专利名称：可断裂信号元件装置和方法
相关申请交叉文献本申请是美国临时申请No.60/021,367(1996年7月8日提交)和60/030,416(1996年11月1日提交)的部分续展申请，其内容纳入本文作参考。
1．引言本发明涉及诊断和检测液体中的少量物质的检测领域。更具体地，本发明涉及一种用于测定装置的可断裂信号元件，尤其是一种可断裂的、信号反射元件。在本发明的较佳实例中，采用这种信号元件的测定装置用标准的激光为基础的检测系统(如CD-ROM读头、DVD读头等)进行检测。本发明还包括用本发明的测定装置来检测分析物的分析方法。本发明的信号元件、测定装置和测定方法能检测一份试样中多种不同的分析物以及多份样品中的一种分析物。
2．发明背景2.1小规模临床测定直到最近，用来检测液体中少量分析物的大多数临床诊断测定还只是采用单独的测试；即，对单份样品进行单独测试来检测个别的分析物。近来，通过设计出了制备多份样品和自动加入试剂的装置以及能平行或迅速连续地快速分析多种试样的装置，提高了效率，节约了成本。这些自动制备试剂装置和多重自动分析仪通常被整合成一个装置。
这类大型临床实验室分析仪可在一个小时内自动或半自动地进行数百次准确测定。然而，这些分析仪十分昂贵，只有集中化实验室和大型医院才有。分析仪集中就必须要运送样品，这样就不能经常对时间紧迫的样品作应急分析。
因此，能降低该专用分析仪的成本且分布更广的简化临床测定就显得更为必需。这种努力的局限性在于临床测试的设计，测试方法应适合在患者身旁或在患者的房内使用而不需有专用的检测仪。血糖和妊娠试验是熟知的例子。
尽管该类有用的试验已有多年，但是自大约1980年起，主要的技术革新是固相免疫测定和其它条带测试(strip test)。最值得注意的是Advance＂试验(Johnson&Johnson)、RAMP＂hCG测定(Monoclonal Antibodies,Inc.),Clear Blue Easy＂(Unipath Ltd.)和ICON(Hybritech)。
Clear Blue Easy＂的所有试剂在层压膜上，它用交联的着色胶乳微球作为信号试剂。它采用毛细管迁移免疫浓缩形式。ICON是双重单克隆夹心式免疫浓缩测定。该测定方法曾经采用反射率小的仪器来定量测定。否则，所有这些方法均只是定性的。
迁移距离可作为定量测定的基础。商业上可购得的是Quantab＂(EnvironmentalTest Systems),AccuLevel＂(Syva),AccuMeter＂(ChemTrak),Clinimeter＂(CrystalDiagnostics)和Q.E.D.＂(Enzymatics)。最新的一种是温度计型测定装置(Ertinghausen G.美国专利No.5,087,556)，该装置目前还没有市售。这些系统可用来测定常规的化学分析物，如胆固醇以及治疗药物的血液水平。
这些方式的一个缺点是，只可同时方便地进行一个或几个测定。
为了填补大批量分析仪和条带测试之间的空白，一些小型的仪器被开发出来。最值得注意的Eclipse ICA＂(Biotope,Inc.)。该装置是台式、随机存取的自动离心免疫测定和化学系统。将患者的样品吸入置于转子中的盒中。在约17分钟内可进行16次测试。结果用UV/可见光光谱测定或荧光测定。测试中需要四种不同类型的盒。每种盒有相对复杂的结构。
尽管已经有了这些进展，但是仍然需要有一种简单的装置，该装置容易用于多重定量测定，最好不需要专门的检测器。
2.2空间可寻址探针阵列最近已经在固体载体上构造出了不同生物材料的空间可寻址阵列。这些探针阵列可同时分析多种分析物。例子是固定在固体载体上捕获互补分析物的寡核苷酸或肽阵列。Fodor等(Nature,Vol.364,1993年8月5日)描述了这样一种系统。连接在固体载体上的短的寡核苷酸探针与液体样品中长的DNA链中的互补序列结合；然后根据收集的杂交数据用计算机来计算核酸样品的序列。
在Fodor等描述的测定系统中，阵列被倒置在紧靠含有标记靶分子的贮液槽上的温度调节流动单元上。为了区分表面结合的分子，系统需要一个非常灵敏的检测仪。
因此，仍需要一种经济的系统，以简化形式制成空间可寻址的探针阵列，该阵列既容易检测又能在一步或尽可能少的步骤中测定液体试样中的多种测试物(即分析物)或多种液体试样中的一种测试物或分析物。
2.3空间可寻址的激光为基础的检测系统一些用于电子应用的装置能对数字信息进行空间寻址检测。特别是，根据差示反射性和透射性的信息记录潜在力，已经开发出了几种格式。
在常规音频或CD-ROM光盘上，通过在盘上形成凹痕将数字信息或数字编码的模拟信息编码在圆形塑料盘上。这些凹痕通常约为用来读取盘上信息的激光入射光束波长的八分之一至四分之一。盘上的凹痕在反射光束中引起破坏性干扰，该干扰对应于二进制的“0”位。平的盘表面将激光反射回检测器，检测器给予相应的二进制“1”位。
在另一常规情况中，反射光密度有改变的为“1”，而光密度恒定的对应于“0”。
由于盘中已经形成的有规则的凹痕来自“0”位和“1”位预定分布的母拷贝，因此能对产生的被检测器收到的信号进行处理，以再现母盘中编码的相同信息。
标准的光盘用12cm聚碳酸酯基材、金属化反射层以及保护性漆涂层制成。目前CD和CD-ROM的格式在ISO9660工业标准中有所描述，其内容纳入本文作参考。
聚碳酸酯基材是光学质量清晰的聚碳酸酯。在标准的压制或大批量制备的CD中，数据层是聚碳酸酯基材的一部分，在模塑过程中用印模(stamper)将数据压成一系列凹痕格式。在该过程中，通常是在高压下将熔融的聚碳酸酯注入模具中，然后冷却，使聚碳酸酯具有模具(或者说“印模”)的镜像图形；因而，在盘上产生了代表盘基材上二进制数据的凹痕，在母盘制作过程中，这些凹痕以印模凹痕的镜像图象格式被保留在聚碳酸酯基材中。印模母盘通常是玻璃。
凹痕以连续螺旋形式压制在CD基材中。施加在其上的金属反射层(通常是铝)确定了固体聚碳酸酯基材的形状，并且根据“凹痕”的有元将激光束差示地反射到读取装置上。在金属反射层上旋涂(spincoat)丙烯酸天然漆薄层，保护其免受磨损和腐蚀。
尽管内容相同并与CD读头兼容，但是可擦写光盘(CD-R)中的信息是以不同方式记录的。在CD-R中，数据层与聚碳酸酯基材分开。聚碳酸酯基材上压有连续的螺旋凹槽作为引导入射激光的地址。数据层用有机染料制成。尽管花青是用于这些盘的首选材料，但是通常用金属稳定化的花青化合物来代替“原料”花青。另一种材料是酞菁。在美国专利No.5,580,696中描述了一种金属酞菁化合物。
在CD-R中，有机染料层被夹在聚碳酸酯基材和金属化反射层之间，该金属反射层的介质通常是24克拉金，但也可以是银。信息通过有合适预选波长的刻录激光来刻录，激光选择性地在染料层中熔融形成“凹痕”，而不在染料中烧出通孔，它只是使染料稍稍熔化，使其变得非半透明，这样就使得读取激光束被折射而不是象标准压制的CD中的物理凹痕那样被反射回读头的传感器上。如同标准CD中那样，漆涂层可保护携带信息的层。
基于与光盘相同的理论，目前正在开发其它用来刻录和储存信息的物理格式在基材上产生差示反射率或折射率并用激光来读取。
这样一种格式称为数字视频盘(DVD)。DVD的外观与标准CD相似它的直径为120mm(4.75英寸)，外表象银色的盘子，中间有一个通孔用来啮合可旋转的驱动装置。和CD一样，数据记录在盘上微小凹痕的螺旋轨迹中，盘用激光束来读取。与CD(在ISO9660标准下，可大约储存约6亿8千万数字字节)相反，DVD可储存47-170亿数字字节。DVD的更大容量是通过将凹痕制得更小、螺旋制得更紧密(即，减少螺旋间距)和将数据记录在多达四层中(盘每面各两层)来实现的。凹痕越小，间距越紧密，读取激光波长就越要小。尽管较小的波长与标准压制的CD兼容，但是它与目前的染料为基的CD-R却不兼容。
下表比较了DVD和CD的特点
因此，单面/单层DVD可有4.7GB的数字信息。单面/双层DVD可有8.5GB的信息。双面/单层盘可有9.4GB信息，而双面/双层DVD有高达17GB的信息。
每种DVD由两片0.6mm厚的基材粘结在一起组成。根据容量的不同，盘可以有1-4层信息层。在8.5GB和17GB选项中，采用了一种半反射体，以便从盘一面进入两层信息层。
对于8.5GB和17GB的DVD选项来说，每一面的第二信息层可注塑在第二基材中，或可以光聚合物层的形式添加。在任何一种情况下，均需要一层半反射物层使两信息层可从盘的一面读取。对于17GB的DVD来说，需要制成双层基材并将它们粘结起来。
DVD激光读头被设计成能将其焦距调节至任一层的厚度，这样就能迅速、自动地读取两层。
所有上述三种格式均需要圆盘能旋转。DVD系统的标称恒定线速度为3.5-4.0米/秒(比双层级中较大凹痕稍快)，它是标准CD速度(1.2mps)的3倍多。
发明概述本发明一方面提供了用于定量和定性测定装置和方法的可断裂信号元件。
可断裂信号元件包含一个可断裂的间隔物(spacer)，该间隔物有一个与基材连接的末端，一个响应信号的末端，以及基材连接末端和信号响应末端间的断裂位点。该可断裂信号元件还包括与可断裂间隔物的信号响应末端相连的信号响应物。
信号元件上有与所选分析物第一位点连接的第一侧链成员以及与所述分析物第二位点相连接的第二侧链成员。第一和第二侧链成员赋予对可断裂信号元件的分析物专一性。
第一侧链成员与所述信号响应末端和所述断裂位点间的可断裂间隔物相连，而第二侧链成员与所述断裂位点和所述基材连接末端间的可断裂间隔物相连。
尽管所述第一和第二成员间的断裂位点随后会发生断裂，但是所选分析物同时与可断裂元件第一侧链成员和第二侧链成员的结合仍可将信号响应物束缚在信号元件的基材连接末端上；相反，如果所选分析物不能与可断裂信号元件的第一和第二侧链成员同时结合，则通过断裂会失去信号元件的信号响应物。在样品和断裂剂接触后，信号的有无可分别表示分析物的存在与否。
另一方面，本发明提供了一种测定装置，该装置包括一个固体载体基材，其上有多个可断裂信号元件以空间可寻址方式与之相连。在一些测定装置实例中，固体载体宜为塑料，而在这些例子中，最佳的是聚碳酸酯。在一些实例中，固体载体被制成碟状，其尺寸最好能兼容于已有的激光反射为基础的检测器(如音频光盘(CD)读头、只读存储器光盘(CD-ROM)读头、数字视频盘(DVD)读头等)的检测。
在某些较佳的测定装置实例中，连接的可断裂信号元件的信号响应物可反射或散射入射光，尤其是入射激光。在这些可断裂的反射信号元件实例中，信号响应物可以是金属微球，较佳的是基本由金组成的微球，最佳的是直径为1-3μm的金微球。这些实例适用于在已有的激光反射为基础的装置(如音频CD、CD-ROM或DVD读头)中检测。
本发明另一方面是在已有的测定方法中采用本发明的可断裂信号元件为基础的测定装置。通常，适于用本发明可断裂信号元件为基础的测定装置的测定方法包括下列步骤使测定装置与液体样品接触，使测定装置与能够断裂所述多个连接的可断裂信号元件的断裂剂接触，除去所述断裂的信号元件的信号响应末端，和检测连接在固体载体基材上的、受分析物束缚的、断裂的信号元件的信号响应物是否存在。
测定装置上的信号元件的空间可寻址性允许鉴定与不同信号元件结合的分析物，包括在单个测定中鉴定多种分析物。
因此，本发明在一个实例中提供了核酸杂交测定方法，其中可断裂信号元件的第一和第二侧链元件包括寡核苷酸。测定样品中的核酸与可断裂信号元件的第一和第二侧链元件同时结合可防止信号元件的信号响应末端通过断裂而丢失。
在另一方面，本发明提供了一种测定装置，该装置包含响应多个核酸序列的可断裂信号元件。本发明这一方面提供了一种装置和方法，通过与含核酸样品接触时产生的信号的空间可寻址性，可对核酸进行测序。
本发明还提供了免疫测定方法。在这些实例中，可断裂信号元件中赋予专一性的侧链元件包括抗体、抗体片段或抗体衍生物。分析物同时与第一侧链元件抗体以及第二侧链元件抗体结合可防止信号元件的信号响应末端通过断裂而丢失。
另一方面，本发明提供了一种测定装置，该装置包含一个固体载体基材，该基材与多个可断裂的信号元件相连，该基材上还编码有计算机软件形式的数字信息。
4．附图简述参看了下列附图后就能更好地了解本发明。
图1A是多个可断裂间隔物的示意图，间隔物的表面连接末端与测定装置基材的衍生位点共价连接；图1B描述了反射信号装置(金属微球)连接到多个可断裂间隔物的信号响应末端上形成可断裂的反射信号元件；图2A是核酸杂交测定的示意图，测定在加入含有核酸的样品后立即使用本发明的可断裂反射信号元件；图2B表示图2A所示测定步骤的下一步，其中样品中的寡核苷酸结合到第一可断裂信号元件的互补寡核苷酸侧链元件上，但不与第二可断裂信号元件中不同的第二组寡核苷酸侧链元件结合；图2C是图2A和2B所示测定步骤在间隔物分子断裂之后下一阶段的示意图。反射性金微球不受试样中互补寡核苷酸专一性杂交的束缚，它从测定装置的表面上除去，从而提供了空间可寻址、差异反射信号；图2D-2E表示本发明的一个方面，其中在试样中加入可溶的寡核苷酸能增加核酸杂交测定的灵敏度；图2F表示，在采用本发明的可断裂反射信号元件的核酸检测测定装置中，使用DNA连接酶可提高分析物专一性结合的强度，分析物专一性结合将可断裂间隔物的信号响应末端与测定装置的衍生基材连接在一起，从而提高了洗涤严格性和测定专一性；图3A表示采用本发明的可断裂反射信号元件的免疫测定方法。图3A描述了用连接在多个信号元件可断裂间隔物侧链元件上的抗体来结合可能存在于试样中的抗原表位位点；图3B表示图3A所示测定步骤的下一步，它描述了样品中的抗原与一个可断裂信号元件中的两个抗体结合，而样品中的抗原不与连接在第二可断裂信号元件上的第二组抗体侧链元件结合；图3C表示图3A和3B所示测定方法在信号元件间隔物断裂后的一个阶段。反射性金微球不受试样抗原与信号元件抗体专一性桥接的束缚，它从测定装置表面中除去，从而提供了空间可寻址、差异反射的信号；图4A到4G表示固体载体基材的制备过程，可断裂反射信号元件按照预定样式排列在该基材上，从而形成本发明的空间可寻址的测定装置；图5A示出了本发明中一个典型的可断裂反射信号元件的可断裂间隔物分子的化学结构，该化学结构表示在连接测定装置衍生塑料基材表面后且在用寡核苷酸侧链成员衍生前的间隔物分子结构，其中piv表示新戊酰保护基团，MMT表示单甲氧基三苯甲游基，n和m各自表示大于等于1的整数；图6进一步表示可断裂间隔物分子，该示意图特别描述了间隔物分子上易断裂的位点，并进一步指出受Piv和MMT基团保护的侧链成员的连接部位；图7A至7C表示可断裂间隔物分子与测定装置基材的活化表面连接的方式。在描述的实施例中，图7A所示基材的胺化表面被转变成图7B所示的活性酯。如图7C所示，可断裂间隔物分子通过活化的酯被连接到固体载体上；图8A和8B表示第一寡核苷酸侧链成员连接多个可断裂间隔物分子断裂位点的表面连接侧时的中间步骤；图9A和9B表示第二寡核苷酸成员连接多个可断裂间隔物分子断裂位点的信号响应侧连接的中间步骤；图10A表示本发明基本完整的可断裂反射信号元件的可断裂间隔物分子，其状态为分子已连接到测定装置的固体基材上并在微球与可断裂间隔物分子的信号响应末端连接前；图10B表示单个反射性颗粒与图10A中可断裂间隔物的信号响应末端的连接，该连接完成了本发明的可断裂反射信号元件；图11A至11G描述了可断裂反射性元件在平的圆盘基材上的各种空间可寻址排列样式，其中图11A特别确定了盘基材上可编码的地址线(adress line)，根据该地址线可以测定可断裂间隔物的位置。在图11A中，可断裂间隔物分子排列在环形轨迹中；图11B表示可断裂信号元件的螺旋排列样式，并且特别确定了特别适于啮合旋转驱动装置的盘圆环中央通孔；图11C表示一种可断裂信号元件的排列样式，该样式适于平行地测定多份样品，并能同时在中央轨道中编码解释软件；图11D示出了一个实例，其中测定装置基材被进一步细微制作以隔开各测定扇区(sector)，从而能在加样时转动测定装置而不必混合样品；图11E示出了一个实例，其中测定装置基材被进一步细微制作成迫使样品在测定装置旋转时单向流动；图11F表示可断裂信号元件空间有组织地排列样式，这种样式每次能测定20份样品中的每份样品中的50种不同的分析物；图11G示出了一种正交交叉的样式，这种样式通过螺旋与螺旋方向或螺旋特性相反的螺旋臂重叠产生；图12是检测图11A测定装置产生的分析物专一性信号的示意图；图13是用来在连接固体基材之前将寡核苷酸侧链成员印到可断裂间隔物上的印模(stamp)实例。如图所示，印模由印模片和进料片组成。印模片有通孔，通孔内装有通过带通道的进料片加入的所需化学物质。通道再与一玻璃毛细管阵列连接。在这种排列方式中，一排孔中装有相同的化学物质。可以根据需要采用不同的孔和通道方式；
图14表示寡核苷酸侧链元件的排列样式，该样式是采用图13所示印模用通过两阶段正交印制(orthogonal printing)来获得的。数字1、2、3和4代表合成中采用的不同的亚磷酰胺序列。在采用三聚物(timer)的寡核苷酸合成中，例如，1可以是AAA,2可以是AAC,3是AAG,4是AAT。每个位置中的第一个数字给出了最接近可断裂间隔物骨架的寡核苷酸构建块(building block)；第二个数字(如果有的话)代表下一个构建块。当要将本发明的可断裂反射信号元件排列在盘状基材上时，正交印制是特别有利的；图15表示在连接固体基材之前，用于将大量寡核苷酸侧链成员同时印制到可断裂间隔物上的互补凹板印制过程(complementary concave printing process)。图中没有显示出可断裂间隔物本身；图16示出了一种结构，其中单个样品被平行地引入测定装置的四个不同的扇区。如果四个扇区中的生物码元(biobit)的密度或亲和性不同，则通过检测每个阳性可断裂信号元件扇区中距加样位置最远的位置，可以测定很大的动态浓度范围；图17表示分散有可断裂间隔物的另一种测定装置结构，其中对第一分析物有专一性的侧链元件与测定装置基材直接连接，而对第二分析物有专一性的侧链元件与信号响应物直接连接，该信号响应物在这里表示为塑料微球；图18示出了分散有可断裂间隔物的另一种结构，其中第一侧链元件与测定装置基材直接连接，第二侧链元件与信号响应物直接连接，分析物使信号响应物凝集。
5．发明详述本发明的测定装置和测定方法是用可断裂信号元件来检测液体试样中的分析物。与预选的受检测分析物的结合防止了信号元件中信号响应物通过断裂而丢失。然后，通过受束缚信号元件的信号响应物产生信号来报告样品中有分析物存在。
在一个较佳的实例中，信号响应物反射或散射入射光，或者可用光来寻址。与预选的受检测分析物的结合防止了信号元件光响应物通过断裂而丢失。然后，通过受束缚信号元件的反射物使入射光(较佳的是入射激光)反射或散射来报告样品中有分析物存在。
本发明的可断裂反射信号元件特别适于采用已有的激光反射为基础的检测器(包括音频光盘(CD)读头、CD-ROM(只读光盘)读头、激光盘读头、DVD(数字视频盘)读头等)来检测。因此，通过采用本发明的可断裂反射信号元件，就很容易使已有的测定化学物质和测定方案能利用普遍安装的已有的激光反射为基础的检测器来进行检测。这样就使得每个测定的成本要低于采用专用检测器的标准测定。
而且，激光反射为基础的检测器的普遍分布还使采用本发明可断裂反射信号元件的测定能现场使用(目前则必须在有专用检测器的地方进行)。这些测定是免疫测定、细胞计数、基于杂交的遗传检测、基于核酸测序的遗传检测、核酸测序等。因此，本发明使得这些目前还必须在大型实验室中进行的测定能在研究实验室、诊所和个人家中进行。
上述的各种激光反射为基础的检测器(包括CD-ROM读头、DVD读头等)适于检测、辨别和解释其各自介质上的空间可寻址的数字信息音频CD读头能专一性地、单独地寻址单独数字编码的声道；CD-ROM读头能专一性地、单独地寻址多个二进制文件，其中包括编码计算机程序的二进制文件(ISO9660，纳入本文作参考，该标准确定了常见的可寻址文件结构)；DVD读头能专一性地、单独地寻址二进制文件和MPEG-编码的数字视频信号。
激光反射为基础的检测器的空间寻址能力目前是用来检测和解释CD上编码的信息等，它为采用本发明的可断裂反射信号元件的测定提供了特别的优点。
因此，通过多个信号元件在一个载体成员或基材上的排列样式与寻址这些单个信号元件空间位置的检测器使用相结合，就能同时测定一份样品中多种不同的分析物。因此，本发明还涉及测定装置，这些装置在这里统称为盘(disk)、生物光盘(bio-compact disk)、生物CD(bio-CD)或生物DVD(bio-CD)，其包含具有不同分析物专一性的可断裂反射信号元件的空间可寻址组合。这些有用的组合包括提高每个单独测定的预定值或专一性的组合、在不同诊断中包括(inculpate)或不包括(exculpate)特定诊断的组合、提供广泛的常规筛选工具的组合等。
专一性相同的多个信号元件按一定样式的排列还使得能用一个测定装置来检测单份分析物较大的浓度范围。因此，本发明另一方面提供了一种测定装置，该装置包含专一性相同的空间可寻址的、可断裂反射信号元件，反射信号元件的物理位置能表达浓度信息。
激光反射为基础的数字检测器的空间可寻址能力还能将解释软件和测定元件结合在一个测定装置上。因此，本发明另一方面是一种测定装置，在该装置上，软件被编码在不同于可断裂反射信号元件排列样式区域的区域中。软件可以包括校正入射激光轨迹的重要信息、测定的解释算法、标准对照值、自诊断等。软件可以包括装置的驱动程序和能远程传送诊断信息的软件。软件可以包括临床测定用的患者教育信息，并能选择观众。
本发明的可断裂反射信号元件展示的基本上为二进制的测定数据还使测定有显著的抗仪器噪扰的优点。例如，小的光反射偏差(有激光源光强度的微小偏差和反射颗粒大小的微小偏差)通常不会影响测定结果，因为当光反射达到临界值时检测器只会记录一个信号。同样，检测装置本身的电子噪扰以及与模-数转换有关的噪扰也不会影响测定结果。这个优点在设计和生产用于现场测定或在困难环境操作条件下进行测定的功能增强的检测仪器时是特别希望的。
5.1空间可寻址的、可断裂的反射信号元件在参看了附图1-3后，就能更加了解本发明的可断裂反射信号元件(也称为生物码元“bio-bit”)的大致操作，这些附图示出了本发明的两个实例。如图1所示，基材20上有一个衍生的表面21，该表面与可断裂间隔物分子30相连，每个可断裂间隔物除了有一个与表面连接的末端外，还有一个靠近金属微球40的信号响应末端。基材可以是多孔的或是固体(但固体较佳)，它可以选自各种材料，如塑料、玻璃、云母、硅等。然而，由于塑料价格便宜、易衍生来连接间隔物分子至表面，并且与已有的激光反射为基础的检测器(如CD-ROM和DVD读头)兼容，因此塑料是较佳的。可采用的典型的塑料是聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯。较佳的是聚丙烯和聚碳酸酯，最佳的为聚碳酸酯。
基材20的表面21可方便地衍生来为每个可断裂间隔物分子30提供共价键。金属球为检测与测定装置基材20结合的间隔物分子存在与否提供了方便的反射性信号产生方式。典型的金属是金、银、镍、铬、铂、铜等，而金是较佳的，因为它容易且牢固结合(例如通过配价结合)可断裂间隔物信号响应末端的游离的SH基团。金属球可以是固体金属，或由塑料、玻璃珠等制成然后熔敷一层金属层。也可用其它反射性材料来代替金属。较佳的金球应直接结合到可断裂间隔物信号响应末端的巯基上。
每个可断裂间隔物分子的一端31与载体表面21相连(例如通过酰胺键)，另一端32与信号产生装置(也称为信号响应物)相连(例如通过巯基残基与反射性金属微球40相连)。间隔物分子有一个断裂位点33，在测定步骤中，该断裂位点易受化学方式或酶方式、热、光等作用(这要视断裂位点的性质而定)而断裂。化学方式宜采用硅氧烷断裂基团和氟化钠溶液(它们分别是典型的化学断裂位点和化学断裂剂)。也可采用其它易断裂的基团，如酯基团或联硫基团。如果在使间隔物断裂后加入金球，则联硫基团是特别佳的。
断裂位点33在可断裂间隔物分子30的表面连接第一末端31和信号响应第二末端32之间。间隔物可含有两个或多个断裂位点以优化所有间隔物的全部断裂。
侧链成员(也称为侧臂)34a和34b为可断裂间隔物提供了分析物专一性，它们位于断裂位点33的相对侧；即，分别靠近可断裂间隔物分子30的表面连接末端和信号响应末端。侧链成员34a和34b的典型构型包括寡核苷酸，通常为5-20聚物，较佳的为8-17聚物，最佳的为8-12聚物，但是也可采用更长的寡核苷酸。侧链成员也可包括(没有限制，根据需要确定)肽、肽的有机连接物或蛋白质等。测定装置(也称为盘、生物相容的盘或BCD)固体表面21的任何特定衍生部位上均有大量可断裂间隔物分子30存在。
本发明一方面是使寡核苷酸侧链成员适于结合试样中存在的互补单链核酸。互补寡核苷酸包括专一性结合碱基对的成员，即一个寡核苷酸会与第二个互补的寡核苷酸结合。
如图2A至2C中更具体的描述(表示本发明的一个实例)，测定装置表面上不同部位的可断裂间隔物分子有不同的寡核苷酸侧链成员。如图2A所示，一个可断裂信号元件有寡核苷酸侧链成员34a和34b，而第二个可断裂信号元件有寡核苷酸侧链成员35a和35b。
如图2A至2C中进一步表述的，当与含寡核苷酸36的试样接触时，互补的寡核苷酸侧链成员34a和34b会结合样品中的寡核苷酸，形成如图2B所示的双螺旋。由于寡核苷酸36与寡核苷酸侧链成员35a和35b之间没有互补性，所以这些基团之间没有结合(如图2B中进一步描述的)。
当断裂位点33断开时，如果没有双螺旋结合的寡核苷酸结合的话，金属微球40会脱离表面。这在图2C中有更详细地描述。如果希望测定多份样品中的一种寡核苷酸，则不同部位的间隔物分子大致有相同的寡核苷酸侧链成员。然后可通过入射光(尤其是入射激光)是否有反射来检测金属微球40的存在与否。
图2F表示本发明的另一核酸检测实例中采用DNA连接酶来提高分析物专一性结合(该结合将可断裂间隔物信号响应末端与测定装置衍生基材连接起来)的强度，因此该实施例提高了洗涤严格性和测定专一性。
核酸检测领域的技术人员应当知道，本发明的可断裂反射信号元件特别适用于检测有确定大小的扩增核酸，尤其是用各种形式的聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、采用T7和SP6 RNA聚合酶扩增方案等扩增的核酸。
在图3A至3C描述的本发明另一个实例中，寡核苷酸侧链成员34a、34b、35a和35b与修饰的抗体38a、38b、38c和38d非共价连接，从而能进行免疫测定。修饰的抗体与侧链成员间的非共价连接通过可断裂间隔物侧链成员寡核苷酸与共价连接到抗体上的寡核苷酸之间的互补性来介导。用互补核酸分子来实现超分子结构的非共价、组合装配的方法在共有的待批美国专利申请08/332,514(1994年10月31日提交)、08/424,874(1995年4月19日提交)、08/627,695(1996年3月29日提交)中有更详细的描述，这些内容纳入本文作参考。在另一个实例中，抗体可用常规交联剂直接或通过接头与可断裂间隔物共价连接。
抗体包括第一专一性结合对的第一个成员和第二专一性结合对的第一个成员。第一专一性结合对的第二个成员以及第二专一性结合对的第二个成员是感兴趣抗原的不同表位位点。更具体地讲，寡核苷酸侧链成员35a与抗体-寡核苷酸38c相连，而寡核苷酸侧链成员35b与抗体-寡核苷酸38d相连。抗体38c和38d可与可能存在于试样中的抗原的不同表位位点结合。“抗原上不同的表位位点”指相同表位上或不同部位的不同表位中不同的、空间上分开的位点。在第二个测定元件中，寡核苷酸侧链成员34a和34b与不同的抗体38a和38b相连，而这些抗体的每一个与抗原的不同表位位点相连。
进一步参看图3A-3C表示的免疫测定，在将含有抗原39的测试溶液施加到图3A所示的一批可断裂反射信号元件上时，抗原39与抗体34a和34b结合，从而防止了金属微球40在断裂位点33断裂(例如通过与化学断裂剂的接触)时从测定装置表面20上解耦下来。相反，第二可断裂信号元件由于抗体35a和35b没有与抗原39结合的亲和力而不与抗原39结合，从而使金属微球40与固体表面分开并从样品中除去。
然后可通过入射光(尤其是入射激光)反射存在与否来检测金属微球40的存在与否。
很明显，如图所示的抗体的结合很容易使标准免疫测定化学物质和免疫测定空间结构能采用本发明的可断裂反射信号元件。在这些经典的免疫测定结构中，有一些在美国专利No.5,168,057(1992年12月1日公开，纳入本文作参考)中有进一步的描述。因此很明显，图3中示意的分析物直接测定方法唯一适用于本发明可断裂反射信号元件和测定装置的免疫测定几何结构。本发明在筛选人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人疱疹病毒的免疫测定中特别有价值。
更应明白，抗体只是广义的专一性结合对中的典型，其中抗体可被认为是专一性结合对的第一成员，而它结合的抗原是专一性结合对的第二成员。通常，专一性结合对可定义为两个分子，这两个分子间的相互亲和性具有足够的亲和性和专一性来实现本发明。因此，本发明的可断裂反射信号元件可包括其它专一性结合对成员作为侧链元件。在这些实例中，可断裂信号元件的第一侧链成员是第一专一性结合对的第一成员，可断裂间隔物的第二侧链成员是第二专一性结合对的第一成员，其中所述第一专一性结合对的所述第二成员和所述第二专一性结合对的所述第二成员相互连接，形成有以下通式的系链环第一专一性结合对的第一成员-第一专一性结合对的第二成员-第二专一性结合对的第二成员-第二专一性结合对的第一成员。
该领域熟知的专一性结合对是生物受体及其天然的拮抗剂和拮抗配体、蛋白质和辅因子、生物素和亲和素或链霉亲和素、α血影蛋白和β血影蛋白单体、抗体Fc部分和Fc受体。
尽管上述列举的实例(核酸分析物定向检测和定向免疫测定)描述成在进行测定前使反射金属球与可断裂间隔物分子连接，但是在本文中作进一步描述的这些以及其它实例中，可以考虑首先使缺少信号产生装置的可断裂间隔物分子暴露在样品中，然后使间隔物分子断裂，这样，后加入的金属球只与残留在表面上的那些间隔物分子连接。在加入金属球后，可以用合适的检测器来检测表面，以确定结合的间隔物分子和分析物。
在本发明的每个测定方法实例中，待测样品必须首先加入。一方面，测定装置是转动的，液体样品(最好是稀释的)加在圆形测定装置基材的中心附近。测定装置盘转动产生的离心力使液体样品分布在固体基材的平的表面上。通过这种方式，基材表面被均匀地覆盖上恒定、均匀分布的液体样品。
在这种施加样品的方法中，将试样(最初约为100μl)稀释成约1ml以便进行处理。将该溶液滴加在转动盘的中心附近。测定部位(可能是盘表面)是亲水的，液体会在转动的测定装置盘上形成一层非常薄的层。液体层厚度可通过滴加频率和盘转动频率来调节。较佳的厚度应小于10μm，这样，样品中所有的分子就能和间隔物连接的静止分子相互作用。覆盖盘需要约100μl的样品溶液。
施加样品的其它方法可以和本发明的可断裂反射信号元件以及测定装置一起使用。特别是，应当明白，上述转动施加主要适用于在每个测定装置中施加单份样品。本发明另一方面可能需要将不同样品施加到静止盘的具体区域。在这种情况下，测定系统可以测定大约1000种不同的样品。每种样品可用大约100万个施加在盘上预定区域中的金球。
图11D显示了有16个不同测定区的本发明测定装置。图11E显示了样品流动方向的一种可能，其中直线表示阻碍液体流动的挡板。
因此，在本发明的一个实例，测定装置被设计成每个测定装置(盘)能同时测定例如1024位患者样品中的一种分析物(即每个盘包含多个赋予相同分析物专一性的相同侧链成员的可断裂间隔物)。在这样的实例中，盘上的每个间隔物分子可以相同，以便测定相同的分析物；盘上特定位置处的间隔物分子与盘上其它位置处间隔物分子相同。这种应用特别适用于临床实验室中进行的大批量分析(同时测定大量患者样品中是否有单个分析物存在)。
也应理解，在包括不同分析物专一性的可断裂反射信号元件的单个测定装置中可测定多份样品中的多种分析物。图11F显示了可用来筛选20份样品中50种不同的生物分子的测定装置。
在以下的例子中，可以测定多份试样中限制量的相同分析物。患者的样品可以通过熟知的方法(如喷墨印制(ink jet printing)和有一次性滴头的微量移液管阵列或它们的组合)施加到盘的特定部位。对于大批量的操作，测定盘可以装在盒子，试样可以直接密封载在盘上或圆形平板的孔内。
在培育合适的时间(只需几秒，使样品在载体表面上横向移动)后，进行洗涤(但是在一些实例中不需要洗涤)，除去未结合的样品。如同常规测定那样调节洗涤严格性，以调节灵敏度和专一性。例如，在核酸检测实例中，可以降低洗涤溶液的盐浓度以提高洗涤严格性，减少分析物和赋予专一性的侧链成员间的不匹配；或可增加盐浓度，降低洗涤严格性，允许不匹配发生。在本发明的核酸杂交和免疫测定实例中，洗涤严格性的调节是该领域技术人员所熟知的。
一方面，在需要时，可以将洗涤溶液加到转动盘中心附近来洗涤圆形盘的表面。样品溶液在推出盘周围离开盘，并被收集。由于盘的转动，如果液体样品能用正常的离心力从盘上除去且不需要调节洗涤严格性的话，则可以不进行洗涤。
在洗涤(如果有的话)后，加入包含断裂剂的溶液，并再次分布在盘表面上。参看图1-3，间隔物分子有一个断裂位点33，在测定步骤中，该断裂位点易受化学或酶方式、热、光等作用(这要视断裂位点的性质而定)而断裂。化学方式宜采用硅氧烷断裂基团，而氟化钠溶液是针对硅氧烷基团的典型的化学断裂剂。也可采用其它易断裂的基团，如酯基团或联硫基团。如果在断裂间隔物后加入金球，则联硫基团是特别佳的。
当断裂位点是硅氧烷(它对自发水解非常稳定，但是在少量浓度的氟离子下很容易断裂)时，加入氟化钠溶液，溶液的浓度为1mM-1M，较佳的为50mM-500mM，最佳的为100mM(0.1M)。断裂步骤只持续几秒。尽管在该步骤中所有的间隔物都已被断裂，但是可断裂间隔物与测定装置衍生基材间的酰胺键仍在这些条件下保持稳定。
在施加样品并断裂间隔物后，必须除去分离的信号产生物(较佳的是反射物，更佳的是金属球，最佳的是金球)，以便在检测时提供差异信号。除去的步骤可以包括引入洗涤溶液的第二次洗涤步骤。
由于采用不同的洗涤严格性，在测定的该步骤中可以有几种方法，从而使不同的测定方法有不同的专一性和灵敏度。
一方面，可以通过转动测定装置(加入或不加入洗涤溶液)来除去分离的反射物。在这一方面，三个参数(金颗粒大小、转动速度和间隔物连接的化合价)可以不同，以提供不同的严格性。
适用于本发明的可断裂反射信号元件和测定装置的不同直径(直径在1nm至0.5-5微米)的金球易从Aldrich Chemical Company,British BioCell International,Nanoprobes,Inc.及其它处购得。生产本发明所需的更大或更小的金球是本领域技术人员能够实现的。在一固定的转动速度下，最大的金球受到的更大的离心力(与r3成比例)和阻力(与r成比例)，它在有相同键合程度的较小的球之前离开。这就为洗涤与定量分析的不同严格性提供了基础。
通过调节转动频率也可调节影响金球的离心力，以除去较松的、结合较弱的金球。只有已经与样品中互补分子结合的间隔物才能继续使金球结合到基材上。
另外，尽管本发明的上述实例描述了一个金球与一个可断裂间隔物的信号响应末端连接，但是应当理解，当本发明的较佳实施例中采用金时，根据金球的不同，成千个间隔物可以结合一个金球。这样，通过改变金球的直径，另外还改变可断裂间隔物与金球的相对密度，就可调节给定转动速度下的测定洗涤严格性。
因此，如果某个金球下基本上所有的间隔物均与互补分子连接的话，那么结合是非常强的。如果某一金球下只有部分间隔物被固定，则根据球径和转动频率的不同，金球可能被保留或除去。
在极端的情况下，所有的球体均被固定或是除去。这也是DNA分析所希望的。在免疫测定中，中间情况是较佳的。因此，应优化系统，使正常控制水平与50％金球固定水平对应。在如图3所示用两个抗体来结合时，较高或较低的固定水平分别对应于较高或较低的分析物浓度。
可用大的离心力来除去结合弱的金球。推动一个金球的离心力大约为0.1nN，但是该数值可以根据金球重量和盘转动频率在很大范围内变动。离心力应足以破坏抗体的非专一性结合并使不匹配的寡核苷酸机械变性。这是提高分析物与本发明可断裂信号元件间相互作用的专一性的重要因素。
当本发明的实例中可断裂间隔物的反射物是铁磁性的物质(例如是涂布金的铁珠或铁合金)时，那些通过断裂而分离的不再被分析物固定在测定装置基材上的反射物可以通过施加磁场来除去。在这种实例中，那些仍连接在测定装置(盘)基材上的信号元件也会响应金属场，但是它们的行动会受第一侧链成员-分析物-第二侧链成员的环的长度和柔度制约。在本实例中，即使移动必将受第一侧链成员-分析物-第二侧链成员的环的长度和柔度的制约，通过施加外部磁场来移动所有连接信号元件的位置也可增加其它信息。尤其是，简单地施加一个磁场可以辨别分析物诱导的信号和随机噪扰(该噪扰并不响应外部磁场的施加)。
在除去不受分析物专一性结合保护的断裂的反射信号物后，可以直接对盘进行读取。或者，在读取前先对盘消毒。在还有一个实例中，盘上可以覆盖一层透明的塑料涂层，以防止金球由于旋涂可聚合的漆(用紫外光聚合)而被进一步除去。光盘的旋涂是该领域中熟知的。预计测定盘的使用期超过10年。
然后，用激光读头扫描盘，该读头会通过反射来检测不同空间预定位置中微球或其它反射元件是否存在。根据微球距离盘旋转轴的距离以及距离地址线(地址线在盘上形成径线)的角距离，就可以具体地确定特定金属球的位置。根据该具体位置以及专一性结合对的预定位置与主分布图的比较，就可确定结合材料的相同性。因此，通过前述方式，就可以在一份液体样品中同时分析上千甚至更多的分析物。
5.2基材的衍生图4A至4G描述了固体载体基材的制备过程，基材上排列有可断裂反射信号元件从而制成本发明的测定装置。图4A示出了一部分大致平的固体载体。如图4B所示，载体的表面上涂布一层抗蚀膜22(如高熔点蜡等)。然后，用有突起24的印模23在抗蚀膜中压印制成凹痕或通孔25的图案，如图4C所示。图案非常有规则，并在载体表面上希望放置可断裂间隔物分子的所有部位形成凹痕。如图4E所示，除去图4D中所示的凹痕底部所有的抗蚀膜。对基材外露的区域21(如图4E所示)进行活化或衍生，以使结合基团(如氨基)与基材表面和任何剩余的抗蚀膜22连接(如图4F所示)。最后，除去剩下的抗蚀膜，使基材原来的表面外露，该基材表面的某些预定位点处连接有氨基(如图4G所示)。
空白盘购自Disc Manufacturing,Inc.(Wilmington,delaware)。氨基衍生可以用氨等离子体通过射频等离子体发生器(ENI,Rochester,NY)来进行。
5.3可断裂间隔物的合成和连接图1以及图5和6描述了一种典型的可断裂间隔物分子。大多数间隔物(称为骨架)是聚(亚烷基二醇)(例如聚乙二醇)，其分子量为400-10000，较佳的为400-2000。骨架的第一末端31与基材20的表面21上衍生的胺基团连接，第二末端32通过硫键51与金属微球40的表面41相连接。骨架包括一个断裂位点33，该位点在间隔物分子30的第一末端31和第二末端32之间。另外，在末端31和断裂位点33之间是侧链成员34a，该侧链成员通常由寡核苷酸构成；在断裂位点33和末端32间是另一个侧链成员34b，它通常由寡核苷酸构成。或者这些侧链成员可以是肽或其它有机分子。可以有两个以上的侧链成员，但是只需要两个成员就能在断裂位点周围形成一个连接的分子环，从而使得在断裂位点断裂后间隔物分子仍与基材表面相连。这些侧链成员可以通过接头(如聚乙二醇)与间隔物骨架相连。
图5所示的可断裂间隔物分子30的一种合成方式基本上大致如下将二甲基氯硅烷连接在一个聚乙二醇分子的两端。掺入分子的硅烷基团在催化量的氯铂酸存在下在N-丙烯酰丝氨酸中反应。两个丝氨酸部分的羟基在以后的合成中用来构建寡核苷酸侧链成员。先用单甲氧基三苯基甲基来保护一个羟基，产物用液相层析纯化。然后用新戊酰基或芴基甲氧羰基(FMOC)来保护另一个羟基。丝氨酸的羧基与聚乙二醇的氨基末端相连。另一端的氨基用3-(2-吡啶联硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯作进一步衍生。另一氨基不进行反应，以便在以后自由地与衍生的基材反应。
下面更详细地描述了另一种但基本相似的间隔物分子的合成及其制备方法。间隔物分子的结构如图5所示。合成开始先构建间隔物分子的中间部分。然后，用例如二甲基氯硅烷来硅烷化聚乙二醇的两端，以提供化合物Ⅰ结构式的化合物。
然后用直链或支链、有末端双键的诸如乙烯乙酸的链烯酸(如CH=CH(CH2)nCOOH,n=1-11，但是碳原子数并不重要，例如乙烯乙酸、丙烯酸等)对硅烷基团进行衍生，以形成有化合物Ⅱ结构式的化合物，然后进一步反应，在硅烷两端保护羟基，以便使化合物Ⅲ结构式的化合物以后连接寡核苷酸。
可采用各种常见的反应剂来实现这个目的，当在催化剂(如氯铂酸)存在下进行反应时，N-丙烯酰基丝氨酸和TMT-丝氨酸甲酯是典型的较佳反应剂。加入醇溶剂中的碱金属氢氧化物(如氢氧化钠)，使获得的酯部分水解，而邻近的受保护的羟基最好水解产生化合物Ⅳ结构式表示的化合物。
末端为氨基的聚乙二醇的一端用硫酯(如3-(2-吡啶联硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)衍生，并与化合物Ⅳ连接，产生化合物Ⅵ结构式表示的化合物。使末端酯基团水解，产生酸，然后再与甲氧基乙酸反应，从而获得化合物Ⅷ结构式表示的化合物。用胺化的聚乙二醇处理该化合物，生成基本上如图5所示的完整的间隔物分子。
制备1化合物Ⅰ在100ml二氯甲烷(DCM)中的聚乙二醇(10g,10mmol，平均分子量1000Aldrich Chemical Company)和三乙胺(TEA)(2.1g,21mmol)的混合物中，滴加入冰浴冷却的20ml的DCM中2.0g二甲基氯硅烷。10分钟后，过滤反应混合物，将过滤物上柱于200g二氧化硅柱。用DCM/MeOH(19∶1)洗脱，获得聚乙二醇、二(二甲基甲硅烷基)醚和化合物Ⅰ结构式表示的化合物。
化合物Ⅰ制备2化合物Ⅱ将化合物Ⅰ(10g,9mmol)和乙烯基乙酸(1.72g,20mmol)溶解在60ml乙酸乙酯(EtoAc)中。加入催化量(40mg)的氯铂酸，将混合物加热至沸腾，并沸腾1小时。冷却后，直接将溶液加入200g二氧化硅柱中。柱用EtoAc和EtoAc/MeOH(9∶1)洗脱，获得聚乙二醇、二(2-羧乙基二甲基甲硅烷基)醚和混合物Ⅱ结构式代表的化合物。
化合物Ⅱ制备3化合物Ⅲ将化合物Ⅱ(9.5g,8mmol)和三甲氧基三苯甲游基丝氨酸甲酯(7.0g,16mmol)溶解在100ml DCM中。在室温下滴加30ml DCM中的二环己基碳化二亚胺(DCC)(3.25g,16mmol)。1小时后，过滤反应混合物。将过滤物直接加入300g二氧化硅柱中。柱用DCM/TEA(99∶1)洗脱，再用DCM/MeOH/TEA(94∶5∶1)洗脱。获得化合物Ⅲ结构式代表的化合物。
化合物Ⅲ制备4化合物Ⅵ将化合物Ⅲ(10g,5mmol)溶解在100ml EtOH中，加入10ml 0.5M EtOH中的NaOH使其部分水解。加入300mg(5mm0l)乙酸使混合物稍稍酸化。邻近羧酸基团的TMT-基团最好被水解。30分钟后，加入0.5ml四乙胺(TEA)使混合物稍稍呈碱性。用反相柱HPLC来对EtOH溶液分级，柱用EtOH/水/TEA(90∶9∶1)来洗脱。获得化合物Ⅳ结构式代表的化合物。
化合物Ⅳ制备5化合物Ⅴ将O,O＇-二(氨基丙基)聚乙二醇(9.5g,5mmol，平均分子量1900)、三乙胺(0.5g,5mmol)和3-(2-吡啶联硫基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.77g,2.5mmol)溶解在150ml DCM中。混合物在室温下搅拌1小时，使体积浓缩一半，然后在200g二氧化硅柱中分级。柱用DCM/MeOH(95∶5)洗脱，获得化合物Ⅴ结构式代表的化合物。
化合物Ⅴ制备6化合物Ⅵ化合物Ⅳ(3.5g,2mmol)和化合物Ⅴ(4.4g,2mmol)溶解在100ml DCM中，加入在5ml DCM中的450mg(2.2mmol)DCC。1小时后，过滤混合物，并在150g二氧化硅柱中分级。柱用DCM/MeOH/TEA(94/5/1)洗脱，获得化合物Ⅵ结构式代表的化合物。
化合物Ⅵ制备7化合物Ⅶ将化合物Ⅵ(6.0g,1.5mmol)溶解在50ml EtOH中，加入3ml 0.5M的NaOH乙醇溶液。30分钟后，用反相HPLC纯化产物，用EtOH/水/TEA EtOH/水/TEA(90∶9∶1)作为洗脱剂，获得化学式Ⅶ结构式代表的化合物。
化合物Ⅶ制备8化合物Ⅷ将化合物Ⅶ(4.0g,1mmol)溶解在80ml DCM。加入5ml DCM中的320mg(2mmol)甲氧基乙酸酸酐和202mg(2mmol)三乙胺。用旋转式汽化器将化合物蒸干。残余物用反相HPLC纯化，用EtOH/水/TEA EtOH/水/TEA(90∶9∶1)洗脱，获得化合物Ⅷ结构式代表的化合物。
化合物Ⅷ制备9化合物Ⅸ将化合物Ⅷ(4.0g,1mmol)和O,O＇-二(氨基丙基)聚乙二醇(4.8g,2.5mmol，平均分子量为1900)溶解在100ml DCM中，加入5ml DCM中的230mg(1,1mmol)DCC。1小时后，过滤混合物，使混合物在100g二氧化硅柱中分级，用DCM/MeOH/TEA(94/5/1)洗脱，获得基本上如图5所示的化合物Ⅸ结构式代表的化合物。
化合物Ⅸ5.4可断裂间隔物与基材的连接每个间隔物分子的一个末端31(例如通过酰胺键)与基材表面21相连。为了使间隔物分子与氨基活化的基材相连，使戊二酐与氨基反应，暴露出羧化物基团(图7A和7B中更具体地示出)。羧化物基团可用五氟苯酚酯化。间隔物分子上游离的氨基会与该活性酯连接。图7C中特别显示出了间隔物分子及其与固体载体表面21具体部位的连接。在制备的这一阶段中，羟基仍被保护。尽管寡核苷酸侧链成员可以在连接到固体表面载体21上之前预先合成到间隔物上，但是较佳的是在将间隔物分子30连接到固体载体上后再连接寡核苷酸侧链成员。
5.5信号响应物的设计和连接本发明的一个特点是信号响应物的检测与以预定的空间可寻址样式排列在测定装置表面上的可断裂间隔物分子相关联。因此，本发明提供了用于连接信号响应物和检测与可断裂间隔物分子相关的信号的方法、组合物和装置。
5.5.1作为信号响应物的金颗粒在本发明的一些较佳的实例中，采用能反射或散射光的颗粒作为信号响立物。反射和/或散射光的颗粒是能弹性地(即基本上不吸收光能)反射或散射入射光的分子或材料。这些光反射和/或散射颗粒包括，例如，金属颗粒、胶态金属(如胶态金)、胶态非金属标记(如胶态硒)、乳液制成的染色塑料颗粒、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯或类似材料。
这些颗粒的大小在1nm-10μm范围内，较佳的在500nm-5μm间，最佳的在1-3μm间。颗粒越大，光散射作用就越大。然而，由于结合的以及松散的溶液颗粒均是如此，因此随着用来散射信号的颗粒大小的增加，背景也会增加。
直径为1nm-10μm(微米)(较佳的为0.5-5μm，最佳的为1-3μm)的金属微球在本发明的光反射/光散射实例中是较佳的。金属球为检测断裂的但仍受分析物束缚的、结合在盘上的间隔物分子提供了一种方便的信号响应物。典型的材料是金、银、镍、铬、铂、铜等，或其合金，其中金是较佳的。金属球可以是固体金属，或是由塑料或玻璃珠等制成，然后在上面涂布一层金属。类似地，不同组成的金属微球上可以有光反射金属表面。金属球也可以是合金或聚集物。
从Aldrich Chemical Company,British BioCell International,Nanoprobes,Inc.及其它处可以购得适用于本发明的可断裂反射信号元件和测定装置的不同直径(直径在1nm至0.5-5微米)的金球。生产本发明所需的更大或更小的金球是本领域技术人员能够实现的。
当用近场光学显微镜、紫外光、电子束或扫描探测显微镜进行读取时，采用小得多的球体是非常有利的。较小的球体是以下这些实例中较佳的，因为在基材给定区域内可以辨别更多的可断裂间隔物。
尽管圆形颗粒是较佳的，但是在一些实例中也可采用非圆形的颗粒。
在生物应用中，信号响应物(尤其是金或胶乳微球)最好涂布有去污剂或进行衍生，以使其有表面电荷。这是为了防止这些颗粒与表面或相互之间非专一性地连接。
较佳的金球直接与可断裂间隔物的信号响应末端的硫代基团结合，形成非常强的键。
在寡核苷酸侧臂的合成完成后，如下文所述的，用二硫赤藓糖醇等来还原间隔物分子30的信号响应末端上的吡啶联硫基。反应非常迅速，而且是定量的，获得的还原的硫代基团对金的亲和性非常高。类似地，卤代基团对金也有很高的亲和性。因此，通过将悬浮液加到固体载体21的表面上，使金球作为液体(如蒸馏水)中的悬浮液形式分散。金球只与末端为巯基的间隔物占据的部位连接，而不与基材的其余表面连接。
另外，尽管本发明上述实例已经描述了单个金属球可与单个可断裂间隔物的信号响应末端连接，但是应当理解，当在本发明较佳实例中采用金时，根据金球直径的不同，数千个间隔物可以与一个金球相连。估计1-3μm的球可以结合约1000-10000可断裂间隔物。
这样，通过改变金球直径以及可断裂间隔物与金球的相对密度，就可调节任何给定转动速度下的测定洗涤严格性。
因此，如果某个金球下基本上所有的间隔物均与互补分子连接，则结合是非常强的。如果某一金球下只有部分间隔物被固定，则根据球径和转动频率的不同，金球可能被保留或除去。
5.5.2其它响应光的信号响应物在本发明的可断裂信号元件和测定装置的其它一些实例中，可以采用光吸收而不是光反射材料作为信号响应物。在该实例中，寻址位置没有反射光(而不是有反射光)表明捕获了分析物。尽管形式有些不同，但是该方法与可擦写光盘采用的方法类似。
尽管内容相似且与CD读头兼容，但是与标准的压制的CD中通过凹痕来编码信息相比，可擦写光盘(CD-R)是以不同的方式来记录信息的。在CD-R中，数据层与聚碳酸酯基材分开。聚碳酸酯基材压制有连续的螺旋槽作为入射激光的参照定位指南。用一种有机染料来制成数据层。尽管花青是用于这些盘的首选材料，但是通常用金属稳定化的花青化合物来代替“原始的”花青。另一种材料是酞菁。在美国专利No.5,580,696中描述了这样一种金属酞菁。
在CD-R中，有机染料层被夹在聚碳酸酯基材和金属化反射层之间，该金属化反射层的介质通常是24克拉的金，但也可以是银。信息是这样被记录的用具有合适的预选波长的记录激光在染料层中选择性地熔融形成“凹痕”(并不是在染料中烧出通孔，而只是稍稍熔融)，使其变得不透明，这样读取激光束被折射而不是象标准压制的CD中的物理凹痕那样被反射回读头传感器。和标准CD中一样，用漆涂层来保护携带信息的层。
本发明的这个实例中采用的光吸收染料多于CD-R中采用的染料。光吸收染料是能从电磁波谱(理想的是在对应于光源波长的波长下)吸收能量的任何化合物。如该领域中所知的那样，染料通常包括共轭的杂环结构，下面是典型的染料种类偶氮类染料、重氮类染料、三嗪类染料、食用色素或生物染色剂。具体的染料包括考马斯亮蓝R-250染料(Biorad Labs,Richmond,Calif.)、Reactive Red2(Sigma chemical Company,St.Louis,Mo.)、溴酚蓝(Sigma)、二甲苯苯胺(Sigma)和酚酞(Sigma)。Floyd J.Green的Sigma-Aldrich Handbook of Stains,Dyes andIndicators(Aldrich Chemical Company,Inc.,Milwaukee,Wis)提供了其它染料的许多数据。通过这些数据，可以选择有合适光吸收性能的染料来符合光源发出的波长。
在这些实例中，可将不透明的含有染料的颗粒(而不是反射颗粒)作为响应光的信号物，从而逆转编码信息相。胶乳球的直径在1-100μm之间，较佳的为10-90μm，最佳的为10-50μm。染料可防止激光从盘基材的金属层反射。
在其它实例中，信号响应元件可以是荧光剂(如荧光素)、propidium iodide或藻红蛋白、化学荧光剂(如响应入射光的荧光素)、或将可溶的荧光底物断裂成不溶形式的指示酶。适用于该实例的其它荧光染料包括得克萨斯红、若丹明、绿色荧光蛋白等。当蓝色激光被广泛使用时，荧光染料将是特别有用的。
本发明的光反射、光散射和光吸收实例最好采用圆形测定装置作为基材，按照一定样式排列可断裂信号元件。在一个特别佳的实例中，测定装置与已有的光盘读头(如光盘(CD)读头或数字视频盘(DVD)读头)兼容，因此它最好是直径约为120mm、厚约1.2mm的盘。盘也指圆环。
然而，应当理解，本发明的可断裂反射信号元件也可以空间可寻址方式排列在非圆形的、基本平的基材上，并且这种测定装置必须用适合基材形状的检测器来读取。
光盘上可空间辨别的可断裂信号元件(或生物码元)的最大数目与波长和物镜的数值孔径有函数关系。在所有种类的存储器光盘(如CD-ROM、WROM(一次性写入，多次读取)盘和磁光盘)中，提高存储器容量的一种方法是减少二极管(该二极管能照亮存储器光盘的数据轨道)激光发射的光波长。波长越小，就越能辨别盘上更小的数据点(即分辨率较高)，从而提高了数据密度。目前的CD-ROM采用的是波长为780纳米(nm)的激光。目前的DVD读头采用的是波长在635至650nm之间的激光。新的二极管激光(发射例如481nm附近的蓝光)会增加能在本发明的信号测定装置盘上空间寻址的信号元件数目。另一种获得蓝辐射的方法是用非线性光学材料使红外激光的频率加倍。
目前的CD-ROM读头采用反射读取和透射读取两种方式。两种获取数据的方法均与本发明兼容。金颗粒尤其适于用作反射型CD-ROM读头的信号响应物。光吸收染料特别适用于透射型读头(如美国专利No.4,037,257中所讨论的那种)。
5.5.3其它的信号响应物该领域技术人员应当明白，适用于本发明可断裂间隔物的信号响应物不局限于光反射或光吸收的金属颗粒或染料。合适的信号响应物包括(但不局限于)可用光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电子、光学或化学方式检测的任何组合物。在一些较佳的实例中，合适的信号响应物包括比色标记如胶态金或着色的玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳液等)珠、用标记的链酶亲和素共轭物着色的生物素、磁珠(如DynabeadsTM)、放射性标记(如3H、125I、35S、14C或32P)、以及酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它ELISA中常用的酶)。
该领域技术人员应当理解，各种信号间隔物适于改装成本发明的可断裂间隔物。例如，有许多专利提供了在生物测定中产生可检测信号的各种广泛的理论。这种信号响应物通常适用于本发明的一些实例中。作为非限制性的描述，下面一份美国专利一览表指出了适用于本发明一些实例中的几种信号响应物美国专利No.3,646,346，放射活性信号产生方式；3,654,090,3,791,932和3,817,838，酶联信号产生装置；3,996,345，荧光剂-淬灭剂信号产生方式；4,062,733，荧光剂或酶信号产生方式；4,104,029，化学发光信号产生方式；4,160,645，非酶类催化剂产生方式；4,233,402，酶结合对信号产生方式；4,287,300，酶阴离子电荷标记。上述所有这些美国专利均全部纳入本文作参考。
该领域已知的其它信号产生方式(例如美国专利No.5,021,236和4,472,509)也均由于所有这些目的而纳入本文作参考。可用金属螯合配合物来使信号产生方式与可断裂间隔物分子连接，或与作为侧链成员连接在间隔物分子上的抗体连接。用有机螫合剂(如连接抗体的DTPA)的方法在美国专利No.4,472,509中有所描述，其内容纳入本文作参考。
在其它一些实例中，可用磁球来代替反射球，磁球可通过用足够强度的磁场处理盘来取向。由于空的部位不存在任何磁性材料，因此可以检测其它其余的间隔物分子位置，并处理信息以确定试样中的物质。另外，在样品杂交后可加入反射或磁性物质，以提供信号产生装置。
可采用顺磁离子作为信号产生装置，这些离子例如是铬(Ⅲ)、锰(Ⅱ)、铁(Ⅲ)、铁(Ⅱ)、钴(Ⅱ)、镍(Ⅱ)、铜(Ⅱ)、钕(Ⅲ)、钐(Ⅲ)、镱(Ⅲ)、钆(Ⅲ)、钒(Ⅱ)、铽(Ⅲ)、镝(Ⅲ)、钬(Ⅲ)和铒(Ⅲ)，其中钆是特别佳的。适用于其它方面(如X-射线制图)的离子包括(但不局限于)镧(Ⅲ)、金(Ⅲ)、铅(Ⅱ)，尤其是铋(Ⅲ)。
检测这些标记的方式是该领域中熟知的。因此，例如可以用照相胶片或闪烁计数检测放射性标记，用检测发射光的光检测器检测荧光标记。酶标记的检测通常是通过为酶提供一个底物，然后通过检测酶与底物的反应产物来实现的，比色标记通过简单地观察有颜色的标记来检测。胶态金标记可通过测定散射光来检测。
较佳的非反射信号产生方式是生物素，它可用亲和素或链酶亲和素来检测。这种标记的应用是该领域技术人员所熟知的，其在例如美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241中有所描述；这些专利均纳入本文作参考。
5.6可断裂间隔物侧链成员的连接可断裂间隔物的侧链成员赋予分析物专一性。在一个较佳的实例中，侧链成员是寡核苷酸。
寡核苷酸可以在间隔物连接到测定装置(盘)衍生基材上之前分步合成到可断裂间隔物上。或者，在间隔物分子与测定装置基材连接之前，完整制备的寡核苷酸可以在一个步骤中直接连接到间隔物分子上。在这种情况下，间隔物分子有受保护的氨基和/或巯基，而不是两个受保护的羟基。除去一个保护基团，加入例如一端有异氰酸酯基团的寡核苷酸。第二个寡核苷酸以类似方式与可断裂间隔物分子的第二个侧链成员相连。
或者，侧链成员寡核苷酸可在可断裂间隔物连接到基材上后再合成，合成可以是用完整制备的寡核苷酸单步加入或分步加入。当在一个测定装置基材上进行不同分析物专一性的多个测定时，预计后一种方案是较佳的。侧链成员连接到先前固定在基材的可断裂间隔物上的通用方法(无论是一步还是分步加入)在这里被称为印制。
亚磷酰胺类化学物质适于用来制备寡核苷酸侧链成员，但是也可采用其它化学物质。在常规的固相合成中，寡核苷酸是用单体亚磷酰胺类制得的。在常规的合成后，将寡核苷酸连接到树脂载体上，用液相层析纯化，除去反应物(包括溶剂和未反应的单核苷酸)，并除去不完全合成产生的较短的寡核苷酸。在一些情况下，寡核苷酸不能这样来纯化，因此较短的寡核苷酸会污染所需的寡核苷酸。这会导致不希望的杂交。比所需产物只少一个核苷酸的寡核苷酸污染物最难对付，因为它们的结合强度几乎与正确序列的寡核苷酸相同。
在制备用作本发明可断裂反射信号元件中侧链成员的寡核苷酸时，用亚磷酰胺的三聚物或四聚物是有利的，较佳的。例如采用四聚物起始材料可以在三步内合成制得12聚物。在这种情况下，不可避免的不完全合成产物是8聚物和4聚物，它们分别代表少1或2个合成步骤。由于8聚物的结合比12聚物弱得多，因此这些污染物不会产生明显的干扰。
在通过分步加入将可断裂间隔物的侧链成员施加到固定在测定装置基材表面上的间隔物上时，寡核苷酸宜通过化学印制(chemical printing)来连接到可断裂间隔物上，化学印制是在印模上形成与固体基材上间隔物分子分布互补的所需寡核苷酸化学溶液。印制非常迅速，而且成本很低。它还能提供很高的分辨率。例如Science269卷664-665页(1995)中描述了一种简单的印制方法。
在这种印制方法中，测定装置基材上间隔物分子的一个保护基团被除去。将所需的寡核苷酸施加到印模表面，使得印模上具体的预定位置上有专一性的寡核苷酸，然后将印模表面施加到间隔物覆盖的基材载体表面上，从而使所需寡核苷酸排列在有间隔物分子存在的具体区域内。随后，除去第二个保护基团，再次用化学印模将不同寡核苷酸施加到活化的区域上。这些步骤在图8A、8B、9A、9B、13和14中有具体的描述。
或者，可用喷墨印制来施加各寡核苷酸，如美国专利No.4,877,745和5,429,807中所述的方法，其公开纳入本文作参考。
这些直接印制的方法均很迅速。当用三聚物或四聚物来构建寡核苷酸时，进行两次印制循环就能产生所有可能的6聚物至8聚物寡核苷酸的阵列。为了包含所有的8聚物，测定装置必须含有256×256个不同的寡核苷酸。附加的印制循环可迅速地增加寡核苷酸的长度，虽然所有组合可能不会置于大小合适的表面上，因此可能需要用几个测定装置来表示所有这些组合。
图15显示了用于本发明的另一种印制方法，凹板互补印制。尽管只显示出了两个步骤，但是该方法能同时印制大量的寡核苷酸。合成寡核苷酸的混合物；例如，可在每一步中采用四个亚磷酰胺的混合物来合成12聚物，在合成的最后一步中将非常长的间隔物连接到每个寡核苷酸上。在另一端提供一个活性基团(如异硫氰酸酯)。使寡核苷酸混合物和结合确定部位的互补寡核苷酸的印模一起培育。在印制过程中，间隔物会与基材相连。例如，双螺旋可通过加热来变性，使印模和基材分离。
已经开发出了许多合成寡核苷酸的方法，尤其是在固体表面上合成空间可寻址的寡核苷酸的方法，这些方法是该领域技术人员已知的。特别适用于本发明的方法在美国专利No.4,542,102；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,445,934；5,489,678；5,510,270；5,424,186；6,624,711中有更进一步的描述；这些内容均纳入本文作参考。
适用于本发明的其它方法大致包括(1)分步光化学合成、(2)分步喷射化学合成和(3)制备的寡核苷酸的固定。也可采用玻璃毛细管阵列系统。在后一种情况下，合成可以象在自动化DNA合成仪中那样在所有毛细管平行地进行合成。
尽管这里已经描述了寡核苷酸侧链成员是用标准的脱氧核糖核苷酸亚磷酰胺合成的DNA寡核苷酸，但是应知道某些寡核苷酸类似物，例如吡喃糖基RNA(E.Szathmary,Nature 387:662-663(1997))和肽核酸，可以形成比天然寡核苷酸忠实性更高、结合更强的双链。因此，这些人造的类似物也可用来构建寡核苷酸侧链元件。
尽管寡核苷酸侧链成员可以与互补的寡核苷酸结合并因此可直接用于核酸探针测定，但是本发明还有一个方面是将这些寡核苷酸侧链成员专一性结合对成员与其它测定的用途组合起来。
在后面的这些实例中，结合对成员(如抗体)与侧链成员寡核苷酸的非共价连接是通过侧链成员寡核苷酸与共价连接在结合对成员上的寡核苷酸间的互补性来介导的。关于用互补的核酸分子来实现超分子结构的非共价、组合装配的方法在共有的待批美国专利申请No.08/332,514(1994年10月31日提交)、08/424/874(1995年4月19日提交)、08/627,695(1996年3月29日提交)中有更详细的描述，其内容纳入本文作参考。
如图3A和3C所示，寡核苷酸侧链成员34a,34b,35a和35b与修饰的抗体38a,38b,38c和38d非共价连接，从而可以进行免疫测定。修饰的抗体与侧链成员的非共价连接是通过侧链成员和共价连接在抗体上的寡核苷酸间的互补性来实现的。
尽管图3例举了抗体的例子，但是可以知道，也能够用抗体片段和衍生物(如Fab片段、单链抗体、嵌合抗体等)。通常，用于该实例中的结合对成员通常是第一和第二专一性结合对的第一成员，典型的例子是分别与抗原、配体等结合的抗体、受体等。
5.7测定装置上可断裂反射信号元件的图案放置根据上面的讨论可以知道，响应分析物的可断裂反射信号元件在测定装置(盘基材)上的空间分步可以在两个水平上决定可断裂间隔物本身的连接水平，以及连接间隔物侧链成员的水平。还应理解，分析物灵敏度的空间分步也可通过这两者的组合来确定。
控制可断裂间隔物分布的方法的第一步是设计基材的亲水和疏水区域。首先使疏水表面活化、亲水表面失活，以产生一个与疏水的、不反应的网状结构分开的亲水的功能点阵列。如果基材是玻璃、云母、硅、亲水塑料或类似材料，则首先通过酸或碱处理使整个表面具有反应性。使点之间的中间空间硅烷化。这最好是用网格作为印模。另一方面，如果基材是是疏水材料，它可以通过在氨存在下进行等离子体处理，然后作为亲水基材进行硅烷化来加以活化。使抗蚀膜材料与石印或机械印刷结合，除去所需部分的抗蚀膜，就可在那些部位进行活化。
反应点上宜连接有亲水性间隔物如聚乙二醇(PEG)。如果基材含有氨基或巯基，则PEG的另一端可预先用各种已知能与氨基或巯基连接的官能团活化。这些官能团包括异氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰基和琥珀酰亚胺酯基团。
光致抗蚀膜也适用于制作可断裂信号元件的排列图案。在制作时，入射激光使光致抗蚀膜部分解聚，使得这些区域的光致抗蚀膜溶解。对外露的塑料或金属化塑料进行化学处理(如用氨等离子体进行胺化)。在除去抗蚀膜后，就可以按照需要将间隔物、侧链成员和信号物连接到处理过的区域上。用光致抗蚀膜来设计母盘图案的方法是光盘制作领域中熟知的。
或者，在氨等离子体处理时，可用含有小孔和其它必需特征的固体掩模来代替抗蚀膜。孔的直径约为1-3微米。孔在掩模中呈圆形，它形成了螺旋的轨迹或是螺旋和圆形轨迹的组合图案。掩模可以是金属或塑料。可采用几种金属，如铝、镍或金。聚碳酸酯是较佳的塑料，因为它能很好地保持外形。然而，塑料可与氨等离子体反应，因此采用塑料掩模的较佳方法是，通过蒸发、溅镀或本领域已知的其它方法在塑料上沉积一层金属。掩模中的孔可用激光制成。该领域技术人员应该知道，在1秒钟内可在薄的金属或塑料板中产生1000个大小为1μm的孔。或者，可用半导体工业中熟知的常规方法来蚀刻出孔。在设计信号元件的排列图案的掩模方法中，是将掩模压在基材上，然后施加氨等离子体。掩模可以重复使用。
应当理解，分析物灵敏度的空间分布也可通过按一定样式施加间隔物侧臂来实现。
参照上述的印制方法，图13中显示了一种可能的寡核苷酸印模的示意图。印模有通孔，通孔内装有用来为待合成寡核苷酸提供所需构建块的某一化学物质。在图13中，每列中装有相同的化学物质，因此在图13给出的实施例中，一次印模循环可以用四种不同的化学物质。在商用系统中，列数相当高，通常为64-256，但是在特殊的情况下也可以用较低和较高的列数。如果要将一定大小的所有可能的寡核苷酸制备到测定装置基材上，则线性印模是较佳的。
通过这种方式，就可以制得给定的一组寡核苷酸构建块六聚物的所有可能组合。例如，通过两个采用64-列线性印模的反应循环，可以制得三聚物。在一排通孔中加入64种不同的三聚物亚磷酰胺的每一种。在印制亚磷酰胺后，印制氧化剂、解封闭剂和加盖剂(cap reagent)。由于每个点中的这些化学物质是相同的，因此印模可以是平板，或整个基材可以简单地浸入试剂溶液中。旋转基材90°，重复同一步骤。这样就可以制得三聚物所有可能的组合。类似地，可以制得任何系列的寡核苷酸亚酰胺的所有组合。
图14所示例子显示了四种不同的寡核苷酸亚酰胺的所有可能组合的制备。在第一次印制循环后，水平行中的每个点含有相同的寡核苷酸，但是每一行的寡核苷酸不同。这些寡核苷酸片段在图14中用数字1、2、3和4表示。当将印模旋转90°，重复印制循环后，就形成了四种寡核苷酸的所有组合。
前述的正交印制方法在盘实例中生产本发明的信号元件中是特别有利的。正交印制使得间隔物分子的列以同心圆方式分布，其与音频或CD-ROM光盘中环状放置的信息类似。正交印制方法的一种较佳方案是将两种空间螺旋方向相反的螺旋印模重叠起来。
印模的位置必须精确在约1μm内。这可以通过在机械上用2-4个导向针孔对或光电导向微型翻译器(microtranslator)来实现。在基材和印模的两个垂直侧上可以沉积一层可移动的反射涂层，它们的相对位置可用干涉仪来测定。基材和印模也可以有一对微棱镜，这对微棱镜必须完全对准，以便使光通过光检测器。
图11A至11G描述了可断裂反射信号元件在圆形平盘基材上按照空间可寻址样式排列的各种样式。图11A特别确定了盘基材上可编码的地址线，从该地址线可以测定可断裂间隔物的位置。在图11A中，可断裂间隔物分子以环形轨迹样式放置。图11B示出了可断裂信号元件的螺旋放置样式，并且特别确定了特别用来啮合旋转驱动装置的盘圆环的中央通孔。图11C示出了一种可断裂信号元件的排列样式，该样式适于平行地测定多个样品，并能同时在中央轨道中编码解释软件。图11D示出了一个实例，其中测定装置基材被进一步细微制作成将各测定部分隔开，从而能使测定装置在加样时转动而不必混合样品。
图11E示出了一个实例，其中测定装置基材被进一步细微制作成迫使样品在测定装置旋转时单向流动。细微制作固体表面的技术是该领域已知的，在美国专利No.5,462,839；5,112,134；5,164,319；5,278,048；5,334,837；5,345,213中特别进行了描述，其内容纳入本文作参考。
图11F示出了可断裂信号元件空间有组织的排列样式，这种样式每次能测定20份样品中的50个不同的分析物。图11G示出了一种正交交叉样式，这种样式是通过螺旋图案与方向相反或螺旋特性相反的螺旋臂叠加产生的。
可断裂反射信号元件(或生物码元)在测定装置表面上的空间分布可以设计成能定量测定分析物的浓度。
因此，在一些实例中，通过捕获分析物来进行定量测定。在一个实施方案中，测定装置上装有专门用于每种所选分析物的均匀密度的生物码元。将试样引入盘中央。通过施加旋转力使试样迅速分散到四周。在分散的过程中，分析物被可断裂信号元件的各自同源侧链元件捕获，从而使样品前缘的分析物浓度减少。
如果生物码元的密度相对于加入物的浓度是足够的话，则所有分析物会在样品前缘到达测定装置周围前被捕获。然后可以根据离样品引入部位最远的阳性生物码元的位置来确定每种分析物的浓度。
应该理解，如果专门用于检测分析物的生物码元更多，则可检测的分析物浓度的动态范围就更大。在前述的实例中，生物码元的均匀密度会增加。然而还应理解，生物码元的密度不必是恒定的，还可采用线型或指数型变化的生物码元密度(从盘中央到周围测得)，以改变浓度检测的动态范围。
在本发明的其它实例和方面，将对所选分析物有不同亲和性的生物码元连接到测定装置上可以有类似效果，即，提高浓度检测的动态范围。
还可考虑采用其它结构来表达浓度信息。图16示出了一种结构，其中单个样品被平行地引入测定装置的四个不同的扇区。如果四个扇区中的生物码元的密度或亲和性其中一个不同，或密度和亲和性均不同，则通过检测每个正性生物码元扇区中距加样位置最远的位置，可以测定很大的动态浓度范围。
在其它实例中，可考虑采用平衡测定。因此，通过对整个盘取样并测定每个分析物的阳性生物码元百分比，就可确定浓度。
在每个实例中，通常有大量生物码元专门用来检测正负对照。
在其它实例中，对多个不同的分析物有专一性的可断裂反射信号元件(生物码元)可按不同的样式来放置。例如，专一性不同的生物码元可以混合在盘的每个区域中。或者，它们可以分布到不同的区域内。将专一性生物码元按照一定样式放置到预定位置以及用检测器(如CD-ROM)解释生物码元相同性的能力使设计变得灵活。该领域技术人员应知道，设计样式应当用含有不同浓度的已知分析物的试样进行测试和调节。
5.8其它的测定装置结构病毒通常是直径小于0.5μm的球形颗粒。细菌通常是球状或杆状的；它们最大的尺寸通常小于2μm(除了鞭毛和其它类似外部纤维外)。这些病原体比本发明的可断裂信号元件中所用的金球稍小一些或是大小相似。因此，它们同时与上述可断裂信号元件的两个侧链成员同时作用会受空间上的抑制。
因此，另一种结构和可断裂间隔物一起分散。对分析物有专一性的一个侧链成员以空间可寻址方式与测定装置的基材表面直接连接。对所选分析物的第二个位点有专一性的第二侧链成员与信号响应物直接连接。在较佳的实例中，该响应物是金球。在这一变化的结构中，对分析物的识别产生了直接的夹心结构，该结构的通式为基材-第一侧链成员-分析物-第二侧链成员-信号响应物。该结构可以被说成一种限制情况，其中可断裂间隔物式中的“m”为0。
这一特定的结构也可用于检测核酸杂交(如图17所示)。
在这一结构中，如果信号响应物是反射性的，则信息的编码与前述结构中的相似，即分析物的存在由反射信号来表示。或者，当信号响应物不透明时(例如通过加入颜料)，编码方式则相反分析物的存在通过没有来自装置基材的金属化层的反射来表示。
在这一结构中，磁性塑料球是特别有利的。因为它们内部含有磁性颗粒，所以它们不如胶乳球那样透明。而且，可用磁力来除去那些难以用其它方法除去的结合较弱的球，如胶乳球，因为胶乳球的密度与水接近，用离心力没有效果。
这一结构的其它变化利用了反射测定中的凝集(如图18所示)。在这种变化中，信号响应物最好是微球。这些微球相当小(30-600nm)，从而使得单独一个微球不会有效地阻断光。
在参照了下列非限制性的实施例后可以更好地理解本发明。
6．实施例Ⅰ提高核酸杂交测定的专一性在核酸定向杂交测定中，可断裂信号元件的侧链元件是寡核苷酸，该寡核苷酸被设计成与样品中待检测的所选预定核酸的不同部位杂交。在该方法的多种用途中，与样品中甚至只有一个不匹配的寡核苷酸的交叉反应性应减少到最小。特别是，适于采用本发明的可断裂反射信号元件来检测点突变(如检测易导致乳房癌和卵巢癌的BRCA1和BRCA2基因中的点突变)的核酸杂交测定必须能区别只有一个核苷酸不匹配的核酸样品。
可断裂信号元件的寡核苷酸侧链元件越长(因此侧链元件和核酸样品间有互补性的序列越长)，错误地识别不匹配样品的可能性就越高，因为即使存在不匹配，杂交强度仍然相当高。
因此，减少错误识别不匹配核酸序列的一种方法是减少侧链元件寡核苷酸的长度。通过将侧臂减到8聚物甚至6聚物可以提高专一性。这些仍能在室温下根据不同的洗涤严格性杂交，洗涤严格性条件是该领域技术人员熟知的。不匹配寡核苷酸会通过5个或更少的寡核苷酸来配对，其在室温下的结合是非常不稳定的。
然而，这种溶液仍有其自身的问题用于识别的总长度相当短，只有12-16个核苷酸，这会相应地减少制约可断裂信号元件的信号响应物所需的杂交总长度。采用连接酶(如图2E-2F所示)可以部分解决这个问题。连接不仅能提供更强的结合，而且还能进一步作用，以保证专一性，因为如果寡核苷酸末端附近存在不匹配，DNA连接酶不会将寡核苷酸连接起来。由于寡核苷酸非常短，因此不匹配碱基对不被接受。连接酶可作为寡核苷酸匹配的非常严格的检查物。
另一采用三识别原理的互补溶液(图2D-2E所示)建设性地减少了可与可断裂信号元件侧链元件杂交的试样序列。在液体样品接触测定装置前，在样品溶液中加入一种可溶的增强专一性的寡核苷酸(例如8聚物)，该寡核苷酸与样品寡核苷酸的中间部分互补。该8聚物能在测试条件下很好地进行杂交。可断裂信号元件的侧链元件则能识别紧靠已形成的双链的6个核苷酸。
连接会保证专一性，还能提供强的键。如果寡核苷酸末端附近存在不匹配，则连接酶不会连接寡核苷酸。因为寡核苷酸非常短，因此不匹配碱基对不能被接受。连接酶可作为非常严格的寡核苷酸匹配的检查物。
很明显，加入试样中的增强专一性的可溶性寡核苷酸(这里是8聚物)可以被设计成用来测定样品末端附近潜在的不匹配，在该处的不匹配最不利于侧链元件的结合。
另外，由于连接酶的加入保证了共价环，因此可以通过加入离液剂和/或加热来提高洗涤严格性，以除去任何非选择性的寡核苷酸。
然而，有一种样品核酸可以冒充适于并能与侧链元件结合的“封闭的”样品寡核苷酸，这种样品核酸具有必需的末端6核苷酸序列，但序列间直接连接，中间没有插入8聚物序列。
如图2D所示，另外加入一种10聚物样品(该样品的序列取自第一侧链元件寡核苷酸序列和第二侧链元件寡核苷酸序列)就可防止在接触本发明的测定装置时发生这种结合。
增强专一性的可溶的寡核苷酸的8+10+8的组合是本发明中较佳的，但是也可采用其它组合如7+9+7和8+8+8。
提高专一性的另一种方法包括采用所谓的挂锁(padlock)探针，其中环形的寡核苷酸被连接起来，从而允许充分洗涤来除去结合较弱的探针。挂锁探针对互补和单个不匹配寡核苷酸的辨别率为50∶1(Nilsson等，Science265:2085(1994))，而常规探针的比例通常在2∶1至10∶1之间。
通过自动合成制得有下列序列的寡核苷酸，根据与可断裂间隔物分子的连接部位的不同(5＇端或3＇端)，使它们每一个都有一个末端巯基(脂族氨基)。Ⅰa:5＇-CGGGTGTGG Ⅰb:CGGCCGCGG-3＇Ⅱa:5＇-CGGGTGTGA Ⅱb:CGGCCGCGG-3＇Ⅲa:5＇-CGGGTGTGC Ⅲb:CGGCCGCGG-3＇Ⅳa:5＇-CGGGTGTGT Ⅳb:CGGCCGCGG-3＇合成有两个脂族氨基(代替上述的保护的羟基)的可断裂间隔物分子，一个氨基被单甲氧基三苯甲游基(MMT，酸不稳定)保护，另一个被芴基氧羰基(FMOC，碱不稳定)保护。在除去FMOC基团后，使氨基功能在水性条件下与4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMMC)反应。将巯基衍生的Ⅰa加入间隔物分子中，使其与间隔物分子连接。然后用乙酸处理，除去MMT，在用pH8的缓冲液洗涤后加入SMCC，使Ⅱb与间隔物分子连接。将上述制得的间隔物分子与聚碳酸酯基材连接。
制得含有5＇-GCCCAC ACCGCC GGCGCC-3＇的试样，使其在接近Ⅰa和Ⅰb侧链成员的Tm温度下与可断裂信号元件接触。将样品溶液的温度加热到约比Tm高20℃。然后，用0.1M氟化钠溶液处理信号元件并洗涤。仍连接在基材上的间隔物分子表示5＇-GCCCACACCGCCGGCGCC-3＇受束缚而存在。
用前述方法来分析5＇GCCCACACTGCCGGCGCC-3＇、5＇-GCCCACACGGCCGGCGCC-3＇、5＇-GCCCACAGCCGGCGCC-3＇(分别采用具有侧链成员Ⅱa和Ⅱb、Ⅲa和Ⅲb、Ⅳa和Ⅳb的间隔物分子)。
7．实施例Ⅱ:HIV-1的检测基本上按照美国专利No.5,599,662(纳入本文作参考)中所述的方法扩增来自临床样品中的HIV-1原病毒DNA。
用标准的Ficoll-Hypaque密度梯度法分离获得外周血单核细胞。在分离获得细胞后，抽提出DNA(如Butcher和Spadoro,Clin.Immunol.Newsletter 12:73-76(1992)中所述，其内容纳入本文作参考)。
在100μl的反应体积中进行聚合酶链反应，其中50μl是样品。反应含有具有下列初始浓度的下列试剂10mM Tris-HCl(pH8.4)50mM KCldATP,dCTP,dGTP和dUTP各200μM25pmol引物1，其序列如下所示25pmol引物2，其序列如下所示3.0mM MgCl210％甘油2.0单位Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)2.0单位UNG(Perkin-Elmer)引物1:5＇-TGA GAC ACC AGG AAT TAG ATA TCA GTA CAA TGT-3＇引物2:5＇-CTA AAT CAG ATC CTA CAT ATA AGT CAT CCA TGT-3＇扩增在TC9600 DNA热循环仪(Perkin Elmer,Norwal,Connecticut)中进行，采用下列温度进程(1)预培育，50℃2分钟；(2)初始循环，94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒；(3)第2-4次循环，94℃变性30秒，退火30秒，72℃延伸30秒，与循环1相比，每次循环的退火温度增加2℃(至58℃)；(4)循环5-39,90℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。
在温度循环后，将反应混合物在90℃加热2分钟，然后稀释成1ml。或者-20℃保藏样品，融冻后，在90℃加热2分钟，并稀释至1ml。
具有硅氧烷部分的可断裂间隔物基本上按照上述5.2和5.3节所述那样合成并以均匀密度连接到衍生的120mm聚碳酸酯盘基材上。然后在可断裂间隔物上印制下列侧链成员第一侧链成员5＇-TAG ATA TCA GTA CAA-3＇第二侧链成员3＇-TAT TCA GTA GGT ACA-5＇将直径为1-3μm的金微球悬浮液滴加到盘上，轻轻转动盘，使金颗粒分散。加入金颗粒直至流出物的颗粒密度与初始悬浮液中的相同，从而保证可断裂间隔物被饱和。
在室温下将样品滴加在以连续速度转动的测定装置的中央附近。在样品前缘达到周边时停止转动，使盘在室温下静止培育3-5分钟。
在盘转动时滴加入1ml样品缓冲液作为洗涤液。加入1ml 100mM氟化钠，通过盘转动来分散。使盘静止培育1-2分钟，然后在迅速转动测定盘时滴加入5ml样品缓冲液。
对盘进行干燥，然后直接在CD-ROM程控读头中读取，以测定每个放置有可断裂间隔物的预定部位。
本发明不局限于这里列举的实施例的范围，这些实施例只是用来描述本发明的个别方面。实际上，除了那些已知的和本文公开的内容外，根据前述描述和附图所作的各种改进、等价方案和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些改进也包括所附权利要求的范围内。
本文中引用的所用出版物均纳入本文作参考。
权利要求
1．一种可断裂信号元件，它包含可断裂间隔物，所述可断裂间隔物有一个与基材连接的末端，一个响应信号的末端，以及所述基材连接末端和所述信号响应末端间的一个断裂位点；信号响应物；与所选分析物上第一位点结合的第一侧链成员；和与所述所选分析物上第二位点结合的第二侧链成员；其中所述信号响应物连接在所述可断裂间隔物的所述信号响应末端上，所述第一侧链成员与所述信号响应末端和所述断裂位点间的所述可断裂间隔物连接，所述第二侧链成员与所述断裂位点和所述基材连接末端间的所述可断裂间隔物连接。
2．根据权利要求1所述的可断裂信号元件，其中所述信号响应物反射或散射入射光。
3．根据权利要求2所述的可断裂信号元件，其中所述信号响应物是金微球。
4．根据权利要求3所述的可断裂信号元件，其中所述金属微球基本上由选自金、银、镍、铂、铬、铜的金属组成。
5．根据权利要求4所述的可断裂信号元件，其中所述金属微球基本上由金组成。
6．根据权利要求5所述的可断裂信号元件，其中所述金微球的直径在1nm至10μm之间。
7．根据权利要求6所述的可断裂信号元件，其中所述金微球的直径在0.5至5μm之间。
8．根据权利要求7所述的可断裂信号元件，其中所述金微球的直径在1至3μm之间。
9．根据权利要求1所述的可断裂信号元件，其中所述断裂位点易受化学断裂。
10．根据权利要求9所述的可断裂信号元件，其中所述易化学断裂的位点包括至少一个硅氧烷基团。
11．根据权利要求1所述的可断裂信号元件，其中所述第一侧链成员和所述第二侧链成员包括寡核苷酸。
12．根据权利要求11所述的可断裂信号元件，其中所述第一和第二侧链成员寡核苷酸是5聚物至20聚物。
13．根据权利要求12所述的可断裂信号元件，其中所述第一和第二侧链成员寡核苷酸是8聚物至17聚物。
14．根据权利要求12所述的可断裂信号元件，其中所述第一和第二侧链成员寡核苷酸是8聚物至12聚物。
15．根据权利要求1所述的可断裂信号元件，其中所述第一侧链成员包括第一专一性结合对的第一成员，所述第二侧链成员包括第二专一性结合对的第一成员，和所述第一专一性结合对的所述第二成员与所述第二专一性结合对的所述第二成员各自在单个分析物的表面上。
16．根据权利要求15所述的可断裂信号元件，其中所述第一专一性结合对的所述第一成员包括第一抗体、抗体片段或抗体衍生物，所述第二专一性结合对的所述第一成员包括第二抗体、抗体片段或抗体衍生物。
17．根据权利要求15所述的可断裂信号元件，其中所述第一侧链成员包括第一侧链成员寡核苷酸，所述第二侧链成员包括第二侧链成员寡核苷酸，所述第一专一性结合对的所述第一成员包括第一结合对寡核苷酸，所述第二专一性结合对的所述第一成员包括第二结合对寡核苷酸，和所述第一侧链成员寡核苷酸包括的序列与所述第一结合对寡核苷酸中包括的序列互补，所述第二侧链成员寡核苷酸包括的序列与所述第二结合对寡核苷酸中包括的序列互补，所述的互补序列是非共价缔合的。
18．一种测定装置，它包括固体载体基材，和多个如权利要求1所述的可断裂信号元件，其中所述可断裂信号元件通过其基材连接末端以空间可寻址的样式与所述固体载体基材相连接。
19．一种测定装置，它包括固体载体基材，和多个权利要求2-17任一所述的可断裂信号元件，其中如所述可断裂信号元件通过基材连接末端以空间可寻址的样式与所述固体载体基材相连接。
20．根据权利要求18所述的测定装置，其中所述固体载体基材是选自聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯的塑料。
21．根据权利要求20所述的测定装置，其中所述固体载体基材是聚碳酸酯。
22．根据权利要求18所述的测定装置，其中所述固体载体基材被制成盘状。
23．根据权利要求22所述的测定装置，其中所述盘的外径约为120mm，厚度约为1.2mm。
24．根据权利要求18所述的测定装置，其中每个所述可断裂信号元件的所述信号响应物是铁磁性的。
25．根据权利要求18所述的测定装置，其中所述第一侧链成员包括第一抗体、抗体片段或抗体衍生物，和所述第二侧链成员包括第二抗体、抗体片段或抗体衍生物。
26．根据权利要求25所述的测定装置，其中所述第一抗体和所述第二抗体对病毒的不同表位位点有专一性，该病毒选自人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人疱疹病毒。
27．根据权利要求26所述的测定装置，其中所述第一抗体和所述第二抗体对人免疫缺陷病毒的表位有专一性。
28．根据权利要求27所述的测定装置，其中所述免疫缺陷病毒是HIV-1。
29．根据权利要求27所述的测定装置，其中所述免疫缺陷病毒是HIV-2。
30．根据权利要求26所述的测定装置，其中所述病毒是丙型肝炎。
31．根据权利要求18所述的测定装置，其包括多个识别不同分析物的所述信号元件。
32．根据权利要求18所述的测定装置，其中信号元件的空间模式表示了一种或多种分析物的浓度。
33．根据权利要求18所述的测定装置，它还包括编码在载体基材上的计算机软件。
34．一种测定方法，该方法包括下列步骤使权利要求18所述的测定装置与液体样品接触，使所述测定装置与用来断裂所述多个连接的可断裂信号元件的断裂剂接触，除去所述断裂的信号元件的信号响应末端，和检测受分析物束缚的、断裂的、连接在固体载体基材上的信号元件上信号响应物的存在。
35．一种测定方法，该方法包括下列步骤使权利要求19所述的测定装置与液体样品接触，使所述测定装置与用来断裂所述多个连接的可断裂信号元件的断裂剂接触，除去所述断裂的信号元件的信号响应末端，和检测受分析物束缚的、断裂的、连接在固体载体基材上的信号元件上信号响应物的存在。
36．根据权利要求34所述的测定方法，其中所述信号元件包括一个或多个硅氧烷部分，所述断裂剂包括氟化钠。
37．根据权利要求36所述的测定方法，其中所述断裂剂包括1mM至1M氟化钠。
38．根据权利要求36所述的测定方法，其中所述断裂剂包括50mM至500mM氟化钠。
39．根据权利要求36所述的测定方法，其中所述断裂剂包括100mM的氟化钠。
40．根据权利要求34所述的测定方法，它还包括一步或多步洗涤步骤。
41．根据权利要求34所述的测定方法，它还包括使所述测定装置转动的步骤。
42．一种核酸杂交测定方法，该方法包括下列步骤使权利要求18所述的测定装置与含有核酸的液体样品接触，其中至少一个所述连接的信号元件的第一侧链成员和第二侧链成员各自包括寡核苷酸，使所述测定装置与用来断裂所述多个连接的可断裂信号元件的断裂剂接触，除去所述断裂的信号元件的信号响应末端，和检测受分析物束缚的、断裂的、连接在固体载体基材上的信号元件上信号响应物的存在。
43．一种核酸测序方法，该方法包括下列步骤使权利要求18所述的测定装置与含有核酸的液体样品接触，其中每一个所述连接的信号元件的第一侧链成员和第二侧链成员包括寡核苷酸，使所述测定装置与用来断裂所述多个连接的可断裂信号元件的断裂剂接触，除去所述断裂的信号元件的信号响应末端，和检测受分析物束缚的、断裂的、连接在固体载体基材上的信号元件上信号响应物的存在，其中侧链成员寡核苷酸序列的空间可寻址样式允许根据信号响应来计算重建邻接的序列。
44．一种免疫测定方法，该方法包括下列步骤使权利要求18所述的装置与含有抗原分析物的液体样品接触，其中至少一个所述连接的信号元件的第一侧链成员和第二侧链成员各自包括抗体、抗体片段或抗体衍生物，使所述测定装置与用来断裂所述多个连接的可断裂信号元件的断裂剂接触，除去所述断裂的信号元件的信号响应末端，和检测受分析物束缚的、断裂的、连接在固体载体基材上的信号元件上信号响应物的存在。
45．根据权利要求44所述的测定方法，其中所述第一和所述第二抗体各自识别病毒的表位位点，该病毒选自人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人疱疹病毒。
46．根据权利要求45所述的免疫测定方法，其中所述病毒是人免疫缺陷病毒。
47．根据权利要求46所述的免疫测定方法，其中所述病毒是HIV-1。
49．根据权利要求46所述的免疫测定方法，其中所述病毒是HIV-2。
50．根据权利要求45所述的免疫测定方法，其中所述病毒是乙型肝炎病毒。
51．根据权利要求45所述的免疫测定方法，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。
52.根据权利要求45所述的免疫测定方法，其中所述病毒是人疱疹病毒。
全文摘要
本发明描述了一种用于定量和定性测定装置的可断裂信号元件。所述分析物与可断裂信号元件中对分析物有专一性的第一和第二侧链成员的同时结合将信号响应物束缚在信号元件的底物连接末端上,尽管第一和第二侧链成员间的断裂位点随后会发生断裂。本发明还描述了包含可断裂信号元件的测定装置,以及采用测定装置的分析方法。本发明的分析装置可用常规的CD－ROM和DVD读头来检测。
文档编号C07K16/08GK1230216SQ9719772
公开日1999年9月29日 申请日期1997年7月8日 优先权日1996年7月8日
发明者J·弗塔嫩 申请人:伯斯坦恩实验室股份有限公司