专利名称：治疗包括骨质疏松的绝经后疾病的方法
技术领域：
本发明涉及结合雌激素受体的治疗剂，并发现该治疗剂可用于治疗骨质疏松。
背景技术：
对于绝经后妇女，绝经期发生的雌激素降低是骨质疏松骨折和心血管疾病发病率增加的一个重要病因。虽然，可通过雌激素替代治疗(ERT)防止绝经后骨损失，但是，预防性ERT增加了子宫内膜癌症的危险性。理想的治疗应维持雌激素对骨骼和心血管的作用，但对生殖组织无不良作用。他莫昔芬是雌激素拮抗剂，它能降低胆固醇水平并防止绝经后妇女的骨损失。他莫昔芬还对骨质疏松的卵巢切除鼠模型有效。但是，他莫昔芬具有不良副作用，特别是引起子宫内膜增生和子宫内膜癌症。见1:Love RR,Wiebe DA,Newcomb PA,Cameron L,Leventhal H,Jordan VC,Feyzi J,DeMets DL.(1991)，“他莫昔芬对绝经后妇女心血管发病率的作用”，Annals of Internal Medicine,115,860-864。2:Love RR,Mazess RB,Barden HS,Epstein S,Newcomb PA,Jordan VC,Carbone PP,DeMets DL.(1992)，“他莫昔芬对患乳腺癌的绝经后妇女骨密度的作用”，New England Journalof Medicine,326,852,856。3:Turner RT,Wakely GK,HannonKS,Bell NH.(188)，“他莫昔芬对卵巢激素缺乏鼠破骨细胞介导的小梁骨吸收的抑制”，Endocrinology,122,1146-1150。
发明概述本发明提供了预防和治疗绝经后疾病的方法，该方法无明显的亲子宫作用。此方法包括给有此需要的病人使用有效量的式Ⅰ化合物及其可药用的酸加成盐
其中X表示3位或4位碘或溴原子，符号R1和R2可相同或不同，表示C1-C3烷基，特别是甲基或乙基，或者R1表示氢原子而R2表示C1-C3烷基，或者R1和R2与它们连接的氮原子一起表示饱和杂环，一般是5或6元环，特别是1-吡咯烷基、哌啶子基、4-甲基哌啶子基或吗啉代基团。
发明详述本发明是治疗绝经后疾病的治疗方法，该方法使用以前制备的并确定对治疗雌激素受体阳性乳腺癌有效的化合物。这些化合物以上述式Ⅰ描述并描述在美国专利4839155中。
用于本治疗方法的优选的化合物为
(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]吡咯烷已知这些化合物结合雌激素受体并依所研究组织不同而引起雌激素激动或拮抗作用。
术语“绝经后疾病”指骨质疏松和动脉粥样硬化性心血管疾病如心肌梗塞和中风以及血浆胆固醇的增加。本发明方法可有效预防骨损失并产生与降低动脉硬化发病率有关的血脂分布。
通过对骨质疏松的卵巢切除鼠模型及绝经后妇女的研究评价防止骨损失的能力。
组织形态测定研究表明当摘除雌性成年鼠卵巢时，邻胫骨干骺端发生进行性骨损失。卵巢切除后(OVX)三个月后，通过骨更新增加，60-70％的网状骨质被除去，其中过量的骨吸收占优势。腰椎也发生骨损失，但速率较慢。OVX引起的鼠骨损失(可通过雌激素替代剂量彻底预防)形成了最广泛使用的、性能最好的骨质疏松动物模型的基础。
Sprague-Dawley鼠的鼠龄为7-8个月。通过双能量X线吸光分析(DXA)对脊柱的腰3-6区和邻胫骨干骺端测定骨密度基值(BMD)。然后，将鼠分成对腰BMD具有约相同的平均值和标准偏差的8-10个组。这些组中的鼠双侧卵巢切除(OVX)并且每一实验中有一组未切除。
将艾多昔芬制备为口服制剂，即在1％羧甲基纤维素水溶液中的悬浮液。通过口腔管饲法每天对鼠给药一次。在每一实验中，一组OVX和未切除组每天通过管饲法服用口服制剂载体。手术后那天即开始给药。
治疗2周后测定血浆胆固醇水平。腰和胫骨BMD测定周期为1个月。将动物处死，摘除子宫并测量湿重。死后收集胫骨、植入并切片进行组织形态测定(15)。在距生长板上1.2mm的次级松质中测定网状骨质区和周边。网状骨质区(Cn.B.Ar)以髓状区的百分率表示。使用Parfitt等人开发的方程由主区和周边测定次级结构参数、小梁宽、小梁长和小梁分离。艾多昔芬对骨质疏松的卵巢切除鼠模型的骨损失、血浆胆固醇和子宫重量作用的起始剂量范围研究本研究的目的为了确定艾多昔芬预防骨质疏松OVX鼠模型骨损失的最佳剂量。
BMD在治疗1、2及3个月后测定。除了摘除胫骨进行组织形态测定外，切除股骨和椎骨(L1和2)进行离体BMD测定(只测股骨)和机械性实验。艾多昔芬剂量为2、8、40和200μg/kg/天。
按照所有测定参数，艾多昔芬无作用剂量为2μg/kg。
只有200μg/kg的艾多昔芬对OVX引起的腰脊柱中BMD降低有显著预防作用。此剂量是有效的并在1个月内造成骨损失的100％抑制。对腰脊柱治疗3个月后，200μg/kg的艾多昔芬引起约50％的骨损失抑制。
在邻胫骨中，在1个月时8-200μg/kg的艾多昔芬引起约50％骨损失抑制。在3个月时此保护程度降至约25％，无显著性。这表明对此骨骼部位200μg/kg的艾多昔芬不是最佳剂量。
离体骨密度测量表明200μg/kg的艾多昔芬维持邻股骨BMD在未切除对照组的水平。此剂量也维持股骨中干髓质横切面在未切除对照组的水平，这表明艾多昔芬防止皮质和网状骨质的损失。艾多昔芬在3点弯曲实验中对股骨骨干或在轴向压力实验中对L2脊柱体的机械强度无不利影响。
组织形态测定表明治疗3个月后艾多昔芬对邻胫骨网状骨质区只有小的并且是非显著的作用，这与BMD测定吻合。在小梁宽度方面，各组之间无差别。尽管艾多昔芬对胫骨网状骨质区缺乏长期效果，但剂量低到40μg/kg时对小梁数目和分离的活性也是明显的。
艾多昔芬(200μg/kg)显著降低血浆胆固醇(图5)。治疗3个月后，艾多昔芬的所有剂量都引起非常弱但有统计学显著性的子宫重量增加。艾多昔芬对骨质疏松的卵巢切除鼠模型中骨损失、血浆胆固醇和子宫重量作用的精确剂量研究本研究的目的为了确定艾多昔芬预防骨质疏松OVX鼠模型骨损失的最佳剂量。在1个月时测定BMD并在收集子宫和胫骨前再继续治疗2周。
200和500μg/kg的艾多昔芬完全防止了腰椎中发生的骨损失。1000μg/kg的艾多昔芬对腰椎无显著性作用。200-1000μg/kg的艾多昔芬完全防止了邻胫骨骨干中的骨损失。
组织形态测定表明防止OVX引起的网状骨质损失的艾多昔芬最佳剂量为500μg/kg。200和500μg/kg的艾多昔芬显著防止OVX引起的小梁宽度降低。500和1000μg/kg的艾多昔芬显著保护了小梁的数量。200-1000μg/kg的艾多昔芬显著防止了OVX引起的小梁分离的增加。
艾多昔芬的所有剂量显著降低了血浆胆固醇水平(
图11)。任何被测剂量的艾多昔芬对子宫的湿重都无作用。
通过以治疗OVX鼠6周后的所有测定参数一致确定了艾多昔芬的500μg/kg剂量为最佳值。
在6周的治疗期内，发现艾多昔芬的最佳剂量为500μg/kg。防止椎骨骨损失的最小有效剂量为200μg/kg而降低胆固醇的最小有效剂量为100μg/kg。总之，艾多昔芬的骨保护和降低胆固醇作用对防止绝经后疾病是有用的，其对子宫内膜无不良作用。
对绝经后妇女在3个月的研究中，将艾多昔芬的三个剂量(2.5、5和10mg/kg)与安慰组比较。这些妇女在研究初期骨密度低。通过测定骨吸收(以C-端肽排泄测定的尿胶原交联排泄，自由交联和总交联)和骨形成(血清骨钙蛋白)的生化标记物的变化，来检测与骨损失速度的降低相一致的对骨作用的存在。
观察到的与这些生化标记物水平降低有关的剂量(见下)表示骨更新的降低并与雌激素对绝经后妇女骨更新的作用一致。所有变化以相对基值的百分率变化描述。用下列符号表示与安慰组有统计学显著差异*=p＜0.01,**=p＜0.001
还测定了治疗前后不同脂参数、纤维蛋白原及其它凝集/纤维蛋白溶解参数水平的变化，将其作为艾多昔芬对心血管疾病危险性的类似作用的指数。本实验的结果如下。<
>当本发明的化合物及其有活性的可药用盐口服时，可制成液体，如糖浆、混悬剂或乳液、片剂、胶囊及锭剂。
一般来说，液体制剂由本发明化合物或其可药用盐在适宜液体载体(一种或多种)中的悬浮液或溶液组成，液体载体有如乙醇、甘油、非水溶剂如聚乙二醇、油或水，其中添加助悬剂、防腐剂、香料或着色剂。
片剂形式的组合物可使用任何常规用于制备固体制剂的适宜药用载体(一种或多种)制备。这些载体的例子包括硬脂酸镁、淀粉、乳糖、蔗糖和纤维素。
胶囊形式的组合物可通过常规包囊方法制备。例如，可用标准载体制备含活性成分的小丸并再将其填充进硬明胶胶囊；或者，可用任何适宜的载体(一种或多种)如含水胶、纤维素、硅酸盐或油制备分散液或混悬液，并再将此分散液或混悬液填充如软明胶胶囊。
当本发明的化合物及其活性的可药用盐非经胃肠道(即通过注射或输注)给药时，可制备为溶液或混悬液。
非经胃肠道给药组合物一般由在灭菌含水载体或非经胃肠道用油中的活性成分的溶液或混悬液组成，非经胃肠道用油如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油。或者，可将此溶液冻干并恰在给药前再用适当溶剂重新配制。
当以此种方式给药时，典型的栓剂组合物含有本发明的化合物或其有活性的可药用盐，以及粘合剂和/或润滑剂如聚二醇类、明胶或可可脂或其它低熔点植物或合成蜡或脂肪。
典型的透皮制剂含有常规水性或非水载体，例如，霜剂、软膏、洗剂或糊剂，或为含药硬膏剂、贴剂或膜。
对于局部给药，采用的药物组合物包括溶液、混悬液、软膏及固体插入物。典型的可药用载体为，例如，水、水和与水混溶溶剂如低级烷醇或植物油的混合物，以及水溶性眼科用无毒聚合物如纤维素衍生物如甲基纤维素。该药物制剂还可含有无毒辅剂如乳化剂、防腐剂、湿润剂和成形剂，如聚乙二醇类；抗菌剂成分如季铵化合物；缓冲成分如碱金属氯化物；抗氧剂如焦亚硫酸钠；及其它常规成分如脱水山梨醇单月桂酸酯。
优选地，该组合物是单位剂量形式。本发明化合物在药物剂量单位中的剂量是有效的、无毒的量，选自0.01-200mg/kg活性化合物，优选0.1-100mg/kg。所选剂量给需要治疗或预防骨质疏松或降低血浆胆固醇或预防心血管疾病的患者每天使用1-6次，使用途径有口服、直肠给药、局部给药或注射，或者通过输液。给人使用的口服剂量单位优选含10至500mg活性化合物。较低剂量一般用于非经胃肠道给药。当对患者来说安全、有效、方便时，就口服给药。
当本发明的化合物按照本发明给药时，无不能接受的毒性作用。
实施例1通过过筛、混合并按例如如下的比例将各组分填充入硬明胶胶囊，制备式(Ⅰ)活性化合物的口服给药的口服剂型。
组分 量(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2-苯 100mg基-1-丁烯基]苯氧基]吡咯烷硬脂酸镁 10mg乳糖 100mg实施例2将蔗糖、硫酸钙二水合物和口服活性式(Ⅰ)化合物混合并用10％明胶溶液制粒。将此湿颗粒过筛，干燥，并与淀粉、滑石和硬脂酸混合，过筛并压制成片剂。
组分 量(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2- 75mg苯基-1-丁烯基]苯氧基]吡咯烷硫酸钙二水合物 100mg蔗糖 15mg淀粉 8mg滑石 4mg硬脂酸 2mg实施例3将(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]吡咯烷50mg分散于25ml生理盐水中制备注射液。
实施例4此实验对艾多昔芬和雷洛昔芬对骨质疏松的作用机理进行比较。用含萤虫素酶报告基因(如下)的雌激素响应因子(ERE)上流的构件，表明艾多昔芬和雌激素一样是通过成骨细胞中ERE的纯激动剂。天然甾类激素雌激素和艾多昔芬之间的激动作用能力相似。与艾多昔芬浓度(0.01至10μM)相同的雷洛昔芬，其通过ERE信号极弱，幅度与载体对照相似。
进行竞争实验来确定通过此响应因子的作用机理。通过ERE雷洛昔芬抑制雌激素和艾多昔芬的激动活性。配体(雌激素或艾多昔芬)剂量为100nM时，有一个最大激动响应。用500nM雷洛昔芬共同治疗将报告基因的活性降低至载体对照组的水平。相反，500nM的艾多昔芬不降低100nM雌激素在成骨细胞中的最大激动作用。如果使用艾多昔芬和雌激素的次最大浓度(＜100nM)，在成骨细胞中通过ERE，这两种激动剂有加合作用。
实验方法将细胞接种于6孔板中，其浓度为1.5×105个细胞/孔，或以1.5×104细胞/孔接种于24孔板中，培养基为无酚红培养基。使用含鼠乳腺癌病毒启动子的DNA构件，其中糖皮质激素反应因子已被5个拷贝的33碱基对卵黄生成素响应因子代替。这是萤虫素酶报告基因(MMTV-ERE-Luc)的上流(Wen,D.X.,Y-F,Xu,M.K.Goldman and P.McDonnell,1994。“通过靶细胞内明显信号路径操纵人孕酮受体的A和B异构体”，Molec.Cell.Biol.14:8356-8364)。以双萤虫素酶检测方法(Promega,Madison,WI)用renilla-萤虫素酶载体校正转染效果。通过脂转染方法(Life Technologies,Gaithersburg,MD)将DNA引入鼠骨肉瘤(Ros 17/2.8)细胞。在6孔板中用每孔2μg而在24孔板中用每孔140ng的MMTV ERE-Luc和25ng对照renilla-萤虫素酶载体(pRL-CMV)共转染细胞。用renilla-萤虫素酶载体共转染校正转染效果，用不同底物，coelenterazine，针对其生物发光读数(Promega,Madison WI)。细胞培养过夜。然后，除去转染培养基并将细胞在有激素或无激素条件下培养48小时。在磷酸缓冲盐水中洗涤细胞，然后用500μl/孔1×被动溶解缓冲液(PLB)溶解15分钟，同时在摇床上摇动样品。以12000g将裂解物离心30秒并在报告酶分析前将清澈的溶胞产物转移至试管中。将样品(20μl)转移至96孔发光检测板中并与100μl每种实验试剂(Promega,Madison,WI)反应。通过微光LB96P发光计(Wallac,Gaithersburg,MD)注射每种实验试剂，检测萤虫素酶活性。萤虫素酶活性提供了含雌激素响应因子(ERE)的雌激素反应基因的转录活化的替代物。因此，萤虫素酶活性的升高是激动作用的指征，而下降表明通过ERE有拮抗作用。
讨论艾多昔芬是通过成骨细胞中雌激素响应因子(ERE)的激动剂。与艾多昔芬相反，在被测剂量时雷洛昔芬是通过成骨细胞中ERE的拮抗剂，这表明与雷洛昔芬所见的骨节约作用的机理不同。因此，雷洛昔芬可通过含存在于人TGFβ3启动子的5′-未翻译区中的序列的非ERE起生物作用。在相同的细胞系统中，雷洛昔芬抑制含ERE的卵黄生成素启动子的表达并因此具有纯雌激素拮抗作用。此雷洛昔芬响应因子(Yang,N,N.,Venugopalan,M.,Hardikar,S.,and Glasebrook,A.(1996)，被17β-雌二醇代谢物和雷洛昔芬活化的雌激素响应因子的确定，Science 273:1222-1225)与ERE不在同一基因上，这表明通过此反应因子调节将对不同基因产生作用。这使艾多昔芬与选择性雌激素受体调节因子(SERM)雷洛昔芬的作用机理不同，并使艾多昔芬具有更经典的雌激素型机理，其在成骨细胞中通过ERE发挥生物激动作用。艾多昔芬和雌激素的作用特异性地针对携带经典ERE的报告基因构件。此系统对细胞特异性因子是敏感的并因此成为对内源基因转录作用的有效模型。
权利要求
1．预防和治疗绝经后疾病的方法，包括给需要的患者使用有效量的式Ⅰ化合物。
2．权利要求1所述的方法，其中绝经后疾病是骨质疏松。
3．权利要求1所述的方法，其中式Ⅰ化合物是(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]乙基]吡咯烷。
4．式Ⅰ化合物在制备用于治疗绝经后疾病的药物方面的用途。
5．权利要求4的用途，其中绝经后疾病是骨质疏松。
6．权利要求1的用途，其中式Ⅰ化合物是(E)-1-[2-[4-[1-(4-碘代苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]乙基]吡咯烷。
全文摘要
描述了治疗骨质疏松的新方法。艾多昔芬是优选的化合物。
文档编号C07D295/08GK1236299SQ97199492
公开日1999年11月24日 申请日期1997年9月3日 优先权日1996年9月6日
发明者J·N·布拉德贝尔, M·戈文 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司