本发明涉及组织细胞分离技术领域，具体涉及一种仔猪小肠上皮刷状缘的分离及提取方法。
背景技术：
产肠毒素大肠杆菌（ETEC）所引发的仔猪腹泻病和水肿病给养猪业带来了巨大的损失，其中ETEC F5（K99）主要感染新生仔猪并引起腹泻和死亡。ETEC致腹泻的关键点在于小肠内是否存在相应的受体。因此，研究产肠毒素大肠杆菌在小肠内的受体是探究产肠毒素大肠杆菌致病机理的基础。因为，仔猪刷状缘上具有黏附大肠杆菌ETEC（enterotoxic escherichia coli）的受体蛋白，因此，通常仔猪刷状缘会作为研发用材料。
现有技术中已公开的制备刷状缘的方法为Baker（1997）法，但是该方法制备的刷状缘细胞的浓度不是很高，而且刷状缘几乎失去了原有的黏附能力。
技术实现要素：
前人所报道的刷状缘提取方法存在一定的不足，本发明为了克服现有的问题，提供了一种改进后的仔猪小肠上皮刷状缘的分离及提取方法。
包括如下步骤：
S1.取健康仔猪小肠段，纵向剪开，以等渗溶液冲洗肠壁去除内容物；
S2.将小肠在低渗溶液中铺开，置于冰上，浸泡 10~15 分钟后，刮下肠上皮绒毛；5000~7000rpm匀浆搅拌5秒，过滤、离心收集沉淀；
S3.用 1×PBS 重悬沉淀，震荡混匀后，2500~3500rpm离心；
S4.重复S3步骤2~3遍，最后用1×PBS混匀沉淀，即得仔猪小肠上皮刷状缘。
传统制备刷状缘细胞的方法为Baker（1997）法，但是，发明人在前期研究中发现，使用传统的Baker（1997）法来分离提取仔猪小肠上皮刷状缘细胞是不合适的，后来发明人通过大量的试验在Baker（1997）法的基础上通过调整匀浆转速和洗涤转速，从而成功制得足量浓度的仔猪小肠上皮刷状缘细胞。
优选地，S2所述匀浆搅拌的转速为6000rpm。
本发明研究发现：洗涤转速不能太高也不能太低，因为转速太低较难收集到足量浓度的刷状缘沉淀，转速太高易使刷状缘分裂成碎片，不便在显微镜下观察。因此，优选地，S3所述离心的转速为3000rpm。
优选地，S1所述等渗溶液为等渗生理盐水。
优选地，S2所述低渗溶液为5mM的EDTA溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
相比于传统的提取方法，本发明调整的主要参数是：将匀浆转速由12000rpm 降低到 6000rpm。同时，将1×PBS 的洗涤转速变为 3000rpm，因为转速太低较难收集到足量浓度的刷状缘沉淀，转速太高易使刷状缘分裂成碎片，不便在显微镜下观察。
采用本文所使用的提取方法，可以保持刷状缘受体的天然活性，使其在体外黏附观察实验（brush border adhesion assay in vitro）中仍然具备一定的黏附能力。如此，可以省去制备组织冰冻切片等步骤，操作人可以直接使用刷状缘细胞溶液开展细菌黏附力判定工作。
说明书附图
图1刷状缘的形状观察。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
屠宰健康仔猪，取其小肠段，纵向剪开；以等渗生理盐水冲洗肠壁，去除内容物；在低渗 EDTA（5mM）溶液中铺开，置于冰上，浸泡 10~15 分钟后，用载玻片轻轻刮下肠上皮绒毛；6000rpm匀浆搅拌5秒，以3层纱布过滤；离心收集沉淀，去上清液，用 1×PBS 重新悬浮管底物，并轻微混匀震荡以减少杂质含量， 3000rpm离心（该洗涤步骤重复2遍）。最后用约 5ml 的 1×PBS混匀沉淀，即得仔猪小肠上皮刷状缘细胞。
如果不立刻使用仔猪小肠上皮刷状缘细胞，可向溶液中再加入100μl 的硫酸庆大霉素（1mg/ml）和 100μl 的叠氮钠（3mM）。放入4度冰箱备用，放置时间不宜超过6小时。
本实施例制备的仔猪小肠上皮刷状缘细胞的浓度为1×106/ml。刷状缘呈现典型的半圆弧形，见图1。
实施例2
屠宰健康仔猪，取其小肠段，纵向剪开；以等渗生理盐水冲洗肠壁，去除内容物；在低渗 EDTA（5mM）溶液中铺开，置于冰上，浸泡 10~15 分钟后，用载玻片轻轻刮下肠上皮绒毛；5000rpm匀浆搅拌5秒，以3层纱布过滤；离心收集沉淀，去上清液，用 1×PBS 重新悬浮管底物，并轻微混匀震荡以减少杂质含量， 2500rpm离心（该洗涤步骤重复3遍）。最后用约 5ml 的 1×PBS混匀沉淀， 即得仔猪小肠上皮刷状缘细胞。
如果不立刻使用仔猪小肠上皮刷状缘细胞，可向溶液中再加入100μ l 的硫酸庆大霉素（1mg/ml）和 100μ l 的叠氮钠（3mM）。放入 4 度冰箱备用，放置时间不宜超过6小时。
本实施例制备的仔猪小肠上皮刷状缘细胞的浓度为1×103/ml。
实施例3
屠宰健康仔猪，取其小肠段，纵向剪开；以等渗生理盐水冲洗肠壁，去除内容物；在低渗 EDTA（5mM）溶液中铺开，置于冰上，浸泡 10~15 分钟后，用载玻片轻轻刮下肠上皮绒毛；7000rpm匀浆搅拌5秒，以3层纱布过滤；离心收集沉淀，去上清液，用 1×PBS 重新悬浮管底物，并轻微混匀震荡以减少杂质含量， 3500rpm离心（该洗涤步骤重复3遍）。最后用约 5ml 的 1×PBS混匀沉淀， 即得仔猪小肠上皮刷状缘细胞。
如果不立刻使用仔猪小肠上皮刷状缘细胞，可向溶液中再加入100μ l 的硫酸庆大霉素（1mg/ml）和 100μ l 的叠氮钠（3mM）。放入 4 度冰箱备用，放置时间不宜超过6小时。
本实施例制备的仔猪小肠上皮刷状缘细胞的浓度为1×105/ml，但碎片较多。
实施例4
屠宰健康仔猪，取其小肠段，纵向剪开；以等渗生理盐水冲洗肠壁，去除内容物；在低渗 EDTA（5mM）溶液中铺开，置于冰上，浸泡 10~15 分钟后，用载玻片轻轻刮下肠上皮绒毛；6000rpm匀浆搅拌5秒，以3层纱布过滤；离心收集沉淀，去上清液，用 1×PBS 重新悬浮管底物，并轻微混匀震荡以减少杂质含量， 6000rpm离心（该洗涤步骤重复3遍）。最后用约 5ml 的 1×PBS混匀沉淀， 即得仔猪小肠上皮刷状缘细胞。
如果不立刻使用仔猪小肠上皮刷状缘细胞，可向溶液中再加入100μ l 的硫酸庆大霉素（1mg/ml）和 100μ l 的叠氮钠（3mM）。放入 4 度冰箱备用，放置时间不宜超过6小时。
本实施例的刷状缘分裂成碎片，不便在显微镜下观察。
实施例5
屠宰健康仔猪，取其小肠段，纵向剪开；以等渗生理盐水冲洗肠壁，去除内容物；在低渗 EDTA（5mM）溶液中铺开，置于冰上，浸泡 10~15 分钟后，用载玻片轻轻刮下肠上皮绒毛；10000rpm匀浆搅拌5秒，以3层纱布过滤；离心收集沉淀，去上清液，用 1×PBS 重新悬浮管底物，并轻微混匀震荡以减少杂质含量， 3000rpm离心（该洗涤步骤重复3遍）。最后用约 5ml 的 1×PBS混匀沉淀， 即得仔猪小肠上皮刷状缘细胞。
如果不立刻使用仔猪小肠上皮刷状缘细胞，可向溶液中再加入100μ l 的硫酸庆大霉素（1mg/ml）和 100μ l 的叠氮钠（3mM）。放入 4 度冰箱备用，放置时间不宜超过6小时。
本实施例的刷状缘分裂成碎片，不便在显微镜下观察。
实施例6
屠宰健康仔猪，取其小肠段，纵向剪开；以等渗生理盐水冲洗肠壁，去除内容物；在低渗 EDTA（5mM）溶液中铺开，置于冰上，浸泡 10~15 分钟后，用载玻片轻轻刮下肠上皮绒毛；12000rpm匀浆搅拌5秒，以3层纱布过滤；离心收集沉淀，去上清液，用 1×PBS 重新悬浮管底物，并轻微混匀震荡以减少杂质含量， 6000rpm离心（该洗涤步骤重复3遍）。最后用约 5ml 的 1×PBS混匀沉淀， 即得仔猪小肠上皮刷状缘细胞。
如果不立刻使用仔猪小肠上皮刷状缘细胞，可向溶液中再加入100μ l 的硫酸庆大霉素（1mg/ml）和 100μ l 的叠氮钠（3mM）。放入 4 度冰箱备用，放置时间不宜超过6小时。
本实施例的刷状缘分裂成碎片，不便在显微镜下观察。
实施例7
屠宰健康仔猪，取其小肠段，纵向剪开；以等渗生理盐水冲洗肠壁，去除内容物；在低渗 EDTA（5mM）溶液中铺开，置于冰上，浸泡 10~15 分钟后，用载玻片轻轻刮下肠上皮绒毛；3000rpm匀浆搅拌5秒，以3层纱布过滤；离心收集沉淀，去上清液，用 1×PBS 重新悬浮管底物，并轻微混匀震荡以减少杂质含量， 1000rpm离心（该洗涤步骤重复3遍）。最后用约 5ml 的 1×PBS混匀沉淀， 即得仔猪小肠上皮刷状缘细胞。
如果不立刻使用仔猪小肠上皮刷状缘细胞，可向溶液中再加入100μ l 的硫酸庆大霉素（1mg/ml）和 100μ l 的叠氮钠（3mM）。放入 4 度冰箱备用，放置时间不宜超过6小时。
本实施例转速太低，经2-3次离心洗涤后所得沉淀物很少，因此得到的刷状缘细胞浓度也非常低，显微镜下已难观察到典型特征的刷状缘细胞。