一种生物法联产甘露醇与葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法与流程

文档序号:12584519阅读:979来源:国知局

本发明属于生物技术领域,具体地说,是关于一种联产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的生产方法。



背景技术:

甘露醇是一种天然存在的六元糖醇,在食品、医药、化工和轻工等领域具有广泛应用。目前,甘露醇主要由化学法或海带提取法生产。由于,现有的甘露醇生产方法成本及耗能较高。近年来,具有高选择性、低耗能等优点的微生物发酵生产甘露醇的方法广受关注(参考文献[1]Ghoreishi SM,Shahrestani RG.Innovative strategies for engineering mannitol production.Trends in Food Science&Technology,2009,20:263–270)。

自然界中许多微生物可以利用碳水化合物合成甘露醇,如球拟酵母菌属(Torulopsis)、假丝酵母菌属(Candida)、接合酵母菌属(Zygosaccharomyces)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、粗糙青霉(Penicillium scabrosum)、黑曲霉(Aspergills niger)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri),发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum),旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis),中间乳杆菌(Lactobacillus intermedius),肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)等(参考文献[2],Saha BC,Racine FM.Biotechnological production of mannitol and its applications.Applied Microbiology and Biotechnology.2011,89(4):879-91.)。然而,利用生物发酵法生产甘露醇的技术路线,葡萄糖被转化为廉价的乙酸和乳酸,同时提供能量参与果糖向甘露醇的转化,且分离过程需要耗费较高的成本。

近年来,利用全细胞催化或多酶协同催化体系进行甘露醇的生产的研究受到广泛重视。Kaup等人构建了表达有甘露醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌全细胞催化剂,以果糖和甲酸为底物,实现了甘露醇的高效生产(Kaup,et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli:construction of an efficient biocatalyst for D-mannitol formation in a whole-cell biotransformation.Commun Agric Appl Biol Sci.2003;68(2Pt A):235-40.)。随后,以甘露醇脱氢酶和甲酸脱氢酶为核心构建的多酶协同催化体系成功应用于肠膜眀串珠菌、谷氨酸棒杆菌等微生物中,实现了甘露醇的高效生产。该方法与发酵法相比,终反应体系中只含有甘露醇,另外的产物二氧化碳被排放到大气中。因此,其分离工业更为简单。然而,该方法利用甲酸或甲酸盐为其中的一个底物,并产生二氧化碳,不仅不利于环境且造成了原料的浪费。

由于,目前的酶催化路线的局限性,还需要对该体系进行巨大的改进。葡萄糖脱氢酶在辅酶NAD+或NADP+的作用下具有将催化葡萄糖生成葡萄糖酸内酯的活性,该反应过程中葡萄糖酸内酯可自发的进一步转化为葡萄糖酸。Kim等人,曾利用酵母来源的Reductase YOR120W与枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶构建了一个用于首先醇的反应体系,转化率可达到78.5%(Shin Ah Yoon and Hyung Kwoun Kim,Development of a Bioconversion System Using Saccharomyces cerevisiae Reductase YOR120W and Bacillus subtilis Glucose Dehydrogenase for Chiral Alcohol Synthesis,J.Microbiol.Biotechnol.(2013),23(10),1395–1402)。目前,尚未有报道利用葡萄糖脱氢酶与甘露醇脱氢酶构成的双酶催化体系应用于甘露醇合成的报道。因此,建立葡萄糖脱氢酶与甘露醇脱氢酶构成的双酶协同催化体系,对于转化含有葡萄糖和果糖的原料,生产高值的甘露醇和葡萄糖酸具有重大意义。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种联产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的生产方法。

本发明以蔗糖为原料,或葡萄糖和果糖为原料,在有或无金属离子的条件下,利用蔗糖酶、NAD(P)H依赖的甘露醇脱氢酶、NAD(P)+依赖型的葡萄糖脱氢酶构成的生物催化体系催化生产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐。

具体的,采用蔗糖为底物时,通过蔗糖酶的作用,将蔗糖转化为葡萄糖和果糖;果糖在NAD(P)H依赖的甘露醇脱氢酶(EC 1.1.1.138或EC 1.1.1.67)及辅酶NADH或NADPH的作用下,生成甘露醇和NAD(P)+,产生的NAD(P)+在NAD(P)+依赖型的葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.118、EC 1.1.1.119)的作用下,生成NAD(P)H,并将葡萄糖转化成葡萄糖酸;葡萄糖酸可进一步与体系中的金属盐 进行反应,生成相应的葡萄糖酸盐;以葡萄糖和果糖为底物时,果糖在NAD(P)H依赖的甘露醇脱氢酶(EC 1.1.1.138或EC 1.1.1.67)及辅酶NADH或NADPH的作用下,生成甘露醇和NAD(P)+,产生的NAD(P)+在NAD(P)+依赖型的葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.118、EC 1.1.1.119)的作用下,生成NAD(P)H,并将葡萄糖转化成葡萄糖酸;葡萄糖酸可进一步与体系中的金属盐进行反应,生成相应的葡萄糖酸盐。

本发明提供的联产甘露醇和葡萄糖酸及葡萄糖酸盐的生产方法,所述的蔗糖酶,酶学分类号为EC3.2.1.26,选自但不限于曲霉菌属来源的蔗糖酶、青霉菌属来源的蔗糖酶、酵母菌属来源的蔗糖酶中的一种或二种。所述的NAD(P)H依赖的甘露醇脱氢酶,酶学分类号为EC1.1.1.138或EC1.1.1.67,选自但不限于蘑菇属来源的甘露醇脱氢酶、假丝酵母属来源的甘露醇脱氢酶、乳杆菌属来源的甘露醇脱氢酶、明串珠菌属来源的甘露醇脱氢酶、假单胞菌属来源的甘露醇脱氢酶;所述的NAD(P)+依赖型的葡萄糖脱氢酶,酶学分类号为EC1.1.1.118、EC1.1.1.119,选自但不限于芽孢杆菌属来源的葡萄糖脱氢酶、假单胞菌属来源的葡萄糖脱氢酶、葡糖杆菌属来源的葡萄糖脱氢酶中的一种或二种。所述的金属阳离子为钙、钠、钾、锌、(亚)铁离子中的一种或两种以上

具体地,所述的以蔗糖或葡萄糖和果糖为原料生产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的生物催化体系为表达有蔗糖酶(EC3.2.1.26,)、NAD(P)H依赖的甘露醇脱氢酶(EC1.1.1.138或EC1.1.1.67)、NAD(P)+依赖型的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.118或EC1.1.1.119)的一种或多种细胞,及利用细胞内NADH、NAD+、NADPH和NADP+,以及细胞自身代谢再生NAD+为NADH或NADP+为NADPH的细胞自身代谢辅酶再生系统,组成的生物催化体系。或者,以蔗糖或葡萄糖和果糖为原料生产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的所述的生物催化体系可以为不依赖活体细胞的蔗糖酶、NAD(P)H依赖的甘露醇脱氢酶、NAD(P)+依赖型的葡萄糖脱氢酶及NADH、NAD+、NADPH和NADP+,组成的生物催化体系。

该技术路线以廉价的蔗糖或葡萄糖和果糖的混合物为原料,可在反应体系中实现葡萄糖向葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的高效转化,同时实现果糖向甘露醇的高效转化。

附图说明

图1反应原理图。

具体实施方式

以下结合具体实施例,对本发明做进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

如图1所示,本发明的甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的生产方法,以蔗糖或葡萄糖和果糖为底物,通过由蔗糖酶、NAD(P)H依赖的甘露醇脱氢酶、NAD(P)+依赖型的葡萄糖脱氢酶和辅酶构成的生物催化体系催化生产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐。

实施例1

于1L水体系中,葡萄糖的终质量浓度为10%,果糖的终质量浓度为10%,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADP+)的终浓度为100mM,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的终浓度为100mM,氯化钙浓度为0.6M,反应pH为7.0,反应温度为30度,Agaricus bisporus来源的NADPH依赖型的甘露醇脱氢酶的量1000U/L,Gluconobacter oxydans来源的NADP+依赖型的葡萄糖脱氢酶的量10000U/L,反应12h,反应体系中甘露醇浓度为7.9%,葡萄糖酸钙74g。

实施例2

于1L水体系中,蔗糖的终质量浓度为10%,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的终浓度为100mM,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的终浓度为100mM,氯化钙浓度为0.6M,反应pH为7.0,反应温度为30度,蔗糖酶的量为300U/L,Agaricus bisporus来源的NADPH依赖型的甘露醇脱氢酶的量1000U/L,Gluconobacter oxydans来源的NADP+依赖型的葡萄糖脱氢酶的量10000U/L,反应12h,反应体系中甘露醇浓度为3.9%,葡萄糖酸钙31g。

实施例3

于1L水体系中,葡萄糖的终质量浓度为10%,果糖的终质量浓度为10%,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的终浓度为100mM,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADH)的终浓度为100mM,氯化钙浓度为0.6M,反应pH为7.0,反应温度为30度,Lactobacillus brevis来源的NADH依赖型的甘露醇脱氢酶的量1000U/L,Bacillus subtilis来源的NAD+依赖型的葡萄糖脱氢酶的量10000U/L,反应12h,反应体系中甘露醇浓度为8.4%,葡萄糖酸钙87g。

实施例4

于1L水体系中,葡萄糖的终质量浓度为10%,果糖的终质量浓度为10%,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的终浓度为100mM,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADH)的终浓度为100mM,氯化锌浓度为0.6M,反应pH为7.0,反应温度为30度,Lactobacillus brevis来源的NADH依赖型的甘露醇脱氢酶的量1000U/L,Bacillus subtilis来源的NAD+依赖型的葡萄糖脱氢酶的量10000U/L,反应12h,反应体系中甘露醇浓度为8.4%,葡萄糖酸锌8.9%。

实施例5

于1L水体系中,葡萄糖的终质量浓度为10%,果糖的终质量浓度为10%,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADH)的终浓度为200mM,氯化钙浓度为0.6M,反应pH为7.0,反应温度为30度,Lactobacillus brevis来源的NADH依赖型的甘露醇脱氢酶的量1000U/L,Bacillus subtilis来源的NAD+依赖型的葡萄糖脱氢酶的量10000U/L,反应12h,反应体系中甘露醇浓度为8.2%,葡萄糖酸钙76g。

实施例6

于1L水体系中,葡萄糖的终质量浓度为10%,果糖的终质量浓度为10%,氯化钙浓度为0.6M,反应pH为7.0,反应温度为30度,共表达有Lactobacillus brevis来源的NADH依赖型的甘露醇脱氢酶与Bacillus subtilis来源的NAD+依赖型的葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌全细胞催化剂5g(湿重),反应12h,反应体系中甘露醇浓度为92%,葡萄糖酸钙86g。

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