5表明了源自登革热血清型2的重组蛋白在cynomolgus猴中诱导中和抗体的特异性，其应答比用减毒病毒所获得的至少大4倍。
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(15)Hochuli E.等(1987)，色谱学杂志(J.Chromatography)411177-184。
(16)J.Sehmitt，H.Hess，H.G.Stunnenberg，加组氨酸尾的蛋白的亲和纯化。分子生物学报道(Mol.Biol.Reports)，18223-230。
(17)Flamand M.等(1992)，用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达和分泌日本脑炎病毒非结构蛋白NS1。病毒学191826-836。
(18)欧洲专利No.0318216。
(19)Morein B.(1987)，用限制在多聚体物理形式中的抗原免疫的免疫应答潜力。Vet.Immunol.Immunopathol.17153-159。
权利要求
1.免疫原性多肽或糖肽，其特征在于其由源自一种黄病毒科病毒特别是源自登革热病毒蛋白E、或pre M、或NS1或NS3的一种多肽或糖肽组成，所述多肽在其羧基端带有选自组氨酸、色氨酸或半胱氨酸的2-8个氨基酸的残基。
2.根据权利要求1的多肽或糖肽，其特征在于所述糖肽由羧基端缺失70-105个氨基酸的包膜蛋白E组成。
3.根据权利要求1或2的多肽或糖肽，其特征在于羧基端序列由6个组氨酸的残基组成，该序列使所述多肽具有固定在二价或三价阳离子上的特性。
4.适用于刺激易受登革热病毒感染之个体免疫力的组合物，其特征在于其含有至少一种权利要求1-3之一的多肽或糖肽。
5.根据权利要求4的组合物，其特征在于所述糖肽源自登革热病毒的糖蛋白E。
6.根据权利要求4或5的组合物，其特征在于所述多肽或糖肽是登革热病毒至少3种血清型的根据权利要求1-3之一的至少3种多肽的混合物，优选每种已知血清型的多肽混合物。
7.根据权利要求4-6之一的组合物，其特征在于其含有多肽D3EA100His6和/或多肽D2EΔ100His6。
8.根据权利要求4-7之一的组合物，其由源自登革热病毒蛋白E或preM或NS1或NS3优选源自蛋白E的多肽或糖肽组成。
9.根据权利要求6或7的组合物，其特征在于相对于所述组合物的总肽，每种肽以10-50％重的比例存在。
10.根据权利要求4-9之一的组合物，其特征在于其还含有来自其他黄病毒如黄热病病毒、日本脑炎病毒或丙型肝炎病毒的多肽、糖肽或蛋白。
11.根据权利要求4-9之一的组合物，其特征在于其还含有在羧基端带有选自组氨酸、色氨酸和半胱氨酸的2-8个氨基酸残基的病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原。
12.核酸序列，其由编码登革热病毒一种蛋白的序列组成，且缺失3′端210-315个核苷酸，并已添加了编码选自组氨酸、色氨酸或半胱氨酸的2-8个氨基酸的3′序列。
13.根据权利要求12的核酸序列，其特征在于该序列编码登革热病毒血清型1、2、3或4的蛋白E。
14.根据权利要求12或13的核酸序列，其特征在于该3′序列编码6个组氨酸。
15.适用于在真核细胞中表达外源基因的核酸载体，其特征在于其含有权利要求12-14之一的核酸序列，该序列在5′端带有与所述序列的蛋白编码序列同源或异源的信号序列，它们一起处于可在所述真核细胞中被活化的启动子控制下。
16.根据权利要求15的表达载体，其特征在于所述真核细胞为一种昆虫细胞，特别是草地夜蛾SF9，所述载体为一种易于与杆状病毒载体实现同源重组的并在信号序列上游带有杆状病毒内源基因的特别是polyedrine的启动子的穿梭载体。
17.根据权利要求15或16的表达载体，其特征在于它是于1994年12月1日以I-1497号保藏在CNCM的重组杆状病毒，其带有下述肽的编码序列羧基端缺失100个氨基酸并由6个组氨酸替代的登革热病毒血清型2的蛋白E。
18.根据权利要求15或16的表达载体，其特征在于它是于1995年10月11日以I-1624号保藏在CNCM的重组杆状病毒，其带有下述肽的编码序列羧基端缺失100个氨基酸并由6个组氨酸替代的登革热病毒血清型4的蛋白E。
19.根据权利要求15或16的表达载体，其特征在于它是于1995年10月11日以I-1625号保藏在CNCM的重组杆状病毒，其带有下述肽的编码序列羧基端缺失100个氨基酸并由6个组氨酸替代的登革热病毒血清型3的蛋白E。
20.根据权利要求15或16的表达载体，其特征在于它是于1995年10月11日以I-1626号保藏在CNCM的重组杆状病毒，其带有下述肽的编码序列羧基端缺失100个氨基酸并由6个组氨酸替代的登革热病毒血清型1的蛋白E。
21.适用于在易感染登革热病毒的宿主中诱导细胞或体液免疫应答的组合物，其特征在于其含有编码权利要求1-3之一的多肽的核酸。
22.权利要求1-4之一的多肽或糖肽的制备方法，其特征在于其包括在与所述2-8个氨基酸的序列有亲和性的载体上进行亲和层析的步骤。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于所述载体是含有二价或三价离子特别是镍、铜、钴或锌的对富电子组氨酸、色氨酸或半胱氨酸具有亲和力的柱子。
24.抗登革热病毒的多价疫苗，其特征在于其含有根据权利要求4-11和21之一的免疫原性组合物，必要时还有任何疫苗佐剂，特别是带有二价或三价离子的佐剂如氢氧化铝或磷酸钙，或弗氏佐剂类型的佐剂，或胞壁酰肽衍生物或免疫刺激复合物。
25.根据权利要求24的多价疫苗，其特征在于其还含有来自其它黄病毒如黄热病病毒或日本脑炎病毒、或蜱传脑炎病毒或丙型肝炎病毒的免疫原性多肽或糖肽。
26.根据权利要求24的多价疫苗，其特征在于其含有相应于登革热病毒每种血清型的4种肽或糖肽，及含有二价或三价离子的佐剂。
27.根据权利要求24的多价疫苗，其特征在于它含有据权利要求1-3之一的1、2、3或4种肽或糖肽以及减毒病毒。
28.根据权利要求24的多价疫苗，其特征在于它除含有根据权利要求1-3之一的多肽外，还含有一种或多种病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原。
29.一种多价疫苗，其特征在于它含有携带权利要求1-3之一多肽之编码序列的核酸的混合物。
30.由源自登革热病毒蛋白E、preM、NS1或NS3的多肽或糖肽组成的抗原组合物，其特征在于它含有该病毒三种不同血清型的至少3种抗原，优选含4种血清型中每一种的抗原。
全文摘要
抗黄病毒科特别是抗登革热病毒的多价亚单位疫苗,其含有源自每一血清型的重组肽,该肽羧基端用含2—8个组氨酸、色氨酸或半胱氨酸的肽取代。
文档编号C07K14/18GK1202201SQ9619831
公开日1998年12月16日 申请日期1996年11月14日 优先权日1995年11月14日
发明者V·狄尤贝尔, I·斯塔罗波利 申请人:巴斯德研究所