用于抑制α的制作方法

专利名称：用于抑制α的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及医学领域，并且具体地涉及使用玻连蛋白受体αvβ5的拮抗剂抑制αvβ5介导的组织血管发生的方法和组合物。背景整联蛋白是已知结合胞外基质蛋白并因此介导细胞-细胞和细胞-胞外基质相互作用(一般称为细胞粘连事件)的一类细胞受体。然而，尽管在文献中描述了许多整联蛋白及其相应的配体，仍然难以理解许多整联蛋白的生物学功能。整联蛋白受体构成了一个蛋白家族，这些蛋白具有共享的由α和β亚基组成的非共价异二聚体糖蛋白复合物的结构特征。
目前已知以其优先结合玻连蛋白的原始特征命名的玻连蛋白受体，指称为αvβ1、αvβ3和αvβ5的三个不同的整联蛋白。Horton,Int.J.Exp.Pathol.,71:741-759(1990)。αvβ1结合纤连蛋白和玻连蛋白。αvβ3结合种类繁多的配体，包括血纤蛋白、血纤蛋白原、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、玻连蛋白、威勒布兰特因子、骨反应素和骨唾液蛋白Ⅰ。αvβ5结合玻连蛋白。目前仍在研究这三种整联蛋白在组织中的许多细胞相互作用中所起的特异性细胞粘连作用。然而，已知有许多具有不同生物学功能的不同的整联蛋白以及具有共享的生物学特异性的不同的整联蛋白和亚基。
许多整联蛋白的配体内的一个重要识别位点是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列。在以上鉴别为玻连蛋白受体整联蛋白的所有配体中都发现了RGD。可以用含有该RGD序列的多肽(“肽”)模拟该RGD识别位点，并且这种RGD肽是整联蛋白功能的已知抑制剂。然而，重要的是注意到，根据该RGD肽的序列和结构，可以改变该抑制的特异性以导向特定的整联蛋白。
有关该RGD识别位点的讨论，参见Pierschbacher等，Nature,309:30-33(1984)、和Pierschbacher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:5985-5988(1984)。改变整联蛋白特异性的各种RGD多肽亦描述于Grant等，Cell,58:933-943(1989),Cheresh，等，Cell,58:945-953(1989)、Aumailley等，FEBS Letts.,291:50-54(1991)和Pfaff等，J.Biol.Chem.269:20233-20238(1994)和美国专利4,517,686、4,578,079、4,589,881、4,614,517、4,661,111、4,792,525、4,683,291、4,879,237、4,988,621、5,041,380和5,061,693号。
血管发生亦称为新血管形成，是涉及新发育血管生长进入组织的组织血管形成的过程。该过程由内皮细胞和平滑肌细胞的浸润介导。据信该过程以以下三种方式之一进行1)该脉管可以从先前存在的脉管出芽；2)可以从前体细胞发生脉管的从头发育(血管发生)；或3)现存的小脉管的直径可以扩大。Blood等，Bioch.Biophys.Acta,1032:89-118(1990)。已知血管内皮细胞含有至少五种RGD依赖性整联蛋白，包括玻连蛋白受体(αvβ3或αvβ5)、胶原蛋白Ⅰ型和Ⅳ型受体(α1β1)、层粘连蛋白受体(α2β1)、纤连蛋白/层粘连蛋白/胶原蛋白受体(α3β1)和纤连蛋白受体(α5β1)。Davis等，J.Cell.Biochem.,51:206-218(1993)。已知平滑肌细胞含有至少六种RGD依赖性整联蛋白，包括α5β1、αvβ3和αvβ5。
血管发生是新生儿生长中的重要过程，但在伤口愈合和在包括组织炎症、关节炎、牛皮癣、癌症、糖尿病性视网膜病、黄斑变性和其它新血管性眼病的种类繁多的临床重要疾病中亦很重要。这些与血管发生相关的临床疾病被称为生血管性疾病(angiogenic disease)。Folkman等，Science,235:442-447(1987)。在成人或成熟组织中一般没有血管发生，尽管其的确在伤口愈合和在黄体生长周期中发生。参见例如，Science,248:1408-1410(1990)。
使用对各种整联蛋白α或β亚基免疫特异性的单克隆抗体体外抑制细胞粘连，已将玻连蛋白受体αvβ3与包括微血管内皮细胞的种种细胞类型的细胞粘连相关联。Davis等，J.Cell.Biol.51:206-218(1993)。另外，Nicosia等，Am.J.Pathol.,138:829-833(1991)描述了使用RGD肽GRGDS抑制从在胶原蛋白凝胶中培养的大鼠主动脉体外形成“微脉管”。
但是，抑制胶原蛋白凝胶培养物中的体外“微脉管”形成不是抑制组织中血管发生的模型，因为未显示所述微脉管结构与毛细管出芽相同，或在胶原蛋白凝胶培养物中微脉管的形成等同于新血管生长进入完整的组织，例如关节炎组织、肿瘤组织或希望抑制血管发生的疾病组织。
近来证实了αvβ3在血管发生中的作用。参见，Brook等，Science,264:569-571(1994)。显示整联蛋白在人类伤口肉芽发生组织中而不是在正常皮肤中的血管上表达。抗αvβ3受体的单克隆抗体抑制由生长因子(细胞因子)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及由黑素瘤片段诱导的血管发生。然而，所述拮抗剂仅抑制新脉管，而不抑制先前存在的脉管。另外，特定的含有RGD的线性和环状肽亦显示抑制新血管形成。
已有提议抑制血管发生将对限制肿瘤生长是有用的治疗法。已提议通过(1)抑制释放诸如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的“生血管分子”，(2)诸如通过使用抗bFGF抗体中和生血管分子和(3)抑制内皮细胞对血管发生刺激物应答抑制血管发生。后一策略受到了注意，并且Folkman等，Cancer Biology,3:89-96(1992)已描述了可以用于抑制血管发生的几种内皮细胞应答抑制剂，包括胶原酶抑制剂、基膜更新抑制剂、血管抑制性(angiostatic)类固醇、真菌源血管发生抑制剂、血小板因子4、血小板反应蛋白、诸如D-青霉胺和硫代苹果酸金的关节炎药物、维生素D3类似物、α-干扰素等等。有关其它建议的血管发生抑制剂，参见Blood等，Bioch.Biophys.Acta.,1032:89-118(1990)、Moses等，Science,248:1408-1410(1990)、Ingber等，Lab.Invest.,59:44-51(1988)和美国专利5,092,885、5,112,946、5,192,744和5,202,352。
然而，在本发明之前从未提示或鉴别整联蛋白αvβ5在血管发生中的作用，亦未有先前参考文献中描述的任一种血管发生抑制剂导向抑制αvβ5。另外，除本发明之外，没有任何参考文献暗示αvβ5整联蛋白在新血管形成、特别是由生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-α(TGF-α)和表皮生长因子(EGF)诱导的新血管形成中的作用。
尽管参与控制血管发生的生长因子的数量有限，但存在对从非活动状态向新血管状态转换的不同水平的过程控制。参见，D’Amore,Investigative Ophthal.Visual Sci.,35:3974-3979(1994)。虽然一些参与血管发生的生长因子在合成水平受调节，而其它的则由激活状态调节。当非活动脉管在受伤或局部缺血后进行新血管形成时，发生这些细胞事件。
据认为特别是VEGF是原发性肿瘤中和局部缺血性眼病中血管发生的主要介质。有关综述，参见Foldman,Nature Medicine,1:27-31(1995)。VEGF是46千道尔顿(kDa)的同二聚体，它是内皮细胞特异性生血管的(Ferrara等，Endocrin.Rev.,13:18-32(1992))和血管通透因子(Senger等，Cancer Res.,46:5629-5632(1986))，它与具有酪氨酸激酶活性的高亲和性膜结合受体结合(Jakeman等，J.Clin.Invest.,89:244-253(1992))。
近来已显示受体酪氨酸激酶的激活促进整联蛋白依赖性细胞在胞外基质蛋白上迁移。具体地说，Klemke等，J.Cell Biol.,127:859-866(1994)已暗示，EGF受体(EGFR)酪氨酸激酶促进使用αvβ5整联蛋白的FG人胰腺癌细胞在玻连蛋白上的细胞机动性而不是粘连。作者提供了直接证据，表明用该EGF配体占据EGFR激活了该EGFR酪氨酸激酶的活化，其最终刺激导致诱导αvβ5依赖性细胞在玻连蛋白基质上迁移的蛋白激酶C(PKC)依赖性路径，而在正常情况下所述细胞不能在玻连蛋白基质上迁移。因此，Klemke等的发现提供了将细胞因子特别是EGF的存在与细胞迁移中的整联蛋白活性相对应的证据。已显示PKC的激活参与鸡尿囊绒膜模型系统中血管发生的调节。参见，Tsopanoglou等，J.Vasc.Res.,30:202-208(1993)。所述作者鉴定了在该模型系统中分别刺激和抑制血管发生的特定的PKC激活剂和抑制剂。
然而，上述Klemke等或Tsopanoglou等均未描述细胞因子和所述αvβ5整联蛋白的表达和/或激活在促进各种病症和疾病状态中血管发生的作用以及用特异性αvβ5拮抗剂对其抑制。
近来的实验证据已显示，在眼病的猴子模型系统中由视网膜静脉闭合诱导的视网膜局部缺血导致在眼睛的眼房中VEGF快速上升。该上升与如Miller等，Am.J.Path.,145:574-584(1994)所述所观察到的虹膜新血管形成同时发生。其中诱导了缺氧的增殖性视网膜病的小鼠模型系统中的另外的数据，显示VEGF信使RNA在相对缺氧的6-12小时内增加并保持升高直至发展新血管形成。当新血管衰退时，VEGF表达亦然，如Pierce等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,92:905-909(1995)。
因此，在局部缺血的动物模型中证实的近期数据已将VEGF诱导与新血管形成之前的局部缺血的诱导相关联。也已将VEGF以及其他生长因子牵涉在涉及新血管形成的其它病症和疾病状态中，如Folkman,Nature Medicine,1:27-31(1995)综述。
Folkman等的文献亦概括了目前用于控制不需要的血管发生的临床途径。临床试验中的病人接受了使用包括血小板因子4、烟曲霉素衍生物、羧基-氨基三唑等等的生血管抑制剂的治疗性处理。但是，文献或目前的治疗参考均未将αvβ5的表达与血管发生、特别是由VEGF诱导的血管发生相关联。因此，在本发明之前，没有任何人描述或利用使用αvβ5拮抗剂的治疗制度控制正在进行的与αvβ5的存在和激活相关的血管发生的组织中的血管发生。
因此，除了本文对αvβ3和与血管发生生长因子的关系的报道，本申请人不知道任何其它的可以使用αvβ5介导的细胞粘连的抑制剂抑制组织中血管发生的证明。具体地说，先前从未证明组织中的血管发生需要αvβ5功能或αvβ5拮抗剂可以抑制组织中、特别是眼新血管疾病中的血管发生。发明简述本发明证明除了组织中的需要αvβ3的血管发生途径，亦存在独立的新的αvβ5依赖性途径。因此，本发明描述了可以抑制血管发生的αvβ5抑制剂。本发明再描述了在促进血管发生中的αvβ5介导的活性与生长因子受体酪氨酸激酶和蛋白激酶C(PKC)的生长因子(细胞因子)激活相关。以这种方式起作用的生长因子(细胞因子)包括血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)等等。
本发明因此描述了在组织中抑制血管发生的方法，包含给予该组织包含血管发生抑制量的αvβ5拮抗剂的组合物。
欲处理的组织可以是需要抑制血管发生的任何组织，例如发生新血管形成的疾病组织。典型的组织包括正在进行新血管形成的眼组织、炎症组织、实体瘤、转移瘤、进行再狭窄的组织等等组织。在推荐实施方案中，与αvβ5表达相关的新血管形成是暴露给生长因子VEGF、TGF-α和EGF的结果。
特别优选的是针对在诸如眼睛的组织中抑制VEGF诱导的血管形成的治疗方法，在该组织中疾病时血管发生显著，所述疾病包括糖尿病性视网膜病(亦称为增殖性糖尿病性视网膜病)、年龄相关的黄斑变性、假定的眼组织胞浆菌病、未熟儿视网膜病、镰形细胞视网膜病和新血管青光眼。在其它优选的实施方案中，所述治疗方法针对抑制包括角膜移植、疱疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状胬肉、与使用隐性眼镜片相关的新血管角膜翳等等的角膜新血管疾病中发生的血管发生。
用于本发明方法的αvβ5拮抗剂可以结合αvβ5并竞争性地抑制αvβ5结合至天然玻连蛋白配体的能力。最好是，该拮抗剂对αvβ5展示出超过其它整联蛋白的特异性。在特别推荐的实施方案中，该αvβ5拮抗剂抑制玻连蛋白或其它含有RGD的配体与αvβ5的结合，但是基本上不抑制玻连蛋白与αvβ3或αⅡbβ3的结合。优选的αvβ5拮抗剂可以是融合多肽、线性或环状多肽、衍生多肽、单克隆抗体或其功能片段、或亦称为有机模拟物的αvβ5配体模拟物的有机分子，它们均特异性地与αvβ5相互作用。
本发明的αvβ5拮抗剂的给予包括眼内、静脉内、经皮、滑液内、肌内和口服给予。在其它推荐实施方案中，与控制肿瘤发生和癌症转移的化疗制度协同给予。附图简述附图构成本说明书的一部分

图1A-1D描述αv整联蛋白抗体拮抗剂抑制细胞因子诱导的兔子角膜血管发生。在实施例4中描述了用或者bFGF或者VEGF处理诱导血管发生及其用αv整联蛋白抗体拮抗剂P1F6(αvβ5)和LM609(αvβ3)处理的效果。OD和OS分别是实验兔子的右眼和左眼。大箭头标明具有水肿的角膜血管发生，而小箭头指向正常结膜缘脉管。图1A和1B显示用bFGF诱导血管发生，而图1C和1D显示用VEGF诱导血管发生。图1A和1C中的兔子角膜显示用P1F6处理，而图1B和1D显示用LM609处理。
图2A和2B是显示分别用或者bFGF或者VEGF诱导并接着用或者P1F6或者LM609进行单克隆抗体处理后的以mm2+/-标准差(两个系列的每个均为n=8)表示的平均新血管面积的矩形图。所述结果在实施例4中讨论。
图3A-3F以照片描述了抗整联蛋白抗体处理对鸡CAM制备物的效果。结果在实施例6A中描述。用或者bFGF或者VFGF诱导血管发生，接着静脉内给予做为对照的磷酸缓冲盐水(PBS)或者具有描述于图1的图例中的P1F6或者LM609单克隆抗体的磷酸缓冲盐水(PBS)。用bFGF处理的CAM示于图3A、3C和3E，而用VEGF处理的CAM示于图3B、3D和3F。接受静脉内注射PBS的对照CAM示于图3A和3B。在图3C和3D中使用P1F6抗体处理CAM，而在图3E和3F中使用LM609抗体处理CAM。
图4A和4B以矩形图的格式提供示于图3A-3F的结果的定量。相对于对照或抗体处理在Y轴上描绘血管发生指数。图4A和4B分别显示bFGF和VEGF诱导的血管发生。所述结果在实施例4中讨论。
图5A-5F以照片描述了如实施例6中描述的合成肽处理对鸡CAM制备物的效果。或者用bFGF或者用VEGF诱导血管发生，接着静脉内给予做为对照的磷酸缓冲盐水(PBS)或者具有合成环状肽RGDfV(SEQID NO 4)或者RADfV(SEQ ID NO 5)的磷酸缓冲盐水(PBS)。用bFGF处理的CAM示于图5A、5C和5E，而用VEGF处理的CAM在图5B、5D和5F中。接受静脉内注射PBS的对照CAM示于图5A和5B中。在图5C和5D中使用RDGfV肽处理CAM，而在图5E和5F中使用RADfV肽处理CAM。
图6A和6B以矩形图的格式提供示于图5A-5F的结果的定量。相对于对照或抗体处理在Y轴上描绘血管发生指数。图6A和6B分别显示bFGF和VEGF诱导的血管发生。所述结果在实施例6中讨论。
图7A-7E显示抗整联蛋白单克隆抗体和钙感光蛋白(calphostin)C对由独立的细胞因子bFGF、TNF-α、VEGF和TGF-α诱导的CAM血管发生的效果。亦评价了PMA。所述检测和结果在实施例6中描述。以矩形图格式描绘结果，在Y轴上画血管发生指数，而在X轴上显示各种对照或抑制剂。图7A-7E分别显示用bFGF、TNF-α、VEGF、TGF-α和PMA诱导的血管发生。
图8是矩形图，显示抗体处理对鸡胚CAM中CSl黑素瘤肿瘤生长的效果，按照实施例5C和6D中的描述进行检测。将以毫克(mg)表示的肿瘤重量在Y轴上对X轴上标明的各种处理作图。CSAT是对先前描述的整联蛋白β1亚基特异性的对照抗体，先前描述了LM609和P1F6。
图9是对照对比αvβ5肽拮抗剂、标记肽189(SEQ ID NO 9)对黑素瘤肿瘤生长的效果的矩形图，以mm3计的肿瘤体积描绘于Y轴上。该检测和结果描述于实施例8中。
图10描述如在实施例10A-G中描述的化合物7的合成。
图11描述如在实施例10A-C、H-I中描述的化合物9的合成。
图12描述如在实施例10J中描述的化合物10的合成。
图13描述分别描述于实施例10K-L和10M-N中的化合物12和化合物14的合成。
图14描述化合物15、化合物16、化合物17和化合物18的化学结构。所述化合物的详细合成描述于实施例10O-R。
图15A和15B显示鸡MMP-2的连续cDNA序列以及显示于第二行的推测氨基酸序列。第三和第四行分别显示如实施例7中描述的人和小鼠MMP-2的推测氨基酸序列。该鸡cDNA序列列于SEQ ID NO 23中，以及编码氨基酸序列亦做为SEQ ID NO 24单独展示。示于图15A中做为负数的5’非翻译区和编码酶原的区的第一个核苷酸的编号实际在序列表中代表编号1，使得后者看起来比该图长；但是，除了编号之外，该核苷酸序列在长度和序列上与展示于序列表中的序列是相同的。因此，有关本说明书中鸡或人MMP-2核苷酸位置的参考(例如用于扩增人MMP-2片段的引物中)是基于图中标明的核苷酸位置，而不是列于序列表中的核苷酸位置。
图16显示具有631个残基的成熟人MMP-2蛋白的氨基酸残基序列。人MMP-2源片段的氨基酸残基位置对应于该图中的位置。该氨基酸残基序列列于SEQ ID NO 25。
图17显示肽85189和惰性盐对应物121974对CAM模型中VEGF诱导的血管发生的影响，在实施例6A中进一步描述。将该效果与未处理(标为NT)和对照(标记为69601)肽处理的制备物比较。通过如实施例6A中的进一步描述计算分枝点的数量，测定对血管发生的影响。
图18、19和20分别显示如实施例6D中进一步描述的、在静脉内暴露给对照肽69601和拮抗剂85189后UCLAP-3、M21-L和FgM肿瘤的肿瘤重量的减少。以肿瘤重量在Y轴对X轴上的肽处理用数据作图。
图21描述肽和抗体对如实施例8中进一步描述的嵌合小鼠人模型中黑素瘤肿瘤生长的影响。评价的肽包括对照69601(标记为601)和拮抗剂85189(标记为189)。测试的抗体是LM609。以mm3计的肿瘤体积于Y轴上对在X轴上的各种处理作图。
图22A和图22B分别显示与对照肽69601(标记为601)相比、剂量范围为10、50和250μg/注射的拮抗剂85189(标记为189)降低M21L肿瘤体积和湿重的效果，如实施例8中所述。
图23A和23B显示拮抗剂肽85189(在虚线和实心圆圈上标记为189)对比对照肽69601(在虚线和空心方块上标记为601)、以二种不同处理制度在小鼠人类模型中抑制M21 L中瘤体积的效力，在实施例8中进一步描述。以mm3计的肿瘤体积于Y轴上对在X轴上的天数作图。发明详述A．定义氨基酸残基在其肽键处化学消化(水解)多肽形成的氨基酸。本文描述的氨基酸残基最好是“L”异构型。但是，可以用“D”异构型的残基置换任何L氨基酸残基，只要该多肽保持目的功能性质。NH2指多肽氨基末端的游离氨基。COOH指多肽羧基末端的游离羧基。与标准多肽命名法(描述于J.Biol.Chem.,243:3552-59(1969)并于37 CFR§1.822(b)2)采用)保持一致，在以下对应表中显示氨基酸残基的缩写对应表符号 氨基酸单字母 三字母Y Tyr酪氨酸G Gly甘氨酸
FPhe苯丙氨酸MMet甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer丝氨酸IIle异亮氨酸LLeu亮氨酸TThr苏氨酸VVal缬氨酸PPro脯氨酸KLys赖氨酸HHis组氨酸QGln谷氨酰胺EGlu谷氨酸ZGlxGlu和/或GlnWTrp色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬酰胺BAsxAsn和/或AspCCys半胱氨酸XXaa未知或其它另外，以下具有以下含义BOC叔丁酯基DCCI 二环己基碳二亚胺DMF二甲基甲酰胺OMe甲氧基HOBt 1-羟基苯并三唑(1-hydroxybezotriazole)
应注意，本文按惯用法表示所有氨基酸残基序列，其左右定向是常规的氨基末端至羧基末端方向。再者，应注意氨基酸残基序列的开始或结束处的破折号表明与一个或多个氨基酸残基的再一序列的肽键。
多肽通过相邻氨基酸残基的氨基和羧基之间的肽键相互连接的氨基酸残基的线性序列。
肽以多肽中方式相互连接的不超过50个氨基酸残基的线性序列。
环状肽指具有包含如典型肽中的几个酰胺键的杂原子环的化合物。该环状肽可以是“首尾相连”环化线性肽，其中线性肽的n-末端与该线性肽的末端羧酸盐形成酰胺键，或者其可以含有其中该聚合物为homodetic ore heterodetic并包含酰胺键和/或其它键(例如二硫桥、硫酯、硫代酰胺、胍基等等键)以闭合该环的环状结构。
蛋白以多肽中方式相互连接的超过50个氨基酸残基的线性序列。
融合蛋白指含有通过典型的肽键可操作地连接(“融合”)的至少两个不同的多肽域的多肽，这两个域对应于自然中未发现融合的肽。
合成肽通过肽键连接的化学产生的氨基酸残基链，不含有天然存在的蛋白和其片段。
B．一般考虑本发明总的涉及血管发生由特异性玻连蛋白受体αvβ5介导以及抑制αvβ5功能抑制血管发生的发现。本发现由于血管发生在各种疾病过程中的作用而是重要的。通过抑制血管发生，可以干预疾病、减轻症状、并在一些病例中治愈疾病。当新血管生长是与疾病相关的病理学起因或对其病理学起作用时，抑制血管发生将减轻该疾病的有害效应。实例包括类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、炎症性疾病、再狭窄等等。当需要新血管生长支持有害组织生长时，抑制血管发生将降低对该组织的血液供应，并由此对降低基于血液供应需要的组织质量起作用。实例包括对局部缺血应答的新血管生长、导致生长因子诱导的血管发生、持续需要新血管形成以使肿瘤生长超过几毫米厚的肿瘤生长、以及建立实体瘤转移瘤。
本发明的方法是有效，部分是因为该治疗法对血管发生有高度选择，并对其它生物学过程无高度选择。如实施例中所示，仅新脉管的生长含有大量的αvβ5，因此所述治疗方法不会不利地影响成熟脉管。
仅抑制αvβ5即有效地抑制血管发生的发现允许研制具有潜在高度特异性、并因此具有相对低毒性的治疗组合物。虽然本发明公开了使用具有抑制一种或多种整联蛋白能力的基于肽的试剂，但人们也可以设计更选择性地抑制αvβ5的其它试剂。因此，某些基于肽的试剂不具有抑制除由αvβ5介导之外的其它生物学过程的副作用。
例如，如本内容所示，可以制备对与αvβ5而不是αvβ1、αvβ3或αⅡbβ3免疫反应高度选择性的单克隆抗体，其对抑制αvβ5功能具相似选择性。另外，可以设计对抑制αvβ5具选择性的含RGD肽，如本文进一步描述的。
在本发明的发现之前，不知道可以通过使用拮抗αvβ5生物学功能的试剂体内抑制血管发生以及任何依赖血管发生的过程。
C．抑制血管发生的方法本发明提供在组织中抑制血管发生并由此抑制组织中依赖血管发生的事件的方法。一般而言，该方法包含给予组织包含血管发生抑制量的αvβ5拮抗剂的组合物。
用于实践本发明方法的靶组织定义为含αvβ5组织，其特征在于可检测的αvβ5整联蛋白受体的存在。换言之，通过在细胞膜中存在αvβ5受体复合物定义含αvβ5组织。这种组织包括上皮和间充质源细胞。可以通过一些方法检测该受体的存在，这些方法包括该受体与抗αvβ5整联蛋白受体抗体的免疫反应性，其中通过显微镜、免疫沉淀、配体结合检测中的竞争等等技术检测组织中的该免疫反应。以下和在实施例1中描述优选用于检测组织中αvβ5存在的抗体。例如，在实施例2中借助免疫荧光显微术描述了αvβ5在肾脏、皮肤和眼组织中的分布。
在本发明的范围内，亦将含αvβ5组织定义为具有血管发生标记的组织。如先前所述，血管发生包括种种涉及组织新血管形成的过程，该过程包括“出芽”、血管发生或脉管变大，所有的血管发生过程都由αvβ5表达介导并依赖于αvβ5表达。除了创伤伤口愈合、黄体形成和胚胎发生，据信大多数血管发生过程与疾病过程相关，因此本治疗法的应用对疾病有选择性且没有有害副作用。
有各种据信其中血管发生是重要的疾病，称为生血管性疾病，这种疾病包括但不限于诸如免疫和非免疫性炎症、慢性关节风湿病和牛皮癣的炎症性疾病、诸如再狭窄、动脉粥样硬化斑和骨质疏松中的毛细管增生的与脉管不适当或不合适侵入相关的疾病、和诸如实体瘤、实体瘤转移瘤、血管纤维瘤、晶状体后纤维形成、血管瘤、卡波西肉瘤和需要新血管形成以支持肿瘤生长的类似癌症相关的疾病。
特征为新血管形成的眼病提供了特别优选的治疗目标。眼部新血管形成是在导致灾难性视力丧失的绝大多数眼病中观察到的最常见的病理变化。从预先存在的脉络膜、视网膜或parlimbal脉管的新血管生长可以引起导致破坏眼睛正常解剖学关系和同时丧失正常视觉功能的水肿、出血或维管膜形成。
特征为血管发生的眼病包括角膜新血管疾病，它们包括角膜移植、疱疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状胬肉、与使用隐性眼镜片相关的新血管角膜翳等等。其它的眼病亦包括糖尿病性视网膜病(DR)、年龄相关的黄斑变性(ARMD)、假定的眼组织胞浆菌病(POHS)、未熟儿视网膜病(ROP)和新血管性青光眼等等。虽然抑制这些疾病中的血管发生不一定治愈根本的疾病，但它会显著地降低与这些疾病相关的视觉发病率。
例如，患有糖尿病超过25年的300,000人的90％会有某种形式的DR,DR是特征为渗漏和/或增生的血管的视网膜疾病。这些患者的30％事实上将有可以用本发明的治疗法减轻的后一种病症。对于ARDM，超过65岁的人群中的25％，即约630,000人，将会有该疾病的某种形式，预期到2030年，超过630万人将有ARDM。因此，拥有使用本发明的治疗组合物和方法抑制αvβ5相关血管发生的能力具有重大医学价值。
因此，抑制疾病组织中血管发生的方法减轻该疾病的症状，并根据疾病可以对治愈该疾病起作用。在一个实施方案中，本发明考虑在组织中抑制血管发生本身。可以通过诸如在通过免疫组织化学检测免疫αvβ5免疫阳性新生和未成熟脉管结构的实施例中描述的各种方法，评价组织中血管发生的程度和由此本发明方法达到的抑制程度。
如本文所述，任何的各种组织或由器官化组织组成的器官都可以支持在疾病状态下的血管发生，它们包括皮肤、肌肉、肠、结缔组织、关节、骨骼和在有生成血管刺激物时血管可以入侵的类似组织。
具体而言，本发明的方法和αvβ5拮抗剂组合物可以治疗性地用于抑制由生长因子(亦称为细胞因子)诱导的血管发生。在生理条件下，血管发生受高度调节，并如Brook等，Science,264:569-5761(1994)先前发表的，已显示被诸如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的特定生血管分子激活。亦已描述了血管发生的负调节剂。因此，血管发生由局部刺激剂和抑制剂的精细平衡所调节。参见，D’Amore,InvestigativeOphthal.Visual Sci.,35:3974-3979(1994)。
当严格控制正常非活动毛细血管的生血管刺激剂和抑制剂的生理平衡被扰乱时，例如在某些疾病状态发生的，毛细管内皮细胞受诱导增生、迁移并最终分化形成新血管。
如Leibovich，“细胞因子在肿瘤血管发生过程中的作用”，载于“Human Ctokines:Their Role in Disease and THerapy”，编辑Aggarwal和Puri，第35章，Blackwell Science,Inc.(1995)综述，血管发生的特征为具有一套早期事件后续一套晚期事件的事件级联。早期事件之前是传递从血管外源传送的生血管生长因子和细胞因子。然后在靶微血管系统内进行早期事件，伴随着破坏胞间连接点、诱导表达内皮细胞激活抗原和蛋白水解表现型、以及内皮细胞定向方式迁移的起始。晚期事件的特征为在发育的毛细管芽的细胞、内皮细胞、周皮细胞和平滑肌细胞内生长因子和细胞因子基因的自分泌表达和旁分泌表达。这些细胞依次调节细胞与胞外基质的相互作用，导致从现存成熟脉管形成新功能性毛细管环。
如此处和发明背景中所讨论的，文献中的报道描述了一种在生长因子(包括那些与增加αvβ5表达相关的生长因子，即VEGF、TGF-α和EGF)的出现与肿瘤质量扩增之间以及在人类和实验动物的增生性新血管疾病中血管发生的开始中的联系。
因此，在许多其它生长因子中，VEGF、EGF、TGF-α是特征为其刺激细胞生长的性质的受考虑的生长因子。生长因子是由作用于分泌细胞或另一细胞的一种细胞分泌的蛋白质。它们作用的能力取决于通常为跨膜蛋白的生长因子受体的存在。诸如VEGF的生长因子亦一般称为细胞因子，其被定义为由细胞分泌的、影响同一(自分泌)或另一(旁分泌)细胞的生长和代谢的多肽激素。术语细胞因子不限于由免疫系统细胞产生的分子和同一系统的生物学应答修饰物。因此，术语细胞因子是一广泛的类别，其基于一个类型的生物学应答的一个亚类型是诸如VEGF、bFGF、EGF、TGF-α等等的刺激性生长因子或增强子。有关综述参见，Aggarwal等，“细胞因子和细胞因子受体的常见和非常见特征综述”，载于“Human Ctokines:Their Role in Disease and THerapy”，编辑Aggarwal和Puri，第1章，Blackwell Science,Inc.(1995)。
在本发明中，考虑αvβ5特异性拮抗剂和诸如抗VEGF抗体的非生长因子拮抗剂用于抑制组织中的血管发生。在推荐实施方案中，本文描述的αvβ5拮抗剂用于抑制其中αvβ5整联蛋白受体表达被诱导的生长因子诱导的血管发生。在此方面优选的生长因子包括VEGF、EGF、TGF-α等等。
如在发明背景中讨论的，已知生长因子EGF和VEGF与其做为酪氨酸激酶起作用的细胞受体结合。另外显示该EGF受体的激活与导致激活αvβ5以使特定细胞子在玻连蛋白基底上迁移的蛋白激酶C的激活相对应。因此，暴露给细胞因子或生长因子与整联蛋白表达或激活中的协同应答之间的作用机制是一复杂的生物学过程。如本发明所示(参见实施例6A)，用细胞因子VEGF在或者兔眼模型或鸡绒毛膜尿囊模型中处理组织，导致依赖于蛋白激酶C激活的αvβ5增强的血管发生。
在一个特别推荐的实施方案中，本发明考虑使用αvβ5拮抗剂抑制其中血管发生由VEGF诱导的任何组织中的血管发生。例如，已显示在各种动物模型中的视网膜局部缺血导致从苗勒细胞分泌的VEGF向上调节，VEGF的产生必然诱导眼内组织的新血管形成。参见，Miller等，Am.J.Path.,145:574-584(1994)和Pierce等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、92:905-909(1995)。
因此，在本发明中，欲处理的组织是患有糖尿病性视网膜病、黄斑变性、新血管性青光眼或以上讨论的等等疾病的患者的视网膜组织，而欲抑制的血管发生是其中有视网膜组织新血管形成的视网膜组织血管发生。以上和在实施例中讨论了来自患有眼新血管形成病症或疾病病人的典型组织，包括角膜组织。评价本发明的αvβ5拮抗剂治疗视网膜血管发生效果的典型模型系统，是在实施例9中描述的视网膜新血管形成的鼠模型。
在另一相关实施方案中，欲处理的组织是炎症组织，并且欲抑制的血管发生是有炎症组织新血管形成的炎症组织新血管形成。在这一类中，该方法考虑了在诸如患有慢性关节风湿病的关节炎组织中、在免疫或非免疫性炎症组织中、在牛皮癣组织等等之中抑制血管发生。
根据在内皮细胞上粘连分子表达的诱导和酶的释放，认为细胞因子白介素1和肿瘤坏死因子-α与类风湿性关节炎相关，在关节损伤中起直接作用。参见，Arend等，Arthritis & Rheumatism,38:151-160(1995)。已提出用细胞因子特异性抑制剂阻断这两种细胞因子以及导向在该病症中表达的细胞粘连分子的治疗制度。参见，Haskard等，Cell AdhesionComm.,2:235-238(1994)。
因此，通过使该治疗法针对(address)并导向该αvβ5粘连分子的涉及的事物而抑制关节炎病症中的血管发生，是在本发明之前的发明的另一推荐实施方案。
在另一相关实施方案中，欲处理的组织是患有实体瘤、转移瘤、皮肤癌、乳腺癌、血管瘤或血管纤维瘤等等癌症的患者的肿瘤组织，并且欲抑制的血管发生是有肿瘤组织新血管形成的肿瘤组织血管发生。可以通过本方法治疗的典型的实体瘤组织包括肺、胰脏、乳腺、结肠、喉、卵巢等等组织。
在人类实体瘤中存在的复杂细胞因子网络的作用是Leek等，J.Leukocyte Biol.,56:423-435(1994)综述的主题，其内容通过引用结合到本文中。据认为一些细胞因子包括VEGF、酸性和碱性FGF(bFGF)、TGF-α和TGF-β、EGF、TNF-α、血小板源内皮细胞生长因子、血管生成素、干扰素α和γ、白介素1、6和8等等影响恶性组织和细胞系中血管发生的各种细胞机制。例如，除了VEGF在各种肿瘤定位之外，近来显示VEGF与乳腺癌中的血管发生有关，如Brown等Human Path.,26:86-91(1995)所述。
通过用抗细胞因子抗体筛选肿瘤组织样品，可以鉴别分泌各种细胞因子并因此诱导应答中的局部血管发生的肿瘤，特别是在本发明中具有细胞因子VEGF、TGF-α和EGF以及产生的αvβ5介导的血管发生的肿瘤。本领域一般技术人员对于这种方法用于或者培养的或者活检肿瘤组织样品是熟悉的。抗上述细胞因子的抗体可以通过OncogeneSciences(Uniondale,NY)或Upstate Biotech Incorporated(Lake Placid,NY)购得。因此通过这些方法筛选选择的肿瘤组织，使得人们可以评价用本发明αvβ5拮抗剂的血管发生抑制性活性的潜力。
在实施例中描述了典型的肿瘤组织血管发生及其抑制。
由于新血管形成在肿瘤生长中的重要作用，抑制肿瘤组织血管发生是本发明的再一推荐实施方案。缺乏肿瘤组织新血管形成时，该肿瘤组织不会得到需要的营养、生长缓慢、停止额外的生长、退化并最终变为坏死导致杀死该肿瘤。
换言之，本发明提供通过按照本方法抑制肿瘤血管发生而抑制肿瘤新血管形成的方法。类似地，本发明提供通过实践所述血管发生抑制方法而抑制肿瘤生长的方法。
所述方法亦对转移瘤形成特别有效，因为(1)它们的形成需要原发性肿瘤的血管形成，以使转移性癌症细胞可以逸出该原发性肿瘤，和(2)它们在第二位点的建立需要新血管形成以支持该转移瘤的生长。在相关实施方案中，本发明考虑与其它诸如针对实体瘤和用于控制转移瘤建立的常规化疗的治疗法联合实践该方法。血管发生抑制剂的给予通常在化疗期间或之后进行，尽管最好在化疗制度后，在该肿瘤组织通过诱导血管发生以通过对该肿瘤组织提供血液供应和营养而恢复而对该毒性攻击应答时抑制血管发生。另外，最好在切除实体瘤的手术后给予该血管发生抑制方法，做为对抗转移瘤的预防。
在本方法用于抑制肿瘤新血管形成的范围内，该方法亦可以用于抑制肿瘤组织生长、抑制肿瘤转移瘤形成以及使已建立的肿瘤退化。对于后者，如对用于本发明中所述的或在兔眼检测模型中或用嵌合小鼠人模型的模型系统评价肿瘤质量的减小，在该小鼠人模型系统中将患有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠的皮肤用人新生儿包皮取代，如Yan等，J.Clin.Invest.,91:986-996(1993)所述，其公开内容通过引用结合到本文中。后一模型提供了研究血管发生和用本发明的方法抑制其的另一体内模型。在实施例5C和6D中提出了使用该兔肿瘤模型和本发明的αvβ5拮抗剂的典型结果，在实施例8中描述了在SCD小鼠模型中抑制血管发生的结果。
再狭窄是阻碍血管成形术成功的、在经皮经腔冠状血管成形术位点平滑肌细胞(SMC)迁移和增殖的过程。可以将再狭窄过程中的SMC迁移和增殖考虑为由本方法抑制的血管发生过程。因此，本发明亦考虑通过按照本方法于血管成形术之后在患者中抑制血管发生，抑制再狭窄。为抑制再狭窄，通常将αvβ5拮抗剂于血管成形术程序后给予约2至约28天，更通常是在该程序后的约头14天给予。
在本发明的许多实施方案中，治疗的患者最好是人类患者，尽管应理解本发明的原理表明本发明对所有的哺乳动物均有效，所有的哺乳动物都包括于术语“患者”中。在此范围内，将哺乳动物理解为包括寻求按照本发明的方法治疗疾病的任何哺乳动物物种，特别是农业和家养哺乳动物物种。
抑制组织中血管发生的本方法以及因此也实践治疗血管发生相关疾病的方法，包括用包含治疗有效量的可以抑制αvβ5与其天然配体结合的αvβ5拮抗剂的组合物接触其中发生或有风险发生血管发生的组织。因此，该方法包含给予患者治疗有效量的含有本发明的αvβ5拮抗剂的生理上可耐受的组合物。
给予该αvβ5拮抗剂的剂量范围取决于该拮抗剂的形式及其效力，如本文进一步描述的，该剂量范围的量大到足以产生其中血管发生和由血管发生介导的疾病症状被减轻所需的效果。该剂量不应大至引起不良副作用，例如高粘滞性综合症、肺水肿、充血性心力衰竭等等。一般而言，该剂量根据病人的年龄、病症、性别和疾病程度变化，并可以由本领域技术人员确定。亦可以由医生在有任何并发症时调整该剂量。
αvβ5拮抗剂是通过抑制该受体与其配体即玻连蛋白的结合活性阻断或抑制αvβ5的生理或药理活性的分子。优选的αvβ5拮抗剂可以或者是单克隆抗体、肽或者是αvβ5配体模拟物的有机基分子。
治疗有效量是足以在被处理的组织中产生可测量的血管发生抑制的αvβ5拮抗剂量，即血管发生抑制量。可以如本文所述，通过免疫组织化学或本领域技术人员已知的其它方法原位测定血管发生的抑制。
就αvβ5拮抗剂可以采取αvβ5配体有机模拟物、含RGD肽、抗αvβ5单克隆抗体或其片段、或αvβ5受体模拟物的形式所及的范围内，应理解其效力和因此的“治疗有效”量的表达可以变化。但是，如本检测方法所示，本领域技术人员可以容易地评价本发明的候选αvβ5拮抗剂的效力。
可以通过包括在CAM检测中、在体内兔眼检测中抑制血管发生和通过天然配体与αvβ5结合的抑制等在本文中描述的以及诸如此类的检测的各种方法测定αvβ5拮抗剂的效力。
优选的αvβ5拮抗剂具有在拮抗剂浓度低于0.5微摩尔浓度(μM)、优选地低于0.1μM、更优选地低于0.05μM时，大体上抑制诸如玻连蛋白的天然配体与αvβ5在溶液中结合的能力。“大体上”指在存在该αvβ5拮抗剂时，观察到通过抑制使玻连蛋白的结合减少至少50％，本文将50％抑制称为IC50值。
更优选的αvβ5拮抗剂表现出对αvβ5超出其它整联蛋白的选择性。因此，优选的αvβ5拮抗剂大体上抑制玻连蛋白与αvβ5结合，但大体上不抑制玻连蛋白与诸如αvβⅠ、αvβ3或αⅡbβ3的另一整联蛋白的结合。特别优选的是与抑制玻连蛋白与另一整联蛋白结合时的IC50活性相比，在抑制玻连蛋白与αvβ5结合时表现出IC50活性低10倍至100倍的αvβ5拮抗剂。在实施例中描述了测定抑制玻连蛋白与整联蛋白结合的IC50活性的典型检测。
单克隆抗体形式的本发明αvβ5拮抗剂治疗有效量的量，通常使得当以生理上可耐受组合物给予时足以达到的血浆浓度为从约0.01微克(μg)/毫升(ml)至约100μg/ml，优选从约1μg/ml至约5μg/ml，通常为约5μg/ml。换言之，该剂量可以变化，从约0.1mg/kg至约300mg/kg，优选从约0.2mg/kg至约200mg/kg，更优选从约0.5mg/kg至约20mg/kg，每天给予一个或多个剂量，给予一天或几天。
当该拮抗剂采取单克隆抗体的片段形式时，可以根据相对于完整抗体质量的该片段的质量容易地调整该量。推荐的血浆摩尔浓度是从约2微摩尔浓度(μM)至约5毫摩尔浓度(mM)，优选地为约100μM至1mM抗体拮抗剂。
多肽或其它类似大小的小分子αvβ5配体模拟物形式的本发明αvβ5拮抗剂，其治疗有效量的多肽量通常使得当以生理上可耐受组合物给予时足以达到的血浆浓度为从约0.1微克(μg)/毫升(ml)至约200μg/ml、优选从约1μg/ml至约150μg/ml。基于质量为每摩尔约500克的多肽，优选的血浆摩尔浓度是从约2微摩尔浓度(μM)至约5毫摩尔浓度(mM)，优选地为约100μM至1mM多肽拮抗剂。换言之，按照体重的剂量可以变化，从约0.1mg/kg至约300mg/kg，优选从约0.2mg/kg至约200mg/kg，每天给予一个或多个剂量，给予一天或几天。
本发明的单克隆抗体、多肽或有机模拟物可以通过注射或通过长时间(over time)逐渐输注非肠道地给予。尽管欲处理的组织通常可以通过系统给予在体内被接触，并因此最常通过静脉内给予治疗组合物治疗，但考虑了当有可能该被导向的组织含有靶分子的其它组织和传递方法。因此，本发明的单克隆抗体、多肽或有机模拟物可以眼内、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、透皮给予，亦可以通过蠕动(peristaltic)方法传递。
含有本发明的αvβ5拮抗剂的治疗组合物常规静脉内给予，例如通过注射一个单位剂量。术语“单位剂量”当关系到本发明的治疗组合物使用时，指适于做为受治疗者单位剂量的物理上独立的单位，每单位含有预定量的计算用以产生目的治疗效果的、与所需稀释剂(即溶媒)或载体联用的活性物质。
在示于实施例中的一个推荐实施方案中，以单剂量静脉内给予该αvβ5拮抗剂。
以与剂量制剂相匹配的方式和治疗有效量给予所述组合物。给予的量和给予的时间取决于欲治疗的受治疗者、受治疗者的系统利用该活性成分的能力、和目的治疗效果的程度。所需给予的活性成分的精确量取决于医生的判断，并对每个人都是特别的。不过，本文公开了系统应用的合适剂量范围并取决于给药途径。给药的适当制度亦可变化，但通常为首次给予后，通过后续注射或其它给予以1小时或几个小时的间隔给予重复剂量。或者，考虑了足以保持体内治疗法规定的血液浓度范围的连续静脉内输注。
D.治疗组合物本发明考虑了用于实践本文描述的治疗方法的治疗组合物。本发明的治疗组合物含有生理上可耐受的载体以及本文描述的、溶解于或分散于该载体中做为活性成分的αvβ5拮抗剂。在推荐实施方案中，当给予哺乳动物或人类患者用于治疗目的时，该治疗性αvβ5拮抗剂组合物不具免疫原性。
本文使用的术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”以及其语法变化，当其指组合物、载体、稀释剂和试剂时可以互换使用，并表示所述物质可以给予哺乳动物，或给予时不会产生不良的生理效果，例如恶心、头晕、胃不适等等。
含有溶解于或分散于其中的活性成分的药用组合物的制备是本领域非常清楚的，并且不需要基于配方而限制。通常这种组合物做为或者液体溶液或者悬浮液的注射剂制备，但是，亦可以制备适于在使用前在液体中的溶液或悬浮液的固体形式。该制剂亦可以乳化。
该活性成分可以与药学上可接受的和与该活性成分匹配的赋形剂混合，并且其量适于在本文描述的治疗方法中使用。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或诸如此类的及其组合。另外，如果需要，该组合物可以含有少量增强该活性成分效力的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓中剂等等。
本发明的治疗组合物可以包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与例如盐酸或磷酸无机酸或诸如乙酸、酒石酸、苯乙醇酸等等的有机酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成的)。亦可以从无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁以及有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等衍生与游离羧基形成的盐。
当用于制备环状多肽αvβ5拮抗剂时，特别推荐盐酸盐。
生理上可耐受的载体是本领域众所周知的。典型的液体载体是除了该活性成分和水之外不含任何物质的、或含有缓冲液的无菌水溶液，诸如含有生理pH值下的磷酸钠、生理盐水或含有这两者的无菌水溶液，诸如磷酸缓冲盐水。而且，水性载体可以含有超过一种缓冲盐以及诸如氯化钠和氯化钾的盐、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶质。
液体组合物亦可以含有除水外的液相和不包含水的液相。这种其它液相的典型是甘油、诸如棉籽油的植物油和水-油乳液。
治疗组合物含有血管发生抑制量的本发明的αvβ5拮抗剂，通常配制为含有占总治疗组合物重量的至少0.1％(重量)量的拮抗剂。重量百分比是抑制剂与总组合物的重量比例。因此，例如0.1％(重量)是每100克总组合物0.1克抑制剂。
E整联蛋白αvβ5的拮抗剂αvβ5拮抗剂用于本方法以抑制组织中的血管发生，并可以采取各种形式，所述形式包括以使得与天然αvβ5配体的功能性相互作用受到干扰的方式与αvβ5相互作用的化合物。典型的拮抗剂包括衍生自αvβ5上的配体结合位点的αvβ5类似物或模拟物、模拟参与αvβ5-配体结合相互作用的结构区的αvβ5天然配体模拟物、具有对应于αvβ5特异性天然配体的功能结合域、特别是对应于αvβ5天然配体的含RGD域的序列的多肽、和与或者αvβ5或者天然配体免疫反应的抗体，它们均表现出本文定义的拮抗剂活性。
1．多肽在一个实施方案中，本发明考虑了多肽形式的αvβ5拮抗剂。多肽(肽)αvβ5拮抗剂可以在参与αvβ5-配体相互作用的区具有或者αvβ5天然配体或者αvβ5自身的序列特征，并且表现出本文描述的αvβ5拮抗剂活性。优选的αvβ5拮抗剂肽含有RGD三肽，并在该含RGD区中在序列上对应于天然配体。
优选的含RGD多肽的序列对应于诸如其序列是众所周知的玻连蛋白的αvβ5天然配体的含RGD区的氨基酸残基序列。
如先前所述，与其它整联蛋白相比，特别优选的αvβ5拮抗剂肽优先抑制αvβ5与其天然配体的结合。这些αvβ5特异性肽是特别优选的，至少是因为对αvβ5的特异性降低了诸如抑制其它整联蛋白的不良副作用的发生率。可以在诸如实施例中描述的ELISA检测的典型的结合抑制检测中，容易地鉴别优选的具有对αvβ5选择性的αvβ5拮抗剂肽的身份。
本发明的多肽通常包含不超过约100个氨基酸残基、优选地不超过约60个残基、更优选地不超过约30个残基。肽可以是线性或环状，尽管特别优选的肽是环状。在实施例中描述了优选的肽。
当该多肽超过100个残基时，如本文所述，通常以融合蛋白或蛋白片段的形式提供。
应理解，主题多肽不需要与αvβ5天然配体的氨基酸残基序列相同，只要它包括对拮抗αvβ5配体与αvβ5结合必需的序列并且可以在诸如本文描述的那些检测中做为αvβ5拮抗剂起作用。
主题多肽包括其氨基酸残基序列示于本文的多肽的任何类似物、片段或化学衍生物，只要该多肽是αvβ5拮抗剂。因此，对本多肽可以进行各种改变、置换、插入和缺失，这里这种改变对其使用提供某种优点。在此方面，本发明的αvβ5拮抗剂多肽相当于而不是等同于列举的肽的序列，其中制造了一个或多个变化并且其保留在本文定义的一个或多个检测中做为αvβ5拮抗剂起作用的能力。
因此，多肽可以采取肽衍生物的各种形式的任何形式，包括酰胺、与蛋白的缀合物、环状肽、多聚化肽、类似物、片段、化学修饰肽等等衍生物。
术语“类似物”包括其氨基酸残基序列与本文具体所示的序列大体上相同的任何多肽，其中一个或多个残基已被功能类似的残基保守置换并且展示本文描述的αvβ5拮抗剂活性。保守置换的实例包括诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的一个非极性(疏水性)残基置换另一非极性残基；诸如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、甘氨酸与丝氨酸之间一个极性(亲水性)残基置换另一个残基、一个碱性残基诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸置换另一碱性残基、或诸如天冬氨酸或谷氨酸的一个酸性残基置换另一酸性残基。
短语“保守置换”亦包括使用化学衍生的残基代替非衍生的残基，只要这种多肽展示必要的抑制活性。
“化学衍生”指主题多肽具有一个或多个通过侧链官能团反应化学衍生的残基。除了侧链基团衍生，化学衍生物可以具有一个或多个主链修饰，包括诸如N-甲基、N-乙基、N-丙基等等的α-氨基取代；诸如硫酯、硫代酰胺、胍基等等的α-羰基取代。这种衍生分子包括例如那些其中游离氨基已被衍生形成盐酸胺、对甲苯磺酰基、苄酯基、叔丁酯基、氯乙酰基或甲酰基的分子。游离羧基可以被衍生形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离羟基可以被衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以被衍生形成N-im-苄基组氨酸(N-im-benzylhistidine)。做为化学衍生物亦包括的是那些含有一个或多个20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如4-羟脯氨酸可以置换脯氨酸；5-羟赖氨酸可以置换赖氨酸；3-甲基组氨酸可以置换组氨酸；高丝氨酸可以置换丝氨酸；和鸟氨酸可以置换赖氨酸。本发明的多肽亦包括具有相对于本文所示序列的多肽序列的一个或多个残基添加和/或缺失的任何多肽，只要保持必要的活性。
特别优选的衍生物是按照分子式环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMe Val)简写为c(RGDf-NMeV)的环状肽，其中在该肽的缬氨酸残基上有一个N-甲基取代的α-氨基，并且环化将该肽的伯氨基和羧基末端连接起来。
术语“片段”指具有的氨基酸残基序列短于其氨基酸残基序列示于本文的多肽的氨基酸残基序列的任何主题多肽。
当本发明的多肽具有的序列与αvβ5天然配体序列不同时，通常是因为已进行了一个或多个保守或非保守置换，通常不超过30数量百分比，并且优选地不超过氨基酸残基数量的10％被置换。亦可以在多肽的任一端添加额外的残基以提供“接头”，通过“接头”可以将本发明的多肽方便地添加至标记或固体基质或载体。
在以下描述了可以与本发明的多肽一起使用的标记、固体基质和载体。
氨基酸残基接头一般至少为一个残基，并可以为40或更多个残基，更常见为1-10个残基，但不形成αvβ5配体表位。用于连接的典型的氨基酸残基包括酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸或诸如此类的。另外，主题多肽除了另外具体说明之外，可以由于序列被修饰而与αvβ5配体的天然序列不同，这种修饰通过末端NH2酰化作用，例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化、通过末端羧基酰胺化，例如用氨、甲胺等等的末端修饰进行。如众所周知的，末端修饰可以用于降低对蛋白酶消化的易感性，并因此延长该多肽在溶液中、特别是可能存在蛋白酶的生物体液中的半衰期。在此方面，因为环化形成稳定结构以及观察到本文描述的环状肽的生物学活性，多肽环化亦是有用的修饰，并且亦是特别优选的。
本发明的任何肽均可以以药学上可接受的盐的形式使用。可以与本发明的肽形成盐的合适的酸包括无机酸，诸如三氟乙酸(TFA)、盐酸(HCl)、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、甲磺酸、乙酸、phosphoricacetic acid、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸或诸如此类的。特别优选HCl盐。
可以与本发明的肽形成盐的合适的碱包括诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等等的无机碱；和诸如单、双和三烷基和芳基胺(例如三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺等等)和可选取代的乙醇胺(例如乙醇胺、二乙醇胺等等)的有机碱。
另外，可以如实施例中所述制备不包括游离离子盐本发明的肽，其中存在于氨基酸残基侧链基团(例如Arg、Asp等等)的带电荷酸或碱基团相互结合，并中和形成“内盐”化合物。
可以通过多肽领域技术人员已知的任何技术包括重组DNA技术，合成亦称为主题多肽的本发明的肽。因为纯度、抗原特异性、不含不需要的副产物、生产容易等等原因，优选诸如固相Merrifield型合成的合成化学技术。许多可利用的技术的优秀的概括可以参考Steward等，“Solid Phase Peptide Synthesis”,W.H.Freeman Co.,San Francisco,1969；Bodanszky，等，“Peptide Synthesis”,John Wiley & Sons，第二版，1976；J.Meienhofer,“Hormonal Proteins and Peptides”，第2卷，第46页，Academic Press(纽约)，1983；Merrifield,Adv.Enzymol.,32:221-96,1969；Fields等，Int.J.Peptide Protein Res.,35:161-214,1990；和有关固相肽合成的美国专利4,244,946和有关经典溶液合成的Schroder等，“ThePeptides”，第1卷，Acadmeic Press(纽约)，1965，它们均通过引用结合到本文中。在上述文献中描述了可用于这种合成的适当的保护基团并描述于J.F.W.McOmie,“Protective Groups in Organic Chemistry”,Plenum Press，纽约，1973，该文献通过引用结合到本文中。
一般而言，所考虑的固相合成方法包含向一生长中的肽链顺序添加一种或多种氨基酸残基或适当保护的氨基酸残基。正常情况下，第一个氨基酸残基的或者氨基或者羧基由合适的、选择性可除去的保护基团保护。利用一个不同的选择性可除去的保护基团用于含有反应性侧链基团的氨基酸，例如赖氨酸。
用固相合成做为典型，将受保护的或衍生的氨基酸通过其未保护羧基或氨基连接至惰性固相支持体。然后选择性地除去该氨基或羧基的保护基团，并在适于形成酰胺键的条件下将具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中的下一个氨基酸与已连接至该固相支持体的残基混合和反应。然后从该新加入的氨基酸残基除去氨基或羧基的保护基团，然后加入下一个氨基酸(适当保护)并如此继续。所有需要的氨基酸已按正确序列连接后，顺序或同时除去任何存留的末端和侧链基团保护基团(和固相支持体)，以提供最终线性多肽。
可以使例如如上述得到的线性多肽反应，形成其相应的环状肽。Zimmer等，Peptides 1992，第393-394页，ESCOM Science Publishers,B.V.,1993描述了制备环状肽的典型方法。通常，将叔丁酯基保护的肽甲酯溶解于甲醇中，加入氢氧化钠溶液，并将该混合物于20℃(20C)反应以水解除去该甲酯保护基团。将溶剂蒸发后，用乙酸乙酯从酸化的水性溶剂萃取该叔丁酯基保护的肽。然后于温和酸性条件下，在二氧杂环己烷共溶剂中除去该叔丁酯基保护基团。通过在存在1-羟基苯并三唑和N-甲基吗啉的情况下，将该线性肽的稀释溶液与二环己基碳二亚胺在二氯甲烷和二甲基甲酰胺的混合物中反应，将如此得到的具有游离氨基和羧基末端的未保护的线性肽转化成为其相应的环状肽。然后通过层析纯化得到的环状肽。
Gurrath等，Eur.J.Biochem.,210:911-921(1992)描述了环状肽合成的替代方法，在实施例中有描述。
另外，可以以融合蛋白的形式提供该αvβ5拮抗剂。融合蛋白是通过本文描述的重组DNA方法产生的蛋白，其中该主题多肽做为与诸如谷胱甘肽巯基转移酶(GST)或其它众所周知的载体的第二个载体蛋白的融合物表达。优选的融合蛋白包含本文描述的MMP-2多肽。在实施例中描述了MMP-2融合蛋白的制备。
在实施例中描述了用于本方法在主要表现出αvβ5相关的血管发生的组织中的特别优选的肽或衍生肽，它们包括示于SEQ ID NO 4、6、7、8和9的多肽。
亦优选源自本文描述的MMP-2的多肽，它具有示于SEQ IDNo:11-22的序列。
2．单克隆抗体本发明在一个实施方案中描述了单克隆抗体形式的αvβ5拮抗剂，如本文所述该抗体与αvβ5免疫反应，并抑制αvβ5与其天然配体结合。本发明亦描述产生所述抗体的细胞系、产生所述细胞系的方法和产生单克隆抗体的方法。
本发明的单克隆抗体包含抗体分子，该抗体分子1)与分离的αvβ5免疫反应，和2)抑制玻连蛋白与αvβ55结合。优选的优先与αvβ5结合的单克隆抗体包括具有mAb P1F6和mAb P5H9的免疫反应特征的单克隆抗体，在实施例中对其进行了描述。
本文使用各种语法形式的术语“抗体或抗体分子”做为指免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即含有抗体结合位点或互补位的分子)群的集合名词。
“抗体结合位点”是由特异性结合抗原的重链和轻链可变区和超可变区组成的抗体分子的结构部分。
用于本发明的典型抗体是完整的免疫球蛋白分子、大体上完整的免疫球蛋白分子和含有互补位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域称为Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)的那些部分，这些部分亦称为抗体片段。
在另一推荐实施方案中，本发明考虑包含源自本发明单克隆抗体的Fab片段的截短的免疫球蛋白分子。该缺失Fc受体的Fab片段是可溶性的，并提供在血清半衰期方面的治疗优点和在使用该可溶性Fab片段模式方面的诊断优点。可溶性Fab片段的制备是免疫学领域一般已知的，并可以通过各种方法完成。
例如，通过众所周知的方法通过分别用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对大体上完整抗体进行蛋白水解反应，制备抗体的Fab和F(ab’)2部分(片段)。参见例如授予Theofilopolous和Dixon的美国专利4,342,566号。Fab’抗体部分亦是众所周知的，从F(ab’)2部分产生，接着通过用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键、并接着用诸如碘乙酰胺的试剂烷基化产生的蛋白硫醇。优选含有完整免疫球蛋白分子的抗体并如本文描述的加以使用。
各种语法形式的短语“单克隆抗体”指仅含有一种抗体结合位点、可以与一特定表位免疫反应的抗体分子群。因此单克隆抗体通常展示与其免疫反应的任何表位的单一结合亲和性。因此，单克隆抗体可以含有具有许多抗体结合位点的抗体分子，每个位点对不同表位有免疫特异性，例如双特异性单克隆抗体。
单克隆抗体通常由称为杂交瘤的单细胞克隆产生的抗体组成，该杂交瘤仅分泌(产生)一种抗体分子。通过融合抗体产生细胞和骨髓瘤细胞或其它自持细胞系，形成该杂交瘤细胞。这种抗体的制备首先由Kohler和Milstein,Nature,256:495-497(1975)描述，该文献的描述通过引用结合到本文中。其它的方法由Zola,Monoclonal Antibodies:AManual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987)描述。然后可以就与αvβ5免疫反应的抗体分子的存在和抑制αvβ5与天然配体结合方面筛选如此制备的杂交瘤上清液。
简言之，为形成产生该单克隆抗体组合物的杂交瘤，将骨髓瘤或其它自持细胞系与从用αvβ5源超免疫的哺乳动物脾脏得到的淋巴细胞融合。
用于制备杂交瘤的骨髓瘤细胞系优选来自与该淋巴细胞相同的物种。通常，129 GlX+品系小鼠是优选的哺乳动物。用于本发明的合适的骨髓瘤包括次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷-敏感型(HAT)细胞系P3X63-Ag8.653和Sp2/0-Ag14，它们可以从美国典型培养物保藏中心，Rockville,MD分别以CRL 1580和CRL 1581的名称得到。
通常用聚乙二醇(PEG)1500将脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过对HAT的敏感性选择融合的杂种。采用酶联免疫吸附检测(ELISA)鉴别产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤，在实施例中描述了ELISA的变化。
亦可以通过起始包含含有分泌恰当特异性抗体分子的杂交瘤的营养培养基的单克隆杂交瘤培养物，产生本发明的单克隆抗体。在足以使该杂交瘤将抗体分子分泌入培养基的条件和时间内保持该培养物。然后收集含有抗体的培养基。然后可以通过众所周知的技术进一步分离所述抗体分子。
用于制备这些组合物的培养基是本领域众所周知的并可以购得，包括合成培养基、近交小鼠等等。典型的合成培养基是添加了4.5gm/l葡萄糖、20mM谷氨酰胺和20％胎牛血清的Dulbecco基本必需培养基(DMEM；Dulbecco等，Virol.,8:396,1959)。典型的近交小鼠品系是Balb/c。
产生单克隆抗体、杂交瘤细胞或杂交瘤细胞培养物的其它方法亦是众所周知的。参见，例如，Sastry，等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:5728-5732(1989)和Huse等，Science,246:1275-1281(1989)描述的从免疫学所有组成部分分离单克隆抗体的方法。
本发明亦考虑的是杂交瘤细胞、含有产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞的培养物。特别优选的是分泌单克隆抗体mAb P1F6和mAbP5H9的杂交瘤细胞系，在实施例中描述了其制备。
本发明在一个实施方案中考虑了具有mAb P1F6或mAb P5H9的免疫反应特性的单克隆抗体。
不需要过度实验，亦有可能确定单克隆抗体是否具有与本发明的单克隆抗体相同(即，相等)的特异性(免疫反应特性)，即通过确定前者是否防止后者与预选择的靶分子结合来确定。如果被测试的单克隆抗体与本发明的单克隆抗体竞争，如本发明的单克隆抗体在用于与处于固相的靶分子结合的标准竞争检测中的结合下降所示的，则有可能这两个单克隆抗体与同一表位或密切相关的表位结合。
确定单克隆抗体是否具有本发明单克隆抗体的特异性的再一方法是，用与其正常反应的靶分子预温育本发明的单克隆抗体，然后加入测试的单克隆抗体，以确定被测试的单克隆抗体是否在其与该靶分子结合的能力方面受抑制。如果被测试的单克隆抗体受抑制，则它多半具有与本发明的单克隆抗体相同或功能相等的表位特异性。
确定单克隆抗体是否具有本发明单克隆抗体的特异性的另一方法是，测定所研究的抗体的CDR区的氨基酸残基序列。在其CDR区中具有相等或功能相同氨基酸残基序列的抗体分子具有同样的结合特异性。多肽测序的方法是本领域众所周知的。
由抗体与其免疫反应的表位定义抗体的免疫特异性、其靶分子结合能力和抗体对该表位展示的伴随的亲和性。该表位的特异性至少部分由抗体免疫球蛋白重链可变区的氨基酸残基序列限定，部分由轻链可变区氨基酸残基序列限定。
使用术语“具有结合特异性”表明相当的单克隆抗体展示同样或类似的免疫反应(结合)特性，并竞争结合预选择的靶分子。
人化单克隆抗体提供超出鼠单克隆抗体的特别的优点，特别是因为它们可以在人类中用于治疗。具体而言，人抗体不会象“异源”抗原那样快速从循环中清除。另外，人抗体不会以异源抗原和异源抗体的同样方式激活免疫系统。制备“人化”抗体的方法一般是本领域众所周知的，并可以容易地应用于本发明的抗体。
因此，本发明在一个实施方案中考虑通过移植导入人类免疫系统的组分而大体上不影响该抗体结合抗原能力人化的本发明的单克隆抗体。
3．αvβ5特异性模拟物本发明证实αvβ5拮抗剂一般可以用于本发明，所述拮抗剂可以包括多肽、抗体和命名为“模拟物”、具有干扰αvβ5功能能力的其它分子。特别优选的是特异性干扰αvβ5功能但不干扰其它整联蛋白功能的拮抗剂。
在此范围内，应理解各种试剂可以适于用于本方法中，只要这些试剂具有必要的生物学活性。这些试剂一般称为模拟物，因为它们通过阻断受体中配体结合域并因此干扰(即，抑制)正常功能，具有“模拟”参与该受体功能性相互作用的αvβ5配体的能力。在一替代实施方案中，αvβ5拮抗剂可以是该受体的模拟物，而不是其配体。
模拟物是除了抗体或配体源肽之外的、表现上述特性的任何分子。它可以是合成肽、肽的类似物或衍生物、诸如有机模拟分子的形状象上述结合域的结合口袋的化合物或其它分子。
优选的本发明模拟物是基于有机的分子，并因此称为有机模拟物。特别优选的通过做为αvβ5配体模拟物而做为αvβ5拮抗剂起作用的有机模拟物是描述于实施例10中的化合物7、9、10、12、14、15、16、17和18。
可以通过本领域已知的药物设计的各种结构分析方法的任一种进行αvβ5模拟物的设计，所述方法包括制作分子模型、二维核磁共振(2-D NMR)分析、X射线晶体学、肽随机筛选、肽类似物或其它化学聚合物或化合物文库等等药物设计方法学。
在本说明书中呈现的广泛结构证据显示αvβ5拮抗剂可以是融合多肽(例如，MMP-2融合蛋白)、小多肽、环形肽、衍生化肽、有机模仿分子或单克隆抗体，它们是共享选择性抑制αvβ5功能特性的各种各样不同的化学结构，以所述结构证据的观点来看，可以用于本方法的主题αvβ5拮抗剂的结构不需要如此限制，但包括本文定义的任何αvβ5模仿物。
F．鉴别αvβ5拮抗剂的方法本发明亦描述鉴别按照本方法使用的候选αvβ5拮抗剂的检测方法。在这些检测方法中，评价候选分子抑制αvβ5与其天然配体结合的效力，并评价其抑制组织中血管发生的效力。
第一种检测测定鸡尿囊绒膜(CAM)中的血管发生，并被称为CAM检测。CAM检测已由其它作者详细描述，并被进一步用于测定肿瘤组织的血管发生和新血管形成。参见Auspmnk等，Am.J.Pathol.,79:597-618(1975)和Ossonski等，Cancer Res.,40:2300-2309(1980)。
CAM检测是广泛认可的体内血管发生的检测模型，因为发生了整个组织的新血管形成。实际的鸡胚血管生长进入CAM，或生长进入在CAM上生长的组织。
如本文所证实的，CAM检测基于新血管生长的量和程度描绘了新血管形成的抑制。另外，容易的是监视移植到CAM上的任何组织的生长，例如肿瘤组织。最后，因为在该检测系统中有内部毒性对照，该检测特别有用。将鸡胚暴露给任何检测试剂。照这样，该胚胎的健康是毒性的指标。
测定血管发生的第二个检测是体内兔眼模型，并称为兔眼检测。兔眼检测已由其它作者详细描述，并被进一步用于存在诸如沙利度胺的生血管抑制剂时检测血管发生和新血管形成。参见D’Amato等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:4082-4085(1994)。
兔眼检测是广泛认可的体内血管发生的检测模型，因为以从角膜边缘向角膜内生长的兔血管为例证，新血管形成过程可以容易地通过眼睛的天然透明的角膜观察。另外，可以容易地随时间监视新血管形成的刺激或抑制的程度和量或新血管形成的退化。
最后，将兔暴露给任何检测试剂，照这样，兔子的健康是该检测试剂的毒性指标。
在实施例中详细描述了测定天然配体玻连蛋白与αvβ5直接结合抑制的第三种检测和优选实施方案。该检测通常通过ELISA测定诸如玻连蛋白的天然配体与固相中的分离αvβ5结合抑制的程度，该抑制是由αvβ5特异性抑制所介导。
因此，该检测亦可以用于鉴别展示对αvβ5的特异性并且不抑制天然配体与其它整联蛋白结合的化合物。通过进行平行ELISA检测检测该特异性，其中在分离的检测室中，就对天然配体的结合能力和候选化合物抑制整联蛋白结合预选择配体的相对能力同时筛选αvβ5和其它整联蛋白。在实施例中描述了优选的筛选检测形式。
G．产品本发明亦考虑了产品，该产品是提供本发明的αvβ5拮抗剂的贴有标签的容器。产品包含包装材料和包含于该包装材料内的药物。
在产品中的药物是本发明的任一αvβ5拮抗剂，将其按照本公开的说明配制成如本文所述药学上可接受的形式。该产品含有足以用于治疗本文指明的病症的量或者单剂量或者多剂量量的药物。
该包装材料包含表明其中说明的该药物用途的标签，例如，用于由抑制血管发生协助治疗病症或本文公开的其它病症。该标签可以再包括用法说明和市场销售必需的相关信息。该包装材料可以包括储存该药物的容器。
本文使用的术语包装材料指诸如玻璃、塑料、纸、铝箔等等可以以固定工具内保持药物的材料。因此，例如，该包装材料可以是塑料或玻璃西林瓶、层压封袋等等用于包含包括该药物药用组合物的容器。
在推荐实施方案中，该包装材料包括是明确表达的标签，其描述了该产品的内容和其包含的药物的用途。实施例与本发明相关的以下实施例是描述性的，不应视为具体限制本发明。另外，认为在本领域技术人员技术范围内的现在已知的或后来开发的本发明的变化属于本发明要求保护的范围。1．制备αvβ5特异性单克隆抗体如Wayner等，J.Cell Biol.,113:919-929(1991)所述(其公开内容通过引用结合到本文中)，通过用A549肺癌细胞免疫入RBF/DnJ小鼠，使用标准杂交瘤方法产生单克隆抗体P1F6和P5H9。从免疫后的小鼠取出脾脏，并与Ns-1/FOX-NY骨髓瘤细胞融合。如Wayner等所述，通过特异性抑制UCLA-P3粘连至玻连蛋白包被的表面，筛选产生导向癌细胞玻连蛋白受体的杂交瘤，并通过在胸腺细胞饲养层上有限稀释进行克隆。
P1F6和P5H9单克隆抗体均显示与该αvβ5复合物特异性免疫反应，并不与αv亚基、β5亚基或其它整联蛋白免疫反应。该P1F6单克隆抗体可从Gibco BRL(Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD)购得，该P5H9单克隆抗体可以从Fred Hutchinson Cancer Research Institute,Seattle,WA的E Wayner博士处得到。
如本文所述类似地衍生和表征用于本发明的其它αvβ5单克隆抗体。另外，通过融合分离自用或者不纯或者纯化形式的αvβ5受体免疫的小鼠的脾脏产生αvβ5单克隆抗体。该αvβ5的纯化是整联蛋白生物学领域一般技术人员众所周知的方法，并已由Smith等，J.Biol.Chem.,265:11008-11013(1990)描述，其说明书通过引用结合到本文中。纯化后，如E2小节中所述将分离的受体制备为免疫小鼠的免疫原，并基本上按照Kohler和Milstein,Nature,256:495-497(1975)描述制备，其说明书通过引用结合到本文中。筛选得到的杂交瘤克隆与该免疫原的反应性，并如在以下实施例中所述进行表征。2．表征抗αvβ5单克隆抗体的特异性并用于αvβ5表达的组织分布定位
A．对玻连蛋白的特异性Wayner等，J.Cell.Biol.,113:919-929(1991)显示在实施例1中制备的P5H9单克隆抗体阻断UCLA-P3癌细胞附着玻连蛋白，但不影响细胞附着胶原蛋白或纤连蛋白。亦显示同样的细胞仅含有该αvβ5玻连蛋白受体，并且都不具有αvβ3特异性、在非还原条件下免疫沉淀由α链(160kD)和β链(95kD)组成的异二聚体。用P5H9检测到的该αvβ5受体亦表明介导M21骨髓瘤细胞和H2981癌细胞与玻连蛋白的粘连。该P1F6单克隆抗体具有同样的免疫反应性特性。
B．与抗整联蛋白受体抗体的免疫荧光在伤口愈合过程中，血管的基膜表达几种粘连蛋白，包括威勒布兰特因子、纤连蛋白和血纤蛋白。另外，在培养平滑肌和内皮细胞表面表达粘连受体的整联蛋白家族的几个成员。参见，Cheresh,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84:6471(1987)；Janat等，J.Cell Physiol.,151:588(1992)；和Cheng等，J.Cell Physiol.,139:275(1989)。
除了整联蛋白β5亚基的结构和功能，Pasqualini等，J.Cell Sci.,105:101-111(1993)(其说明书通过引用结合到本文中)描述了用其它抗β5单克隆抗体定位的该亚基的组织分布。
上述与实施例1中描述的那些类似的β5亚基特异性单克隆抗体系从用接受用A549人肺癌细胞系免疫的小鼠的脾脏制备的杂交瘤分泌的。通过用该杂交瘤培养上清液阳性表面染色A549细胞，和通过免疫沉淀来自表面标记的A549提取物的αvβ5复合物，选择该杂交瘤。然后使用所述单克隆抗体定位该β5亚基在正常人胸腺、皮肤和肾脏中的组织分布。在恒冷箱切片机上从该冷冻组织块上切下4微米厚切片，以进行后续的使用对该β5整联蛋白特异性的抗体的抗生蛋白链菌素-生物素免疫过氧化物酶染色，如Pasqualini等的参考文献中描述的进行。
胸腺切片的染色显示，β5在血管、哈索尔小体、皮质和髓质基质细胞和基膜上的分布。皮肤切片显示，β5在表皮基层和在一些皮血管壁上，肾脏切片显示肾小球区、近肾小球体、近曲小管和集合小管的染色。因此，β5的分布对包括毛细管内皮细胞的不同细胞类型是非均质的，更重要的是在毛细内皮细胞上，其染色与培养脐静脉内皮细胞的染色一致。
C．患有眼病的患者的人视网膜组织与抗整联蛋白受体抗体的免疫荧光眼部新血管形成是在导致灾难性视力丧失的绝大多数眼病中观察到的最常见的病理变化。从预先存在的脉络膜、视网膜或parlimbal脉管的新血管生长，可以引起导致破坏眼睛正常解剖学关系和同时丧失正常视觉功能的水肿、出血或纤维血管膜形成。
在生理条件下血管发生受高度调节，并已显示由诸如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的特定生血管细胞因子激活。如Brooks等，Science,264:569-571(1994)描述的，已显示抗αvβ3单克隆抗体在包括下述CAM模型中的模型系统中阻断bFGF和TNF-α诱导的血管发生。如在实施例4-6中所述，抗αvβ5单克隆抗体阻断血管发生的独立途径，具体而言是由血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-α(TGF-α)和表皮生长因子(EGF)诱导的血管发生。
因此，如在本发明的范围内描述的，用独特的整联蛋白αvβ3和αvβ5定义了两个血管发生途径。为调查这些整联蛋白在人类眼病中的表达和作用，从患有增生性糖尿病性视网膜病(PDR)的患者于玻璃体摘出术时整块得到视网膜上(epiretinal)新血管膜和视网膜下(subretinal)新血管膜。这些患者已被临床追踪并选择用于在临床检验和基底荧光素血管造影术证明的具有活动增生性新血管疾病的基础进行组织学评价。将得到的组织立即在Tissue Tek冷冻保藏剂中冷冻并切片。
当通过免疫荧光检验这些患者的组织时，如与小鼠单克隆抗体LM609的免疫反应性表明的，血管对整联蛋白αvβ3呈阳性。该整联蛋白的分布看起来限于血管，并与血管标记威勒布兰特因子的染色(用抗该因子的兔抗体定位)一致。用或者若丹明缀合的抗小鼠免疫球蛋白或荧光素缀合的抗兔免疫球蛋白使免疫反应性位点可见，这两种染色剂的使用使得可以共定位该整联蛋白的位置和血管特异性抗体。
从正常眼或患有萎缩膜的、没有活动性增生血管的患者得到的样本对该整联蛋白αvβ3免疫荧光阴性。
用在实施例1中制备的抗αvβ5单克隆抗体P1F6平行地对同样的组织平行地进行αvβ5存在和分布的免疫组织化学分析。该染色揭示αvβ5存在于用威勒布兰特因子分布共定位的血管上。然而，非血管组织用该P1F6抗体亦展示有限的荧光，表明αvβ5的较广泛的分布。这与αvβ3的存在限于血管形成对比。
当比较αvβ3和αvβ5之间分别用抗体LM609和P1F6的膜免疫荧光染色时，血管壁上的染色型式实际上相同，表明αvβ3和αvβ5均呈现于存在于诸如糖尿病性视网膜病的新血管眼病的新增生人血管的表面。
本文描述的结果由此表明，αvβ5整联蛋白受体在其中发生血管发生的特定组织类型中选择性表达，例如从患有活动性增生性新血管疾病的患者的新血管膜所观察到的。这些组织与在以下实施例4-6中描述的暴露给特定生长因子的那些组织一起，为本发明的治疗方面提供了理想的靶。3．制备合成肽a．合成程序使用例如Merrifield,Adv.Enzymol.,32:221-296(1969)和Fields,G.B.和Noble,R.L.,Int.J.Peptide Protein Res.,35:161-214(1990)描述的标准固相合成技术，合成用于实践本发明方法的环状多肽。
将2克(g)BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OMe(SEQ ID NO 1)首先溶解于60毫升(ml)甲醇中，向其中加入1.5ml 2N氢氧化钠溶液以形成混合物。然后将该混合物于20℃(20C)搅拌3小时。蒸发后，将残留物吸收于水中，并用稀盐酸酸化至pH3，用乙酸乙酯萃取。将萃取物在Na2SO4上干燥，再蒸发并将产生的BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH(SEQ ID NO 2)与20ml二氧杂环己烷中的2N HCl于20C一起搅拌2小时。将产生的混合物蒸发以得到H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH(SEQ IDNO 3)，将其接着溶解于1800ml二氯甲烷和200ml二甲基甲酰胺(DMF)的混合物中，并接着被冷却至0C。其后，边搅拌边顺序加入0.5g二环己基碳二亚胺(DCCI)、0.3g1-羟基苯并三唑(HOBt)和0.23ml N-甲基吗啉。
将产生的混合物于0C再搅拌24小时，然后于20C再搅拌48小时。浓缩该溶液并用混合床离子交换剂处理以除去盐。将产生的树脂通过过滤除去后，蒸发澄清的溶液，通过层析纯化残留物，导致回收环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(亦以单字母代码列出为c-RGDfV)(SEQ IDNO 4)。肽中的小写字母表示该氨基酸的D形式，而不是由大写字母表示的L形式。
如上述制备环状对照肽环(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)(亦以单字母代码列出为RADfV)(SEQ ID NO 5)。先前已显示该环状肽c-RADfV(SEQID NO 5)抑制血纤蛋白原与整联蛋白αvβ3结合，并且不抑制血纤蛋白原与整联蛋白αⅡbβ3或αvβ1的结合(Pfaff，等，J.Biol.Chem.,269:20233-20238,1994)。
类似地制备特异性抑制天然配体与αvβ5结合的其它肽，并如以下实施例所述测试其特异性和活性范围。这些包括以下类似得到的肽环(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(SEQ ID NO 6)和环(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)(SEQ ID NO 7)。亦合成制备具有氨基酸残基序列Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe(SEQ ID NO 8)和环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal)(SEQ ID NO 9)的肽。在SEQ ID NO 9中，Me Val中的前缀“Me”表明位置6的缬氨酸在该缬氨酸残基酰胺键的α氨基氮被甲基化修饰。
b．替代合成程序ⅰ．合成环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Nme Val)、TFA盐使用固相Merrifield型程序，通过以分步方式顺序将NMe Val、DPhe、Asp(OBut)、Gly和Fmoc-Arg(Mtr)加入4-羟甲基-苯氧基甲基-聚苯乙烯树脂(Wang型树脂)(应用了在Houben-Weyl,l,c.，第15/Ⅱ卷，第1-806页(1974)中描述了惯常的Merrifield型肽合成方法)合成Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa。该聚苯乙烯树脂和氨基酸残基前体可从Aldrich、Sigrna或Fluka化学公司购得)。完成顺序加入所述氨基酸残基后，使用1∶1的TFA/二氯甲烷混合物从肽链除去该树脂，提供Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH产物。然后用1∶1的哌啶/DMF混合物除去Fmoc基团，提供粗Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMe Val-OH前体，然后用HPLC以惯常方式纯化该前体。
为了环化，用85ml的二氯甲烷(Aldrich)稀释在15ml DMF(二甲基甲酰胺；Aldrich)中的0.6g Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMe Val-OH(上述合成的)的溶液，并加入50mg NaHCO3。在干冰/丙酮混合物中冷却后，加入40μl的二苯基磷酰基叠氮化物(Aldrich)。于室温静置16小时后，浓缩该溶液。将浓缩物进行凝胶过滤(Sephadex G10柱，在异丙醇/水8∶2中)，然后以惯常方式通过HPLC纯化。用TFA(三氟乙酸)/H2O(98∶2)处理，产生环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal)xTFA，然后以惯常方式通过HPLC纯化它；RT=19.5；FAB-MS(M+H):589。
ⅱ．合成“内盐”通过将环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal)xTFA悬浮于水中并接着在真空下蒸发以除去TFA，从上述产生的环状肽除去TFA盐。将形成的环状肽称为“内盐”，并命名为环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)。使用术语“内盐”，因为该环状肽含有两个带相反电荷的残基，它们互相之间内电平衡，形成总的不带电的分子。一个带电残基含有酸部分，另一带电残基含有氨基部分。当该酸等分和该氨基部分互相之间非常接近时，该酸部分可以被该氨基部分脱质子，形成总的带电中性的羧酸盐/铵盐种类。
ⅲ．HCl处理产生环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xHCl将80mg的环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)溶解于0.01M HCl中5至6次，并在每次溶解操作后冷冻干燥。随后通过HPLC纯化，产生环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xHCl；FAB-MS(M+H):589。
ⅳ．甲磺酸处理产生环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xMeSO3H将80mg的环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)溶解于0.01M MeSO3H中5至6次，并在每次溶解操作后冷冻干燥。随后通过HPLC纯化，产生环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xMeSO3H；RT=17.8；FAB-MS(M+H):589。
替代的环化方法包括衍生具有巯基部分的无环状肽前体的侧链基团，并当暴露于略高于正常生理pH条件(pH7.5)时，与该分子内存在的其它巯基基团分子内形成二硫键，形成环状肽。另外，无环状肽前体的C末端羧酸盐部分可以与该分子内存在的游离巯基部分反应，产生硫酯环化肽。
表1肽命名 氨基酸序列SEQ ID NO62184(66203*) 环(RGDfV) 462185(69601*) 环(RADfV) 562181 环(GrGDFV)662187 环(RGDFv) 762880 YTAECKPQVTRGDVF 8121974(85189*) 环(RDGf-NMeV) 9112784环(RGEf-NMeV) 10huMMP-2(410-631)**11huMMP-2(439-631)**12huMMP-2(439-512)**13huMMP-2(439-546)**14huMMP-2(510-631)**15huMMP-2(543-631)**16chMMP-2(410-637)***17chMMP-2(445-637)***18chMMP-2(445-518)***19chMMP-2(445-552)***20chMMP-2(516-637)***21chMMP-2(549-637)***22*以星号标明的肽是在HCl中制备的，并与同一行命名的肽在序列上相同；没有星号的肽是在TFA中制备的。小写字母表明D-氨基酸；大写字母表明L-氨基酸。**合成肽的人类MMP-2氨基酸残基序列由示于图15A和15B以及图16的对应残基位置标明。(MMP-2指基质金属硫蛋白酶家族的一个成员)。所述人类MMP-2序列以天然半胱氨酸残基列出，而不以如融合肽所述的工程化的半胱氨酸残基列出。用非天然半胱氨酸残基于指明的残基位置置换该天然氨基酸残基，以增强该合成以及表达的融合蛋白的溶解度，并确保正确折叠以呈现该结合位点。***合成肽的鸡MMP-2氨基酸残基序列由示于图15A和15B的对应残基位置标明。所述鸡MMP-2序列以天然半胱氨酸残基列出，而不以如上述融合肽的工程化的半胱氨酸残基列出。4．通过体内兔眼模型检测测定的用αvβ5拮抗剂抑制生长因子诱导的血管发生可以在以眼睛角膜为典型的天然透明结构中观察抗αvβ5拮抗剂对生长因子诱导的血管发生的影响。新血管从具有丰富血液供应的角膜边缘向通常不具有血管的角膜中央生长。当将诸如VEGF和TGF-α的血管发生刺激剂用于角膜时，诱导新血管从角膜边缘生长。当将血管发生的拮抗剂用于角膜时，抑制新血管从角膜边缘生长。因此，角膜通过内皮细胞从角膜边缘向坚韧的堆积胶原蛋白的角膜组织侵入进行血管发生是轻易可见的。该兔眼模型检测因此提供在将化合物直接植入眼睛角膜后直接观察血管发生的刺激和抑制的体内模型。
A．体内兔眼模型检测1)由生长因子诱导的血管发生用生长因子在该体内兔眼模型检测中诱导血管发生，并在以下进行描述。
a．制备含有生长因子和单克隆抗体的hydron丸如D’Amato等，Proc.Natl.Acad.Sci.,91:4082-4085(1994)所述制备含有生长因子和单克隆抗体(mAbs)的hydron聚合物丸。单个的丸含有750ng生长因子(亦称为细胞因子)，具体地说是或者bFGF或者VEGF,它们结合至硫糖铝(Carafet,Marion Merrel Dow Corporation,Cincinnati,OH)，以稳定所述细胞因子并确保它们缓慢释入周围组织。另外，制备含有PBS中的或者40μgmAb P1F6(抗αvβ5)或对照抗体LM609(抗αvβ3)的hydron丸。
按照众所周知的方法，使用A蛋白Sepharose CL-4B亲和柱层析从腹水纯化所有测试的mAb。然后将洗脱的免疫球蛋白对PBS透析，并用Detoxi-gel(Pierce Chemicals,Rocford,IL)处理以去除内毒素。已显示内毒素是有效的生血管和炎症刺激剂。因此用产色素鲎变形细胞溶解物检测(Bio Whittaker,Walkersville,MD)测试单克隆抗体中内毒素的存在，并且只有那些没有可检测的内毒素的mAb用于兔眼模型检测中。
在特别制造的在其表面有2.5mm钻孔核的特氟隆栓内铸造所述丸。将约12μl的铸造材料置于每个栓中，并在无菌橱中聚合过夜。然后通过紫外辐射将丸灭菌。
将一系列的8只动物用于成对眼实验，其中每只动物接受含有预选择的细胞因子与预选择的抗体或对照免疫球蛋白的hydron植入物。具体地说，对于每只兔子，一只角膜外科手术植入含有与mAb P1F6联用的或者bFGF或者VEGF的hydron丸，另一只角膜用与MAb LM609联用的或者bFGF或者VEGF处理。将单个的丸植入在兔子角膜的中基质中外科手术创造形成的“口袋”中。使用装备有其上装有用于摄影记录各个角膜的照相机的分束器的Wild M691型手术显微镜，在无菌条件下进行外科手术。通过用69 Beaver刀片做一个3mm的至一半角膜厚度的切口，在角膜基质中制作一个3mm×5mm的“口袋”。使用虹膜复位器沿周边解剂基质，并将该丸植入，使其周边距边缘2mm。
在以后的12天中，所述细胞因子和mAb从该植入丸扩散进入周围组织，由此影响从角膜边缘的血管发生。
分别将左和右角膜称为OS和OD。然后观察角膜12天。在手术后第10天照相，此时新血管形成为最高峰。
使用细胞因子/mAb混合物的上述处理的代表性摄影结果示于图1A-1D。mAb抑制细胞因子诱导的血管发生的平行定量示于图2A和2B。在图1A和1D中，其中角膜分别暴露给bFGF/P1F6和VEGF/LM609组合物，如大箭头所示，细胞因子诱导的带有水肿的血管发生是显著的。因此，αvβ5抗体P1F6对抑制bFGF诱导血管发生无效。类似地，αvβ3抗体LM609对抑制VEGF诱导的血管发生无效。
与之相反，当将细胞因子/mAb组合物bFGF/LM609和VEGF/P1F6用于兔眼模型时，如图1B和1C中分别所示，细胞因子诱导的血管发生被抗体抑制。在这些图中，显示由小箭头指示的正常结膜缘脉管，表明所述整联蛋白抗体抑制一种类型的细胞因子诱导的血管发生的效力。
如图2A和2B中所示，亦定量了特定mAb的整联蛋白免疫反应性对上述细胞因子诱导的血管发生的效果。如图2A和2B中分别所示，用或者bFGF或者VEGF刺激血管发生。每天通过装有Nikon照相机的Wild手术显微镜对受处理的眼睛照相。将影像记录在Kodak Ektachrome 64T幻灯片上，并在通过GS670型成象显象密度计获得后，使用Biorad的Molecular Analyst 1.1软件，将图象转换做计算机辅助定量。矩形图描绘了暴露给mAb P1F6或LM609后的平均新血管面积±标准差(两个系列中的每个n=8)。
如图2A中所示，当与用P1F6处理同一动物的另一只眼相比时，LM609将bFGF诱导的血管发生降低86％(p＜0.005，成对t-检定)。当如图2B所示使用VEGF刺激血管发生时，观察到相反的效果，其中与LM609处理的眼睛具有对VEGF诱导的血管发生的最低效果相比，P1F6将新血管形成的平均面积降低60％(p＜0.03，成对t-检定)。
很明显，仅新的细胞因子诱导的血管受暴露给特定的mAb影响，而预先存在的周缘脉管未受两种mAb影响，提示观察到的效果局限于角膜新形成的血管。
用在实施例3中制备的合成肽进行类似的检测，并如下述用于抑制特异性地与αvβ5表达相关的细胞因子诱导的血管发生。
这些结果表明由特定细胞因子诱导的血管发生仅受一种类型的抗整联蛋白抗体影响，具体地说αvβ5整联蛋白受体在VEGF诱导的血管发生中起作用，为证实这些结果，如在下一个实施例中所示，用细胞因子和整联蛋白抗体的组合物评价鸡尿囊绒膜(CAM)的另一个新血管模型。
b．用多肽处理每个实验由8只兔子组成，其中兔子的一只眼睛接受包含100纳克(ng)bFGF的丸，而另一只眼睛接受包含1微克(ug)VEGF的丸。如上述将所述丸插入角膜口袋，所述细胞因子接着就刺激新血管生长进入角膜。肽在1ml PBS中皮下(s.q.)给予，在插入丸的那天的起始剂量为50ug/kg兔，其后每天皮下剂量以20ug/kg给予。7天后，如上述评价角膜。
在vFGF和VEGF刺激的眼睛中，接受对照肽的兔子在7天时均显示大量角膜血管生长。接受肽85189的兔子显示与对照相比，在vFGF刺激的眼睛中角膜血管生长的量小于50％，在VEGF刺激的眼睛中几乎100％抑制。5．鸡尿囊绒膜(CAM)制备物中的血管发生A．未处理CAM的表征1)制备CAM在正常胚胎血管发生已导致形成成熟血管之后，可以在鸡尿囊绒膜(CAM)上诱导血管发生。如Leibovich等，Nature,329:630(1987)和Ausprunk等，Am.J.Pathol.,79:597(1975)所述，已显示血管发生对特定细胞因子或肿瘤片段应答而被诱导。从鸡胚制备CAM，以进行后续的诱导血管发生以及用本发明的αvβ5拮抗剂如以下和在实施例6中所述进行抑制。
从McIntyre Poultry(Lakeside,CA)得到10日龄的鸡胚，并于37C以60％湿度温育。使用小型专用钻(crafts drill)Dremel,Division of EmersonElectric Co.,Racine,WI)在蛋的末端直接通过蛋壳在气囊上穿一小孔。在蛋的宽边的预先用对光检查该蛋确定的无胚胎血管的区钻第二个孔。在第一个孔施以负压，导致CAM(尿囊绒膜)从壳膜扯离，并在CAM上形成一个假气囊。使用小型砂轮(Dremel)在掉落的CAM上方的壳切出一个1.0厘米(cm)×1.0cm的正方形窗口。该小窗口使得可以直接利用下面的CAM。
然后，将产生的CAM制备物于胚胎发生10天时使用，此时血管发生已减退。因此将该制备物用于本发明，以诱导对细胞因子处理应答的新生的血管发生。
2)CAM的组织学为分析鸡胚CAM的显微结构，在恒冷箱切片机上从冷冻块上切下6微米(μm)厚的切片，做免疫荧光分析。
未处理的10日龄的CAM的典型是没有血管的区。由于到胚胎发生的此阶段时，CAM系统中的血管发生正在减退，该系统可以用于本发明，以用各种细胞因子刺激从已存在的脉管产生新血管系统从邻近区域向此时缺乏任何脉管的CAM区生长。
如在该CAM模型和在以下实施例中显示的，当血管在正常胚胎发生或由细胞因子诱导进行新生长时，所述血管表达αvβ3和αvβ5。
B.由生长因子诱导的血管发生如实施例4A所述，在兔眼模型中血管发生已显示由细胞因子或生长因子诱导。在本文描述的实验中，在实施例4中描述的兔角膜制备物中的血管发生同样被如本文所述局部用于CAM血管上的生长因子诱导。
通过将用Hanks平衡盐溶液(HBSS,GIBCO,Grand Island,NY)或含有预选择浓度(即测试影响血管发生的浓度)细胞因子的HBSS饱和的5毫米(mm)×5mm Whatman滤片(1号Whatman滤纸)置于没有血管的10日龄鸡胚的CAM区，诱导血管发生，然后将窗口用胶带封闭。于72小时后通过照相显微镜监视血管发生。将CAM快速冷冻，然后如实施例2B和2C中所述用丙酮将6μm恒冷切片固定，并用10μg/ml的选择的抗整联蛋白抗体包括如实施例1中所述的导向抗αvβ5的抗体，通过免疫荧光染色。
Brooks等，Science,264:569-571(1994)的先前研究已显示，血管在bFGF和TNF-α处理的制备物中是极其明显的，但不存在于未处理的CAM。所述作者亦显示在bFGF诱导的血管发生之后αvβ3表达增强。虽然整联蛋白β1的表达与在未处理CAM中观察到的没有改变，但β1在受刺激的血管中亦是容易检测到的。
这些发表的发现表明，在人类和鸡中，涉及血管发生的血管均显示αvβ3的增强表达。与此一致的是，αvβ3在培养内皮细胞上的表达由各种体内细胞因子诱导，如Janat等，J.Cell Physiol.,151:588(1992)；Enenstein等，Exp.Cell Res.,203:499(1992)和Swerlick等，J.Invest.Derm.,99:715(1993)所述。
在本发明中，现已确定一种独立的细胞因子介导途径，它刺激依赖于一种不同的粘连整联蛋白受体αvβ5的表达和激活的血管发生。如本文所述的CAM暴露给细胞因子VEGF、TGF-α和EGF的效果与αvβ5的表达、与血管发生和用αvβ5拮抗剂抑制该血管发生的关系在实施例6中进行了描述。
C.由肿瘤诱导的血管发生为研究αvβ5在肿瘤诱导的血管发生中的作用，将各种αvβ5阴性人类黑素瘤和癌片段用于CAM检测中，该CAM系从17天鸡胚的CAM如Brooks等，J.Cell Biol.,122:1351(1993)和如本文所述预先生长和分离。
通过直接将肿瘤片段添附在CAM上，在CAM检测系统中诱导血管发生。该鸡胚CAM的制备与上述程序相同。未使用滤纸片，而将50毫克(mg)至55mg重量的得自如下述细胞系悬浮液生长的αvβ5阴性肿瘤片段置于CAM上原先没有血管的区。
将由Pasqualini等J.Cell Sci.,105:101-111(1993)描述的细胞系rabdomyosarcoma、髓细胞样(HL-60或KG-1)和淋巴样(T细胞-Jurkat,HPB/ALL,PEER；和各种B细胞系)用于在鸡胚CAM上生长人类实体瘤。首先以在总体积为30μl的无菌HBSS中的各种细胞系的单细胞悬浮液加在CAM上。用胶带封闭窗口并将胚胎培养7天使人类肿瘤损害生长。在7天结束时(此时胚胎为17天)，从所述CAM切除肿瘤，并将周围的CAM组织去除干净。将肿瘤切成50mg至55mg的肿瘤片段，以用于血管发生。将所述肿瘤片段置于如实施例5A中描述的新的一组10天鸡胚CAM的无血管区。
然后用先前描述的mAb P1F6或P5H9，对在有或无局部或静脉内应用诱导αvβ5的细胞因子(VEGF、TGF-α或EGF)的鸡胚CAM上体内生长的肿瘤进行αvβ5表达染色。
然后如实施例6C和6D中所述，对这些CAM肿瘤制备物进行后续处理，以测定抗体和包括MMP-2C末端片段的肽对肿瘤诱导的血管发生的影响。
在一个实施方案中，将从加州大学旧金山分校的Caroline Damsky博士处得到的仓鼠黑素瘤细胞CS-1用于如上述用于黑素瘤肿瘤形成的CAM检测。在将约50mgCS-1肿瘤片段转移至新的10天鸡胚CAM上之后，独立的制备物分别接受静脉内注射或者100μg或者300μg P1F6抗体、LM609抗体或对照CSAT(抗β1)抗体。另一对照包括未接受处理的制备物。结果在以下实施例6D中讨论。6．抑制如在CAM检测中测定的血管发生A．通过静脉内应用抑制剂抑制生长因子诱导的血管发生评价了用静脉内注射入CAM制备物的单克隆抗体对生长因子诱导的血管发生的影响，做为本发明的体内模型系统使用。
在活动性新血管形成之后，一旦脉管停止发育，αvβ5表达降低至无法用免疫荧光分析检测的水平。与成熟脉管缺乏αvβ5表达相反的这种在进行血管发生的血管中αvβ5表达调节，为本发明提供了控制和抑制血管发生的独特能力，如以下在CAM血管发生检测系统的模型所示。
用于进行静脉内注射的鸡胚CAM的制备基本上如上述。
首先通过使用生长因子饱和的滤片在10日龄的鸡胚上诱导血管发生。具体地说，在首次检测中，通过暴露给浓度均为150ng/ml的或者bFGF或者VEGF诱导血管发生。
对于使用生长因子，在对光检查程序中选择显著的血管，并在蛋壳上做标记以标明其位置。在蛋壳上钻孔，使CAM掉落，然后将生长因子饱和的滤纸如上述独立地放置于CAM上。用无菌胶带封闭窗口并将胚胎置于培养箱中。
24小时后，在蛋壳的侧边直接在先前选择的显著血管之上小心地切出第二个小窗口。小心地除去外部蛋壳使胚胎膜完整。用一小滴使血管容易看见的矿物油(Perkin-Elmer Corp.Norwalk,CT)使壳膜透明。然后，将磷酸缓冲盐水(PBS)、PBS中的75μg的纯化无菌抗整联蛋白抗体或75μg的合成肽(环状肽RGDfV,SEQ ID NO 4和对照环状肽RADfV,SEQ ID NO 5)注射入在生长因子诱导的CAM上明显的血管里。用胶带封闭窗口并使胚胎培养直至72小时。
在立体显微镜中对滤片和代表性的周围CAM组织照相(图3A-3F和图5A-5F)，确定每种条件12个CAM的平均生血管指数±标准差(图4A-4B和图6A-6B)。以双盲方式通过分析在每个片的面积内血管分枝的数量和程度，对每个胚胎的血管发生计分。分数范围为1(低)至4(高)，并通过从所有的数据减去本底值1，确定血管发生指数。
在CAM模型中整联蛋白抗体介导的抑制生长因子诱导的血管发生的特异性与上述在兔眼角膜模型中观察到的一致。如分别在图3A和3B中所示，bFGF和VEGF均在对照PBS处理的CAM中引起血管发生。然而，用αvβ5特异性抗体P1F6处理，导致如图3D中所示的抑制VEGF诱导的血管发生，而如在图3C中所见，未检测到对bFGF诱导的血管发生的抑制。与之相反，LM609αvβ5特异性抗体抑制bFGF诱导的血管发生(图3E)，但对VEGF诱导的CAM中的血管发生几乎没有作用(图3F)。
这些结果亦分别示于有关bFGF和VEGF处理的CAM的图4A和4B的方块图中，其中将血管发生指数对以未暴露给抗体做为对照的仅暴露给或者LM609或者P1F6作图。因此，整联蛋白特异性抗体对生长因子诱导的血管发生的抑制取决于生长因子类型。
暴露给含RGD肽支持上述结果。在存在PBS时，如图5A和5B中所示，暴露给bFGF和VEGF均导致在对照CAM中的血管发生。与之相反，针对αvβ3和αvβ5的环状肽拮抗剂RGDfV(SEQ ID NO 4)消除了由或者bFGF或者VEGF诱导的血管发生。环状肽RADfV(SEQ ID NO 5)不影响或者bFGF或者VEGF处理的CAM制备物中的血管发生。所示结果亦示于图6A和6B，其中bFGF和VEGF刺激的CAM的血管发生指数以显示暴露给测试和对照肽作图。因此，这些发现与在兔角膜中的发现一起表明，bFGF和VEGF诱导的血管发生依赖于独特的、但为同源的αv特异性整联蛋白，但都可以用环状肽RGDfV抑制。
在具有VEGF诱导的血管发生的CAM模型中进行的再一检测中，如先前所述将2μg肽85189(SEQ ID NO 9)和惰性盐对应物121974独立地静脉内注射。与对照肽69601(SEQ ID NO 5)和未处理(以NT为标记)制备物的效果相比较，评价所述肽的效果。
通过测定血管分枝点的数量，测定所述肽对VEGF诱导的血管发生的影响。因此，通过计数在该滤片范围内发生的血管分枝点的数量，定量血管发生或缺乏血管发生。认为分枝的血管主要对应于新生血管出芽血管。以双盲方式由至少二名观察者进行定量。将该结果表达为生血管指数，其中生血管指数是每个滤片的分枝点(VEGF刺激的)的数量减去分枝点(对照未刺激的)的数量。实验常规是每种条件有6-10个胚胎。如图17中所示，肽85189和121974均完全抑制血管发生，正如与未处理或对照肽处理的制备物相比可测定分枝点的减少所表明的。
用如在实施例3中所述制备的合成肽进行其它的类似检测，以定义表现出对αvβ5而不是αvβ3相关的血管发生特异性的肽。亦用如在实施例3和7中所述制备的MMP-2C末端片段和用如在实施例10中所述制备的有机分子进行检测。
通过将生长因子的血管发生诱导分析延伸至包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-α(TGF-α)或佛波醇酯4-β-佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)，进一步确认和加强整联蛋白抗体抑制生长因子诱导的血管发生的特异性。
将包括bFGF和VEGF的上述生长因子(细胞因子)以1.0μg/ml的浓度如先前所述独立应用于10日龄的CAM模型。以20ng/ml的浓度使用PMA。
在生长因子处理24小时后，或者通过如上述的单血管内剂量或者通过在下一实施例中描述的局部给予，将抗体LM609和P1F6或者蛋白激酶C(PKC)抑制剂钙感光蛋白C独立地提供给该CAM模型。对于以后3天连续时期的血管内注射，以每个胚胎75μg的浓度使用所述抗体，并以100nM的剂量使用钙感光蛋白C。
在第13天时，解剖出滤片和相连的CAM组织，并用立体显微镜分析血管发生。以双盲方式通过分析在所述片面积内的血管分枝的数量和程度给血管发生计分。分数范围从低(1)至高(4)。通过从所有的数据减去本底计分1确定血管发生指数。用每种条件5-6个胚胎重复实验2-4次。
如图7A和7B中分别所示，抗αvβ3抗体LM609阻断了对bFGF和TNF-α应答的血管发生，而抗αvβ5抗体P1F6几乎没有抑制效果。与之相反，如图7C-7E中分别所示，P1F6对抑制由VEGF、TGF-α或PMA诱导的血管发生有效，而LM609不能抑制。
PMA是有效的血管发生诱导剂，它可以激活蛋白激酶C(PKC)，后者为丝氨酸苏氨酸激酶的胞内家族。因此，我们亦检测了PKC抑制剂钙感光蛋白C对鸡CAM上血管发生的影响。Calphostin C阻断了由PMA(图7E)以及VEGF和TGF-α(分别示于图7C和7D)诱导的血管发生而对bFGF或TNF-α介导的血管发生(分别示于图7A和7B)有最小效果。
总而言之，这些结果表明存在两个独立的独特血管发生途径，其中一个途径如Brooks等，Science,264:569-571(1994)先前所述，依赖于αvβ3介导信号，其主要不依赖于PKC，第二个途径由关键依赖PKC激活的αvβ5介导的转导信号增强。
除上述实验之外，为确定P1F6和LM609 mAb在静脉内接种了LM609的CAM组织中的定位，于室温将固定的切片用HBSS中的2.5％BSA封闭1小时，接着通过用1∶250稀释的山羊抗小鼠若丹明标记的二级抗体(Tago)染色。然后用Zeiss免疫荧光化合物显微镜分析切片。
B．通过局部应用抑制剂抑制生长因子诱导的血管发生为确定αvβ5是否在血管发生中起活跃的作用，将如上述用生长因子饱和的滤片置于CAM上，以诱导血管发生并接着应用或者P1F6或者LM609。
然后用50ml含有25mg mAb的HBSS，总体积25μl无菌HBSS于0、24和48小时处理滤片。72小时后，收获CAM并置于35mm陪替氏培养皿中，并用1ml PBS清洗一次。然后在Olympus立体显微镜下以双盲方式由两个观察者分析滤纸的底面和CAM组织。当CAM表现出在直接位于滤片下的CAM血管浸润方面有大于50％的减少时，就认为血管发生抑制是显著的。每种抗体重复实验4次，每种条件有6-7个胚胎。
为检测整联蛋白抗体对来自正常脉管发育的预先存在的邻近无脉管区的成熟血管的影响，将用mAb饱和的滤片置于未接受局部应用细胞因子的10天胚胎的CAM血管化区域上。
亦用本发明的合成肽进行CAM检测，以确定环状和线性肽对生长因子诱导的血管发生的影响。如前述制备的8μg肽独立地存在于总体积25μl的无菌HBSS中。立即将该肽溶液应用于该CAM制备物上，并且然后于24和48小时再次应用。于72小时，将该滤纸和周围的CAM组织解剖并如上述观察。
用分别如实施例7和10所述制备的所述MMP-2片段和有机分子进行类似的检测。
C．通过局部应用抑制肿瘤诱导的血管发生1)用单克隆抗体处理除了上述评价抗αvβ5抗体和肽拮抗剂影响的血管发生检测之外，亦调查了αvβ5在肿瘤诱导的血管发生中的作用。做为诱导物，使用了预先生长和分离自17天鸡胚CAM的αvβ5阴性人类组织。如在实施例5C中所述制备所述片段。
如上所述，以25μg在25μl HBSS中的浓度将mAb独立的局部应用于所述肿瘤片段，并用胶带封闭窗口。以同样方式于24小时和48小时再次加入mAb。于72小时，如上述分析所述肿瘤和周围的CAM组织。
如在实施例5C中所述，通过移植不表达整联蛋白αvβ5的人类细胞系到10日龄鸡胚CAM上，初始产生肿瘤。
为定量所述mAb对肿瘤诱导的血管发生的影响，以双盲方式由两个观察者在立体显微镜下计数进入该CAM病灶平面内的肿瘤的血管。
类似地将在实施例3中制备的合成肽、描述于实施例7中的MMP-2制备物和在实施例10中制备的有机分子如上述局部应用于所述肿瘤诱导的生血管CAM检测系统。类似地评价包括本发明描述的MMP-2制备物和有机分子的所述肽对所述脉管生存能力的影响。
D．通过静脉内应用抑制肿瘤诱导的血管发生1)用单克隆抗体处理亦用通过静脉内注射应用的mAb处理上述制备的肿瘤诱导的血管。如实施例5C中所述将CS-1黑素瘤肿瘤置于CAM上，并用胶带封闭窗口，24小时后如前述将100-300μg纯化的mAb一次静脉内接种入鸡胚血管中。然后使所述鸡胚培养7天。然后如上述观察血管发生的程度。在此时期后，切除肿瘤并通过其肿瘤分析，以确定抗体暴露对肿瘤生长或抑制的影响。
用300μgαvβ5特异性抗体P1F6处理CS-1肿瘤的结果示于图8。与未处理的和CSAT处理的肿瘤相比，该肿瘤重量显著地降低至小于50mg。αvβ3特异性抗体LM609亦抑制肿瘤生长，但是比用P1F6的效力低。用接受100μgP1F6处理的肿瘤得到了相当的结果。因此，P1F6有效地抑制αvβ5介导的CAM制备物上肿瘤模型的血管发生，导致肿瘤细胞团减小。
2)用其它αvβ5拮抗剂处理亦评价了肽、MMP-2制备物或有机分子对肿瘤诱导的CAM检测系统中的血管发生的影响。如上述使用该肿瘤-CAM制备物，除了不静脉内注射mAb，将如实施例7中所述制备的MMP-2制备物和实施例10中制备的有机分子独立地静脉内注射入可见的血管。
在特定的一组检测中，用抗69601(SEQ ID NO 5)的所述αvβ5反应性肽85189(SEQ ID NO 9)做为对照，进行另外的肿瘤退化检测。如上述进行所述检测，除了将100ug肽于各种肿瘤植入后的18小时时静脉内注射入该CAM，此时所述肿瘤包括UCLAP-3、M21-L和FgM肿瘤类型。再过48小时后，切除所述肿瘤并得到湿重。
图18、19和20分别显示与用或者PBS或者肽69601的缺乏效果相反的、在静脉内暴露给肽851 89后UCLAP-3、M21-L和FgM肿瘤的肿瘤重量的减少。7．鉴别通过抑制细胞附着和通过配体-受体结合检测检测到的αvβ5特异性拮抗剂A．抑制细胞附着做为确定本发明的拮抗剂的整联蛋白受体特异性的一种方法，如下述进行细胞附着抑制检测。
简言之，如先前Filardo等，J.Cell Biol.,130:441-450(1995)所述，用表达β5亚基的质粒首先转染缺乏αvβ3和αvβ5表达的CS-1仓鼠黑素瘤细胞。通过阻断表达αvβ5的CS-1细胞与VN或层粘连蛋白包被的平板结合的能力，确定潜在的αvβ5拮抗剂的特异性。做为典型检测的实例，将孔首先用10ug/ml底物包被过夜。在清洗和用PBS中的1％热变性BSA于室温封闭30分钟后，将浓度范围0.0001uM至100uM的肽85189(SEQID NO 9)独立地与CS-1细胞混合，以50,000细胞/孔的细胞数量加入孔中。于37C温育10-15分钟后，将含有细胞和肽的溶液废弃。在用1％结晶紫染色后测定附着细胞的数量。通过加入100微升(μl)10％乙酸洗脱与细胞相连的结晶紫。通过于600nm波长测定该洗脱结晶紫的光密度对细胞附着定量。
用融合蛋白或含有该MMP-2蛋白的各种区的合成肽对应物进行类似的检测。所述MMP-2源多肽包括在与αvβ5结合相互作用中活跃的并由此可以抑制MMP-2激活和相关活性的MMP-2C末端区。这些多肽或者做为具有源自如实施例1中所述的MMP-2C末端域的序列的合成多肽或者做为包括所有或部分如下述制备的MMP-2C末端域的融合蛋白制备。MMP-2C末端分子均提呈鸡和人类特异性序列。
鸡源MMP-2C末端域(亦称为与铰链区紧密邻近的血红素结合蛋白域)包含MMP-2的氨基酸残基445-637。鸡MMP-2的完整核苷酸序列和编码的氨基酸序列在以下描述并示于图15A和15B中，所述核苷酸序列和氨基酸序列分别列为SEQ ID NO 23和24。以下亦描述了人类MMP-2核苷酸序列和编码的氨基酸序列，后者示于图16和SEQ ID NO25。人类MMP-2中对应于鸡的445-637区的C末端域开始于氨基酸残基439并结束于631，因为如图15A和15B中所示，该人类序列中缺失6个残基。用于实践本发明方法的人类和鸡源的C末端MMP-2合成肽均列于表1。所述合成肽的氨基酸残基序列与通过重组融合蛋白对应物产生的那些氨基酸残基序列相同但没有GST融合组分。如下述制备源自鸡和人类的C末端MMP-2融合蛋白。
MMP-2融合蛋白是具有与诸如谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的载体(融合)蛋白融合(通过共价肽键可操作地连接)的MMP-2C末端域序列或其部分的嵌合多肽。
为扩增鸡和人类MMP-2的各个区，基于已知的鸡和人类MMP-2分别的cDNA序列设计引物序列。将亦称为明胶酶原的未加工鸡MMP-2的cDNA核苷酸序列的完整的上链与示于第二行的推测氨基酸序列(Aimes等，Biochem J.,300:729-736,1994)一起示于图15A和15B。该图的第三和第四行分别显示人类(Collier等，J.Biol.Chem.,263:6579-6587(1988))和小鼠MMP-2(Reponen等，J.Biol.Chem.,267:7856-7862(1992))的推测氨基酸序列。相同的残基用点标明，而不同的残基则以其单字母IUPAC字给出。缺失的残基用破折号标明。氨基酸残基的编号从该酶原的第一个残基开始，信号肽的残基则以负数编号。如此在图中将核苷酸序列编号，但在序列表中将第一个核苷酸列为1号。用三个向前的箭头标记推定的翻译起点(ATG)，并用星号标明翻译终止信号(TGA)。鸡酶原和活性酶的氨基末端序列用菱形和单箭头包括。如前述，将鸡明胶酶原核苷酸序列和氨基酸残基序列一起做为SEQ IDNO 23列出，而将编码的氨基酸残基序列独立地做为SEQ ID NO 24列出。
产生鸡MMP-2扩增区的模板或者是编码全长成熟鸡MMP-2多肽的cDNA(由纽约州立大学Stoney Brook分校(纽约)的J.P.Quigley博士提供)，或者是通过标准技术从鸡尿囊绒膜组织切除的样本得到的总细胞RNA制备的cDNA。对于后者，用MuL V逆转录酶和对3’末端核苷酸特异性的下游引物5’ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3’(SEQ ID NO 26)得到该cDNA，所述下游引物的5’和3’末端分别互补于发表的鸡MMP-2序列的核苷酸1932-1912)。如图15的图例中所示，本文描述的引物的核苷酸位置对应于在该图中显示的那些位置，而不对应于在序列表中显示的那些位置，因为后者以数字1开始，而不是如该图例中所示的负数。按照GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer)制造商的说明书，进行逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。亦将该引物工程改造以含有内部EcoRⅠ限制位点。
从上述cDNA模板的二者之一，通过用上述列出的3’引物(SEQ IDNO 26)与以下列出的多种5’引物的一种配对的PCR，得到一些鸡MMP-2 C末端区，它们均在羧基末端的位置637具有天然半胱氨酸残基。所述扩增区编码以下MMP-2融合蛋白，其序列对应于图15A和15B中所示的并亦列于SEQ ID NO 24的氨基酸残基位置1)203-637；2)274-637；3)292-637；4)410-637；5)445-637。设计用于扩增编码以上列出的MMP-2融合蛋白的每个核苷酸区的上游或5’引物，以编码在工程改造的(即PCR导入的)内部BamHⅠ限制位点3’的多肽起始位点，以使定向连接入或者pGEX-1λT或者pGEX-3X表达载体。5’引物包括以下序列，其5’和3’末端对应于该图中所示的鸡MMP-2序列标明的5’和3’核苷酸位置(亦对每个引物标明了氨基酸残基位置起始位点)1)核苷酸599-619，编码203起始位点5’ATGGGATCCACTGCAAATTTC3’(SEQID NO 27)；2)核苷酸809-830，编码274起始位点5’GCCGGATCCATGACCAGTGT’A3’(SEQ D NO 28)；3)核苷酸863-883，编码292起始位点5’GTGGGATCCCTGAAGACTATG3’(SEQ D NO 29)；4)核苷酸1217-1237，编码410起始5’AGGGGATCCTTAAGGGGATTC3’(SEQID NO 30)；和5)核苷酸1325-1345，编码445起始位点5,CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3’(SEQ ID NO 31)。
随后按照制造商关于扩增高保真性PCR系统(BoehringerMannheim)的说明书，对该模板DNA的标明的核苷酸区扩增35个循环(退火温度55C)。将产生的PCR产物凝胶纯化，用BamHⅠ和EcoRⅠ限制性酶消化，并在连接入在连接反应之前已类似地消化以及脱磷酸的或者pGEX-1λT或者pGEX-3X载体(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)之前再次纯化。质粒的选择基于扩增产物所需的阅读框架。通过热休克用独立的构建物转化感受态的大肠杆菌菌株BSJ72或者BL21细胞。在对阳性克隆双脱氧测序以确认导入编码序列的完整性之前，通过PCR筛选产生的加入相应MMP-2融合蛋白编码质粒的菌落。另外，通过表达适当大小的GST-MMP-2融合蛋白，证实质粒加入的确认。
基本上如GST基因融合系统(Pharmacia Biotech)的制造商所述，使用IPTG诱导的对数期培养物进行每种重组GST-MMP-2融合蛋白的纯化。简言之，通过超声处理裂解回收的细菌，并在澄清和在sepharose 4B偶联的谷胱甘肽(Pharmacia Biotech)固定化该重组蛋白之前，与去污剂温育。在充分清洗后，用50 mM Tris-HCl,pH8.0中的10mM还原的谷胱甘肽从该亲和基质独立洗脱固定化的融合蛋白，并对PBS充分地透析，以在使用之前除去残留的谷胱甘肽。
先前尝试产生鸡MMP-2残基445和637之间的、只有一个编码的半胱氨酸残基的融合蛋白，产生不溶性产物。因此，为制备源自该C末端区、不包括存在于先前描述的融合蛋白中的内源末端半胱氨酸残基的其它可溶性MMP-2融合蛋白，将核苷酸序列导入扩增的MMP-2区，以编码需要时根据特定融合蛋白的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基天然地存在于鸡MMP-2序列的位置446和位置637。在人类序列中，这些位置分别对应于440和631。因此，设计融合蛋白以在目的鸡MMP-2序列的氨基或羧基末端含有工程改造的末端半胱氨酸残基，以与另一末端的天然存在的半胱氨酸提供二硫键，如该构建物需要的。如实施例3中先前所述，类似地制备鸡和人类的合成MMP-2片段。
如此设计寡聚核苷酸引物，以扩增用于表达可溶性MMP-2/GST融合蛋白的鸡MMP-2C末端区。扩增的鸡MMP-2C末端区包括编码氨基酸残基位置445-518、445-552、516-637和549-637的那些区。对于含有残基517的融合蛋白，用半胱氨酸置换天然编码的酪氨酸残基，以与位于残基位置446或者637的半胱氨酸之一形成二硫键。对于含有残基551的融合蛋白，用半胱氨酸置换天然编码的色氨酸残基，以与位于残基位置446或者637的天然编码的半胱氨酸之一形成二硫键。
简言之，使用编码重组GST/MMP-2(410-637)融合蛋白的如上述制备的pGEX-3X质粒构建物做为按照扩增高保真性PCR试剂盒(Boehringer Mannheim)的制造商方案的扩增模板，该扩增使用了一组寡聚核苷酸引物，其设计是基于发表的鸡MMP-2序列(亦示于图15A和图15B和SEQ ID NO 23)。一个上游引物具有核苷酸序列(5’CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3’(SEQ ID NO 32))，该引物被设计编码起始位点位于在用于插入pGEX-3X GST载体的工程化内部BamHⅠ核酸内切酶限制位点之后的位置445的鸡MMP-2蛋白。该引物的5’和3’端分别对应于图15A和15B中的鸡MMP-2序列的位置1325-1345。另一设计以编码位于在用于插入pGEX-1λT GST载体的工程化内部BamHⅠ限制位点之后的位置516的鸡MMP-2蛋白起始位点和在位置517编码半胱氨酸残基的上游引物，具有核苷酸序列(5’GCAGGATCCGAGTGCTGGGTTTATAC3’(SEQ ID NO 33))。该引物的5’和3’末端分别对应于该图中的鸡MMP-2序列的位置1537-1562。设计以编码位于在用于插入pGEX-1λT GST载体的工程化内部EcoRⅠ核酸内切酶限制位点之后的位置549的鸡MMP-2蛋白起始位点和在位置551编码半胱氨酸残基的第三个上游引物，具有核苷酸序列(5’GCAGAATTCAACTGTGGCAGAAACAAG3’(SEQ ID NO 34))。该引物的5’和3’末端分别对应于该图中的鸡MMP-2序列的位置1639-1665。
将这些上游引物独立与下列下游引物之一使用，以产生源自鸡MMP-2C末端域的上述区。设计以在位置518编码鸡MMP-2蛋白终止位点、在位置517编码半胱氨酸残基、和含有用于插入GST载体的内部EcoRⅠ核酸内切酶限制位点的第一个下游引物(反义)，具有核苷酸序列(5’GTAGAATTCCAGCACTCATTTCCTGC3’(SEQ ID NO 35))。以5’-3’方向书写的该引物的5’和3’末端分别与该图中的鸡MMP-2序列的位置1562-1537部分互补。设计以在位置552编码鸡MMP-2蛋白终止位点、在位置551编码半胱氨酸残基、和含有用于插入GST载体的内部EcoRⅠ核酸内切酶限制位点的第二个下游引物，具有核苷酸序列(5’TCTGAATTCTGCCACAGTTGAAGG3’(SEQ ID NO 36))。以5’-3’方向书写的该引物的5’和3’末端分别与该图中的鸡MMP-2序列的位置1666-1643部分互补。设计以在位置637编码鸡MMP-2蛋白终止位点和含有用于插入GST载体的内部EcoRⅠ核酸内切酶限制位点的第三个下游引物，具有核苷酸序列(5’ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3’(SEQID NO 37))。以5’-3’方向书写的该引物的5’和3’末端分别与该图中的鸡MMP-2序列的位置1932-1912部分互补。
将由以特定组合使用以产生含有至少一个如上述的工程化半胱氨酸残基的上述上游和下游引物连接的鸡MMP-2羧基末端区，按照扩增高保真性PCR系统(Boehringer Mannheim)的制造商说明书独立地用55C的退火温度扩增30个循环。将产生的扩增产物独立地纯化，根据需要用BamHⅠ和或用EcoRⅠ限制性酶消化，并在连接入适当的GST融合蛋白载体(或者pGEX-3X或者pGEX-1λT，如由该上游寡聚核苷酸引物的阅读框架所表明)之前再次纯化。为连接所述扩增的MMP-2产物，在连接反应之前将所述载体类似地消化和脱磷酸。然后用产生的含有MMP-2的载体构建物通过热休克独立地转化感受态大肠杆菌菌株BL21细胞。在对阳性克隆双脱氧测序以确认导入编码序列的完整性之前，通过PCR和适当大小的GST融合蛋白的产生，筛选编码适当大小融合蛋白的质粒的菌落。基本上如上述产生其它GST-MMP-2融合蛋白那样，使用IPTG诱导的对数期培养物进行重组GST融合蛋白的纯化。
除上述鸡MMP-2 GST融合蛋白之外，制备两个人类MMP-2 GST融合蛋白，以表达成熟人类MMP-2酶原多肽的氨基酸区203-631和439-631。标明的区分别对应于鸡MMP-2区203-637和445-637。如上述对鸡MMP-2-GST融合蛋白那样，使用由国立癌症研究院，Bethesda,MD的W.G.Stetler-Stevenson博士提供的编码完整人类MMP-2开放阅读框的cDNA模板，通过PCR产生人类MMP-2-GST融合蛋白。基于先前发表的人类MMP-2序列(Collier等，J.Biol.Chem.,263:6579-6587(1988))设计上游5’引物序列，以编码导入的内部EcoRⅠ限制位点，以将扩增的产物插入适当的表达载体。
一个设计以编码位于在用于插入pGEX-1λT GST载体的工程化内部EcoRI核酸内切酶限制位点之后的位置203的人类MMP-2蛋白起始位点的上游引物，具有核苷酸序列(5’GATGAATTCTACTGCAAGTT3’(SEQ ID NO 38))。该引物的5’和3’末端分别对应于该人类MMP-2开放阅读框架序列的位置685-704。另一个设计以编码位于在用于插入pGEX-1λT GST载体的工程化内部EcoRⅠ限制位点之后的位置439的人类MMP-2蛋白起始位点的上游引物，具有核苷酸序列(5’CACTGAATTCATCTGCAAACA3’(SEQ ID NO 39))。该引物的5’和3’末端分别对应于该人类MMP-2开放阅读框架序列的位置1392和1412。
将上述引物的每种独立地与具有与结尾远离MMP-2开放阅读框架并指导蛋白在氨基酸残基631后终止的5’和3’末端与人类MMP-2序列的碱基1998和1978分别互补的一种下游引物一起使用。产生的扩增产物表达含有人类MMP-2氨基酸残基203-631(SEQ ID NO 40)和439-631(SEQ ID NO 12)的融合蛋白。
将产生的PCR产物纯化，用EcoRⅠ消化并在连接反应之前，为连接入类似地消化和脱磷酸的pGEX-1λT质粒再纯化。如上述转化细胞。
也如上述制备含有氨基酸残基410-631(SEQ ID NO 11)、439-512(SEQ ID NO 13)、439-546(SEQ ID NO 14)、510-631(SEQ ID NO 15)和543-631(SEQ ID NO 16)的其它人类MMP-2融合蛋白，以用于本发明的方法。
B．配体-受体结合检测将分别于实施例1和3中制备的αvβ5免疫反应性抗体和合成肽，通过测定其在纯化的配体-受体结合检测中拮抗αvβ5、αvβ3和αⅡbβ3受体结合活性的能力进行筛选。这些结合研究的方法已由Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:10003-10007(1993)、Smith等，J.Biol.Chem.,265:11008-11013(1990)和Pfaff等，J.Biol.Chem.,269:20233-20238(1994)描述，其说明书通过引用结合到本文中。
描述了在配体-受体结合检测中鉴别拮抗剂的方法，其中该受体被固定到固相支持体上，并且该配体和拮抗剂是可溶性的。亦描述了一种配体-受体结合检测，其中该配体被固定到固相支持体上，并且该受体和拮抗剂是可溶性的。
简言之，以50纳克(ng)/孔的包被浓度将选择的纯化整联蛋白独立地固定于Titertek微滴定孔中。用于所述配体-受体结合检测的受体的纯化是本领域众所周知的，并可以用本领域一般技术人员熟悉的方法容易地得到。于4C温育18小时后，用Tris缓冲盐水中的10毫克/毫升(mg/ml)牛血清白蛋白(BSA)封闭平板上的非特异性结合位点。对于抑制研究，测试选定抗体或肽的各种浓度的阻断125I-玻连蛋白或其它标记的配体与整联蛋白受体αvβ5、αvβ3、αvβ1和αⅡbβ3结合的能力。
尽管这些配体表现出对特定整联蛋白的最佳结合，例如玻连蛋白对αvβ5和αvβ3，血纤蛋白原对αⅡbβ3，使用阻断玻连蛋白与所述受体之一的结合的或者抗体或者肽的结合抑制研究，使得可以精确地测定半最大抑制受体与配体结合必需的以微摩尔浓度(μM)计的量。使用浓度为1nM的放射性标记的配体，并用未标记合成肽独立地竞争结合。3小时温育后，清洗除去游离的配体，并通过γ计数检测结合的配体。
因此，将本文描述的配体-受体结合检测用于筛选表现出对特定整联蛋白受体(具体地说即αvβ5)选择性特异性的环状或线性合成肽以及单克隆抗体和有机分子，做为实践本发明中的玻连蛋白受体(αvβ5)拮抗剂使用。8．通过嵌合小鼠人检测测定的用αvβ5拮抗剂的肿瘤组织生长的体内退化通过用人新生儿包皮代替SCID小鼠皮肤的一部分，制备体内嵌合小鼠人模型。基本上如Yan等，J.Clin.Invest.,91:986-996(1993)所述制备该体内嵌合小鼠人模型。简言之，从SCD小鼠(6-8周龄)手术切除2cm2正方面积，并用人包皮代替。将该小鼠麻醉，并通过剃须从侧腹区的每边5cm2区除去毛发。通过除去皮肤全厚度直至筋膜，制备两个环状的2cm2移植床。将源自人新生儿包皮的同样大小的全厚度人皮肤移植物置于该创口床并缝合到位。使用缝合至皮肤的Band-Aid覆盖该移植物。使用微孔纱布(clothtape)覆盖该伤口。
建立该皮肤移植物后，用黑素瘤细胞接种该人类包皮。使用M21L人类黑素瘤细胞系，以在该SCID小鼠上的人皮肤移植物上形成人类实体瘤。将2×106M21L的单细胞悬浮液皮内注射入该人类皮肤移植物。然后观察该小鼠2-4周，以使可测定的人类肿瘤生长。
在可测定的肿瘤建立后，将250μg的或者具有SEQ ID NO 9(含RGD环状肽Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-NMeVal)的肽(体积为100μl)或者对照肽环Arg-βAla-Asp-D-Phe-Val在三周内每周三次腹膜内注射入该小鼠。该时间结束时，摘除该肿瘤并通过重量和组织学分析。
结果示于图9，其中以mm3计的肿瘤体积在Y轴上相对于X轴上的肽处理作图。与肿瘤体积大于300mm3的对照肽(标记为肽601)相比，在该图中标记为肽189的具有SEQ ID NO 9的测试肽显著地将肿瘤体积降低至约25mm3。
因此，通过静脉内使用αvβ5拮抗剂肽189阻断αvβ5受体，导致该模型系统中黑素瘤肿瘤的退化，与前述CAM和兔眼模型系统中的方式一样。
在用M21-L黑素瘤肿瘤细胞在该小鼠人嵌合检测系统中的其它实验中，将用mAB LM609的应答与用合成肽85189(SEQ ID NO 9)与对照合成肽69601(SEQ ID NO 5)相比得到的应答相比较。如上述进行检测。示于图21中的结果证实，与肿瘤体积为约360mm3的对照肽相比，合成肽85189显著地将肿瘤体积降低至约25mm3。mAB LM609亦显著地将肿瘤体积降低至60mm3。
因此，通过静脉内使用αvβ3特异性LM609抗体和肽阻断αvβ3受体，导致与本发明描述的其它模型系统相比的该模型系统中癌的退化。
在使用具有可测定M21-L中瘤的SCD小鼠模型的另外检测中，在一初步分析中，对以10-250μg/ml浓度范围注射的肽69601(对照)和85189(测试)进行剂量反应曲线。确定处理后切除的肿瘤的平均体积和重量，结果分别示于图22A和22B。与用对照肽处理相比，肽85189在测试浓度范围内有效抑制M21-L中瘤生长，最有效的剂量为250μg/ml。
为分析肽85189随时间进程的处理效力，在同一SCD肿瘤模型中评价两个处理制度。在一个检测中，在第6天时开始用或者肽85189或者69601处理，第0天则是将3×106细胞的M21-L中瘤皮下注射入小鼠皮肤，每隔一天用250μg/ml的肽85189或对照69601腹膜内注射直至29天。同样地进行另一检测，除了在第20天时开始处理。在检测结束时，切除肿瘤并测定以mm3计的平均肿瘤体积。以此值±平均标准差将该数据作图。
分别示于图23A和23B中的这些检测的结果表明，取决于特定的处理制度，肽85189而不是69601抑制开始处理后各天的肿瘤生长。因此，肽85189是血管发生和由此的肿瘤生长的有效的αvβ5拮抗剂。
亦将该SCID/人嵌合模型用于评价本发明的其它αvβ5拮抗剂的效力，即先前制备的抗体、MMP-2制备物和有机分子，后者如实施例10中所述制备。9．制备αvβ5介导的视网膜血管发生的鼠小鼠模型以及用αvβ5拮抗剂的抑制基于实施例2C中对αvβ3和αvβ5在视网膜新血管组织中表达的观察，使用一新的小鼠模型研究系统给予这两种整联蛋白的环状肽拮抗剂对视网膜血管发生的影响。新生小鼠以与在其它哺乳动物和人类中观察到的类似方式，在出生后的头二周内发育视网膜脉管，在此期间表面视网膜血管系统形成了丰富、高度分枝的脉管网络，其起始于视神经头并向周边辐射覆盖视网膜表面(Jiang等，Glia,15:1-10(1995)。
对于该模型，用环状肽kRGDfV(SEQ ID NO 4)(亦称为肽203)或对照肽RADfV(SEQ ID NO 5)从第0天开始，每天二次皮下注射新生小鼠4天。在出生后第5天，取出眼球并于室温在4.0％多聚甲醛(PFA)中固定。
为定量小鼠视网膜血管发生，测定从视神经头至选自12小时时钟的六个相等扇形中每个的单根脉管的最远点的距离。计算平均距离，并与从整个同窝仔中得到的类似数据平均。为测定视网膜血管的总体积，以2.0μm光学切片扫描整个样本并数字化储存数据。然后使用Bio-Rad Lasersharp软件的“种子(seed)”功能以确定阈值，并计数每个切片中的立体像素。写入一个宏以计算所有切片的体积总和并确定所有血管结构的值。
直接从照片测定血管的二维生长(的结果表明)，与对照肽相比，系统给予的肽拮抗剂203抑制视网膜血管发生的40％(N=9,p＜.0000001，配对t-测试)。在未处理的新生小鼠与接受肽203的5日龄小鼠之间未观察到统计学差异，因此该肽有效地抑制血管发生。另外，在未处理5日龄小鼠和同日龄的接受对照肽的小鼠之间未观察到统计学差异。因此，当与未处理对应物相比时，RGDfV处理的新生小鼠的视网膜血管发生的抑制为100％有效。
使用一个采用脉管生长三维本质的更为定量的分析，与对照相比，在肽203处理的动物中观察到视网膜血管体积减少78％。203处理的动物的出生后第5天的平均脉管体积为3.6×106μm3，在对照处理的动物中为15.7×106μm3。未处理新生小鼠中视网膜血管所占体积与5日龄203处理的动物无法区别。
上述得到的结果显示，所述拮抗剂特异性地阻断新血管形成，而对已建立的血管无影响。所述结果表明，视网膜新血管疾病的病理学与视网膜下新血管形成疾病观察到的不同，并且αvβ5拮抗剂有效地治疗患有与血管发生相关的盲眼疾病的患者。
使用如分别于实施例7和实施例10描述的制备的MMP-2和有机模拟物αvβ5拮抗剂进行类似的检测。
10．制备有机分子αvβ5拮抗剂有机αvβ5拮抗剂化合物7、9、10、12、14、15、16、17和18的合成在以下描述，并亦示于注释的图中。然后将称为本发明的有机模拟物的产生的有机分子用于抑制αvβ5介导的血管发生的方法中。
对于下述的每个合成物，在Perkin-Elmer 241分光光度计UV上测定旋光，并在Beckman DU-70光度计上记录可见光谱。在Bruker AMX-400和AMX-500光度计上于400和500 MHz下记录1H和13C NMR谱。将快速原子轰击(FAB)条件下，在VG ZAB-ZSE质谱仪记录高分辨率质谱(HRMS)。用70-230目硅胶进行柱层析。在Merck Art.5744(0.5mm)上进行制备性TLC。在Thomas Hoover装置上测定熔点。
A．化合物1如图10中描绘的t-Boc-L-酪氨酸苄酯

化合物1
于25℃向0.10M(M)二氯甲烷中的N-(叔丁酯基)-L-酪氨酸(t-Boc-L-酪氨酸)(1.0当量；Aldrich)的溶液中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(1.5当量)，并搅拌1小时。接着，加入1.5当量苯甲醇，并将该混合物于25℃再搅拌12小时。然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释该反应混合物，并用水洗涤二次(2X)，用盐水洗涤一次(1X)并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物。亦可从Sigrna购得化合物1-t-Boc-L-酪氨酸苄酯。
B．化合物2如图10步骤Ⅰ中描绘的(S)-3-(4-(4-溴丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸苄酯

化合物2将t-Boc-L-酪氨酸苄酯(2克，5.38mmol；如上述合成)、1,4-二溴丁烷(1.9ml,16.2 mmol；Aldrich)、碳酸钾(5g)和18-冠醚-6(0.1g；Aldrich)的混合物于80℃加热12小时。冷却后，滤掉沉淀并将该反应混合物在真空中蒸发至干燥。然后使用100％己烷通过结晶纯化该粗产物，产生2.5g(92％)的化合物2。C．化合物3如图10步骤ⅱ中描绘的(S)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸苄酯

化合物3将化合物2(2.5g,4.9mmol)与叠氮钠(1.6g,25mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(20ml)中于25℃搅拌12小时。然后蒸发溶剂，并将残留物用水(约10ml)处理，并用乙酸乙酯萃取二次。将有机层合并，借助硫酸镁干燥并蒸发，产生无色浆的2.0克(90％)化合物3(FAB-MS:469(M+H+)。
D．化合物4如图10步骤ⅲ中描绘的(S)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-氨基-丙酸苄酯

化合物4将化合物3(2.0g(4.4mmol))溶解于三氟乙酸(TFA；2ml)，并于室温搅拌3小时。在真空中蒸发产生无色浆的1.6克(定量的)的化合物4，它不用进一步纯化即用于下一步。FAB-MS:369(M+H+)。E．化合物5如图10步骤ⅳ中描绘的(S)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸苄酯

化合物5将化合物4(1.6g；4.3mmol)、丁磺酰氯(0.84ml；6.6mmol)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发，并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至干燥后，通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物，产生1.4克(67％)的非晶形固体的化合物5。
F．化合物6如图10步骤ⅴ中描绘的(S)-3-(4-(4-氨基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸

化合物6将化合物5(1.3g(2.6mmol)溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)并在氢气中(1个大气压；Parr Shaker装置)于25℃在存在100mg钯(在活性炭上10％)时氢化。3小时后，滤掉该催化剂，并将溶剂蒸发，产生油状残留物的化合物6。在从水中冻干后，得到白色粉末的1.0克(定量)的化合物6。FAB-MS:373(M+H+)。
G．化合物7如图10步骤ⅵ中描绘的(S)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸

化合物7将二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的化合物6(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8 mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60℃加热12小时。冷却后，在真空中蒸发溶剂，并通过HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)纯化残留物，冻干后产生白色非晶形粉末的50mg(25％)化合物7。FAB-MS:415(M+H+),m.p.:70℃。
H．化合物8如图11步骤ⅲ中描绘的(S)-3-(4-(4-氨基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸

化合物8
将化合物3(0.5g(1.07mmol)溶解于10ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.1ml三氟乙酸(TFA)，并在氢气中(1个大气压；Parr Shaker装置)于25℃在存在30mg钯(在活性炭上10％)时氢化。3小时后，滤掉该催化剂并将溶剂蒸发，产生油状残留物的化合物8。在从水中冻干后，得到白色粉末的370毫克(定量)的化合物8。FAB-MS:353(M+H+)。
I.化合物9如图11步骤ⅳ中描绘的(S)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸

化合物9将二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的化合物8(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60℃加热12小时。冷却后，在真空中蒸发溶剂，并通过HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)纯化残留物，冻干后产生白色非晶形粉末的160mg(90％)化合物7。FAB-MS:395(M+H+)。
J．化合物10如图12步骤ⅰ-ⅵ中描绘的(R)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸

化合物10使用与合成化合物7相同的反应顺序制备D-酪氨酸类似物10，如下述使用中间体化合物100-600以形成化合物10，得到205 mg的白色非晶形物质FAB-MS:415(M+H+)。
1)化合物100如图12中描绘的t-Boc-D-酪氨酸苄酯

化合物100于25℃向0.10M(M)二氯甲烷中的N-(叔丁酯基)-L-酪氨酸(t-Boc-L-酪氨酸)溶液(1-0当量；Aldrich)中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(1.5当量)并搅拌1小时。接着，加入1.5当量苯甲醇，并将该混合物于25℃再搅拌12小时。然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释该反应混合物，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X，并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物。
2)化合物200如图12步骤ⅰ中描绘的(R)-3-(4-(4-溴丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸苄酯

化合物200将t-Boc-D-酪氨酸苄酯(2克，5.38mmol；如上述合成)、1,4-二溴丁烷(1.9ml,16.2mmol；Aldrich)、碳酸钾(5g)和18-冠醚-6(0.1g；Aldrich)的混合物于80℃加热12小时。冷却后，滤掉沉淀并将该反应混合物在真空中蒸发至干燥。然后使用100％己烷通过结晶纯化该粗产物，产生2.5g(92％)的化合物200。
3)化合物300如图12步骤ⅱ中描绘的(R)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸苄酯

化合物300将化合物200(2.5g,4.9mmol)与叠氮钠(1.6g,25mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(20ml)中于25℃搅拌12小时。然后蒸发溶剂并将残留物用水(约10ml)处理，并用乙酸乙酯萃取二次。将有机层合并，借助硫酸镁干燥并蒸发，产生无色浆的2.0克(90％)化合物300(FAB-MS:469(M+H+)。
4)化合物400如图12步骤ⅲ中描绘的(R)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-氨基-丙酸苄酯

化合物400将化合物300(2.0g(4.4mmol)溶解于三氟乙酸(TFA；2ml)并于室温搅拌3小时。在真空中蒸发，产生无色浆的1.6克(定量的)的化合物400，它不用进一步纯化即用于下一步。FAB-MS:369(M+H+)。
5)化合物500如图12步骤ⅳ中描绘的(R)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸苄酯

化合物500将化合物400(1-6g；4.3mmol)、丁磺酰氯(0.84ml；6.6mmol)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至干燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物，产生1.4克(67％)的非晶形固体的化合物500。
6)化合物600如图12步骤ⅴ中描绘的(R)-3-(4-(4-氨基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸

化合物600将化合物500(1.3g(2.6mmol)溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)，并在氢气中(1个大气压；Parr Shaker装置)于25℃在存在100mg钯(在活性炭上10％)时氢化。3小时后，滤掉该催化剂并将溶剂蒸发，产生如油状残留物的化合物600。在从水中冻干后，得到白色粉末的1.0克(定量)的化合物600。FAB-MS:373(M+H+)。
7)化合物10如图12步骤ⅵ中描绘的(R)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸将二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的化合物600(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60℃加热12小时。冷却后，在真空中蒸发溶剂，并通过HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)纯化残留物，冻干后产生白色非晶形粉末的50mg(25％)化合物10。FAB-MS:415(M+H+),m.p.:70℃。5)化合物11如图4中描绘的(S)-3-(4-(4-叠氮基丁氧基)苯基-2-(10-樟脑亚磺酰氨基)-丙酸苄酯

化合物11将化合物4(1.0g；2.7mmol)、1 0-樟脑磺酰氯(6.6mmol；AldrichChemical Company)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至干燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物，产生1.4克(67％)的非晶形固体的化合物11。
L．化合物12如图4步骤ⅰ-ⅱ中描绘的(S)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-(10-樟脑亚磺酰氨基)-丙酸

化合物12按照以下条件将化合物11氢化和脒基化得到化合物12步骤ⅱ将化合物11(1.3g(2.6mmol)溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)，并在氢气中(1个大气压；Parr Shaker装置)于25℃在存在100mg钯(在活性炭上10％)时氢化。3小时后，滤掉该催化剂并将溶剂蒸发，产生油状中间体胺。在从水中冻干后，得到白色粉末的1.0克(定量)的中间体胺，接着如下述进行步骤ⅱ将二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的上述形成的中间体胺化合物(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich Chemical Company)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60℃加热12小时。冷却后，在真空中蒸发溶剂，并通过HPLC(LichrocartRP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA99∶1至1∶99)纯化残留物，冻干之后产生白色非晶形粉末的50mg(25％)化合物12。FAB-MS:509.6(M+H+)。
M．化合物13如图13中描绘的(S)-3-(4-(5-溴戊氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸苄酯

化合物13将t-Boc-L-酪氨酸苄酯(4.5克，12.1mmol；如上述合成的化合物1)、1,5-二溴戊烷(5ml,36.7mmol；Aldrich)、碳酸钾(10g)和18-冠醚-6(0.25g；Aldrich)的混合物于80℃加热12小时。冷却后，滤掉沉淀并将该反应混合物在真空中蒸发至干燥。然后使用100％己烷通过结晶纯化该粗产物，产生5.35g(85％)的化合物13。N．化合物14如图13步骤ⅰ-ⅴ中描绘的(S)-3-(4-(5-胍基戊氧基)苯基-2-丁亚磺酰氨基-丙酸

化合物14与上述使用中间体化合物1-6形成化合物7的程序或使用化合物100-600形成化合物10的上述公开的程序相同地进行溴-叠氮化物-交换、Boc-切割、用丁磺酰氯磺酰化、用DPFN氢化和脒基化的五步骤反应顺序。得到白色粉末的化合物14 FAB-MS:429(M+H+)。
O．化合物15如图14中描绘的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基乙基)苯氧基)-2-噁唑烷二盐酸盐1)合成化合物15的原材料2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐

化合物15通过酯化0.10M甲醇和稀1％HCl中的(D或L)N-(叔丁酯基)-L(D)-酪氨酸(t-Boc-L(D)-酪氨酸)(1.0当量；Sigma)，得到原材料2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐。将该混合物于25℃搅拌12小时，然后用碳酸钾中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐。
2)合成化合物1 5的原材料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步骤程序如下将二氯甲烷(0.10M)中的对氨基-苄腈(1.0当量；Aldrich)与2,3-环氧丙醇(1.0当量；Aldrich)于25℃搅拌12小时。接着在真空中除去溶剂并如下述将粗4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈进行到下一步骤将25℃的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈(1.0当量；如上述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(potassium tert-butylate)(1.1当量；Aldrich)于110℃搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷，并将其进行到如下述的下一步骤将二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷(1-0当量；如上述)与1.1当量硫化氢、1.1当量甲基碘和1.1当量乙酸铵于25℃搅拌。将该反应混合物搅拌6小时，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到所述脒，并将其进行到如下述的下一步骤将1.0当量的如上述合成的脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1当量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亚氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25℃保护并搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂，并将粗产物在0.10M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。将该反应混合物在0℃搅拌6小时，然后用水(5当量)淬火，并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中间体2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶联，形成化合物15的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2N-BOC-氨乙基)苯氧基甲基-2噁唑烷将1.9克2-N-BOC-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)于室温搅拌30分钟。搅拌后，加入10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)，并于室温再搅拌15分钟。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到化合物15的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2N-BOC-氨乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并将其进行到下一步骤。
4)将化合物15的保护形式脱保护形成化合物15:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷二盐酸盐，图14将化合物15的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2N-BOC-氨乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述合成)用4ml 2NNaOH于室温处理4小时。然后接着于0℃至25℃滴加二氧杂环己烷中的40ml 2N HCl溶液处理3小时。然后将该反应混合物用碳酸氢钠(5当量)淬火，并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物15:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷二盐酸盐；m.p.165℃(d)。P．化合物16如图14中所示的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷1)合成化合物16的原材料2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐

化合物16通过酯化0.10M甲醇和稀1％HCl中的((D或L)酪氨酸)(1.0当量；Sigma)，得到原材料2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐。将该反应混合物于25℃搅拌12小时，然后用碳酸钾中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀释，用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并对粗产物如下处理将上述化合物(4.3mmol)、丁磺酰氯(6.6mmol)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至干燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物，产生标题化合物。
2)合成化合物16的原材料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步骤程序如下将二氯甲烷(0.10M)中的对氨基-苄腈(1.0当量；Aldrich)与2,3-环氧丙醇(1.0当量；Aldrich)于25℃C搅拌12小时。接着在真空中除去溶剂并如下述将粗4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈进行到下一步骤
将25℃的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈(1.0当量；如上述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(1.1当量；Aldrich)于110℃搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷，并将其进行到如下述的下一步骤将二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述)与1.1当量硫化氢、1.1当量甲基碘和1.1当量乙酸铵于25℃搅拌。将该反应混合物搅拌6小时，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到所述脒，并将其进行到如下述的下一步骤将1.0当量的如上述合成的该脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1当量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亚氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25℃保护，并搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并将粗产物在0.10M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。将该反应混合物在0℃搅拌6小时，然后用水(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中间体2-N-BOC-丁磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶联，形成化合物16的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2噁唑烷将1.9克2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)于室温搅拌30分钟。搅拌后，将10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)加入，并于室温再搅拌15分钟。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物16的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并将其进行到下一步骤。
4)将化合物16的保护形式脱保护形成化合物16:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷，图14将化合物16的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述合成)用4ml 2N NaOH于室温处理4小时。然后接着于0℃至25℃滴加二氧杂环己烷中的40ml 2N HCl溶液处理3小时。然后将该反应混合物用碳酸氢钠(5当量)淬火，并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到化合物16:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷；m.p.236-237℃。Q．化合物17如图14中所示的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷1)合成化合物17的原材料2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐

通过酯化0.10M甲醇和稀1％HCl中的((D或L)酪氨酸)(1.0当量；Sigma)，得到原材料2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐。将该反应混合物于25℃搅拌12小时，然后用碳酸钾中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂，并对粗产物如下处理将上述化合物(4.3mmol)、丙磺酰氯(6.6mmol)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和水洗涤。在蒸发至干燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物，产生标题化合物。
2)合成化合物17的原材料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步骤程序如下将二氯甲烷(0.10M)中的对氨基-苄腈(1.0当量；Aldrich)与2,3-环氧丙醇(1.0当量；Aldrich)于25℃搅拌12小时。接着在真空中除去溶剂并如下述将粗4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈进行到下一步骤
将25℃的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈(1.0当量；如上述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(1.1当量；Aldrich)于110℃搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷，并将其进行到如下述的下一步骤将二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述)与1.1当量硫化氢、1.1当量甲基碘和1.1当量乙酸铵于25℃搅拌。将该反应混合物搅拌6小时，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到所述脒，并将其进行到如下述的下一步骤将1.0当量的如上述合成的该脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1当量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亚氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25℃保护并搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂，并将粗产物在0.10M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。将该反应混合物在0℃搅拌6小时，然后用水(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中间体2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶联，形成化合物17的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷将1.9克2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)于室温搅拌30分钟。搅拌后，将10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)加入，并于室温再搅拌15分钟。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物17的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并将其进行到下一步骤。
4)将化合物17的保护形式脱保护形成化合物17:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷，图14将化合物17的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述合成)用4ml 2N NaOH于室温处理4小时。然后接着于0℃至25℃滴加二氧杂环己烷中的40ml 2N HCl溶液处理3小时。然后将该反应混合物用碳酸氢钠(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到化合物17:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷；m.p.200℃(d)。R．化合物18如图14中所示的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷1)合成化合物18的原材料2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐

通过酯化0.10 M甲醇和稀1％HCl中的((D或L)酪氨酸)(1.0当量；Sigma)，得到原材料2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基-苯基)丙酸盐。将该反应混合物于25℃搅拌12小时，然后用碳酸钾中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并对粗产物如下处理将上述化合物(4.3mmol)、乙磺酰氯(6.6mmol；Aldrich)和三乙胺(1.5当量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室温搅拌12小时。然后将反应混合物蒸发并将残留物溶解于乙酸乙酯，用稀盐酸、水溶性碳酸氢钠和水洗涤。在蒸发至干燥后通过急骤层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯15∶1)纯化该粗产物，产生标题化合物。
2)合成化合物18的原材料3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步骤程序如下将二氯甲烷(0.10M)中的对氨基-苄腈(1.0当量；Aldrich)与2,3-环氧丙醇(1.0当量；Aldrich)于25℃搅拌12小时。接着在真空中除去溶剂并如下述将粗4-(2,3-二羟基丙氨基)苄腈进行到下一步骤
将25℃的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羟基丙氨)苄腈(1.0当量；如上述)与碳酸二乙酯(1.1当量；Aldrich)和叔丁酸钾(1.1当量；Aldrich)于110℃搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷，并将其进行到如下述的下一步骤将二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羟甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述)与1.1当量硫化氢、1.1当量甲基碘和1.1当量乙酸铵于25℃搅拌。将该反应混合物搅拌6小时，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到所述脒，并将其进行到如下述的下一步骤将1.0当量的如上述合成的该脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1当量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亚氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25℃保护并搅拌6小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂，并将粗产物在0.10M二氯甲烷和1.1当量甲磺酰氯中酯化。将该反应混合物在0℃搅拌6小时，然后用水(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中间体2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐与3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶联，形成化合物18的保护形式3-(4-BOC-眯基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2噁唑烷将1.9克2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸盐(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0当量)于室温搅拌30分钟。搅拌后，将10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-对-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)加入并于室温再搅拌15分钟。然后将该反应混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物，得到化合物18的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并将其进行到下一步骤。
4)将化合物18的保护形式脱保护形成化合物18:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙基磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷，图14将化合物18的保护形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0当量；如上述合成)用4ml 2N NaOH于室温处理4小时。然后接着于0℃至25℃滴加二氧杂环己烷中的40ml 2N HCl溶液处理3小时。然后将该反应混合物用碳酸氢钠(5当量)淬火并接着用乙酸乙酯(0.10M)稀释，并用水洗涤2X、用盐水洗涤1X并在硫酸镁上干燥。然后在真空中除去溶剂并通过硅胶柱层析纯化粗产物得到化合物18:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙基磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷；m.p.212℃(d)。
考虑到以上书面说明书已足以使本领域技术人员实践本发明。确实，除本文这些已显示的和描述外的本发明的各种修饰对本领域技术人员是明显的，并属于所附的权利要求书的范围内。
权利要求
1．产品，它包含包装材料和包含于所述包装材料之中的药物，其中所述药物有效抑制组织中的血管发生并且其中所述包装材料包含一标签，该标签表明所述药物可以用于通过抑制血管发生治疗疾病并且其中所述药物包含血管发生抑制量的αvβ5拮抗剂，该拮抗剂包含其氨基酸残基序列包括基质金属蛋白酶羧基末端域的部分的多肽，所述多肽可以结合整联蛋白αvβ5。
2．权利要求1的产品，其中所述多肽包括示于SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸残基序列。
3．权利要求1的产品，其中所述组织是炎症组织，并且所述疾病是关节炎或类风湿性关节炎。
4．权利要求1的产品，其中所述组织是实体瘤或实体肿瘤转移瘤。
5．权利要求1的产品，其中所述组织是视网膜组织，并且所述疾病是视网膜病、糖尿病性视网膜病或黄斑变性。
6．αvβ5拮抗剂，它包含其氨基酸残基序列包括基质金属蛋白酶羧基末端域的部分的多肽，所述多肽可以结合整联蛋白αvβ5。
7．权利要求6的拮抗剂，其中所述多肽包括示于SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸残基序列。
8．权利要求6的拮抗剂，其中所述多肽是融合蛋白。
9．权利要求6的拮抗剂，其中所述多肽具有示于SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸残基序列。
10．药物，它包含在药学上可接受载体中的、按照权利要求6的αvβ5拮抗剂，其中所述拮抗剂的量足以在组织中抑制血管发生。
11．在组织中抑制血管发生的方法，它包括给予所述组织包含血管发生抑制量的αvβ5拮抗剂的组合物。
12．权利要求11的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
13．权利要求11的方法，其中所述整联蛋白αvβ5拮抗剂与抑制纤维蛋白原与αⅡbβ3结合相比，优先地抑制纤维蛋白原与αvβ5结合。
14．权利要求11的方法，其中所述αvβ5拮抗剂包含其氨基酸残基序列包括基质金属蛋白酶羧基末端域的部分的多肽，所述多肽可以与整联蛋白αvβ5结合。
15．权利要求11的方法，其中所述多肽包括示于SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸残基序列。
16．权利要求11的方法，其中所述多肽是融合蛋白。
17．权利要求11的方法，其中所述多肽具有示于SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸残基序列。
18．权利要求11的方法，其中所述组织是炎症组织，并且所述血管发生是炎症组织的血管发生。
19权利要求18的方法，其中所述组织是关节炎组织。
20．权利要求19的方法，其中所述关节炎组织存在于患有类风湿性关节炎的哺乳动物中。
21．权利要求11的方法，其中所述组织是患有糖尿病性视网膜病的视网膜组织，并且所述血管发生是视网膜血管发生。
22．权利要求11的方法，其中所述组织是实体瘤或实体肿瘤转移瘤，并且所述血管发生是肿瘤血管发生。
23．权利要求11的方法，其中所述给予包括静脉内、经皮、滑膜内、肌内或口服给予。
24．权利要求22的方法，其中所述给予与化疗联合进行。
25．权利要求11的方法，其中所述给予包含单剂量静脉内给予。
26．在患者中诱导实体瘤组织退化的方法，包括给予所述患者包含足以抑制实体瘤组织新血管形成的治疗有效量的整联蛋白αvβ5拮抗剂的组合物。
27．权利要求26的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
28．权利要求26的方法，其中所述αvβ5拮抗剂是按照权利要求6的αvβ5拮抗剂。
29．抑制患者中进行新血管形成的实体瘤组织生长的方法，包括给予所述患者包含足以抑制实体瘤组织生长的治疗有效量的整联蛋白αvβ5拮抗剂的组合物。
30．权利要求29的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
31．权利要求29的方法，其中所述αvβ5拮抗剂是按照权利要求6的αvβ5拮抗剂。
32．治疗具有其中发生新血管形成的炎症组织的患者的方法，包括给予所述患者包含治疗有效量的整联蛋白αvβ5拮抗剂的组合物。
33．权利要求32的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
34．权利要求32的方法，其中所述αvβ5拮抗剂是按照权利要求6的αvβ5拮抗剂。
35．治疗其中视网膜组织中发生新血管形成的患者的方法，包括给予所述患者包含新血管形成抑制量的整联蛋白αvβ5拮抗剂的组合物。
36．权利要求35的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
37．权利要求35的方法，其中所述αvβ5拮抗剂是按照权利要求6的αvβ5拮抗剂。
38．治疗其中在血管成形术后发生平滑肌细胞迁移的组织中再狭窄的患者的方法，包括给予所述患者包含治疗有效量的整联蛋白αvβ5拮抗剂的组合物。
39．权利要求38的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
40．权利要求38的方法，其中所述αvβ5拮抗剂是按照权利要求6的αvβ5拮抗剂。
41．降低患者支持所述组织新生长需要的组织血液供应的方法，包括给予所述患者包含足以降低对所述组织的所述血液供应的治疗有效量的整联蛋白αvβ5拮抗剂的组合物。
42．权利要求41的方法，其中所述拮抗剂是融合蛋白、多肽、衍生多肽、环状多肽、单克隆抗体或有机模拟化合物。
43．权利要求41的方法，其中所述αvβ5拮抗剂是按照权利要求6的αvβ5拮抗剂。
44．权利要求24的方法，其中所述血管发生存在于患有眼病的患者中，该眼病选自糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性、假定的眼组织胞浆菌病、未熟儿视网膜病和新血管性青光眼。
45．权利要求24的方法，其中所述血管发生存在于有角膜新血管疾病的患者中，该角膜新血管疾病选自角膜移植、疱疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状胬肉和与使用隐性眼镜片相关的新血管角膜翳。
46．权利要求24的方法，其中所述血管发生由细胞因子诱导。
47．权利要求46的方法，其中所述细胞因子选自血管内皮生长因子、转化生长因子-α和表皮生长因子。
48．权利要求46的方法，其中所述细胞因子是血管内皮生长因子并且所述血管发生选自视网膜血管发生、角膜血管发生、肿瘤血管发生和炎症组织血管发生。
全文摘要
本发明描述了使用玻连蛋白α
文档编号C07K19/00GK1226254SQ97196818
公开日1999年8月18日 申请日期1997年5月30日 优先权日1996年5月31日
发明者P·布罗克斯, D·A·彻雷斯, M·弗里德兰德 申请人:斯克里普斯研究学院