鞘翅目有害生物的生物控制的制作方法

本发明总体上涉及由其摄食活动而引起对作物植物损害的有害生物的控制，并且更具体地涉及通过包括干扰RNA分子的组合物控制鞘翅目有害生物。本发明进一步涉及包括干扰RNA分子的组合物并且涉及使用此类组合物的方法。背景根萤叶甲属中的昆虫种类(玉米根虫和黄瓜叶甲)被认为是对作物植物最重要的有害生物中的一些。例如，玉米根虫的种类，包括西方玉米根萤叶甲(Diabroticavirgiferavirgifera)，西方玉米根虫(WCR)；巴氏根萤叶甲(D.barberi)，北方玉米根虫(NCR)，黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctatahowardi)，南方玉米根虫(SCR)及墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgiferazeae)，墨西哥玉米根虫(MCR)，是北美最具破坏性的玉米有害生物，每年导致估计超过十亿美元的损失。西方玉米根虫也已经入侵欧洲并且每年导致估计五亿欧元损失。南美叶甲(除了别的之外，俗名包括叶甲、巴西小甲虫、葫芦甲虫及菊花甲虫)在南美是一种重要的玉米、大豆及花生有害生物。玉米损失的大部分由根虫幼虫摄食导致。刚孵出的根虫幼虫位于土壤中的玉米根部并且最初开始摄食细根毛并钻入玉米植物的根尖中。随着幼虫长大，它们摄食初生根并挖隧道进入其中。当根虫数量巨大时，幼虫摄食和由根腐病病原体导致的受损根的劣变可以导致根减少至茎的基部。严重的根损伤干扰根将水和营养素运输进植物的能力，减少植物生长，并且导致减少的谷物产量。严重的根损伤还可以导致玉米植物的倒伏，使得机械收获更困难或不可能。玉米根虫成虫主要摄食玉米须、花粉以及暴露的穗尖上的籽粒(kernel)。如果玉米根虫成虫在玉米生殖组织存在之前开始出现，则成虫可以摄食叶组织，刮掉绿色的表面组织并且留下窗玻璃外观。成虫摄食穗丝可以导致穗尖处的穗丝减少，通常称作穗丝修剪(silkclipping)。在大田玉米中，甲虫种群在花粉散发过程中可以达到足以导致严重的穗丝修剪的程度，这可以干扰授粉并减少收率。因此，不像仅幼虫期导致损失的玉米的鳞翅目有害生物，玉米根虫的幼虫期和成虫期都能够对玉米导致经济损失。根萤叶甲属昆虫有害生物主要是通过密集应用化学杀有害生物剂来控制，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖或导致死亡而可以有效对抗幼虫期和成虫期。由此可以达到良好的昆虫控制，但这些化学品有时也会影响其他益虫。另外的问题出现在使用高杀虫剂的区域中，在这些区域中玉米根虫甲虫种群对某些杀虫剂已经变得有抗性。通过各种抗性管理实践已部分地缓和了这种状况，但对于可替代的害虫控制剂存在着越来越多的需要。来自苏云金芽孢杆菌的若干天然Cry蛋白或工程化的Cry蛋白已经在转基因作物植物中表达并且在商业上被开发以控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物。例如，起始于2003年，通过表达Cry3Bb1、Cry34Ab1/Cry35Ab1或修饰的Cry3A(mCry3A)蛋白而控制玉米根虫的转基因玉米杂交种在美国已经是可商购的。种子产业、大学研究员以及美国环境保护局已经一起合作来制定管理计划，以帮助缓解昆虫对表达杀虫蛋白的转基因植物的抗性的发生。它们主要是基于高剂量以及避护所策略。高剂量策略是使用表达甚至足够杀死部分抗性昆虫的高水平的杀虫蛋白(例如Cry蛋白)的玉米杂交种。基础的假设是杀死部分抗性的昆虫并且大力防止它们交配，从而延迟了抗性的产生。高剂量策略的成功部分取决于杀虫蛋白对具体昆虫种类的特异性活性以及多少该杀虫蛋白可以被表达于转基因玉米植物中。杀虫蛋白对有害生物的特异性活性越高，需要表达于转基因植物中以实现高剂量策略的杀虫蛋白的量越少。例如，表达鳞翅目-有效Cry蛋白(Cry1Ab)的玉米杂交种被认为对抗主要靶标有害生物欧洲玉米螟(玉米螟)是高剂量的。由于Cry1Ab以LC50<10ng/cm2对于欧洲玉米螟幼虫很具毒性(即，高特异性活性)，在转基因植物中可实现的Cry1Ab表达水平很容易将这样的玉米杂交种置于一种高剂量范畴中。然而，不像鳞翅目-有效产品，当前根虫产品不被认为是高剂量的。它们表达的蛋白不有效对抗成虫并且对晚龄幼虫具有有限活性。因此，当前转基因根虫产品允许一些根虫幼虫存活并成为成虫。因此，由玉米根虫成虫导致的穗丝修剪的经济水平仍可以甚至出现在种植为转基因玉米根虫杂交种的部分大田中。例如，西方玉米根虫成虫的密度可以在种植为转基因玉米根虫杂交种的部分大田中超过经济水平，这归因于甲虫的迁入以及成虫从转基因根系的直接羽化。已经有许多报道确认西方玉米根虫成虫羽化自某些玉米转基因根虫杂交种(Crowder(克劳德)等人2005.J.Econ.Entomol.(经济昆虫学杂志)8:961-975)。一个最近的出版物表明当在大田中遇到一些转基因玉米植物或非转基因玉米植物时，西方玉米根虫成虫将展现出类似的摄食行为，并且表明转基因植物中的某些杀虫蛋白对可能影响抗性管理的成虫将具有显著效果是不太可能的。因此，鉴定具有新作用模式的替代昆虫控制试剂将是有益的。特别有用的将是对靶标昆虫有害生物的多个生活期具有毒性的新昆虫控制试剂。此类昆虫控制试剂可以包括靶向靶标昆虫有害生物中的遗传因子的那些。细胞凋亡是一种生理性细胞死亡过程，该过程在许多生物机体中对于健康生物系统的发育和维持而言是关键的。蛋白质的细胞凋亡抑制剂(IAP)家族首先发现于攻击昆虫的杆状病毒中并且已经显示参与抑制对杆状病毒感染应答的昆虫宿主细胞死亡(细胞凋亡)中(Crook(克鲁克)等人1993.J.Virol.(病毒学杂志)67:2168-2174；Birnbaum(伯恩鲍姆)等人1994.J.Virol.(病毒学杂志)68:2521-2528)。随后，IAP蛋白发现于其他生物体中，包括酵母酿酒酵母、线虫秀丽隐杆线虫、苍蝇黑腹果蝇以及若干哺乳动物种类。天然IAP作为半胱天冬酶(细胞凋亡的主要刽子手(executioner))的内源抑制剂而发挥作用，并且IAP家族蛋白由叫做杆状病毒IAP重复(BIR)的大约70个氨基酸结构域表征。BIR结构域的高达三个串联拷贝可以出现于病毒和动物种类的已知IAP家族蛋白内。尽管IAP蛋白家族中的成员资格需要存在BIR结构域和抑制细胞凋亡的能力两者，但是这些含BIR蛋白中的许多相对于细胞凋亡抑制是未经试验的。此外，因为酵母是否具有细胞凋亡程序是有争议的(Zha(查)等人1996.MolCellBiol.(分子与细胞生物学)16:6494-6508)，所以存在于粟酒裂殖酵母和酿酒酵母中的含BIR蛋白提高BIR结构域未唯一地致力于细胞凋亡抑制的可能性。而是，它们可以作为可能已经进化为适合多种目的的蛋白相互作用结构域而起作用。因此，所有IAP对于任何给定生物体而言都是生命关键途径的一部分是不清楚的，特别是在某些昆虫种类中，包括鞘翅目有害生物种类，像根萤叶甲属。有害生物根萤叶甲属种类中的IAP蛋白可以作为有害生物控制策略而被靶向也是未确定的。此外，使用干扰RNA分子可以调节此类IAP蛋白的表达并且如果此类蛋白表达可以被调节，这样的调节是否将导致对靶标根萤叶甲属有害生物的毒性甚至是更未确定的。当一种生物体识别双链RNA(dsRNA)分子并水解它们时，RNA干扰(RNAi)发生。所产生的水解产物是约19-24个核苷酸长度的小RNA片段，这些小RNA片段称作小干扰RNA(siRNA)。然后这些siRNA扩散或被携带至整个生物体，包括越过细胞膜，在那里它们与mRNA(或其他的RNA)杂交并且导致RNA的水解。干扰RNA由RNA干扰沉默复合体(RISC)识别，RNA的效应链(或“引导链”)位于该复合体中。此引导链充当双链体序列的识别和破坏模板。每次siRNA与其互补RNA靶标杂交，该此过程都被重复，有效防止那些mRNA被翻译，并且因此“沉默”mRNA自其中转录的特异性基因的表达。大部分植物miRNA对其靶标mRNA显示出广泛的碱基配对，并引导其裂解(Jones-Rhoades(琼斯-罗兹)等人(2006)Annu.Rev.PlantBiol.(植物生物学年评)57,19-53；Llave(莱维)等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)97,13401-13406)。在其他例子中，干扰RNA可以结合至具有非完美互补性的靶标RNA分子，导致在没有mRNA降解的情况下的翻译阻抑。到目前为止，多数研究的动物miRNA似乎以此方式发挥功能。对于使用这样的具有杀虫活性的组合物和方法，例如用于作物保护或昆虫介导的疾病的控制存在不断的需要。需要新颖的组合物来克服对现有杀虫剂的抗性问题和/或帮助缓解对现有转基因植物方法的抗性的发展。理想地，此类组合物具有高毒性并且当被靶标有害生物口服摄取时是有效的并且对于使用对抗有害生物昆虫的幼虫期和成虫期两者而言具有适用性。因此，提供了其中这些特性中的任一种被增强的组合物的任何发明将代表本领域的进步。概述以上所列出的需要是通过本发明来满足的，在多个实施例中，本发明提供了控制经济上重要的昆虫有害生物的新方法。本发明部分地包括一种抑制一种或多种靶基因和蛋白在昆虫有害生物(例如根萤叶甲属的成员)中的表达的方法。具体而言，本发明包括调节一种或多种细胞凋亡抑制剂(IAP)基因在根萤叶甲属种类中的表达的方法，例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、南美叶甲(Diabroticaspeciosa)(菊花甲虫)以及相关种类，该方法导致摄食、生长、发育及繁殖的中止，并且最终导致昆虫的死亡。该方法包括将双链RNA(dsRNA)或其修饰形式(例如小干扰RNA(siRNA))序列引入进有害生物昆虫体内的细胞中或引入进其中的细胞外环境(例如中肠)中，其中该dsRNA或siRNA进入这些细胞并且抑制至少一种或多种IAP基因的表达并且其中该一种或多种IAP基因的抑制在该有害生物昆虫上发挥有害作用。明确考虑的是，通过在该有害生物的食物中提供一种或多种包括dsRNA或siRNA分子的组合物，本发明的这些方法和组合物将在限制或消除任何植物中或其上的有害生物昆虫侵染方面是有用的。本发明还提供了干扰RNA分子，当递送至昆虫有害生物时，该干扰RNA分子通过毒性作用抑制该昆虫有害生物存活、生长、摄食和/或繁殖的能力，或限制有害生物相关的损害或作物植物的损失。这样的递送可以是通过在转基因植物(例如玉米)中产生干扰RNA，或通过将包括干扰RNA的组合物局部施用至植物或植物种子(如玉米植物或玉米种子)。该干扰RNA分子包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列与可从该有害生物昆虫的IAP基因转录的mRNA的核苷酸序列或可从该有害生物昆虫的IAP基因转录的mRNA的核苷酸序列的一部分互补并且因此抑制该IAP基因的表达，导致摄食、生长、发育、繁殖的中止，并且最终导致该有害生物昆虫的死亡。本发明进一步涉及包括本发明的dsRNA分子的至少一条链的核酸构建体、核酸分子和重组载体。本发明还提供了嵌合核酸分子，这些核酸分子包括本发明的dsRNA的一条反义链，该反义链可操作地与植物微小RNA前体分子相关。本发明还提供了人工植物微小RNA前体，这些前体包括本发明的dsRNA的一条反义链。本发明进一步提供了组合物，这些组合物包括本发明的两种或更多种dsRNA分子，其中这两种或更多种RNA分子各自包括一条不同的反义链，或包括本发明的两种或更多种核酸构建体或核酸分子或人工植物微小RNA前体。本发明进一步提供了用于抑制根萤叶甲属昆虫IAP基因的表达的杀虫组合物，该组合物包括本发明的dsRNA以及一种农业上可接受的载体。根萤叶甲属IAP基因的表达的抑制引起摄食和生长的中止并且最后导致该根萤叶甲属昆虫的死亡。本发明进一步涉及转基因植物，这些转基因植物产生一种或多种本发明的干扰RNA分子，这些干扰RNA分子自我保护免受昆虫摄食损害，并且涉及单独使用或与其他昆虫控制策略组合使用这些植物以赋予最大昆虫控制能力的方法。产生一种或多种本发明的干扰RNA分子或用一种包括一种或多种本发明的干扰RNA分子的组合物处理的植物和/或植物部分对昆虫有害生物侵染是高度抗性的。例如，经济上重要的根萤叶甲属鞘翅目有害生物可以通过一种产生本发明的干扰RNA分子的植物或通过用一种包括本发明的干扰RNA分子的组合物处理的植物或植物种子加以控制。本发明还提供了一种控制根萤叶甲属昆虫的方法，该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与一种作为本发明的干扰RNA或能够产生本发明的干扰RNA的核酸分子接触，从而控制该根萤叶甲属昆虫，该干扰RNA用于抑制IAP基因在该根萤叶甲属昆虫中的表达。在其他方面中，本发明提供了一种减少转基因植物上的成虫根萤叶甲属昆虫种群的方法，该转基因植物表达Cry蛋白、杂种Cry蛋白或修饰的Cry蛋白，该方法包括在该转基因植物中表达一种作为本发明的干扰RNA或能够产生本发明的干扰RNA的核酸分子，从而减少该成虫根萤叶甲属昆虫种群，该干扰RNA能够抑制IAP基因在成虫根萤叶甲属昆虫中的表达。在其他方面中，本发明提供了一种减少对本发明的干扰RNA的抗性在根萤叶甲属昆虫种群中的发展的方法，该方法包括在由该根萤叶甲属昆虫种群摄食的转基因植物中表达一种本发明的干扰RNA，该干扰RNA能够抑制IAP基因在幼虫和成虫根萤叶甲属昆虫中的表达，从而与暴露于仅能够抑制IAP基因在根萤叶甲属昆虫的幼虫期或成虫期的表达的干扰RNA的根萤叶甲属昆虫种群相比，减少抗性在该根萤叶甲属昆虫种群中的发展。在其他方面中，本发明提供了一种减少可从IAP基因转录的靶标RNA在根萤叶甲属昆虫中的水平的方法，该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与一种包括本发明的dsRNA分子的组合物接触，其中该dsRNA分子减少该靶标RNA在该根萤叶甲属昆虫的细胞中的水平。在仍其他方面中，本发明提供了一种赋予植物或其部分对根萤叶甲属昆虫耐受性的方法，该方法包括向该植物或其部分中引入一种本发明的dsRNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，从而赋予该植物或其部分对该根萤叶甲属昆虫的耐受性。在另外的方面中，本发明提供了一种减少被根萤叶甲属昆虫摄食的植物的根损害的方法，该方法包括向该植物的细胞中引入一种本发明的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，从而减少对该植物的根损害。在其他方面中，本发明提供了一种产生对根萤叶甲属昆虫具有毒性的转基因植物细胞的方法，该方法包括向植物细胞中引入一种本发明的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，从而产生与对照植物细胞相比，对该根萤叶甲属昆虫具有毒性的转基因植物细胞。在另外的方面中，本发明提供了一种产生对根萤叶甲属昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物的方法，该方法包括向植物中引入一种本发明的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，从而产生与对照植物相比，对根萤叶甲属昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物。在其他方面中，本发明提供了一种增强根萤叶甲属昆虫种群的控制的方法，该方法包括提供一种本发明的转基因植物或转基因种子并且向该转基因植物或该转基因种子施用一种对根萤叶甲属昆虫而言具有杀虫性的化学杀有害生物剂，从而增强该根萤叶甲属昆虫种群的控制。在其他方面中，本发明提供了一种为玉米种植者提供控制玉米作物中的根萤叶甲属昆虫有害生物种群的手段的方法，该方法包括(a)向该种植者销售或为其提供至少一袋玉米种子，该袋玉米种子包括转基因玉米种子，这些转基因玉米种子包括一种本发明的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物；并且(b)向该种植者做广告宣传该转基因玉米种子产生能够控制根萤叶甲属昆虫有害生物的转基因玉米植物。在下文本发明的描述中更详细地阐述本发明的这些方面和其他方面。附图简要说明图1示出了由wcrIAP1-A、wcrIAP1-B及wcrIAP1-CdsRNA靶向的wcrIAP1mRNA的部分。图2是PCR产物的琼脂糖凝胶，显示在西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)的幼虫期和成虫期中检测到相同的IAP1基因。图3是一个表达载体的图谱，该表达载体包括一种编码本发明的dsRNA的核酸分子。图4是根萤叶甲属IAP编码序列的比对。碱基(A、T、G或C)下“.”指示与参比序列中的碱基相同。不同于参比序列的碱基被指明。图5是将来自表达编码本发明的dsRNA的核酸的转基因玉米植物的根群与对照植物进行比较的绘图。在序列表中的序列的简要说明SEQIDNO:1是西方玉米根虫IAP1cDNA(wcrIAP1)的核苷酸序列，包括5'和3'非翻译区(UTR)。SEQIDNO:2是wcrIAP1(SEQIDNO:1)的编码区的核苷酸序列。SEQIDNO:3是可从wcrIAP1基因转录的mRNA的核苷酸序列。SEQIDNO:4是wcrIAP1mRNA的反义序列，指定为wcrIAP1*。SEQIDNO:5是dsRNA的一条正义链，指定为wcrIAP1-B。SEQIDNO:6是wcrIAP1-B的一条反义链，指定为wcrIAP1-B*。SEQIDNO:7是dsRNA的一条正义链，指定为wcrIAP1-A。SEQIDNO:8是wcrIAP1-A的一条反义链，指定为wcrIAP1-A*。SEQIDNO:9是dsRNA的一条正义链，指定为wcrIAP1-C。SEQIDNO:10是wcrIAP1-C的一条反义链，指定为wcrIAP1-C*。SEQIDNO:11是西方玉米根虫IAP2编码区(wcrIAP2)的核苷酸序列。SEQIDNO:12是可从wcrIAP2转录的mRNA的核苷酸序列。SEQIDNO:13是wcrIAP2mRNA的反义序列，指定为wcrIAP2*。SEQIDNO:14是南方玉米根虫IAP1编码区(scrIAP1)的核苷酸序列。SEQIDNO:15是可从scrIAP1(SEQIDNO:14)转录的mRNA的核苷酸序列。SEQIDNO:16是scrIAP1mRNA的反义序列，指定为scrIAP1*。SEQIDNO:17是北方玉米根虫IAP1编码区(ncrIAP1)的核苷酸序列。SEQIDNO:18是可从ncrIAP1转录的mRNA的核苷酸序列。SEQIDNO:19是ncrIAP1mRNA的反义序列，指定为ncrIAP1*。SEQIDNO:20是由SEQIDNO:2编码的氨基酸序列。SEQIDNO:21是由SEQIDNO:11编码的氨基酸序列。SEQIDNO:22是由SEQIDNO:14编码的氨基酸序列。SEQIDNO:23是由SEQIDNO:17编码的氨基酸序列。SEQIDNO:24是黑腹果蝇IAP蛋白(dmIAP)的氨基酸序列。SEQIDNO:25-28是可由siRNA靶向的wcrIAP1mRNA(SEQIDNO:3)的19-mer部分的实例。SEQIDNO:29-32是可由siRNA靶向的wcrIAP2mRNA(SEQIDNO:12)的19-mer部分的实例。SEQIDNO:33-36是可由siRNA靶向的scrIAP1mRNA(SEQIDNO:15)的19-mer部分的实例。SEQIDNO:37-40是可由siRNA靶向的ncrIAP1mRNA(SEQIDNO:18)的19-mer部分的实例。SEQIDNO:41-44是wcrIAP1*反义19-mer序列的实例。SEQIDNO:45-48是wcrIAP2*反义19-mer序列的实例。SEQIDNO:49-52是scrIAP1*反义19-mer序列的实例。SEQIDNO:53-56是ncrIAP1*反义19-mer序列的实例。SEQIDNO:57-62是在本发明中有用的引物。SEQIDNO:63是编码发夹RNA(hpRNA)的核苷酸序列，指定为hpwcrIAP1-C/wcrIAP1-C*。SEQIDNO:64是编码发夹RNA(hpRNA)的核苷酸序列，指定为hpwcrIAP1-Ca/wcrIAP1-Ca*。SEQIDNO:65是pRNA21534表达载体的核苷酸序列。SEQIDNO:66是pRNA21536表达载体的核苷酸序列。SEQIDNO:67是pRNA21537表达载体的核苷酸序列。详细说明下面提供了本发明的详细说明，以协助本领域的普通技术人员实践本发明。本说明不旨在是一个本发明以其而实施的所有不同方式，或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入其他实施例中，并且关于一个具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。另外，鉴于本披露内容，对本发明的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域技术人员是明显的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐明本发明的一些具体实施例，并不旨在完全列举出其所有排列、组合以及变体。本领域的普通技术人员可以在本文描述的这些实施例中做出修饰和变化而不偏离本发明的精神或范围。除非另外定义，否则所有在此使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在此的本发明的说明中使用的术语是仅出于描述具体实施例的目的，且并不旨在限制本发明。在此提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用以其全文结合在此。为了清晰起见，定义了在本说明书中所使用的某些术语并且将其呈现如下：如在此使用的，“一种/一个(a/an)”或“该(the)”可以表示一种/一个或多于一种/一个。例如，一个细胞可以意指单个细胞或多个细胞。如在此使用的，“和/或”指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(或)解释时组合的缺少。另外，当指可计量值(例如化合物或试剂、剂量、时间、温度等等的量)时，如在此使用的，术语“约(about)”意图包括所指值的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。如在此使用的，过渡短语“基本上由……组成”意指一项权利要求的范围将被解释为包括该权利要求中所提到的指定材料或步骤以及不实质上影响要求保护的发明的一个或多个基本特征和新特征的那些材料或步骤。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不意在被解释为等同于“包括(comprising)”。如在此使用的，“dsRNA”或“RNAi”是指由单个自身互补RNA链或至少由两条互补RNA链形成的多核糖核苷酸结构。互补程度(换言之，％一致性)不需要必须是100％。而是，它必须足够允许在所采用的条件下形成双链结构。优选地，通过GAP(尼德曼(Needleman)和温施(Wunsch)，1970)分析(GCG程序)，使用默认设置确定多核糖核苷酸的％一致性，其中查询序列是至少约21至约23个核苷酸长度，并且GAP分析经至少约21个核苷酸的区域比对这两个序列。在另一个实施例中，查询序列至少150个核苷酸长度，并且GAP分析经至少150个核苷酸的区域比对这两个序列。在一个另外的实施例中，查询序列至少300个核苷酸长度并且GAP分析经至少300个核苷酸的区域比对这两个序列。在又另一个实施例中，查询序列对应于全长靶标RNA(例如mRNA)，并且GAP分析经全长靶标RNA比对这两个序列。便利地，该dsRNA可以在重组宿主细胞中产生自单个开放阅读框，其中正义和反义序列的侧翼是一个不相关序列，该不相关序列使得正义和反义序列可以杂交以与该不相关序列形成该dsRNA分子，从而形成一个环结构。可替代地，正义链和反义链可以在不具有开放阅读框的情况下产生，以保证在转基因宿主细胞中将不制造蛋白质。这两条链还可以被分别表达为两种转录物，一种编码正义链并且一种编码反义链。可以在细胞内部或外部启动RNA双链体形成。该dsRNA可以是部分或完全双链的。RNA可以在体外或在体内酶促地或化学地合成。该dsRNA相对于初级转录产物或完全加工的RNA不需要是全长的。通常，可以使用较高的一致性来补偿较短的序列的使用。此外，该dsRNA还可以包括单链区域，例如该dsRNA可以是部分或完全双链的。该dsRNA的双链区域可以具有至少约18至约25个碱基对的长度，任选是约18至约50个碱基对的序列，任选是约50至约100个碱基对的序列，任选是约100至约200个碱基对的序列，任选是约200至约500个碱基对的序列，以及任选是约500至约1000或更多个碱基对的序列，直到对于其全长而言双链的分子，大小对应于全长靶标RNA分子。该dsRNA可以包含已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接物，其是合成的、天然发生的及非天然发生的。此类类似物的实例包括但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯以及2-O-甲基核糖核苷酸。如在此使用的，术语“特异性减少靶标RNA的水平和/或由该RNA编码的靶蛋白的产生”及其变体是指该dsRNA的一条链的一部分与该靶标RNA足够相同，这样使得在细胞中存在的该dsRNA减少稳态水平和/或所述RNA的产生。在许多情况下，该靶标RNA将是mRNA，并且在产生该mRNA的细胞中存在该dsRNA将导致所述蛋白的产生的减少。优选地，当与野生型细胞相比时，这一积累或产生被减少至少10％，更优选至少50％，甚至更优选至少75％，仍甚至更优选至少95％并且最优选100％。抑制的后果可以通过检查该细胞或生物体的外表特性或通过生化技术加以确认，这些生化技术是例如但不限于，Northern杂交、逆转录、用微阵列监测基因表达、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹法、放射免疫测定(RIA)以及其他免疫测定。微小RNA(miRNA)是不编码蛋白质的RNA，通常在约18至约25个核苷酸长度之间(植物中常见地是约20-24个核苷酸长度)。这些miRNA指导靶转录物的反式切割，负向调节参与各种调节及发育途径的基因的表达(Bartel(巴特尔)，Cell(细胞)，116:281-297(2004)；Zhang(张)等人，Dev.Biol.(发育生物学)289:3-16(2006))。照此，已经显示miRNA参与植物生长和发育的不同方面以及参与信号转导和蛋白质降解。此外，内源性小mRNA(包括miRNA)也可以参与生物胁迫反应，例如病原体攻击。自第一个miRNA在植物中发现以来(Reinhart(莱因哈特)等人，GenesDev(基因与发育)16:1616-1626(2002)，Park(朴)等人，Curr.Biol(当代生物学)12:1484-1495(2002))，已经鉴定了数百种miRNA。另外，已经示出许多植物miRNA是跨非常趋异性分类单元而高度保守的。(Floyd(弗洛依德)等人，Nature(自然)428:485-486(2004)；Zhang(张)等人，PlantJ(植物杂志)46:243-259(2006))。许多微小RNA基因(MIR基因)已经被鉴定出并且是在数据库中公众可获得的(miRBase；microrna.sanger.ac.uk/sequences)。miRNA还描述于美国专利公开2005/0120415和2005/144669A1中，其全部内容通过引用而结合在此。编码miRNA的基因产生长度70bp至300bp的初级miRNA(称作“pri-miRNA”)，其可以形成不完美的茎环结构。单个初级miRNA可以含有从1个至若干个miRNA前体。在动物中，初级miRNA在细胞核中由RNA酶IIIDrosha及其辅因子DGCR8/Pasha加工成约65nt的更短发夹RNA(前miRNA)。这种前miRNA随后输出至细胞质，在那里，它由另一种RNA酶III，切丁酶(Dicer)进一步加工，释放出大小约22nt的miRNA/miRNA*双链体。与动物相反，在植物中，初级miRNA加工为成熟miRNA完全在细胞核内利用单一RNA酶III，DCL1(切丁酶样1)进行。(Zhu(朱).Proc.Natl.Acad.Sci(美国科学院院刊)105:9851-9852(2008))。关于微小RNA生物起源和功能的许多综述是可获得的，例如，参见，Bartel(巴特尔)Cell(细胞)(116:281-297(2004)，Murchison(默奇森)等人，Curr.Opin.CellBiol(细胞生物学新见)16:223-229(2004)，Dugas(杜加斯)等人，Curr.Opin.PlantBiol.(植物生物学新见)7:512-520(2004)和Kim(金姆)NatureRev.Mol.CellBiol(自然综述分子细胞生物学)6:376-385(2005)。如在此使用的，术语“植物微小RNA前体分子”描述一种(约70nt-300nt)小非编码性RNA序列，它由植物酶加工以产生约19-24个核苷酸的产物，称作成熟微小RNA序列。这些成熟序列通过与信使RNA的互补性而具有调节作用。术语“人工植物微小RNA前体分子”描述在加工之前的非编码miRNA前体序列，其中经由以下方式使用该前体序列作为递送siRNA分子的主链序列，将这种miRNA前体分子的内源性天然miRNA/miRNA*双链体置换为一种非天然异源性miRNA的双链体(amiRNA/amiRNA*；例如siRNA/siRNA*)，后一种双链体然后与该siRNA序列一起加工为成熟miRNA序列。在本发明的背景下，用于描述本发明的dsRNA的术语“有毒的”意指本发明的这些dsRNA分子以及此类dsRNA分子的组合作为对昆虫具有负面作用的口服有效昆虫控制试剂而起作用。当本发明的一种组合物被递送至昆虫时，这种结果典型地是该昆虫的死亡，或者该昆虫不以使该组合物可供该昆虫使用的来源为食。这样一种组合物可以是一种表达本发明的dsRNA的转基因植物。“编码序列”是转录成RNA(如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的一个核酸序列。优选地，该RNA进而在一个生物体中被翻译以产生一种蛋白质。如在此使用的，“互补”多核苷酸是能够根据标准Watson(沃森)-Crick(克里克)互补性规则发生碱基配对的那些。具体而言，嘌呤将与嘧啶进行碱基配对，以便形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和在DNA情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)或在RNA情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。应当理解两种多核苷酸可以相互杂交，甚至它们彼此并不完全互补，其条件是每种多核苷酸具有至少一个与另一种多核苷酸基本上互补的区域。如在此使用的，术语“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”是指多核苷酸在容许性盐条件和温度条件下通过碱基配对发生天然结合。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的(partial)”，其中这些核苷酸中仅一些结合，或者当这些单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。如在此使用的，术语“基本上互补的”或“部分互补的”意指两个核酸序列互补至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸。在一些实施例中，这两个核酸序列可以至少在其85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的核苷酸处是互补的。术语“基本上互补”和“部分互补”也可以意指两个核酸序列可以在高严谨度杂交条件下杂交并且这类条件是本领域熟知的。“控制(control或controlling)”昆虫意指通过一种毒性作用抑制一种或多种昆虫有害生物存活、生长、摄食和/或繁殖的能力，或限制昆虫相关的损害或作物植物损失。“控制”昆虫可以或可以不是意为杀死昆虫，尽管它优选意指杀死昆虫。“递送(deliver或delivering)”一种组合物或dsRNA意指该组合物或dsRNA与一种昆虫接触，产生一种毒性作用和对昆虫的控制。可以按照许多公认方式，例如，通过昆虫经口摄取、经由转基因植物表达、一种或多种配制的组合物、一种或多种可喷洒的组合物、一种饵基(baitmatrix)、或任何其他的领域公认的RNA递送系统来递送该组合物或dsRNA。“根萤叶甲属”是一种甲虫属，通常称为“玉米根虫”或“黄瓜甲虫”。存在许多作为作物植物的有害生物的根萤叶甲属物种，包括但不限于，巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫；NCR)、西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫；WCR)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫；SCR)以及墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫；MCR)。在本发明的背景下，术语“玉米根虫”或“黄瓜甲虫”与术语“根萤叶甲属”是可互换的。“根萤叶甲属生活期”或“玉米根虫生活期”意指根萤叶甲属物种的卵、幼虫、蛹或成虫发育形式。“有效的昆虫控制量”意指dsRNA的浓度，它通过一种毒性作用抑制昆虫存活、生长、摄食和/或繁殖的能力，或限制昆虫相关的损害或作物植物损失。“有效的昆虫控制量”可以或可以不意指杀死昆虫的浓度，尽管优选它意指杀死昆虫。如在此使用的“表达盒”意指能够在一个适当的宿主细胞中指导特定的核酸序列的表达的一个核酸序列，包括一个启动子，该启动子可操作地连接至感兴趣的核酸序列上，该核酸序列可操作地连接至终止信号。它还典型地包含正确翻译该核酸序列所需要的序列。包含该感兴趣的核酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着至少一个它的组分相对于至少一个它的其他组分是异源的。该表达盒还可以是一种天然发生的表达盒，但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主而言是异源的，即该表达盒的特定核酸序列不是天然存在于该宿主细胞中的，并且必须已经通过一个转化事件引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。该核酸序列在该表达盒中的表达可以是在一个组成型启动子或一个诱导型启动子的控制之下，只有当该宿主细胞暴露于某一特定的外部刺激时该启动子才引发转录。在多细胞生物(如一种植物)的情况下，该启动子还可能对于特定组织、或器官、或者发育阶段是特异性的。“基因”是一个限定的区域，该区域位于一个基因组之内，并且除了前述的编码序列之外，它还包括其他负责该编码部分的表达控制(也就是转录和翻译)的主要调节核酸序列。一个基因还可以包含其他5'和3'未翻译序列和终止序列。其他可能存在的元件是，例如，内含子。如在此使用的，术语“种植者”意指从事农业，养殖生物机体(如玉米植物，例如玉米)用于食物或原料的个人或实体。“异源”核酸序列是一个天然地不与将该核酸序列引入其中的宿主细胞相关联的核酸序列，包括天然发生的核酸序列的非天然发生的多拷贝。“同源”核酸序列是一个与将该核酸序列引入其中的一个宿主细胞天然地关联的核酸序列。“杀虫”被定义为有毒的生物活性，它能够控制虫，优选地通过杀死它们来控制。本发明的“分离的”核酸分子或核苷酸序列或核酸构建体或dsRNA分子或蛋白通常与其天然环境分离而存在并且因此不是自然的产物。分离的核酸分子或核苷酸序列或核酸构建体或dsRNA分子或蛋白能以纯化形式存在或能存在于非天然环境(例如像重组宿主细胞，如转基因植物)中。在本发明的背景下，后缀“mer”前的数字指示亚基的特定数目。当应用于RNA或DNA时，这指定了分子中碱基的数目。例如，具有序列ACUGGUCGCGUUGCAUGCU的mRNA的19个核苷酸子序列是“19-mer”。“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于一种分离的单细胞或一种培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(例如，植物组织、植物器官、或整株植物)的一部分。“植物细胞培养物”意指植物单元(例如像，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或一种植物的任何其他部分或产物。“植物器官”是植物的一个独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于：全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。玉米根虫“转录组”是玉米根虫细胞中的所有核糖核酸(RNA)转录物的集合。“转化”是一种用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物体的方法。具体地，“转化”意为DNA分子稳定整合到一种感兴趣生物体的基因组中。“转化的/转基因的/重组的”是指一种宿主生物体，例如其中引入了一种异源核酸分子的一种细菌或一种植物。该核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者该核酸分子还可以作为一种染色体外分子存在。这样的一种染色体外分子能够自主复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅包含转化过程的终产物，而且包含其转基因子代。一种“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指一种野生型生物体，例如一种细菌或植物，它不包含该异源的核酸分子。在此使用的对于DNA或RNA碱基和氨基酸给出的命名法如在37C.F.R.§1.822中给出。本发明是基于以下出乎意料的发现，设计用于靶向可从根萤叶甲属昆虫的IAP基因转录的mRNA的双链RNA(dsRNA)或小干扰RNA(siRNA)对根萤叶甲属昆虫有害生物具有毒性并且可以用于控制植物的根萤叶甲属侵染并赋予转基因植物对根萤叶甲属侵染的耐受性。因此，在一些实施例中，本发明提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，该分子包括一条正义链和一条反义链，其中该反义链的一个核苷酸序列与可从根萤叶甲属IAP基因转录的mRNA多核苷酸的一部分互补，该IAP基因包括一个IAP编码序列，该编码序列与SEQIDNO:2具有至少90％一致性、或至少91％一致性、或至少92％一致性、或至少93％一致性、或至少94％一致性、或至少95％一致性、或至少96％一致性、或至少97％一致性、或至少98％一致性、或至少99％一致性，并且其中该dsRNA分子对根萤叶甲属昆虫具有毒性。在一些实施例中，该根萤叶甲属IAP基因来自一种选自下组的根萤叶甲属昆虫，该组由以下各项组成：巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)(带状黄瓜甲虫)、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctataundecimpunctata)(西方斑点黄瓜甲虫)、斯格尼根萤叶甲(D.significata)(3斑叶甲)、南美叶甲(菊花甲虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、班尼根萤叶甲(D.beniensis)、克里斯塔根萤叶甲(D.cristata)、科威根萤叶甲(D.curvipustulata)、双斑根萤叶甲(D.dissimilis)、华丽根萤叶甲(D.elegantula)、伊墨根萤叶甲(D.emorsitans)、禾本科根萤叶甲(D.graminea)、伊斯帕尼根萤叶甲(D.hispanolae)、莱米妮根萤叶甲(D.lemniscata)、赭腿根萤叶甲(D.linsleyi)、米勒根萤叶甲(D.milleri)、钱币形根萤叶甲(D.nummularis)、扇叶根萤叶甲(D.occlusa)、普拉根萤叶甲(D.porracea)、蜗牛根萤叶甲(D.scutellata)、胫骨根萤叶甲(D.tibialis)、三线根萤叶甲(D.trifasciata)以及微绿根萤叶甲(D.viridula)。在另外的实施例中，该根萤叶甲属昆虫是西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)。在一些实施例中，该IAP编码序列包括SEQIDNO:2、SEQIDNO:11、SEQIDNO:14或SEQIDNO:17。在一些实施例中，该dsRNA分子可以包括从至少18至约25个连续核苷酸(例如18、19、20、21、22、23、24或25)至至少约400个连续核苷酸，基本由其组成或由其组成。在一些实施例中，该dsRNA分子包括约500、或约50或约543个连续核苷酸，基本由其组成或由其组成。可以在3'末端、5'末端或3'和5'末端二者处添加另外的核苷酸，以促进dsRNA分子的操作但是不实质地影响该dsRNA分子在RNA干扰(RNAi)中的基本特征或功能。在一些实施例中，反义链与其互补的、可从根萤叶甲属IAP基因转录的mRNA多核苷酸的部分包括SEQIDNO:3、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15或SEQIDNO:18的至少18个连续核苷酸。在其他实施例中，mRNA的该部分包括SEQIDNO:3、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15或SEQIDNO:18的至少从19、20或21个连续核苷酸至至少400个连续核苷酸，基本由其组成或由其组成。在其他实施例中，mRNA的该部分包括SEQIDNO:3的至少约500、或至少约507或至少约543个连续核苷酸，或基本由其组成或由其组成。在其他实施例中，与本发明的dsRNA的反义链互补的mRNA多核苷酸的该部分包括由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:3(wcrIAP1)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:3的核苷酸1至1604。换言之，被靶向的mRNA的该部分包括SEQIDNO:3的1604个19个连续核苷酸子序列(即19-mer)中的任一个，例如，碱基1-19(5'-GAGUAUCGAGUGAGAAAUC-3')(SEQIDNO:25)、碱基2-20(5'-AGUAUCGAGUGAGAAAUCG-3')(SEQIDNO:26)、碱基3-21(5'-GUAUCGAGUGAGAAAUCGU-3')(SEQIDNO:27)，依次类推直至碱基1604-1622(5'-AUAUAGUAAUUUAUAAUAU-3')(SEQIDNO:28)。在其他实施例中，与本发明的dsRNA的反义链互补的mRNA多核苷酸的该部分包括由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:12(wcrIAP2)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:12的核苷酸1至核苷酸1444。换言之，被靶向的mRNA的该部分包括SEQIDNO:12的1444个19个连续核苷酸子序列(即19-mer)中的任一个，例如，碱基1-19(5'-UCAGAAUGGAAUUAUGGCG-3')(SEQIDNO:29)、碱基2-20(5'-CAGAAUGGAAUUAUGGCGA-3')(SEQIDNO:30)、碱基3-21(55'-AGAAUGGAAUUAUGGCGAU-3')(SEQIDNO:31)，依次类推直至碱基1444-1462(5'-AUUAAAAUAAUUGUUUCCU-3')(SEQIDNO:32)。在其他实施例中，与本发明的dsRNA的反义链互补的mRNA多核苷酸的该部分包括由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:15(scrIAP1)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:15的核苷酸1至核苷酸1018。换言之，被靶向的mRNA的该部分包括SEQIDNO:15的1015个19个连续核苷酸子序列(即19-mer)中的任一个，例如，碱基1-19(5'-AUGGCAGGUAGUCAAUCAA-3')(SEQIDNO:33)、碱基2-20(5'-UGGCAGGUAGUCAAUCAAA-3')(SEQIDNO:34)、碱基3-21(5'-GGCAGGUAGUCAAUCAAAU-3')(SEQIDNO:35)，依次类推直至碱基1015-1033(5'-GUCAGAGCGUUUCCUAUCA-3')(SEQIDNO:36)。在仍其他实施例中，与本发明的dsRNA的反义链互补的mRNA多核苷酸的该部分包括由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:18(ncrIAP1)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:18的核苷酸1至核苷酸1020。换言之，被靶向的mRNA的该部分包括SEQIDNO:18的1020个19个连续核苷酸子序列(即19-mer)中的任一个，例如，碱基1-19(5'-AGUCAAUCAAAUUACAUUC-3')(SEQIDNO:37)、碱基2-20(5'-GUCAAUCAAAUUACAUUCA-3')(SEQIDNO:38)、碱基3-21(5'-UCAAUCAAAUUACAUUCAA-3')(SEQIDNO:38)，依次类推直至碱基1020-1038(5'-AGUCAGAGCGUUUCCUAUC-3')(SEQIDNO:40)。在仍其他实施例中，与本发明的dsRNA的反义序列互补的mRNA的该部分基本由SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9组成。在其他实施例中，mRNA多核苷酸的该部分基本由SEQIDNO:3、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15或SEQIDNO:18组成。在本发明的dsRNA分子的另外的实施例中，该反义链的该核苷酸序列可以基本由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:4(wcrIAP1*)的任何19-mer子序列的核苷酸序列组成，其中N是SEQIDNO:4的核苷酸1至1603。换言之，该反义链基本由SEQIDNO:4的1604个19个连续核苷酸子序列(即19-mer)的任一个组成，例如，碱基1-19(5'-GAGUAUCGAGUGAGAAAUC-3')(SEQIDNO:41)、碱基2-20(5'-AGUAUCGAGUGAGAAAUCG-3')(SEQIDNO:42)、碱基3-21(5'-GUAUCGAGUGAGAAAUCGU-3')(SEQIDNO:43)，依次类推直至碱基1604-1622(5'-AUAUAGUAAUUUAUAAUAU-3')(SEQIDNO:44)。在其他实施例中，该反义链的该核苷酸序列可以基本由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:13(wcrIAP2*)的任何19-mer子序列的核苷酸序列组成，其中N是SEQIDNO:13的核苷酸1至核苷酸1444。换言之，该反义链基本由SEQIDNO:13的1444个19个连续核苷酸子序列(即19-mer)组成，例如，碱基1-19(5'-CGCCAUAAUUCCAUUCUGA-3')(SEQIDNO:45)、碱基2-20(5'-UCGCCAUAAUUCCAUUCUG-3')(SEQIDNO:46)、碱基3-21(5'-AUCGCCAUAAUUCCAUUCU-3')(SEQIDNO:47)，依次类推直至碱基1444-1462(5'-AGGAAACAAUUAUUUUAAU-3')(SEQIDNO:48)。在其他实施例中，该反义链的该核苷酸序列可以基本由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:16(scrIAP1*)的任何19-mer子序列的核苷酸序列组成，其中N是SEQIDNO:16的核苷酸1至核苷酸1018。换言之，该反义链基本由SEQIDNO:16的1015个19个连续核苷酸子序列(即19-mer)的任一个的核苷酸序列组成，例如，碱基1-19(5'-UUGAUUGACUACCUGCCAU-3')(SEQIDNO:49)、碱基2-20(5'-UUUGAUUGACUACCUGCCA-3')(SEQIDNO:50)、碱基3-21(5'-AUUUGAUUGACUACCUGCC-3')(SEQIDNO:51)，依次类推直至碱基1015-1033(5'-UGAUAGGAAACGCUCUGAC-3')(SEQIDNO:52)。在其他实施例中，该反义链的该核苷酸序列可以基本由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:19(ncrIAP1*)的任何19-mer子序列的核苷酸序列组成，其中N是SEQIDNO:19的核苷酸1至核苷酸1020。换言之，该反义链基本由SEQIDNO:19的1020个19个连续核苷酸子序列(即19-mer)的任一个的核苷酸序列组成，例如，碱基1-19(5'-GAAUGUAAUUUGAUUGACU-3')(SEQIDNO:53)、碱基2-20(5'-UGAAUGUAAUUUGAUUGAC-3')(SEQIDNO:54)、碱基3-21(5'-UUGAAUGUAAUUUGAUUGA-3')(SEQIDNO:55)，依次类推直至碱基1015-1033(5'-GAUAGGAAACGCUCUGACU-3')(SEQIDNO:56)。在仍其他实施例中，与可从根萤叶甲属昆虫IAP基因转录的mRNA多核苷酸的一部分互补或基本上与其互补的本发明的dsRNA的反义链的核苷酸序列包括SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10的核苷酸序列，或基本由其组成或由其组成。在其他实施例中，该反义链包括SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15或SEQIDNO:18的核苷酸序列，基本由其组成或由其组成。应理解的是，SEQIDNO:4、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16或SEQIDNO:19的19-mer序列的任一个在3’或5’末端可以缺失一个核苷酸或在3’末端、5’末端或两者处可以添加多达6个核苷酸(以任何组合)，以实现反义链基本由SEQIDNO:4、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16或SEQIDNO:19的任一个的19-mer核苷酸序列组成，因为将理解的是，缺失1个核苷酸或添加多达6个核苷酸不实质地影响本发明的双链RNA分子的基本特征或功能。这类另外的核苷酸可以是沿靶序列延伸反义链互补性的核苷酸和/或这类核苷酸可以是促进RNA分子或编码该RNA分子的核酸分子的操作的核苷酸，如本领域的普通技术人员将已知。例如，在3'末端可以存在一个TT突出端，使用该突出端来稳定siRNA双链体并且不影响该siRNA的特异性。在本发明的一些实施例中，该双链RNA分子的反义链可以与该靶标RNA多核苷酸完全互补或该反义链可以与该靶标RNA多核苷酸基本上互补或部分互补。基本上或部分互补意指反义链和靶标RNA多核苷酸可以按约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸配对错配。可以将这类错配引入反义链序列中，例如，靠近3'末端，以便增强双链RNA分子由切丁酶加工，以便在插入本发明的嵌合核酸分子或人工微小RNA前体分子内的siRNA分子中重复错配样式(参见实例部分)等，如本领域的普通技术人员将已知。这类修饰将在双链体的一个末端削弱碱基配对作用并且产生链非对称性，因此增大反义链(而非正义链)受到加工和沉默预期基因的几率(Geng(耿)和Ding(丁)“Double-mismatchedsiRNAsenhanceselectivegenesilencingofamutantALS-causingAllele1(双错配siRNA增强造成突变ALS的等位基因1的选择性基因沉默)”ActaPharmacol.Sin.(中国药理学报)29:211-216(2008)；Schwarz(施瓦茨)等人，“symmetryintheassemblyoftheRNAienzymecomplex(RNAi酶复合体的组合体中的非对称性)”Cell(细胞)115:199-208(2003))。可以将其他此类错配引入进反义链中，这归因于编码表达盒的dsRNA制造中产生的偶然的开放阅读框的消除。通过在编码核苷酸序列的dsRNA中形成点突变来消除此类开放阅读框，从而与靶基因相比，在该dsRNA中产生一些错配。在本发明的一个实施例中，将此类错配引入进编码正义链wcrIAP1-C(SEQIDNO:9)的核苷酸序列中，产生一个编码突变的正义链的核苷酸序列，指定为wcrIAP1-Ca(SEQIDNO:64的核苷酸1-500)。在本发明的一些实施例中，本发明的该dsRNA分子是一种短发夹RNA(shRNA)分子。shRNA在细胞中的表达典型地通过将质粒或重组载体递送例如进入转基因植物(如转基因玉米)中而完成。本发明涵盖一种核酸分子，该核酸分子编码本发明的dsRNA分子的至少一条链。本发明进一步涵盖一种核酸构建体，该核酸构建体包括本发明的dsRNA分子的至少一条链或包括编码本发明的dsRNA分子的至少一条链的核酸分子。在本发明的一个实施例中，该核酸分子编码短发夹RNA。在另一个实施例中，编码短发夹RNA的该核酸分子包括SEQIDNO:63或SEQIDNO:64。在另一个实施例中，该核酸分子是一种重组载体。在又另一个实施例中，该重组载体包括SEQIDNO:65或SEQIDNO:67的核苷酸序列，基本由其组成或由其组成。本发明进一步涵盖嵌合核酸分子，这些核酸分子包括本发明的dsRNA的一条反义链，该反义链可操作地连接至植物微小RNA前体分子。在一些实施例中，该嵌合核酸分子包括一条反义链，该反义链具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16或SEQIDNO:19的19-mer子序列的任一个的核苷酸序列，该反义链可操作地与植物微小RNA前体分子连接。在一些实施例中，该植物微小RNA前体分子是一种玉蜀黍微小RNA前体。在一些实施例中，本发明涵盖一种人工植物微小RNA前体分子，该分子包括本发明的dsRNA分子的一条反义链。在其他实施例中，该人工植物微小RNA前体分子包括一条反义链，该反义链具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16或SEQIDNO:19的19-mer子序列的任一个的核苷酸序列。使用人工植物微小RNA将感兴趣的核苷酸序列(例如人工miRNA；siRNA/siRNA*)递送进植物中在本领域是已知的(参见例如，Schwab(施瓦布)等人2006ThePlantCell(植物细胞)18:1121-1133和在此的实例部分)。在本发明中，这些人工微小RNA是其中插入一个植物微小RNA前体主链和一个昆虫(即动物)siRNA序列的嵌合或杂交分子。如本领域的普通技术人员将理解，典型地希望维持错配，这些错配正常情况下在植物微小RNA前体序列中存在于被置换入该植物微小RNA前体主链中的任何核苷酸序列中。在仍其他实施例中，该人工植物微小RNA前体包括玉米微小RNA前体分子的部分。任何玉米微小RNA(miRNA)前体都适于本发明的这些组合物和方法。非限制性实例包括miR156、miR159、miR160、miR162、miR164、miR166、miR167、miR168、miR169、miR171、miR172、miR319、miR390、miR393、miR394、miR395、miR396、miR397、miR398、miR399、miR408、miR482、miR528、miR529、miR827、miR1432以及现在已知或后来被鉴定出的任何其他植物miRNA前体。在一些实施例中，本发明涵盖核酸构建体、核酸分子或重组载体，其包括本发明的dsRNA分子的至少一条链，或包括本发明的嵌合核酸分子，或包括本发明的人工植物微小RNA。在一些实施例中，该核酸构建体包括本发明的核酸分子。在其他实施例中，该核酸构建体是一种重组表达载体。在一些实施例中，本发明涵盖包括本发明的两种或更多种dsRNA分子的组合物，其中这两种或更多种RNA分子各自包括一条不同的反义链。在一些实施例中，这两种或更多种dsRNA分子存在于同一核酸构建体上、不同的核酸构建体上或其任何组合上。在其他实施例中，该组合物包括一种包含一条基本由SEQIDNO:6的核苷酸序列组成的反义链的RNA分子，一种包含一条基本由SEQIDNO:8的核苷酸序列组成的反义链的RNA分子和/或一种包含一条基本由SEQIDNO:10的核苷酸序列组成的反义链的RNA分子。在其他实施例中，该组合物包括本发明的两种或更多种核酸构建体、两种或更多种核酸分子、两种或更多种嵌合核酸分子、两种或更多种人工植物微小RNA前体，其中这两种或更多种核酸构建体、两种或更多种核酸分子、两种或更多种嵌合核酸分子、或两种或更多种人工植物微小RNA前体各自包括一条不同的反义链。在一些实施例中，本发明涵盖一种用于抑制根萤叶甲属昆虫IAP基因的表达的杀虫组合物，该组合物包括本发明的dsRNA或siRNA以及一种农业上可接受的载体。在一些实施例中，该可接受的农用载体是一种表达本发明的dsRNA或siRNA的转基因生物体。在一些实施例中，该转基因生物体可以是一种表达本发明的dsRNA或siRNA的转基因植物，当被靶标有害生物摄食时导致该靶标有害生物停止摄食、生长或繁殖或导致该靶标有害生物的死亡。在其他实施例中，该转基因植物是一种转基因玉米植物并且该靶标有害生物是一种根萤叶甲属昆虫有害生物。在仍其他实施例中，该根萤叶甲属昆虫有害生物选自下组，该组由以下各项组成：巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)，西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)，黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)，黄瓜条根萤叶甲(带状黄瓜甲虫)，黄瓜十一星叶甲(西方斑点黄瓜甲虫)，斯格尼根萤叶甲(3斑叶甲)，南美叶甲(菊花甲虫)，墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。在其他实施例中，该转基因生物体选自(但不限于)下组，该组由以下各项组成：表达本发明的dsRNA或siRNA的酵母，真菌，藻类，细菌，病毒或节肢动物。在一些实施例中，该转基因生物体是一种病毒，例如一种当侵染昆虫宿主时表达本发明的dsRNA或siRNA的昆虫杆状病毒。这样的一种杆状病毒比野生型未转化杆状病毒针对靶标昆虫可能更具剧毒。在其他实施例中，该转基因生物体是一种施用至靶标有害生物出现或已知已经出现的环境的转基因细菌。在一些实施例中，使用能够在植物组织内生活并复制的非致病共生细菌(所谓的内寄生菌)，或能够定居在叶际或根际的非致病共生细菌(所谓的附生菌)。此类细菌包括以下属的细菌：农杆菌属、产碱菌属、固氮螺菌属、定氮菌属、芽孢杆菌属、棒形杆菌属、肠杆菌属、欧文菌属、黄杆菌属、克雷白菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、沙雷菌属、链霉菌属以及黄单胞菌属。共生真菌(如木霉属和胶枝霉属)也是为了相同目的表达本发明的dsRNA或siRNA的可能宿主。在一些实施例中，可接受的农用载体是一种可用于将包括该dsRNA或siRNA的组合物施用至植物或种子的配制品。在一些实施例中，这些dsRNA或siRNA分子稳定对抗降解，由于其双链性质和DNA酶/RNA酶抑制剂的引入。例如，可以通过包括胸苷或尿苷核苷酸3'突出端来稳定dsRNA或siRNA。包含在本发明的组合物中的dsRNA或siRNA能大量地以工业规模化学地合成。可获得的方法将是通过化学合成或通过使用生物剂。在其他实施例中，该配制品包括一种转染促进剂。在其他实施例中，该转染促进剂是一种含脂质化合物。在另外的实施例中，该含脂质化合物选自下组，该组由以下各项组成：Lipofectamine，Cellfectin，DMRIE-C，DOTAP以及Lipofectin。在另一个实施例中，该含脂质化合物是一种Tris阳离子脂质。在一些实施例中，该配制品进一步包括一种核酸冷凝剂。该核酸冷凝剂可以是本领域已知的任何此类化合物。核酸冷凝剂的实例包括但不限于，亚精胺(N-[3-氨基丙基]-1,4-丁二胺)、鱼精蛋白硫酸盐、聚赖氨酸以及其他带正电的肽。在一些实施例中，该核酸冷凝剂是亚精胺或鱼精蛋白硫酸盐。在仍另外的实施例中，该配制品进一步包括缓冲的蔗糖或磷酸盐缓冲生理盐水。在一些实施例中，本发明涵盖转基因植物或其部分，其包括本发明的dsRNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，其中当与对照植物相比时，该转基因植物对根萤叶甲属昆虫具有增强的抗性。在其他实施例中，该转基因植物或其部分是转基因玉米植物或其部分。本发明进一步涵盖本发明的转基因植物的转基因种子，其中该转基因种子包括本发明的dsRNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物。在一些实施例中，该转基因种子是转基因玉米种子。表达本发明的dsRNA或siRNA的转基因植物对被靶标昆虫有害生物袭击具有耐受性或抗性。当该昆虫开始摄食这样一种转基因植物时，它也摄取所表达的dsRNA或siRNA。这将妨碍昆虫进一步咬食植物组织或者甚至可以伤害或杀死昆虫。编码本发明的dsRNA或siRNA的核酸序列被插入到一种表达盒中，然后该表达盒被优选稳定地整合到该植物的基因组中。跟据本发明所转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于：玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒(pepper)、芹菜、小南瓜(squash)、大南瓜(pumpkin)、大麻、西葫芦、苹果、梨、榅桲、甜瓜、李子(plum)、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥属，以及木本植物，如针叶树以及落叶树。在另外的实施例中，该转基因植物是一种转基因玉米植物。dsRNA或siRNA在转基因植物中的表达由在植物中起作用的启动子驱动。启动子的选择将依赖于表达的时间和空间需要而变化，并且还依赖于昆虫目标种类而变化。因此，考虑了本发明的干扰RNA在叶、柄(stalk)或茎(stem)、穗、花序(例如穗状花序、圆锥花序、穗轴等)、根和/或幼苗中的表达。然而在许多情况下，寻求针对多于一种类型虫害的保护，并且因此在多个组织中的表达是令人希望的。尽管已经显示来自双子叶植物的很多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，但理想的是选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中的表达，并且选择单子叶植物启动子用于在单子叶植物中的表达。然而，对所选择的启动子的起源并没有限制；足够的是它们在驱动dsRNA或siRNA在所希望的细胞中的表达中是操作性的。适用于本发明的启动子包括但不限于组成性地驱动核苷酸序列的表达的那些启动子、在诱导时驱动表达的那些启动子、以及以组织或发育特异性方式驱动表达的那些启动子。这些不同类型的启动子在本领域是已知的。组成型启动子的实例包括但不限于夜香树病毒启动子(cmp)(美国专利号7,166,770)、稻肌动蛋白1启动子(Wang(王)等人，(1992)Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)12:3399-3406；以及美国专利号5,641,876)、CaMV35S启动子(Odell(奥德尔)等人，(1985)Nature(自然)313:810-812)、CaMV19S启动子(Lawton(劳顿)等人，(1987)PlantMol.Biol.(植物分子生物学)9:315-324)、nos启动子(Ebert(埃伯特)等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)84:5745-5749)、Adh启动子(瓦尔克(瓦尔克)等人，(1987)美国科学院院刊84:6624-6629)、蔗糖合酶启动子(Yang(杨)和Russell(拉塞尔)(1990)美国科学院院刊87:4144-4148)、玄参花叶病毒(fmv)启动子(Govindarajulu(戈文达拉朱鲁)等人2008MolPlantMicrobeInteract(分子植物微生物相互作用)21:1027-35)以及泛素启动子(Ubi)。源于泛素的组成型启动子积累在很多细胞类型中。已经从若干植物物种中克隆泛素启动子以用于转基因植物，例如向日葵(Binet(比内)等人，1991，PlantScience(植物科学)79:87-94)、玉蜀黍(Christensen(克里斯滕森)等人，1989，PlantMolec.Biol.(植物分子生物学)12:619-632)、以及拟南芥(Norris(诺里斯)等人，1993，植物分子生物学21:895-906)。玉蜀黍泛素启动子(UbiP)已经在转基因单子叶植物系统中得以发展，并且它的序列以及构建用于单子叶植物转化的载体披露于专利公开EP0342926中。在一些实施例中，可以使用组织特异性/组织优选的启动子。组织特异性或优选的表达模式包括但不限于绿色组织特异性或优选的、根特异性或优选的、茎特异性或优选的、以及花特异性或优选的。适用于在绿色组织中表达的启动子包括调节涉及光合作用的基因的许多启动子，并且这些中的许多已经从单子叶植物和双子叶植物两者中得以克隆。在一个实施例中，可用于本发明的一种启动子是来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉蜀黍PEPC启动子(Hudspeth(哈得斯佩斯)和Grula(格鲁拉)，PlantMolec.Biol.(植物分子生物学)12:579-589(1989))。组织特异性启动子的非限制性实例包括与编码种子贮藏蛋白(如β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白、油菜籽蛋白以及菜豆素)、玉米蛋白或油体蛋白(如油质蛋白)、或脂肪酸生物合成中涉及的蛋白质(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶、以及脂肪酸去饱和酶(fad2-1))的基因关联以及与胚发育过程中表达的其他核酸(如Bce4，参见，例如Kridl(克里德)等人(1991)SeedSci.Res.(种子科学研究)1:209-219；连同欧洲专利号255378)关联的那些启动子。可用于本发明的核苷酸序列在植物(特别是玉蜀黍)中表达的组织特异性或组织优选的启动子包括但不限于直接在根或根中的特定细胞、髓、叶或花粉中表达的那些启动子。此类启动子披露于例如但不限于WO93/07278中，通过引用以其全文结合在此。适用于本发明的组织特异性或组织优选的启动子的其他非限制性实例包括披露于美国专利6,040,504中的棉花二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)启动子；披露于美国专利5,604,121中的稻蔗糖合酶启动子；由德·弗瑞蒙德(deFramond)(FEBS290:103-106(1991)；授予汽巴-嘉基(Ciba-Geigy)的EP0452269)描述的根特异性启动子；描述于美国专利5,625,136(授予汽巴-嘉基)并驱动玉蜀黍trpA基因表达的茎特异性启动子；以及披露于WO01/73087中的夜香树黄叶卷曲病毒启动子，所有专利文献通过引用结合在此。组织特异性/组织优选的启动子的另外的实例包括但不限于，根毛特异性cis-元件(RHE)(Kim(金姆)等人ThePlantCell(植物细胞)18:2958-2970(2006))、根特异性启动子RCc3(Jeong(郑)等人，PlantPhysiol.(植物生理学)153:185-197(2010))和RB7(美国专利号5459252)、凝集素启动子(Lindstrom(林德斯特伦)等人(1990)Der.Genet.11:160-167；以及Vodkin(沃德金)(1983)Prog.Clin.Biol.Res.(临床和生物学研究进展)138:87-98)、玉米乙醇脱氢酶1启动子(Dennis(丹尼斯)等人(1984)NucleicAcidsRes.(核酸研究)12:3983-4000)、S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)(VanderMijnsbrugge(范德米金斯布鲁格)等人(1996)PlantandCellPhysiology(植物与细胞生理学)，37(8):1108-1115)、玉米集光复合体启动子(Bansal(班赛尔)等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)89:3654-3658)、玉米热激蛋白启动子(O'Dell(奥台尔)等人(1985)EMBOJ.(欧洲分子生物学杂志)5:451-458；以及Rochester(罗彻斯特)等人(1986)欧洲分子生物学杂志5:451-458)、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(Cashmore(卡什莫尔)，“Nucleargenesencodingthesmallsubunitofribulose-l,5-bisphosphatecarboxylase(编码核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶的小亚基的核基因)”第29-39页，其中：GeneticEngineeringofPlants(植物基因工程)(Hollaender(霍拉德尔)编辑，PlenumPress(普莱纽姆出版社)1983；以及Poulsen(波尔森)等人(1986)Mol.Gen.Genet.(分子与普通遗传学)205:193-200)、Ti质粒甘露氨酸合酶启动子(Langridge(兰格里奇)等人，(1989)美国科学院院刊86:3219-3223)、Ti质粒胭脂氨酸合酶启动子(兰格里奇等人，(1989)，同上)、矮牵牛花查耳酮异构酶启动子(vanTunen(范·杜能)等人，(1988)欧洲分子生物学杂志7:1257-1263)、豆富甘氨酸蛋白1启动子(beanglycinerichprotein1promoter)(Keller(凯勒)等人，(1989)，GenesDev.(基因与发育)3:1639-1646)、截短的CaMV35S启动子(奥台尔等人，(1985)Nature(自然)313:810-812)、马铃薯的马铃薯糖蛋白启动子(Wenzler(文茨勒)等人，(1989)PlantMol.Biol.(植物分子生物学)13:347-354)、根细胞启动子(Yamamoto(山本)等人，(1990)NucleicAcidsRes.(核酸研究)18:7449)、玉蜀黍玉米蛋白启动子(Kriz(克里茨)等人，(1987)分子与普通遗传学207:90-98；兰格里奇等人，(1983)Cell(细胞)34:1015-1022；Reina(雷纳)等人，(1990)核酸研究18:6425；雷纳等人，(1990)核酸研究18:7449；以及Wandelt(万德尔特)等人，(1989)核酸研究17:2354)、球蛋白-1启动子(Belanger(贝朗葛)等人，(1991)Genetics(遗传学)129:863-872)、α-微管蛋白cab启动子(Sullivan(沙利文)等人，(1989)分子与普通遗传学215:431-440)、PEPC酶启动子(Hudspeth(哈得斯佩斯)和Grula(格鲁拉)(1989)植物分子生物学12:579-589)、R基因复合体-相关的启动子(Chandler(钱德勒)等人，(1989)植物细胞1:1175-1183)、以及查耳酮合酶启动子(Franken(弗兰肯)等人，(1991)欧洲分子生物学杂志10:2605-2612)。在一些具体实施例中，本发明的核苷酸序列与一种根优选的启动子可操作地关联。特别可用于种子特异性表达的是豌豆的豌豆球蛋白启动子(Czako(扎科)等人(1992)Mol.Gen.Genet.(分子与普通遗传学)235:33-40；以及披露于美国专利号5,625,136中的种子特异性启动子。用于成熟的叶中表达的适用启动子是当衰老开始时开启的那些启动子，如来自拟南芥属(Arabidopsis)的SAG启动子(Gan(加恩)等人，(1995)Science(科学)270:1986-1988)。另外，可以使用在质体中起作用的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因95'UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。可用于本发明的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和库尼茨(Kunitz)胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。在本发明的一些实施例中，可以使用诱导型启动子。因此，例如，可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节物来调节植物中的基因表达。本发明的核苷酸序列的表达经由化学调节过的启动子进行的调节使得本发明的多肽仅当用诱导的化学品处理作物植物时能被合成。取决于目的，在应用化学品诱导基因表达时启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学品阻抑基因表达时启动子可以是化学阻抑型启动子。化学诱导型启动子在本领域中是已知的，并且包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(它是由苯磺酰胺除草剂安全剂活化的)、玉蜀黍GST启动子(它是由用作发芽前除草剂的疏水性亲电子化合物活化的)、以及烟草PR-1a启动子(它是由水杨酸活化的)(例如，PR1a系统)、类固醇的类固醇-响应的启动子(参见，例如糖皮质激素-诱导型启动子，在Schena(舍纳)等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)88,10421-10425和McNellis(麦克尼利斯)等人，(1998)PlantJ.(植物杂志)14,247-257中)、以及四环素-诱导型和四环素-阻抑型启动子(参见，例如Gatz(加茨)等人，(1991)Mol.Gen.Genet.(分子与普通遗传学)227,229-237和美国专利号5,814,618与5,789,156)、Lac阻抑物系统启动子、铜-诱导型系统启动子、水杨酸酯-诱导型系统启动子(例如，PR1a系统)、糖皮质激素-诱导型启动子(Aoyama(青山)等人，(1997)植物杂志11:605-612)、以及蜕化素-诱导型系统启动子。诱导型启动子的其他非限制性实例包括ABA-和膨胀-诱导型启动子、生长素-结合蛋白基因启动子(Schwob(施沃布)等人，(1993)PlantJ.(植物杂志)4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基-转移酶启动子(Ralston(罗尔斯顿)等人，(1988)Genetics(遗传学)119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero(科德罗)等人，(1994)植物杂志6:141-150)、以及甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶启动子(Kohler(科勒)等人(1995)PlantMol.Biol.(植物分子生物学)29:1293-1298；Martinez(马丁内斯)等人(1989)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)208:551-565；以及Quigley(奎格利)等人(1989)J.Mol.Evol.(分子进化杂志)29:412-421)。还包括苯磺酰胺诱导型(美国专利号5,364,780)和乙醇诱导型(国际专利申请公开号WO97/06269和WO97/06268)系统和谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地，可以使用描述于Gatz(加茨)(1996)CurrentOpinionBiotechnol.(生物技术新见)7:168-172和加茨(1997)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.(植物生理学与植物分子生物学年度综述)48:89-108中的诱导型启动子中的任一种。适用于指导本发明的核苷酸序列在植物中的表达的其他化学诱导型启动子披露于美国专利5,614,395中，该专利通过引用以其全文结合在此。基因表达的化学诱导还详述于公开申请EP0332104(授予汽巴-嘉基)和美国专利5,614,395中。在一些实施例中，一种用于化学诱导的启动子可以是烟草PR-1a启动子。在另外的方面中，本发明的核苷酸序列可以与一种启动子可操作地关联，该启动子是创伤诱导型或由有害生物或病原体侵染(例如，线虫植物有害生物)进行的诱导型。已经描述了在创伤部位和/或在有害生物攻击(例如，昆虫/线虫吞食)或植物病原菌侵染的部位处表达的数量众多的启动子。理想地，这种启动子应仅在攻击部位处或邻近该部位具有局部活性，并且以这种方式，本发明的核苷酸序列的表达将集中在所侵入的细胞中。此类启动子包括但不限于由以下各项描述的那些启动子：Stanford(斯坦福)等人，Mol.Gen.Genet.(分子与普通遗传学)215:200-208(1989)；Xu(许)等人，PlantMolec.Biol.(植物分子生物学)22:573-588(1993)；Logemann(洛格曼)等人，PlantCell(植物细胞)1:151-158(1989)；Rohrmeier(罗尔迈尔)和Lehle(莱勒)，植物分子生物学22:783-792(1993)；Firek(费尔克)等人，植物分子生物学22:129-142(1993)；Warner(瓦尔纳)等人，PlantJ.(植物杂志)3:191-201(1993)；美国专利号5,750,386；美国专利号5,955,646；美国专利号6,262,344；美国专利号6,395,963；美国专利号6,703,541；美国专利号7,078,589；美国专利号7,196,247；美国专利号7,223,901；以及美国专利申请公开2010043102。在本发明的一些实施例中，使用“最小启动子”或“基本启动子”。最小启动子能够募集并结合RNA聚合酶II复合体及其辅助蛋白，以允许转录起始和延伸。在一些实施例中，最小启动子被构建成仅包括来自转录因子的结合和感兴趣的核苷酸序列的转录所必需的一个选定启动子的核苷酸/核苷酸序列的一个启动子，这一感兴趣的核苷酸序列可操作地与包括但不局限于TATA盒序列的最小启动子相关联。在其他实施例中，最小启动子缺少募集并结合转录因子的cis序列，这些转录因子调节(例如，增强、抑制、赋予组织特异性，赋予诱导性或抑制性)转录。最小启动子通常被放置在待表达的核苷酸序列的上游(即，5’)。因此，可以选择来自与本发明一起可用的任何启动子的核苷酸/核苷酸序列用作一个最小启动子。在一些实施例中，本发明的重组核酸分子可以是一种“表达盒”。如在此使用的，“表达盒”意指一种包含感兴趣的核苷酸序列(例如，本发明的核苷酸序列)的重组核酸分子，其中该核苷酸序列与至少一个控制序列(例如，启动子)可操作地关联。因此，本发明的一些实施例提供了被设计成表达编码本发明的dsRNA或siRNA的核苷酸序列的表达盒。以这种方式，例如，可操作地与本发明的一个或多个核苷酸序列相关联的一个或多个植物启动子可以提供于表达盒中，用于玉米植物、植物部分和/或植物细胞中的表达。包含感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。表达盒还可以是一种天然存在但已经是以适用于异源表达的重组形式获得的表达盒。表达盒还可以任选地包括在植物中具有功能性的一个转录和/或翻译终止区(即，终止区)。多种转录终止子是可供用于在表达盒中使用的并且负责在超出感兴趣的异源核苷酸序列时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。该终止区对于该转录起始区可以是天然的，对于该可操作地连接的感兴趣的核苷酸序列可以天然的，对于该植物宿主可以是天然的，或者可以是源自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的核苷酸序列、该植物宿主、或其任意组合而言是外来的或异源的)。适当的转录终止子包括但不限于CAMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和/或豌豆rbcsE9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物二者中使用。此外，可以使用编码序列的天然转录终止子。本发明的表达盒还可以包括用于选择性标记的核苷酸序列，该选择性标记可以用于选择转化的植物、植物部分和/或植物细胞。如在此使用的“选择性标记(selectablemarker)”意指一种核苷酸序列，当该核苷酸序列表达时向表达该标记的植物、植物部分和/或植物细胞赋予一种不同的表型，并且因此允许此类转化的植物、植物部分和/或植物细胞与不具有该标记的那些区别开来。这一核苷酸序列可以编码一种可选择的抑或可筛选的标记，这取决于该标记是否赋予一种可以通过化学手段而被选择的性状，如通过使用一种选择剂(例如，一种抗生素、除草剂、或类似物)，或者取决于该标记是否仅是一种人们可以通过观察或测试而鉴别的性状，如通过筛选(例如，R基因座性状)。当然，适合的选择性标记的许多实例在本领域中是已知的并且可以用于在此描述的表达盒中。可选择性标志的实例包括但不限于：一种编码neo或nptll的核苷酸序列，它赋予对卡那霉素、G418、以及类似物的抗性(Potrykus(拍特里库斯)等人(1985)，Mol.Gen.Genet.(分子与普通遗传学)199:183-188)；一种编码bar的核苷酸序列，它赋予对草丁膦的抗性；一种编码改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶的核苷酸序列，它赋予对草甘膦的抗性(Hinchee(欣奇)等人(1988)，Biotech.(生物技术)6:915-922)；一种编码腈水解酶(如来自臭鼻克雷白氏杆菌(Klebsiellaozaenae)的bxn)的核苷酸序列，它赋予对溴草腈的抗性(Stalker(斯托克尔)等人(1988)，Science(科学)242:419-423)；一种编码改变的乙酰乳酸合成酶(ALS)的核苷酸序列，它赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS-抑制化学品的抗性(欧洲专利申请号154204)；一种编码甲氨蝶呤-抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)的核苷酸序列(Thillet(泰莱特)等人(1988)，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)263:12500-12508)；一种编码茅草枯脱卤素酶的核苷酸序列，它赋予对茅草枯的抗性；一种编码甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为磷酸甘露糖异构酶(PMI))的核苷酸序列，它赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)；一种编码改变的邻氨基苯甲酸盐合酶的核苷酸序列，它赋予对5-甲基色氨酸的抗性；和/或一种编码hph的核苷酸序列，它赋予对潮霉素的抗性。本领域技术人员能够选择用于在本发明的表达盒中使用的适合的选择性标记。另外的选择性标记包括但不限于：编码β-葡萄糖醛酸酶或uidA(GUS、编码一种不同的显色底物已知的酶的一种核苷酸序列；编码一种调节花青素颜料(红色)在植物组织中的产生的产物的一种R-基因座核苷酸序列(Dellaporta(德拉波塔)等人，“MolecularcloningofthemaizeR-njallelebytransposon-taggingwithAc(通过用Ac进行转座子-标记的玉蜀黍R-nj等位基因的分子克隆)”，第263-282页，其中：ChromosomeStructureandFunction:ImpactofNewConcepts(染色体结构和功能：新概念的影响)，第18次斯塔德勒遗传学研讨会(thStadlerGeneticsSymposium)(Gustafson(古斯塔夫森)和Appels(阿佩尔)编辑，PlenumPress(普莱纽姆出版社)1988))；编码β-内酰胺酶(一种不同的显色底物(例如，PADAC，一种显色的头孢菌素)已知的酶)的一种核苷酸序列(Sutcliffe(萨克利夫)(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)75:3737-3741)；编码xylE、编码一种邻苯二酚双加氧酶的一种核苷酸序列(Zukowsky(茹科夫斯基)等人(1983)美国科学院院刊80:1101-1105)；编码酪氨酸酶(一种能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌(它们又缩合形成黑色素)的酶)的一种核苷酸序列(Katz(卡茨)等人(1983)J.Gen.Microbiol.(普通微生物学杂志)129:2703-2714)；编码β-半乳糖苷酶(一种存在显色底物的酶)的一种核苷酸序列；编码允许生物体发光检测的荧光素酶(lux)的一种核苷酸序列(Ow(欧)等人(1986)Science(科学)234:856-859)；编码可以用于钙敏感性的生物体发光检测中的水母发光蛋白的一种核苷酸序列(Prasher(普瑞舍)等人(1985)Biochem.Biophys.Res.Comm.(生物化学与生物物理研究通讯)126:1259-1268)；或者编码绿色荧光蛋白的一种核苷酸序列(Niedz(尼德兹)等人(1995)PlantCellReports(植物细胞报告)14:403-406)。本领域技术人员能够选择用于在本发明的表达盒中使用的适合的选择性标记。本发明的表达盒还可以包括对其他所希望的性状进行编码的多核苷酸。此类所希望的性状可以是赋予昆虫抗性或赋予线虫抗性的其他多核苷酸，或其他农业上所希望的性状。此类多核苷酸可以与核苷酸序列的任何组合叠加，以产生出具有所希望的表型的植物、植物部分或植物细胞。叠加的组合可以通过任何方法来产生，包括但不限于，通过任何常规的方法学的杂交育种植物或通过遗传转化。如果是通过遗传转化这些植物来进行叠加，则编码其他所希望的性状的核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如，包括一种或多种所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转化而引入另外的性状的靶标。另外的核苷酸序列可以在一个共转化方案中与由表达盒的任何组合提供的本发明的核苷酸序列、核酸分子、核酸构建体、和/或其他组合物同时引入。例如，如果将引入两个核苷酸序列，则它们可以合并在分开的盒(反式)中或可以合并在相同的盒(顺式)上。这些核苷酸序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子来驱动。进一步认识到的是，核苷酸序列可以在一个所希望的基因组位置处使用位点特异性重组系统进行叠加。参见，例如，国际专利申请公开号WO99/25821；WO99/25854；WO99/25840；WO99/25855；以及WO99/25853。因此，表达盒可以包括用于农艺性状的一种或多种多肽的一个编码序列，这些农艺性状的主要受益者是种子公司、种植者或谷粒加工者。感兴趣的多肽可以是由感兴趣的多核苷酸序列编码的任何多肽。适合用于在植物中生产的感兴趣的多肽的非限制性实例包括产生农艺学重要性状的那些多肽，这些性状如除草剂抗性(有时也称为“除草剂耐受性”)、病毒抗性、细菌病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、和/或真菌抗性。参见，例如，美国专利号5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504；以及6,337,431。适合于植物转化的载体说明于在本说明书的其他地方。对于农杆菌介导的转化，二元载体或携带至少一个T-DNA边界序列的载体是适合的，而对于直接基因转移，任何载体都是适合的，并且仅含有感兴趣的构建体的线性DNA也许是优选的。在直接基因转移的情况下，可以使用以单个DNA种类的转化或共转化(Schocher(斯科切尔)等人Biotechnology(生物技术)4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及农杆菌介导的转化这二者，转化通常(但不是必需的)用一种选择性标记进行，这种选择性标记可以提供针对一种抗生素(卡那霉素、潮霉素、或甲氨蝶呤)或一种除草剂(Basta)的抗性。包含编码本发明的短发夹RNA的表达盒的植物转化载体还可以包括以下基因，例如，如披露于美国专利5,767,378和5,994,629中(通过引用结合在此)的提供转基因植物的正向选择的磷酸甘露糖异构酶(pmi)，或提供对除草剂草丁膦(phosphinotricin)(草铵膦(glufosinate))耐受性的草丁膦乙酰转移酶(pat)。然而，选择性标记的选择对于本发明并不是至关重要的。在一个实施例中，适于植物转化的载体包括SEQIDNO:65或SEQIDNO:67的核苷酸序列，基本由其组成或由其组成。在其他实施例中，本发明的核酸序列被直接转化进入质体基因组中。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO95/16783中，以及在McBride(麦克布莱德)等人(1994)Proc.Nati.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)91,7301-7305中广泛描述了质体转化技术。基本的叶绿体转化技术涉及将位于一种选择性标记侧翼的克隆的质体DNA区连同感兴趣的基因一起引入到一种适合的靶组织中，这是(例如)通过生物射弹(biolistics)或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)来进行的。这些1至1.5kb的侧翼区(被命名为靶向序列)促进了与质体基因组的同源重组，并且因而允许置换或修饰该原质体(plastome)的特定区域。最初，将叶绿体16SrRNA和rps12基因的点突变(赋予对大观霉素和/或链霉素抗性)用作用于转化的选择性标记(Svab(斯韦伯)，Z.，Hajdukiewicz(哈度科瓦斯)，P.，和Maliga(马利加)，P.(1990)Proc.Nati.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)87,8526-8530；斯托布(Staub)，J.M.，和马利加，P.(1992)PlantCell(植物细胞)4,39-45)。这以大约每100次靶叶轰击大约1个的频率产生稳定的同质转化株。在这些标记之间克隆位点的存在允许建立一种质体靶向载体用于外源基因的引入(Staub(斯托布)，J.M.，和Maliga(马利加)，P.(1993)EMBOJ.(欧洲分子生物学杂志)12,601-606)。转化效率的实质性增加是通过用一种显性的选择性标记物(对大观霉素-cletoxifying酶氨基糖甙-3'-腺苷转移酶进行编码的细菌aadA基因)替换隐性的rRNA或r蛋白质抗生素抗性基因而获得的(Svab(斯韦伯)，Z.，和Maliga(马利加)，P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)90,913-917)。之前，这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻这种绿藻的质体基因组的高频率转化(Goldschmidt-Clermont(戈尔德施密特-克莱蒙特)，M.(1991)Nucl.AcidsRes.(核酸研究)19:4083-4089)。用于质体转化的其他选择性标记是本领域所已知的，并且包括在本发明的范围之内。典型地，转化之后需要大致15-20个细胞分裂循环以便达到一种同质状态。质体表达(其中多种基因通过同源重组被插入到在每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的庞大的拷贝数目的优点，以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10％的表达水平。在一个优选的实施例中，将本发明的一种核酸序列插入至一种质体靶向的载体中并且转化至一种所希望的植物宿主的质体基因组中。获得了包含本发明的一种核酸序列的对于质体基因组同型的植物，并且这些植物优选地能够高表达该核酸序列。包括本发明的dsRNA或siRNA的转基因植物或种子还可以用一种杀虫剂或杀虫种子包衣进行处理，如描述于美国专利号5,849,320和5,876,739(通过引用结合在此)中。在本发明的杀虫剂或杀虫种子包衣以及转基因植物或种子有效对抗同一靶标昆虫(例如根萤叶甲属靶标昆虫)的情况下，该组合(i)在一种用于进一步增强本发明的组合物对抗该靶标昆虫的活性的方法中以及(ii)在一种用于通过提供对抗该靶标昆虫的又另一种作用机制而防止对本发明的组合物产生抗性的方法中是有用的。因此，本发明提供了一种增强根萤叶甲属昆虫种群的控制的方法，该方法包括提供一种本发明的转基因植物或种子并且向该植物或该种子施用本发明的杀虫剂或杀虫种子包衣。此类杀虫剂和/或杀虫种子包衣的实例包括但不限于，氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、氟利普利(friprole)、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合。在另一个实施例中，该杀虫剂或杀虫种子包衣选自下组，该组由以下各项组成：克百威，胺甲萘，灭多虫，联苯菊酯，七氟菊酯，氯菊酯，氟氯氰菊酯，λ-氯氟氰菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯，毒死蜱，氯氧磷，乐果，灭线磷，马拉硫磷，甲基对硫磷，甲拌磷，特丁磷，叔丁嘧啶磷(tebupirimiphos)，氟虫腈，啶虫脒，吡虫啉，噻虫啉，噻虫嗪，硫丹，杀虫磺，及其组合。包含此类杀虫剂和杀虫种子包衣的商业产品包括但不限于Delta以及本发明的组合物还可以与其他生物控制剂组合，以增强根萤叶甲属昆虫种群的控制。因此，通过提供一种转基因植物，本发明提供了一种增强根萤叶甲属昆虫种群的控制的方法，该转基因植物产生本发明的dsRNA并且进一步包括一种编码选自下组的杀有害生物剂的多核苷酸，该组由以下各项组成：马铃薯糖蛋白、蛋白酶、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白或蛋白复合体、光杆菌属杀虫蛋白或蛋白复合体、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白或蛋白复合体以及球形芽孢杆菌杀虫蛋白。在一些实施例中，该苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自下组，该组由以下各项组成：Cry1蛋白，Cry3蛋白，Cry7蛋白，Cry8蛋白，Cry23蛋白，Cry36蛋白，Cry37蛋白，Cry34蛋白连同Cry35蛋白，修饰的Cry3A蛋白，以及由其产生的杂交蛋白。在其他实施例中，该苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自下组，该组由以下各项组成：Cry3Bb1，Cry34Ab1连同Cry35Ab1，mCry3A以及eCry3.1Ab。在另一个实施例中，该转基因植物和转基因种子是一种玉米植物或玉米种子。在另一个实施例中，该转基因玉米植物通过一种包含本发明的dsRNA的第一转基因玉米植物与一种包含选自下组的转基因事件的转基因玉米植物杂交而提供，该组由以下各项组成：MIR604、事件5307、DAS51922-7、MON863以及MON88017。即使在该杀虫剂或杀虫种子包衣有效对抗一种不同的昆虫的情况下，该杀虫剂或杀虫种子包衣对于扩展昆虫控制的范围是有用的，例如通过将一种具有对抗鳞翅目昆虫活性的杀虫剂或杀虫种子包衣加入本发明的转基因植物或种子(具有对抗鞘翅目昆虫的活性)中，所处理的植物或包衣的转基因种子控制鳞翅目和鞘翅目害虫两者。在另外的实施例中，本发明涵盖来自本发明的转基因植物、种子或其部分的生物样品，其中该样品包括作为本发明的dsRNA或编码本发明的dsRNA的至少一条链的核酸。在其他实施例中，本发明涵盖一种衍生自本发明的转基因植物、种子或其部分的商品产品。在一些实施例中，该商品产品选自下组，该组由以下各项组成：整个或经处理的种子、豆类、谷物、籽粒、壳、粉、粗碾去壳谷类、面粉、糖、糖、淀粉、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、蜡、油、提取物、汁、浓缩物、液体、糖浆、饲料、青贮饲料、纤维、纸或其他从植物生产的食物或产品。在其他实施例中，该生物样品或商品产品对昆虫具有毒性。在其他实施例中，该转基因植物是一种转基因玉米植物。本发明进一步涵盖一种控制根萤叶甲属昆虫的方法，该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与一种作为本发明的干扰RNA或能够产生本发明的干扰RNA的核酸分子接触，从而控制该根萤叶甲属昆虫，该干扰RNA用于抑制IAP基因在该根萤叶甲属昆虫中的表达。在一些实施例中，该IAP基因包括与SEQIDNO:2具有从至少约90％一致性至至少约99％一致性的IAP编码序列。在一些实施例中，该IAP编码序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQIDNO:2，SEQIDNO:11，SEQIDNO:14以及SEQIDNO:17。在其他实施例中，该干扰RNA与可从该IAP基因转录的mRNA多核苷酸的一部分互补。在其他实施例中，mRNA多核苷酸的该部分包括SEQIDNO:3、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15或SEQIDNO:18的从18、19、20或21个连续核苷酸至至少约400个连续核苷酸。在一些实施例中，mRNA多核苷酸的该部分基本由以下各项组成：(a)由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:3(wcrIAP1)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:3的核苷酸1至1603；或(b)由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:12(wcrIAP2)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:12的核苷酸1至核苷酸1444；或(c)由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:15(scrIAP1)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:15的核苷酸1至核苷酸1018；或(d)由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:18(ncrIAP1)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:18的核苷酸1至核苷酸1020。在一些实施例中，mRNA多核苷酸的该部分基本由SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15或SEQIDNO:18的核苷酸序列组成。在控制根萤叶甲属有害生物的方法的一些实施例中，该干扰RNA的核苷酸序列基本由以下各项组成：(a)由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:4(wcrIAP1*)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:4的核苷酸1至1603；或(b)由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:13(wcrIAP2*)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:13的核苷酸1至核苷酸1444；或(c)由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:16(scrIAP1*)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:16的核苷酸1至核苷酸1018；或(d)由N至N+18个核苷酸组成的SEQIDNO:19(ncrIAP1*)的任何19-mer子序列，其中N是SEQIDNO:19的核苷酸1至核苷酸1020。在又另外的实施例中，该干扰RNA的核苷酸序列基本由SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16或SEQIDNO:19的核苷酸序列组成。在控制根萤叶甲属的方法的一些实施例中，该根萤叶甲属昆虫选自下组，该组由以下各项组成：巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)，西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)，黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)，黄瓜条根萤叶甲(带状黄瓜甲虫)，黄瓜十一星叶甲(西方斑点黄瓜甲虫)，斯格尼根萤叶甲(3斑叶甲)，南美叶甲(菊花甲虫)以及墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。在控制根萤叶甲属昆虫的方法的其他实施例中，该接触包括(a)种植转基因种子，该转基因种子能够产生一种表达该核酸分子的转基因植物，其中该根萤叶甲属昆虫摄食该转基因植物或其部分；或(b)将包括该核酸分子的组合物施用至种子或植物或其部分，其中该根萤叶甲属昆虫摄食该种子、该植物或其部分。在一些实施例中，该转基因种子和该转基因植物是一种玉米种子或一种玉米植物。在其他施例中，该种子或植物是一种玉米种子或一种玉米植物。本发明还涵盖一种减少转基因植物上的成虫根萤叶甲属昆虫种群的方法，该转基因植物表达Cry蛋白、杂种Cry蛋白或修饰的Cry蛋白，该方法包括在该转基因植物中表达一种作为干扰RNA或能够产生干扰RNA的核酸分子，从而减少该成虫根萤叶甲属昆虫种群，该干扰RNA能够抑制IAP基因在成虫根萤叶甲属昆虫中的表达。在一些实施例中，本发明涵盖一种减少可从IAP基因转录的靶标mRNA在根萤叶甲属昆虫中的水平的方法，该方法包括向该根萤叶甲属昆虫饲喂一种包括本发明的dsRNA分子的组合物，其中该dsRNA分子减少该靶标mRNA在该根萤叶甲属昆虫的细胞中的水平。在其他实施例中，由该靶标mRNA编码的IAP蛋白的产生被减少。在其他实施例中，该IAP蛋白是一种IAP1或IAP2蛋白。在其他实施例中，该IAP蛋白包括一种氨基酸，该氨基酸与SEQIDNO:20具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％一致性。在其他实施例中，该IAP蛋白包括一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22以及SEQIDNO:23。在其他实施例中，该dsRNA通过一种表达该dsRNA的转基因生物体与根萤叶甲属昆虫接触。在其他实施例中，该转基因生物体是一种转基因植物、转基因细菌或转基因内寄生菌。在其他实施例中，通过将可接受的农用载体中的dsRNA局部地施用至根萤叶甲属昆虫摄食的植物或植物部分来使该dsRNA与该根萤叶甲属昆虫接触。在一些实施例中，减少可从IAP基因转录的靶标mRNA在根萤叶甲属昆虫中的水平的dsRNA对该根萤叶甲属昆虫而言是致死的。在其他实施例中，该根萤叶甲属昆虫选自下组，该组由以下各项组成：巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)，西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)，黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)，黄瓜条根萤叶甲(带状黄瓜甲虫)，黄瓜十一星叶甲(西方斑点黄瓜甲虫)，斯格尼根萤叶甲(3斑叶甲)，南美叶甲(菊花甲虫)以及墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。在一些实施例中，本发明涵盖一种赋予植物或其部分对根萤叶甲属昆虫耐受性的方法，该方法包括向该植物或其部分中引入一种本发明的dsRNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，从而赋予该植物或其部分对该根萤叶甲属昆虫的耐受性。在一个实施例中，该核酸构建体或该嵌合核酸分子包括SEQIDNO:63或SEQIDNO:64的核苷酸序列。在另一个实施例中，该嵌合核酸分子是一种包含SEQIDNO:65或SEQIDNO:67的核苷酸序列的载体。在其他实施例中，本发明涵盖一种减少被根萤叶甲属昆虫摄食的植物的根损害的方法，该方法包括向该植物的细胞中引入一种对应的以上权利要求中任一项的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，从而减少对该植物的根损害。在一个实施例中，该核酸构建体或该嵌合核酸分子包括SEQIDNO:63或SEQIDNO:64的核苷酸序列。在另一个实施例中，该嵌合核酸分子是一种包含SEQIDNO:65或SEQIDNO:67的核苷酸序列的载体。在仍其他实施例中，本发明涵盖一种产生对根萤叶甲属昆虫具有毒性的转基因植物细胞的方法，该方法包括向植物细胞中引入一种本发明的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，从而产生与对照植物细胞相比，对该根萤叶甲属昆虫具有毒性的转基因植物细胞。在一些实施例中，本发明涵盖多个由这一方法产生的转基因植物细胞。在其他实施例中，使该多个转基因植物细胞在包括天然日光的条件下生长。在一个实施例中，该核酸构建体或该嵌合核酸分子包括SEQIDNO:63或SEQIDNO:64的核苷酸序列。在另一个实施例中，该嵌合核酸分子是一种包含SEQIDNO:65或SEQIDNO:67的核苷酸序列的载体。在一些实施例中，本发明涵盖一种产生对根萤叶甲属昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物的方法，该方法包括向植物中引入一种本发明的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，从而产生与对照植物相比，对根萤叶甲属昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物。在其他实施例中，通过转化一种植物细胞并且自该转化的植物细胞产生该转基因植物来进行该引入步骤。在仍其他实施例中，通过共同培育两种植物来进行该引入步骤。在一些实施例中，本发明涵盖一种为玉米种植者提供控制玉米作物中的根萤叶甲属昆虫有害生物种群的手段的方法，该方法包括(a)向该种植者销售或为其提供至少一袋玉米种子，该袋玉米种子包括转基因玉米种子，这些转基因玉米种子包括一种本发明的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物；并且(b)向该种植者做广告宣传该转基因玉米种子产生控制根萤叶甲属昆虫种群的转基因玉米植物。实例通过参考以下具体的实例可以进一步描述本发明。这些实例仅仅是出于说明性目的而提供的，并且并不旨在进行限制，除非另外指明。实例1.根萤叶甲属中的IAP基因的鉴定这一实例描述了从根萤叶甲属昆虫中克隆细胞凋亡抑制剂(iap)基因和编码序列并对其进行测序。西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫；WCR)基本根据制造商的说明，在一个454平台(454生命科学公司(454LifeSciences)，布兰福德，康涅狄格州)上通过焦磷酸测序对全身新生WCR转录组进行测序。将所得测定序列(read)(即，核酸序列的短片段)进行修整并使用MIRA组装器进行组装(参见例如，Chevreux(舍夫勒)等人2004.GenomeRes.(基因组研究)14:1147-1159，通过引用结合在此)。使用所得重叠群制作一个BLAST数据库(Attschul(阿特斯库)等人1990.J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)215:403-410)，其中使用formatdb(NCBI，贝塞斯达，马里兰州)。为了鉴定组装的重叠群与已知昆虫iap基因的相似性，将黑腹果蝇IAP1(dmIAP1)氨基酸序列(Genbank登录号NP730097；SEQIDNO:24)用作针对WCR转录组BLAST数据库的查询序列(query)，其中使用tblastn(蛋白质查询相对于所翻译的核苷酸数据库)。使用1e-05的预期截取值。在一个集合中鉴定并使用了十五个WCR序列，其中使用默认参数的重叠群表达软件(ContigExpress)(VectorNTI版本11，英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚)。组装三个连续序列并且将所得序列通过blastx与GenbankNR数据库进行比较。使用五个454重叠群序列组装一个第一重叠群(重叠群1)并且发现类似于dmIAP1。将重叠群1的集合手动编辑，以去除低品质碱基响应(basecall)并解析454个重叠群之间的差异。通过使用标准桑格(Sanger)测序法，用示于表1中的引物测序来确认最终序列(wcrIAP1；SEQIDNO:1)。wcrIAP1基因是1622个核苷酸长度并且包括一个145bp5’UTR、1050bp编码区(位置146至1195)以及一个427bp3’UTR。编码的WCR-IAP1氨基酸序列示于SEQIDNO:20中。表1.用于对wcrIAP1测序的引物引物名称序列(5'→3')序列标识符WCR_IAP_FP01AGAGCATTAAACAGAGGCCTTCSEQIDNO:57WCR_IAP_RP01TGATAGGAACGCTCTGACTGTGSEQIDNO:58WCR_IAP_FP02ATGGCAGTAGTTCAATCAAATTACATTSEQIDNO:59WCR_IAP_RP02GCCAACCCTGGAATGTTGCSEQIDNO:60WCR_IAP_FP03TTGTGGTGGGGGATTAAAAGSEQIDNO:61WCR_IAP_RP03CATTTGCTAAACCAAAGGGCSEQIDNO:62使用三个454重叠群组装一个第二重叠群(重叠群2)并且也如重叠群1一样进行手动编辑。最终组装的序列是1462bp长度并且指定为wcrIAP2(SEQIDNO:11)，其在5’末端包含一个不完整编码序列。wcrIAP2的最后31bp属于3'非翻译区(UTR)。编码的WCR-IAP2氨基酸序列示于SEQIDNO:21中。黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫；SCR)购买可商购的SCR卵(特点作物公司(CropCharacteristics,Inc)，法明顿，明尼苏达州)并且在大约30℃和周围相对湿度下孵育。收集新羽化的新生SCR(大约100-200只)并且基本根据制造商的说明，用PicoPureTMRNA分离试剂盒(生命科技公司(LifeTechnologies)，卡尔斯巴德，加利福尼亚)提取总RNA。通过分光光度法测量RNA浓度并且通过吸光度比值A260/280和A260/230评估纯度。基本根据制造商的说明，使用锚定寡核苷酸(dT)17引物(西格玛奥瑞奇公司(SigmaAldrich)，圣路易斯，密苏里州)和SuperscriptIII逆转录酶(目录号18080-051；英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚)，将SCR总RNA逆转录为cDNA。反应为在约50℃下孵育1h，随后在约70℃下孵育15min并且然后用80μlddH2O稀释并存储在-20℃下。使用针对wcrIAP1基因的引物从SCR中扩增IAP基因。所有扩增的反应条件如下：95℃5min，随后95℃30s、50℃30s、72℃90s循环35次，并且然后是72℃2min的最终步骤。用FP02：5’-ATGGCAGTAGTTCAATCAAATTACATT-3’(SEQIDNO:59)和RP01：5’-TGATAGGAACGCTCTGACTGTG-3’(SEQIDNO:58)扩增SCRIAP基因的整个编码序列并且在1％琼脂糖凝胶上进行分析。基本根据制造商的说明，使用MinElutePCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，巴伦西亚，加利福尼亚)纯化PCR产物。所得PCR产物长度是1033bp。使用示于表5中的3个正向引物和3个反向引物，使用标准桑格测序法对整个扩增子进行测序。使用重叠群表达软件(VectorNTI，英杰公司)，使用默认参数，组装单独的序列。所得全长scrIAP1编码序列示于SEQIDNO:14中。编码的SCR-IAP1氨基酸序列示于SEQIDNO:22中。巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫；NCR)NCR卵获得自USDAARSNCARL(布鲁金斯(Brookings)，南达科他州)处的昆虫饲养工厂并且在约30℃和周围相对湿度下进行孵育。收集新羽化的新生虫(共约20只)并且基本根据制造商的说明，用PicoPureTMRNA分离试剂盒(生命科技公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚)提取总RNA。通过分光光度法测量RNA浓度并且通过A260/280和A260/230比值评估纯度。根据制造商的建议，使用锚定寡核苷酸(dT)17引物(西格玛奥瑞奇公司，圣路易斯，密苏里州)和SuperscriptII逆转录酶(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚)，将NCR总RNA逆转录为cDNA。通将反应在约42℃下孵育50min，随后在70℃下孵育15min。通过用2μlRNA酶H(英杰公司)处理以除去RNA并且在约37℃下孵育20min，随后在65℃下孵育20min，并且然后用80μlddH2O稀释并且储存在-20℃下。使用上述针对wcrIAP1基因的引物(表1)扩增NCRIAP基因。所有扩增的反应条件如下：95℃5min，随后95℃30s、50℃30s、72℃90s循环35次，并且然后是72℃10min的最终步骤。用引物FP02(SEQIDNO:64)和引物RP01(SEQIDNO:63)扩增NCRIAP基因的整个编码序列并在1％琼脂糖凝胶上进行分析。基本根据制造商的说明，使用凯杰公司(巴伦西亚，加利福尼亚)MinElute试剂盒纯化PCR产物。PCR产物是1038bp。使用示于表1中的3个正向引物和3个反向引物，使用标准桑格测序法对整个扩增子进行测序。使用重叠群表达软件(VectorNTI，英杰公司)，使用默认参数，组装单独的序列。手动编辑集合，以产生最终的连续序列，指定为ncrIAP1(SEQIDNO:17)，其包括1038bp的编码序列。编码的NCR-IAP1氨基酸序列示于SEQIDNO:23中。使用VectorNTIAdvanceTM11.1.0(英杰公司)比对wcrIAP1、scrIAP1和ncrIAP1编码序列。scrIAP1(SEQIDNO:14)和ncrIAP1(SEQIDNO:17)编码序列分别与wcrIAP1编码序列(SEQIDNO:2)具有95％一致性和97％一致性。scrIAP1编码序列与ncrIAP1编码序列具有94％一致性。三个编码序列的比对示于图4中，其中将wcrIAP1编码序列(SEQIDNO:2)用作参比序列。使用VectorNTIAdvanceTM11.1.0(英杰公司)比对WCR-IAP1、SCR-IAP1和NCR-IAP1氨基酸序列。SCR-IAP1(SEQIDNO:22)和NCR-IAP1(SEQIDNO:23)氨基酸序列与WCR-IAP1氨基酸序列(SEQIDNO:20)分别具有95％一致性和97％一致性。SCR-IAP1氨基酸序列与NCR-IAP1氨基酸序列具有94％一致性。三个氨基酸序列的比对示于图5中，其中将WCR-IAP1氨基酸序列(SEQIDNO:20)用作参比序列。WCR-IAP1和WCR-IAP2氨基酸序列具有28％一致性。实例2.IAP1在不同生活期中的检测这一实例描述了wcrIAP1基因在玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)的不同生活期中的检测。使用标准RNA提取法，从西方玉米根虫的幼虫和成虫中分离总RNA。如上所述的进行mRNA至cDNA的逆转录。来自列于表1中的那些引物的IAP1特异性PCR引物与幼虫和成虫DNA一起用于PCR反应中，以检测IAP1的存在。示于图2中的结果证明成虫西方玉米根虫与幼虫期具有相同的或基本上相同的IAP1，表明成虫期中的wcrIAP1可以用与用于靶向幼虫期中的IAP1的dsRNA相同或类似的dsRNA靶向。其结果是，IAPdsRNA在玉米植物的地上和地下组织两者中的表达都可以影响幼虫和成虫两者并且提供优于仅靶向幼虫期的技术的增加的保护。实例3.干扰RNA分子的构建这一实例描述了干扰RNA分子的构建，这些干扰RNA分子被设计成靶向可从根萤叶甲属IAP1基因转录的mRNA。构建wcrIAP1dsRNA双链RNA(dsRNA)分子被设计成与wcrIAP1mRNA(SEQIDNO:3)上的至少三个不同靶标杂交。wcrIAP1-B(正义链，SEQIDNO:5)/wcrIAP-B*(反义链，SEQIDNO:6)、wcrIAP1-A(正义链，SEQIDNO:7)/wcrIAP1-A*(反义链，SEQIDNO:8)和wcrIAP1-C(正义链，SEQIDNO:9)/wcrIAP-C*(反义链，SEQIDNO:10)分别靶向SEQIDNO:3的碱基对693-1192、146-689和473-972。基本根据制造商的说明，使用AmpliScribeTMT7-FlashTM转录试剂盒(爱普森特公司(Epicentre)，麦迪逊，威斯康星州)进行dsRNA的合成。简言之，在每个20μl反应中使用1μg的模板DNA与反向T7启动子。每个样品都用DNA酶处理并用相等体积的5M乙酸铵沉淀并且然后用500μl冰冷70％乙醇洗涤。在1％琼脂糖凝胶上检查dsRNA的完整性。构建scrIAP1dsRNA双链RNA(dsRNA)分子被设计成与整个南方玉米根虫IAP1mRNA(SEQIDNO:15)杂交。基本根据制造商的说明，使用AmpliScribeTMT7-FlashTM转录试剂盒(爱普森特公司，麦迪逊，威斯康星州)进行dsRNA的合成。简言之，在每个20μl反应中使用1μg的模板DNA与反向T7启动子。每个样品都用DNA酶处理并用相等体积的5M乙酸铵沉淀并且然后用500μl冰冷70％乙醇洗涤。在1％琼脂糖凝胶上检查dsRNA的完整性。正义链和反义链的序列分别示于SEQIDNO:15和16中。实例4.干扰RNA分子的生物测定这一实例描述了测试本发明的dsRNA对抗根萤叶甲属昆虫的生物活性。在实验室生物测定中，测试上述dsRNA分子针对若干根萤叶甲属物种的毒性。使用RNA处理的人工食物法进行生物测定。简言之，将修改自Marrone(马罗内)等人1985.J.Econ.Entomol.(经济昆虫学杂志)78:290-293的食物的熔化的人工食物倾倒进24孔板的每个孔中并允许凝固。将dsRNA分子稀释至适当浓度，这样使得将60μl的溶液添加至每个孔中的食物的表面，最终覆盖浓度为100ngdsRNA/cm2。向每个孔中加入一只根萤叶甲属幼虫并且将每个24孔板维持在大约28℃和16:8光照:黑暗光周期下。在侵染后第7天记录死亡率。在所有生物测定中，将被设计成靶向绿色荧光蛋白(GFP)的dsRNA用作阴性对照。将生物测定重复三次。针对西方玉米根虫幼虫测试被设计成靶向玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)IAP1mRNA的不同部分的双链RNA。示于表2中的结果证明，被设计成靶向可从根萤叶甲属昆虫IAP基因转录的mRNA的一部分的dsRNA分子对玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)具有高毒性。wcrIAP1-A/wcrIAP1-A*(SEQIDNO:7/SEQIDNO:8)和wcrIAP1-B/wcrIAP1-B*(SEQIDNO:5/SEQIDNO:6)在7d后都产生平均约90％死亡率。表2.dsRNA针对玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)的活性。还针对黄瓜十一星叶甲(南方玉米根虫)测试wcrIAP1-A/wcrIAP1-A*dsRNA并且与GFP对照中的12％死亡率相比，在这一物种中产生100％死亡率。这一生物测定的结果证明，被设计成靶向一种根萤叶甲属IAP1mRNA的dsRNA对不同的根萤叶甲属物种具有毒性。实例5.干扰RNA分子与杀虫蛋白之间的相互作用这一实例描述了靶向可从根萤叶甲属IAP基因转录的mRNA的dsRNA与具有对抗根萤叶甲属昆虫活性的杀虫蛋白之间的协同相互作用(相对于杀虫活性)。在wcrIAP1-A/wcrIAP1-A*、wcrIAP1-B/wcrIAP1-B*、wcrIAP1-C/wcrIAP1-C*、scrIAP1/scrIAP1*和/或ncrIAP1/ncrIAP1*dsRNA存在和不存在的情况下调查杀虫蛋白mCry3A或eCry3.1Ab对敏感的有害生物物种玉米根萤叶甲(西方玉米根虫；WCR)的作用。使用一龄幼虫来进行WCR食物结合生物测定。在侵染后大约4-7天时评估WCR百分比死亡率。从剂量-反应曲线中选择大约两个给出中间水平的反应的mCry3A和eCry3.1Ab浓度来进行相互作用生物测定。结果表明当存在wcrIAP1-A/wcrIAP1-A*、wcrIAP1-B/wcrIAP1-B*、wcrIAP1-C/wcrIAP1-C*、scrIAP1/scrIAP1*和/或ncrIAP1/ncrIAP1*dsRNA时，WCR百分比死亡率较高，表明当基于WCR生物测定组合使用时，本发明的dsRNA与杀虫蛋白之间的潜在的升高功效。当在wcrIAP1-A/wcrIAP1-A*、wcrIAP1-B/wcrIAP1-B*、wcrIAP1-C/wcrIAP1-C*、scrIAP1/scrIAP1*和/或ncrIAP1/ncrIAP1*dsRNA的存在下测试mCry3A或eCry3.1Ab对抗巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)时，观察到类似结果。实例6.表达于植物细胞中的dsRNA的活性这一实例描述了dsRNA分子在玉米细胞中的表达。载体构建。用于转化植物细胞的表达载体通常包括两个表达盒，一个第一表达盒，包括一个可操作地连接至一个核苷酸序列的Ubi1启动子，该核苷酸序列被设计成产生一种发夹RNA(hpRNA)，该发夹RNA可操作地连接至一个Ubi361终止子；和一个第二表达盒，包括一个可操作地连接至一个pmi(磷酸甘露糖异构酶)选择标记编码序列的Ubi1启动子，该编码序列可操作地连接至一个Ubi1终止子。该第一表达盒中的被设计成形成一种发夹RNA的核苷酸序列包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码融合至一个内含子间隔区序列的正义RNA链，该内含子间隔区序列起作用以形成一个环序列，融合至一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码一条反义RNA链，其一个实例示于图3中，并且具有正义链-内含子间隔区序列-反义链的通式。构建三种这样的表达载体，以在植物中进行测试，1)pRNA21537-其中将hpRNA编码核苷酸序列指定为hpwcrIAP1-C/wcrIAP1-C*(SEQIDNO:63)，被设计成靶向一种玉米根虫IAP基因；2)pRNA21534-其中将hpRNA编码核苷酸序列指定为hpwcrIAP1-Ca/wcrIAP1-Ca*(SEQIDNO:64)，被设计成靶向一种玉米根虫IAP基因；以及3)pRNA21536-其中将hpRNA编码核苷酸序列指定为hpNC/NC*，其作为与玉米根虫或玉米植物DNA没有已知同源性的阴性对照起作用。这些载体还包含用于在细菌中进行选择的选择性标记。为了保证在用本发明的载体转化的转基因植株中不产生非计划中的蛋白，通过在hpRNA编码核苷酸序列中进行单核苷酸点突变来破坏pRNA21534载体中的所有偶然的开放阅读框。进行八个这样的点突变。因此，pRNA21537和pRNA21534中的hpRNA编码序列是相同的，除了pRNA21534中的八个点突变之外。农杆菌制备。可以首先在一个玉米细胞培养物系统(例如黑墨西哥甜(BMS)玉米细胞或愈伤组织)中测试包含编码上述表达盒的发夹RNA的所得载体。使用本领域的普通技术人员已知的标准分子生物学技术将这些载体转化进根癌农杆菌中。为了制备用于转化的农杆菌，将细胞悬浮于BMS培养基中并且将密度调节至约0.45的OD600。可替代地，将农杆菌在28℃和220rpm下于液体YPC培养基中培养过夜。BMS转化之前大约四小时，以100μM的浓度添加乙酰丁香酮并且将细胞密度调节至约0.45的OD600。BMS细胞制备。植物细胞转化之前大约3至4d，通过将5ml的BMS细胞添加至125ml烧瓶中的45mlAW5培养基中将BMS细胞分裂进新的细胞培养基中并且在25℃下，在125rpm和无光下的振荡下进行培养。接下来，通过在室温下以2300xg离心5min来沉淀大约1.4ml的BMS细胞培养物。将细胞用AW5培养基洗涤一次并且再次在相同条件下沉淀细胞。将细胞在45℃下热激5min。BMS细胞转化。将大约1ml的农杆菌悬浮液添加至热激BMS细胞中。将试管在80rpm下振荡15min，简单离心并且除去农杆菌培养基。用无菌滤纸或尼龙网将BMS细胞涂覆到M11/02K培养基板上并且在室温下在无光情况下培养3d。然后将细胞转移至包含抗生素特美汀的培养基板上并且在室温下在无光情况下培养7d，以消灭农杆菌。将细胞转移至包含用于选择的甘露糖的培养基板上并且在室温下在无光情况下培养2至3周。最后，将细胞转移至清洁的选择性培养基板或液体培养基上并且允许再生长2周。实例7.表达IAPdsRNA的玉米细胞的杀虫活性这一实例描述了测试表达IAPdsRNA的转化的玉米细胞针对根萤叶甲属的生物活性。通过将描述于实例6中的转化的黑墨西哥甜愈伤组织饲喂给西方玉米根虫幼虫(玉米根萤叶甲)来进行昆虫毒性测定。可替代地，从转化的玉蜀黍细胞中制备包含干扰RNA的提取物并且将这一提取物掺入进饲喂根萤叶甲属幼虫的适当的昆虫食物中。与摄食非转化的愈伤组织或来自非转化的愈伤组织的提取物的幼虫相比，摄食转化的愈伤组织或这样的愈伤组织的提取物的根虫幼虫受到dsRNA的作用负面影响。实例8.表达dsRNA的转基因玉米植物的杀虫活性将描述于实例6中的载体转化进玉蜀黍植物中。基本如描述于Negrotto(奈格图)等人，2000，PlantCellReports(植物细胞报告)19:798-803中的进行未成熟的玉蜀黍胚的农杆菌转化。对于这一实例，所有的培养基成分基本如描述于Negrotto(奈格图)等人，同上中。然而，本领域内已知的各种培养基成分可以被代替。简言之，使包含一种植物转化质粒的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)在28℃下于YEP(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l琼脂，pH6.8)固体培养基上生长2-4天。将大约0.8X109个农杆菌悬浮于补充有100μMAs的LS-inf培养基中(Negrotto(奈格图)等人，同上)。在此培养基中预诱导细菌30-60分钟。将来自适合的基因型的未成熟胚从8-12天大的穗中切除到液体LS-inf+100μMAs中。用新鲜的感染培养基漂洗这些胚。然后添加农杆菌溶液，并且将这些胚涡旋30秒并且允许其与细菌一起沉降5分钟。然后将这些胚盾片向上地转移到LSA培养基中，并且在黑暗中培养两至三天。随后，将每皮氏板(petriplate)20与25个之间的胚转移到补充有头孢噻肟(250mg/l)和硝酸银(1.6mg/l)的LSDc培养基中，并且在28℃在黑暗中培养10天。将产生胚性愈伤组织的未成熟的胚转移到LSD1M0.5S培养基中。在此培养基上选择培养物约6周，在约3周时进行继代培养步骤。将存活着的愈伤组织转移到补充有甘露糖的Reg1培养基中。在光照中培养(16小时光照/8小时黑暗方案)之后，然后将绿色组织转移到不具有生长调节剂的Reg2培养基中，并且孵育约1-2周。将这些小植株转移到含有Reg3培养基的马真塔(Magenta)GA-7盒(伊利诺斯州芝加哥的马真塔公司(MagentaCorp,ChicagoIll.))中，并且使它们在亮处生长。约2-3周后，通过qRT-PCR测试植物的pmi基因和hpRNA编码序列的存在。将来自PCR测定的阳性植物转移至温室并且随后使用根切除测定和/或全植物测定测试对至少一种玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)的抗性。根切除测定从包含描述于实例6中的构建体的转基因植物上切除根。将切除的根放置在小的扣入式皮氏培养皿中的湿润的无菌萌发纸上。向每个培养皿中添加十只玉米根虫一龄幼虫。在侵染后第48、72和96小时收集数据。通过计数由CRW造成的进入伤口的数目并且关于从0-10规模的根瘢痕形成严重性(其中0是“无瘢痕形成”并且10是“严重的瘢痕形成”)对根进行评分。0至约6的瘢痕形成分数表明与阴性对照hpRNA植物相比，hpRNA植物是阳性的。全植物测定将生长于3”盆中的玉米植物中的每株植物用至少约30-75只新生玉米根虫幼虫侵染。对于每个测定，将3株植物用作未侵染对照，其典型地是一株在根切除测定中表现良好的杂合植物、一株在根切除测定中未测试的纯合植物和一株阴性对照植物。这些植物在测定过程中作为用于生长条件的对照。侵染后10-14天收集数据。评价主要是比较侵染的测试植物与未侵染的和侵染的那些对照植物的主观量度。做出的一种关键视觉评价是植物是否显示出倒伏迹象，倒伏是指示由摄食根系的大量玉米根虫造成的严重损害的情况。生物测定结果尽管生物测定结果未与转基因植物中的hpRNA编码核酸的水平100％相关，但是来自根切除测定的结果表明来自用pRNA21534和pRNA21537两种载体转化的植物的根有效对抗根萤叶甲属(玉米根虫)。来自用任一种载体转化的植物的阳性根导致CRW死亡率并且与具有多达8.3个伤口/根的阴性植物相比，具有最低数目的、处于约1.3个/根的进入伤口。总体上，与对照相比，来自pRNA21534和pRNA21537转化的植物的许多根具有较低的瘢痕形成严重性，表明通过靶向IAP基因，dsRNA处理的幼虫受到负面影响。全植物测定的结果表明，玉米根虫侵染的水平在阴性对照植物中的许多中高到足够引起严重的倒伏，而在相同时间段过程中仅有一株用pRNA21534和pRNA21537载体中的一者转化的阳性植物倒伏。当在全植物生物测定期结束，将植物从土壤中移出以检查根损害和比较根系时，用pRNA21534和pRNA21537转化的植物的根系比对照根群总体上密集得多(参见例如图5)，表明靶向玉米根虫IAP基因的dsRNA的表达足以保护植物免受经济上显著的损害。尽管并非所有用编码靶向玉米根虫IAP基因的hpRNA的载体转化的事件都提供了良好的玉米根虫控制，但是在这些事件中的许多中观察到的结果清楚地显示，编码靶向玉米根虫IAP基因的此类dsRNA的核酸在转基因玉米中的表达是一种用于控制玉米根虫并保护植物免受玉米根虫摄食损害的可行方式。应当理解的是，在此描述的实例和实施例仅是出于说明性的目的，并且根据其说明书的不同修改或变化将提示本领域的技术人员并且将会包含在本申请以及随附的权利要求书的范围的精神和范围之内。在本说明书中提到的所有公开和专利申请对于本发明所涉及领域的技术人员的技术水平是指示性的。所有这些公开物和专利申请均通过引用结合在此，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而被结合。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3