本发明属于三色堇分子育种
技术领域：
：，具体涉及三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法。
背景技术：
：：三色堇(Viola×wittrockiana)，属于堇菜科(Violaceae)堇菜属(Viola)。其花型可爱多变，花色艳丽，品种丰富，花期较长，具有“花坛皇后”的美誉，是冬春花坛、花境、盆花及图案等的首选材料之一；同时，由于其耐寒性较强，可以通过调节播种期来调控三色堇的盛花期，使其在元旦前后开花，因此，有广泛的应用价值。自1983年第一例转基因植物问世以来，转基因植物研究已在培育抗病植物、抗虫植物、提高作物品质及产量、提高作物抗逆性等方面发挥了巨大的作用。然而目前由于受植物转基因方法、受体材料等的限制，利用转基因技术进行植物品质改良受到了一定限制，尤其是对三色堇。近年来，三色堇性状的改良及新品种的繁育都依靠传统的杂交育种(王健和包满珠2007；杜晓华等2010；李清斌等2014；杨迪等2015)，无法通过转基因的手段进行改良，因其再生研究历经多年的努力，仍未获得突破性进展，尚无成熟的再生体系。前人以三色堇的根、下胚轴和子叶片段分别作为外植体诱导出愈伤组织，但由子叶片段得到的愈伤逐渐转变成绿色玻璃化结构，不能继续生长，最后枯萎；根和下胚轴诱导出的愈伤无法得到不定芽(BabberandKulbhushan1991)。卢兴霞(2006)以三色堇花药作为外植体诱导出愈伤，但是愈伤组织极易生根，无法诱导出芽。刘霞(2007)用六种不同的三色堇器官作为外植体诱导再生，只有顶芽较易存活和增殖。有报道以三色堇的叶柄为外植体初步建立了再生体系：方法是通过叶柄首先诱导出愈伤，依次在两种继代培养基上进行培养，然后在分化培养基上诱导分化不定芽，分化出的不定芽在增殖培养基上壮芽和扩增，最后诱导生根(WangandBao2007)。但这一方案步骤复杂，费时费力，难以重复。张其生(2009)初步建立了三色堇的快繁体系，并在Wang的基础上研究建立了以三色堇无菌苗节间茎段和叶柄为外植体的再生体系，也尝试过叶片，但没有成功。由于三色堇的节间茎段和叶柄增殖困难，且易产生玻璃化苗，仍然难以应用。李春燕(2011)在前人的基础上试图解决三色堇再生过程中增殖困难和玻璃化问题，通过改良培养基后再生率有所提高，但三色堇的增值材料玻璃化更为严重，需多次继代去除玻璃化，但多次继代极大影响了无菌苗的再生能力，所以解决问题效果不理想。另外李春燕还尝试用叶片、叶柄和节间茎段为外植体诱导愈伤组织，但无法诱导出绿色愈伤组织，转化效果不理想。至此，三色堇这种再生顽拗种的高效再生体系仍然无法建立。至今三色堇无论采用什么材料，无论基于直接还是间接再生的遗传转化，都没有转化成功的案例，所以没有成功建立三色堇遗传转化体系的报道。此外，到目前为止尚未检索到有关三色堇转基因的方法的报道，特别是没有检索到有关利用三色堇种子浸泡法直接导入外源基因转化三色堇获得新植物的方法的报道。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法。本发明是这样实现的：一种三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法，采用已露白的三色堇种子作为遗传转化的受体材料，经根癌农杆菌浸泡介导目的基因导入受体，利用卡那霉素作为选择剂对转化后的植株进行筛选，通过载体上的35S启动子和目的基因设计特异引物进行PCR检测，同时对阳性植株进行表型观测，筛选得到转基因植株。本发明的具体步骤如下所述：一种三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法，采用已露白的三色堇种子作为遗传转化的受体材料，经根癌农杆菌浸泡介导目的基因导入受体，利用卡那霉素作为选择剂对转化后的植株进行筛选，通过载体上的35S启动子和目的基因设计特异引物进行PCR检测，同时对阳性植株进行表型观测，筛选得到转基因植株，具体步骤如下所述：(1)构建含有目的基因的重组质粒并导入根癌农杆菌，其中：重组质粒含NPTⅡ基因，具备卡那霉素抗性，目的基因由35S启动子驱动(详见实施例1)。(2)将55±5粒三色堇种子装入离心管，加入适量蒸馏水，将种子振荡至管底，将离心管置于40℃水浴15min后自然冷却，黑暗下静置23h后弃管内蒸馏水，加入80mg/L赤霉素(GA3)溶液，振荡使种子与溶液充分接触，黑暗静置1h后弃管内溶液，将种子倒在双层纱布上，用蒸馏水冲洗下，同时搓去种子表面胶质，再将种子用双层无菌纱布包裹，置于10％H2O2振荡消毒15min，洗净后将种子平铺于内垫湿润双层纱布的培养皿中，28℃下暗培养，每隔24h观察种子状态，添加适量蒸馏水保持湿润。当种子萌发使褐色的种皮破裂露白，胚根伸长至2～4mm，即得到露白的三色堇种子。(3)将已露白的三色堇种子浸入含有目的基因的重组根癌农杆菌菌液中，具体步骤：离心管中预先加入重组农杆菌菌液，将三色堇种子从培养皿中移到1.5mL离心管中，使农杆菌菌液刚刚浸没所有种子，轻微振荡离心管，然后倾斜，使种子受到农杆菌浸泡的同时能进行呼吸作用；浸泡后用蒸馏水清洗种子4～5次，继续平铺于培养皿中暗培养；所述重组根癌农杆菌菌液OD600为0.4；所述的重组根癌农杆菌菌液中浸泡1.5h；所述农杆菌菌液中卡那霉素的浓度为100mg/L；(4)将步骤(3)中暗培的露白种子于子叶脱离种皮后置于光照强度2000lx下培养，子叶变绿后移至花盆中，至真叶长出4-5片时可进行抗性筛选；(5)用卡那霉素进行抗性筛选：将步骤(4)中的幼苗用350mg/L卡那霉素进行喷施，获得抗性苗；(6)通过载体上的35S启动子和目的基因设计特异引物，对步骤(5)获得的抗性苗进行PCR检测，获得阳性植株(详见实施例1)。(7)对步骤(6)中的阳性植株进行表型观测，与对照(野生型拟南芥植株)进行比较，获得表型发生明显改变的转基因植株。本发明的有益效果如下：(1)本发明克服了三色堇再生顽拗的局限性，避免了常规遗传转化基于再生体系所需的组织培养等程序，直接通过种子浸泡法转化外源基因，为定向改良三色堇的性状提供了新的育种方法。(2)本发明转化三色堇的方法不经过再生培养阶段，大大简化了实验操作，降低了转化成本。(3)本发明转化周期短，露白种子浸泡后长出子叶即可移栽上盆，仅需15天左右。附图说明序列表SEQIDNO：1是本发明涉及的AtWUS基因全长序列(AtWUS转基因转的是全长)。序列表SEQIDNO：2是本发明涉及的驱动AtWUS基因表达的35S启动子序列。序列表SEQIDNO：3是本发明涉及的转基因抗性植株PCR检测35S启动子特异片段。序列表SEQIDNO：4是本发明涉及的转基因抗性植株PCR检测AtWUS基因特异片段。图1：拟南芥AtWUS基因克隆PCR检测结果。附图标记说明：泳道M：DNAMarker；泳道1-2。图2：本发明所用载体质粒pCAMBIA2300s图谱。图3：本发明构建的重组质粒pCAMBIA2300s-35S-AtWUS图谱。图4：本发明构建的重组载体质粒pCAMBIA2300s-35S-AtWUS双酶切检测图。图5：三色堇露白种子的生长状态。图6：利用卡那霉素(350mg/L)抗性筛选10天后三色堇野生型(非转基因)生长状况。图7：三色堇转AtWUS基因抗性苗PCR阳性检测。附图标记说明：泳道M：DNAMarker；1-21对应抗性苗株系编号；CK为野生型植株对照；D为阴性水对照；P为阳性质粒对照。图8：三色堇转基因植株叶片诱导10天的愈伤组织生长情况。附图标记说明：图8中的A图是叶盘法接种诱导三色堇叶片再生；图8中的B图是经过诱导的野生型三色堇叶片，无明显愈伤组织形成，图8中的C图是经过诱导的转基因三色堇叶片，可见愈伤组织形成。图9：AtWUS农杆菌种子浸泡法侵染时间对三色堇转化阳性率的影响。具体实施方式以下实施例进一步定义本发明。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。现将本发明应用的化学或生物化学物质的缩略表列于表1。表1本发明应用的化学或生物化学物质的缩略表实施例1农杆菌介导的三色堇种子浸泡法直接转化AtWUS基因1)含有目的基因的重组根癌农杆菌的构建(1)AtWUS基因克隆登陆NCBI查询拟南芥WUSCHEL(AtWUS)基因CDS序列(登陆号为NM_127349.3，长度为879bp)设计特异引物对，上游引物(PrimerF1)为：ATGGAGCCGCCACAGCAT，下游引物(PrimerR1)为：CTAGTTCAGACGTAGCTC。用拟南芥顶芽提取的总RNA反转录成cDNA第一链，将稀释后的cDNA作为模板(TemplateDNA)，用上述特异引物进行PCR扩增：PCR反应体系为：PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃30s，64℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增得到AtWUS基因特异DNA片段，长度为879bp(见序列表SEQIDNO:1)。(2)AtWUS表达载体的构建上述PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，16℃过夜。连接片段热激大肠杆菌，将菌液均匀地涂在含有100mg/L氨苄霉素的培养皿上，37℃培养12h，将单菌落进行PCR扩增，挑选条带明亮整齐的单菌落，于37℃添加100mg/L氨苄霉素的液体LB(0.1％NaCL+0.05％酵母提取物+0.1％蛋白胨)，摇菌送武汉擎科创新生物科技有限公司测序，将测序正确的菌落摇菌提取质粒。对比pMD18-T载体(购自宝生物工程大量有限公司)和pCAMBIA-2300s表达载体(华中农业大学园艺林学学院包满珠教授惠赠，见图2)，选取合适的SalⅠ和SacⅠ两个酶切位点进行酶切：酶切反应体系为：酶切产物琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，将AtWUS和pCAMBIA2300s(见图2)进行连接，16℃过夜。连接产物热激大肠杆菌，将单菌落进行PCR扩增，选取条带正确的单菌落摇菌送武汉擎科创新生物科技有限公司测序，测序正确的单菌落摇菌，用无内毒素质粒大提试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取质粒，将质粒酶切，体系同上，酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，质粒酶切片段大小正确的pCAMBIA2300s-35S-AtWUS载体(见图3)即构建成功。按菌液700μL，50％甘油300μL保存菌液，-80℃保存备用。(3)AtWUS表达载体转化农杆菌载体构建过程中已获得含有pCAMBIA2300s-35S-AtWUS载体的大肠杆菌。将载体质粒电转化农杆菌EHA105(农杆菌EHA105菌株为常用菌株，转化方法参照Mahmood等(MahmoodT,ZarT,SaqlanNaqviS(2008)MultiplepulsesimproveelectroporationefficiencyinAgrobacteriumtumefaciens.ElectronJBiotechnol11:145–148)报道的方法，具体步骤如下：①电转杯先后用75％乙醇和无水乙醇各润洗3次，晾干后冰浴20min；②从-70℃冰箱内取出一管农杆菌EHA105感受态细胞，置于冰上解冻；③加入1μL质粒于冻融的农杆菌感受态中，轻轻吸打混匀，冰浴30min；④准备好电转仪，电压为1800V，将混合液转移至电击杯中，快速连续按两下启动键，听到“滴”声后取出；⑤迅速取出电转杯，加入400μL液体LB，吸打混匀后转入到无菌的1.5mL离心管中，28℃，200r/min培养lh；⑥取60μL的转化菌液均匀涂布在含100mg/L卡那霉素的固体LB培养皿上，倒置，28℃恒温培养8-12h；⑦用牙签挑取培养皿上长得大而圆的单菌落转入另一相同抗性的培养皿中作一备份，同时进行菌落PCR扩增检测。⑧挑选条带明亮的单菌落于液体LB培养基上，于28℃摇菌至OD600为0.4，然后按菌液700μL，50％浓度的甘油300μL的比例于-80℃下保存菌液。2)种子的露白处理将55±5粒三色堇种子装入离心管，加入适量蒸馏水，将种子振荡至管底，将离心管置于40℃水浴15min后自然冷却，黑暗下静置23h后弃管内蒸馏水，加入80mg/L赤霉素(GA3)溶液，振荡使种子与溶液充分接触，黑暗静置1h后弃管内溶液，将种子倒在双层纱布上，用蒸馏水冲洗下，同时搓去种子表面胶质，再将种子用双层无菌纱布包裹，置于10％H2O2振荡消毒15min，洗净后将种子平铺于内垫湿润双层纱布的培养皿中，28℃下暗培养，每隔24h观察种子状态，添加适量蒸馏水保持湿润，共重复三次。当种子萌发使褐色的种皮破裂露白，胚根伸长至2～4mm，即得到露白的三色堇种子。3)浸种侵染处理将步骤2)中露白种子置于1)中的农杆菌菌液中浸泡1.5h，具体步骤：将三色堇种子从培养皿中移到1.5ml离心管中，加入农杆菌菌液至刚刚浸没所有种子，轻微振荡离心管，然后倾斜，使种子受到农杆菌浸泡的同时能进行呼吸作用；浸泡后用蒸馏水清洗种子4～5次，继续平铺于培养皿中暗培养；所述农杆菌菌液中卡那霉素的浓度为100mg/L。4)幼苗移栽上盆待子叶脱离种皮后置于光下，子叶变绿后移栽入直径8cm的花盆中，每盆24棵萌发的幼苗，置于每天光照14h、光强2000Lx的光照培养箱。5)卡那霉素筛选抗性苗当幼苗真叶长出4-5片时用350mg/L卡那霉素溶液进行喷施，待野生型(非转基因)幼苗95％以上顶芽都黄化之后，去掉处理的黄化苗，留下抗性苗。6)PCR分子检测(1)DNA提取选取抗性苗顶部除顶芽外的幼嫩叶片进行采样，提取叶片总DNA，方法参照Chen和Ronald(ChenDH,RonaldPC(1999)ArapidDNAminipreparationmethodsuitableforAFLPandotherPCRapplications.PlantMolBiolRep17:53-57)，使用NanoDrop2000C微量紫外分光光度计检测浓度，将DNA浓度调整到100～150ng/μL的范围内。(2)特异引物设计以重组质粒上位于AtWUS上游的启动子35S的序列(见序列表SEQIDNO:2，长度为866bp)和AtWUS基因序列(见序列表SEQIDNO:1，长度为879bp)为模板，上游引物PrimerF2为：5’-TCCAGTATGGACGATTCAAGG-3’，下游引物PrimerR2为：5’-TGTTTGCCCATCCTCCAC-3’。(3)PCR扩增除引物外，PCR反应体系和条件均同上，每次检测都设有阴性对照(即野生型非转基因)、阳性对照(目的基因质粒)和水。反应完成后，取5μL反应产物于1.0％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色5min，紫外灯下观察结果，并用凝胶成像系统(GelLogic200ImagingSystem)拍照保存。PCR扩增得到DNA片段包含35S特异片段(见序列表SEQIDNO:3，序列长度为631bp)和用于PCR检测AtWUS基因的特异片段(见序列表SEQIDNO:4，长度为637bp)，共计1238bp(图7)。7)转基因植株表型鉴定目的基因AtWUS的功能是使周围细胞保持干细胞的特性，提高分生组织活性。取上述转基因三色堇阳性苗及野生型三色堇对照植株叶片与叶柄作为外植体，每个阳性苗3-4片叶片，叶片生长位置为由顶芽向下数4-10片，沿叶柄与茎连接处向叶片位移2-3mm切下叶片和叶柄，确保叶柄上没有腋芽。采用75％酒精消毒35s、0.1％升汞消毒10min。用无菌水洗3-4次，每次3min。将消过毒的叶片在无菌滤纸上，沿叶片边缘切下，叶柄和叶基部切下作为一个外植体，剩下的部分沿叶中脉二分之一处垂直方向切下，为另外两个外植体。于附加0.01mg/LNAA和2.0mg/L6-BA的MS培养基上诱导叶片再生，10d后可观察到阳性植株叶盘边缘有明显愈伤组织的形成，而对照没有，确定外源基因的导入促进了三色堇愈伤组织的形成(图8)。8)转化结果本实施例共侵染三色堇种子170粒，得到转化幼苗148株，移栽至花盆148株，成活148株；卡那霉素筛选148株，18株表现抗性；取18株抗性苗进行PCR检测，阳性苗11棵。移栽成活率＝移栽成活株数/移栽株数＝148/148＝100％阳性率＝PCR检测阳性苗数目/抗性苗数目＝11/148＝7.43％转化效率＝PCR检测为阳性苗数/侵染种子数＝11/170＝6.47％本发明从浸种到上盆进行常规栽培仅需15天，不经过再生组织培养的过程，可直接移栽，成活率高。实施例2对比试验实施例1)三色堇野生型幼苗对卡那霉素浓度的敏感性(1)试验设计本实施例所用质粒为pCAMBIA2300s，该质粒携带有选择标记基因为NPTⅡ，对卡那霉素具有抗性。为确定适宜的卡那霉素筛选浓度，本试验比较了三色堇在6个不同浓度卡那霉素处理后的黄花率和存活率。(2)幼苗培育取三色堇种子50-60粒装入10mL离心管，加入适量蒸馏水，将种子振荡至管底，离心管于40℃水浴15min后自然冷却，黑暗静置23h后弃管内蒸馏水，加入适量80mg/LGA3溶液，振荡后黑暗静置1h，将种子置于双层纱布，蒸馏水冲洗下搓去种子表面胶质，将种子用双层无菌纱布包裹，置于10％H2O2振荡消毒15min，洗净后将种子平铺于铺有湿润双层纱布的培养皿，室温暗培，每隔24h观察种子状态，根据情况添加适量蒸馏水保持湿润。待种子萌发真叶完全展开时，移入8cm直径盆内，每盆24棵萌发的幼苗，置于每天光照14h、光强2000Lx的光照培养箱。(3)试验处理待幼苗长出4-5片真叶时，分别用0mg/L、150mg/L、250mg/L、350mg/L、450mg/L和550mg/L卡那霉素溶液喷施，每天每盆12±1mL，每个处理重复3盆。观察三色堇幼苗生长情况，10-12d后统计黄化率，最后统计存活率，并进一步进行多重比较分析。(4)试验结果结果表明(表2)，整体上卡那霉素的浓度与幼苗的黄花率和存活率呈负相关的关系，卡那霉素浓度到达550mg/L时，幼苗全部死掉。为了让抗生素既能抑制绝大多数非阳性植株的生长，又不会让阳性植株死亡，本实施例采用350mg/L卡那霉素作为筛选抗性苗的核实浓度(保证幼苗的存活率控制在12.5％左右)结果见图6。表2三色堇野生型幼苗各卡那霉素浓度筛选结果方差分析注：表2中数值＝平均值±标准误，LSD测验比较各处理间的差异，不同字母表示数据间差异显著(P＝0.05)。2)农杆菌侵染时间对AtWUS基因转化三色堇的阳性率影响(1)试验设计外源基因农杆菌种子浸泡法转化三色堇试验中，AtWUS基因侵染时间设定了0.5h、1.0h和1.5h三个处理，每个处理55±5粒种子，重复三次。(2)侵染方法将保存在-80℃的重组AtWUS农杆菌取出，取10μL于10mL已高压灭菌的液体LB培养基中(含有100mg/L卡那霉素)，28℃，200r/min暗处理摇菌，待菌液OD值0.4时可进行侵染。将种子暗培后种子萌发会使褐色的种皮破裂露白，胚根伸长，胚根长度在3±1mm时将种子从培养皿中移到1.5mL离心管中，离心管中加入适量体积的农杆菌菌液，刚刚浸没所有种子，轻微振荡离心管，然后倾斜，使种子受到农杆菌浸泡的同时能进行呼吸作用。浸泡不同时间(0.5h、1.0h和1.5h)后用蒸馏水清洗种子4-5次，继续平铺于培养皿中暗培养。(3)抗性筛选真叶脱离种皮后移至光下，真叶变绿后移至8cm直径花盆中，置于每天光照14h、光强2000Lx的光照培养箱。待幼苗长出4-5片真叶时，用350mg/L卡那霉素溶液喷施，每天每盆12±1mL，至对照(未侵染种子长出的植株)幼苗存活率至12.50％为止。(4)阳性鉴定以PrimerF2和PrimerR2为特异引物进行PCR扩增，检测获得的抗性苗，根据条带的长度判断阳性株系，计算阳性率＝PCR检测阳性苗数目/抗性苗数目。(5)比较结果结果表明：1.0h和1.5h条件下都获得了阳性苗，且侵染时间越长阳性苗数目越多，其中侵染1.0h阳性率达2.78％；侵染1.5h阳性率达7.41％。方差分析表明，不同侵染时间下，AtWUS基因转化三色堇的阳性率差异极显著，多重比较表明1.5h时阳性率最高(图9)。试验发现，浸泡侵染时间越长，植株上盆后土壤返菌越严重，从而明显影响生长势，因此最终选定侵染时间为1.5h。3)质粒介导的三色堇转基因的效果(1)试验设计比较大肠杆菌质粒2种浓度和2种负压条件下三色堇种子浸泡法转基因的效率，共计4个处理，每个处理55±5粒种子，重复三次。(2)试验处理将含有pCAMBIA2300s-35S-AtWUS载体的大肠杆菌质粒，用TE缓冲液稀释，浓度分别调整为200ng/μL和400ng/μL。露白三色堇种子的处理同实例1，在离心管中加入适量体积的不同浓度质粒溶液，刚刚浸没所有种子，轻微振荡离心管，然后倾斜，使种子受到农杆菌浸泡的同时能进行呼吸作用。打开离心管盖，放入真空箱，调整不同的负压条件(-0.035MPa和-0.070Mpa)，处理6h后将种子用蒸馏水洗3-4次，继续平铺于培养皿中暗培养。真叶脱离种皮后移至光下，真叶变绿后移至8cm直径花盆中。后续处理、检测与实例1相同。(3)实验结果结果表明，以上4种处理的外源基因质粒种子浸泡法转化三色堇获得了抗性植株，但无阳性苗。而农杆菌介导的种子浸泡法转化三色堇阳性率最高平均值能达到7.41％。因此采用外源基因种子浸泡法，以农杆菌作为转化介质较好。当前第1页1 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