本发明涉及一种胸腺五肽新的制备方法，具体涉及胸腺五肽的固相多肽合成制备方法。
背景技术：
：胸腺五肽，英文名为Thymopoietinpentapeptide;TP-5;Thymopentin，结构式为Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH，分子式及分子量：C30H49N9O9，679.77。胸腺五肽是胸腺生成素Ⅱ(Thy-mopoietinⅡ)第32～36位的氨基酸残基片段,它的基本序列为H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH,保留了胸腺生成素的有效生物活性。有关TP-5的生物活性和免疫功能国内外已有很多报道。TP5为细胞免疫调节药物,具有诱导T细胞分化,促进T淋巴细胞亚群发育并活化的功能。它可增强巨噬细胞吞噬功能及增强红细胞免疫功能,提高自然杀伤细胞活性和白介素-2的产生水平与受体表达水平,增强外周血单核细胞γ-干扰素的产生,增强血清中超氧化物歧化酶活性。胸腺五肽临床用于免疫增强剂，用于艾滋病早期治疗，慢性肝炎，恶性肿瘤，手术及严重感染，还可用于糖尿病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、肾小球肾炎、多发性硬化等自身免疫性疾病，还具有抗衰老作用等。胸腺五肽的合成大部分是采用固相合成方法。目前，常规的胸腺五肽的制备方法是以氯甲基树脂或wang树脂为起始原料，与叔丁氧羰基保护的酪氨酸反应生成酪氨酸树脂，再依次将保护缬氨酸、保护天冬氨酸、保护赖氨酸、保护精氨酸进行缩合反应，生成保护TP-5树脂，再与切肽试剂反应，使TP-5从树脂上脱下，经提纯后得到TP-5产品。上述方法存在明显缺陷，接肽收率低，生产成本高，工艺复杂，例如，使用叔丁氧羰基保护的酪氨酸，其价格比未进行侧链保护的酪氨酸高50%；三废污染严重，使用巯基类化合物作清除剂，使用剧毒的氟化氢和三氟乙酸等。上述方法难以进行工业化生产。技术实现要素：本发明的目的是提供一种固相多肽合成胸腺五肽制备方法，大幅度减少三废和降低原料成本，提高反应收率，以克服现有技术存在的上述缺陷。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种胸腺五肽的制备方法，包括如下步骤：以羟甲基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH；切肽，提纯，获得目标产物。一种胸腺五肽的制备方法，包括如下步骤：（1）以羟甲基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH，（2）将2NHCl/HAc加入步骤（1）的产物进行切肽，加入乙酸乙酯沉淀，过滤、洗涤得五肽粗品；（3）将步骤（2）的粗品采用C18柱进行分离纯化，流动相采用：2%硫酸铵-甲醇溶液；（4）将上柱收集得到的合格溶液，减压浓缩至原体积的十分之一，加乙酸乙酯沉淀，获得目标产物。所述羟甲基树脂的英文名为Hydroxymethylresin.其中，以羟甲基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH的方法包括如下步骤：（1）制备Fmoc-Tyr-树脂：将羟甲基树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干；加入溶解于DMF中的Fmoc-Tyr-OH和DIPEA中，20-40℃反应0.5-1.5小时，加甲醇，20-40℃反应0.5-1.5小时，抽干，分别用DMF、甲醇DMF分别洗涤，抽干，获得Fmoc-Tyr-树脂；（2）制备Fmoc-Val-Tyr-树脂：将上述Fmoc-Tyr树脂中，加入7.5%DBU的DMF溶液，20-35℃反应15-25分钟，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干。加入Fmoc-Val-OH、TBTU溶解于DMF，20-30℃反应1.0-2小时，抽干，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Val-Tyr-树脂；DMF中，树脂的重量浓度为5-15%，Fmoc-Val-OH的摩尔比为树脂的2-5倍，TBTU的摩尔比为树脂的2-5倍。（3）制备Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂：将上述的Fmoc-Val-Tyr-树脂中，加入7.5%DBU的DMF溶液，20-35℃反应15-45分钟，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干。加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH、TBTU溶解于DMF，20-35℃反应1.0-2小时，其余操作同（2），获得Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂；DMF中，Fmoc-Val-Tyr-树脂的重量浓度为5-15%，Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩尔比为树脂的2-5倍，TBTU的摩尔比为树脂的2-5倍。Fmoc-Val-Tyr-树脂与7.5%DBU的DMF溶液的重量比例为：Fmoc-Val-Tyr-树脂∶7.5%DBU的DMF溶液=1∶5-15；（4）制备Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂：将上述Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂中，加入7.5%DBU的DMF溶液，20-35℃反应15-45分钟，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干。加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU溶解于DMF，20-30℃反应1.0-2小时，DMF、甲醇、DMF分别洗涤三次，获得Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂；DMF中，Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂的重量浓度为5-15%，Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔比为树脂的2-5倍，TBTU的摩尔比为树脂的2-5倍。Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂与7.5%DBU的DMF溶液的重量比例为：Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂∶7.5%DBU的DMF溶液=1∶5-15；（5）制备Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂：将上述Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂中，加入7.5%DBU的DMF溶液，20-35℃反应15-45分钟，分别用DMF、甲醇洗涤，抽干。加入Boc-Arg-OH、TBTU，溶解于DMF，20-35℃反应1.0-2小时，其余操作同（2），获得Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂；DMF中，Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂的重量浓度为5-15%，Boc-Arg-OH的摩尔比为树脂的2-5倍，TBTU的摩尔比为树脂的2-5倍。Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂与7.5%DBU的DMF溶液的重量比例为：Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂∶7.5%DBU的DMF溶液=1∶5-15；所述切肽包括如下步骤：将切肽试剂加入Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂,15-35℃反应1.5-3小时，加入乙酸乙酯沉淀，过滤，收集沉淀物，用乙酸乙酯洗,P2O5真空干燥，得粗品；所述分离纯化包括如下步骤：将粗品溶于醋酸铵的水溶液中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相为0.1M硫酸铵:甲醇=95：5；流速为1000-1500ml/min；检测波长为：275nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后脱盐，减压浓缩至原体积的十分之一，加乙酸乙酯沉淀，获得成品。有益效果本发明采用羟甲基树脂为固相载体，以Fmoc保护的氨基酸为单体，第一个氨基酸采用Fmoc-Tyr-OH，不需要侧链保护，以TBTU为缩合剂，逐个接上氨基酸，每步接肽收率≥98%，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH,降低了生产成本，简化工艺，用2NHCl/HAc切肽，加乙酸乙酯沉淀粗品，条件温和，三废污染少。采用C18柱进行分离纯化，使用乙酸乙酯沉淀，无需进行冷冻干燥，纯化收率≥50%，每步接肽收率均在98%以上;切肽后收率为90%，分离纯化收率为54%，总收率约为47%。本发明的方法便于工业化实施。具体实施方式实施例1实施例中采用的原料和物质列表如下：No品名生产厂商1Fmoc-Tyr-OH吉尔生化（上海）公司2Fmoc-Val-OH吉尔生化（上海）公司3Fmoc-Asp(OtBu)-OH吉尔生化（上海）公司4Fmoc-Lys(tBu)-OH吉尔生化（上海）公司5Boc-Arg-OH吉尔生化（上海）公司6羟甲基树脂天津南开和成科技有限公司7TBTU苏州昊帆生物科技有限公司8DMF（N,N-二甲基甲酰胺）国药集团9甲醇国药集团10盐酸国药集团11HAc（冰醋酸）国药集团12乙酸乙酯国药集团13DBU苏州昊帆生物科技有限公司14DIPEA苏州昊帆生物科技有限公司表中所采用原料的中文名称如下：TBTU:O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸；DBU:1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯；DIPEA:N,N-二异丙基乙胺。胸腺五肽的制备方法，包括如下步骤：1、制备Fmoc-Tyr-树脂：取417g羟甲基树脂(1.2mmol/g树脂,500mmol)，用5000mlDMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干。取202gFmoc-Tyr-OH(FW:403.4,500mmol)、550mlDIPEA,，用5000mlDMF溶解，入反应容器，20~40℃反应60分钟。加甲醇500ml，20~40℃反应60分钟。抽干，分别用DMF洗涤三次，抽干。2、制备Fmoc-Val-Tyr-树脂：加4000ml7.5%DBU的DMF溶液，20~40℃反应30分钟，抽干，分别用DMF、无水甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。加入509g(FW:339.4,1.5mol)Fmoc-Val-OH、482g(FW:321,1.5mol)TBTU，用5000mlDMF溶解，加入反应容器，20~40℃反应60分钟。抽干，分别用DMF洗涤三次，抽干。3、制备Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂：加3000ml7.5%DBU的DMF溶液，20~40℃反应30分钟，抽干，分别用DMF、无水甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。加617g(FW:411.5,1.5mol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、482g(FW:321,2.4mol)TBTU，用5000mlDMF溶解，加入反应容器，20~40℃反应60分钟。抽干，分别用DMF洗涤三次，抽干。4、制备Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂：加3000ml7.5%DBU的DMF溶液，20~40℃反应30分钟，抽干，分别用DMF、无水甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。加703g(FW:468.5,1.5mol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、482g(FW:321,2.4mol)TBTU，用5000mlDMF溶解，加入反应容器，20~40℃反应60分钟。抽干，分别用DMF洗涤三次，抽干。5、制备Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-树脂：加3000ml7.5%DBU的DMF溶液，20~40℃反应30分钟，抽干，分别用DMF、无水甲醇和DMF各洗涤三次，抽干。加493g(FW:310.81.5mol)Boc-Arg-OH，482g(FW:321,1.5mol)TBTU，用5000mlDMF溶解，加入反应容器，20~40℃反应60分钟，抽干，分别用DMF洗涤三次，抽干。再分别用无水甲醇、DMF、无水甲醇各洗涤三次，抽干，得保护五肽树脂。6、在保护五肽树脂中，于冰水浴冷却下，加入5000ml的2NHCl/HAc,除去冰水浴，于25℃~30℃搅拌2小时。加入25000ml冷至5~10℃的乙酸乙酯进行沉淀，静置2小时后过滤，用乙酸乙酯充分洗涤，P2O5减压干燥，得粗品360g（FW:680，530mmol）。其中，2NHCl/HAc（氯化氢/冰醋酸）溶液制备方法为：将工业用的浓硫酸滴入食用粗盐（已烘干）中，产生HCl气体，通过二个硫酸洗气瓶，通至盛有1000毫升（约重1050克）HAc吸收瓶中（先称好毛重和净重），待其重量增加至1123克左右即停止，装入试剂瓶内，盖紧内塞放入冰箱。7、将360g粗品溶于1000ml0.1M醋酸铵中，过滤除去少量不溶物，滤液经C18柱纯化，流动相：0.1M硫酸铵:甲醇（95：5）；流速为：1000ml/min；检测波长为：275nm；用分析液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后脱盐，减压浓缩至原体积的十分之一，加乙酸乙酯沉淀，得160g白色块状物成品（MW：680,235mmol）,总收率47%（以树脂的500mmol计）。纯度为：99.51%，最大单个杂质为0.40%，其他均符合获得符合2010版中国药典质量标准。当前第1页1 2 3