本发明涉及生物农药的提取、纯化方法，具体涉及从发酵液中提取米尔贝霉素，继而对其进行纯化，获得高纯度的米尔贝霉素的方法。
背景技术：
米尔贝霉素(milbemycins)于1967年由日本的sankyo公司的Aoki等人从Streptomyceshygroscopicussugsp,aureolacrimosus发酵液中分离出的一种具有十六环内酯混合物的抗生素。米尔贝霉素对各种螨类都有较高的防治效果。该天然产物的20种组分大多数对农业害虫具有广谱防治活性，如蚜、螨、黄褐天幕毛虫、肠道寄生虫以及其他危害作物及家畜的寄生虫。该药对害虫作用强烈，用药量少，对人畜安全，不污染环境，只杀害虫，不伤害天敌，也不易产生抗性，是目前最有前途的广谱、高效、新型无交叉抗性的生物杀虫剂。
通过多年的结构改良，于1986年正式以商品名米尔贝肟(Milbemycin oxime)上市。米尔贝肟是米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的肟衍生物，米尔贝肟的使用收到了很好的效果。有专家预测，它可以替代目前用于作物保护的有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类及有机氯类化合物。
目前米尔贝肟的主要制备途径是：从发酵液中提取米尔贝霉素A3和A4，然后经过半合成得到米尔贝肟。要进一步提高和推广米尔贝肟的使用，目前需主要从三方面进行技术改进：1、对菌种、发酵工艺进行改良，提高发酵液中米尔贝霉素A3和A4的单位；2、对A3和A4的提取、纯化工艺进行改进以提高收率和质量；3、改进半合成工艺，提高合成收率。通过三个生产阶段的技术提高，降低米尔贝肟的生产成本，为推广米尔贝肟在作物保护中的使用打下良好基础。
目前关于米尔贝霉素，公开的专利和专利申请主要集中在两个方面：1、对于米尔贝霉素进行半合成的结构改良的工艺研究；2、对结构改良后的衍生物的制剂工艺及其使用方法研究。尚未见到关于从发酵液中提取、纯化米尔贝霉素的专利研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法，尤其是米尔贝霉 素的A3和A4两个组分。本发明的技术方案如下：
一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法，包括以下步骤：
1)将米尔贝霉素发酵液进行絮凝、过滤，得到菌丝渣；
2)用非水溶性溶剂萃取菌丝渣，得到一次萃取液；
3)将一次萃取液依次进行酸洗、浓缩、碱处理，然后用二次萃取溶剂萃取，得到二次萃取液；
4)对二次萃取液进行酸洗，降温沉淀，过滤取滤液得一次纯化上柱液；
5)用硅胶柱层析分离一次纯化上柱液，收集得一次层析液；
6)对一次层析液中的米尔贝霉素进行衍生处理，然后用碱洗涤，浓缩，结晶，干燥晶体，再将晶体溶解，过滤取滤液得衍生纯化上柱液；
7)用硅胶柱层析分离衍生纯化上柱液，收集得二次层析液；
8)浓缩二次层析液，结晶，分离，得到米尔贝霉素衍生物晶体；
9)将米尔贝霉素衍生物水解、萃取、浓缩、结晶、干燥得到米尔贝霉素A3和A4含量大于80％的米尔贝霉素。
上述步骤1)是对米尔贝霉素发酵液进行絮凝和过滤。首先将米尔贝霉素发酵液加热，通常加热至60～80℃，保温30～60分钟，同时搅拌；然后加入絮凝剂进行絮凝，絮凝时间一般为30～60分钟；可采用的高分子絮凝剂例如有机絮凝剂聚丙烯酰胺PAM，无机絮凝剂例如聚合氯化铝、聚合硫酸铁等，也可以是这些絮凝剂不同比例的混合物；过滤前通常加入助滤剂，可选用的助滤剂例如：珍珠岩粉助滤剂、硅藻土助滤剂，用量为发酵液体积的0～3w/v％，优选为1～2w/v％，助滤剂粒度通常在40～80目；过滤得到湿菌丝渣。
上述步骤2)对菌丝渣进行萃取：所述非水溶性溶剂为低分子酯类溶剂，优选醋酸丁酯、乙酸乙酯等；非水溶性溶剂的用量优选为每克湿菌丝渣2.5～5mL，萃取温度20～50℃，时间2～5小时，过滤收集萃取液；可重复对菌渣萃取，合并收集萃取液，。
上述步骤3)中，对一次萃取液进行酸性洗涤的酸优选为盐酸或硫酸的水溶液，浓度为0.05-0.2mol/L，洗涤温度15-30℃，通常是在室温下，加入一次萃取液体积50％的酸性洗水，搅拌洗涤10～20分钟，静置40～60分钟，分离，排尽酸性洗涤废水。将酸洗后的一次萃取液进行真空浓缩，温度控制在50～90℃蒸尽萃取溶剂；然后加碱处理，pH控制在11～13之间，一般加入浓缩物体积的1～1.5倍的0.3mol/L的NaOH溶液，搅拌得到均一的粘稠料液；二次 萃取溶剂选用低分子量的烃类溶剂，优选庚烷、己烷、甲苯、二甲苯等，控制萃取液中的米尔贝霉素单位为0.5-2.0万μg/mL，搅拌萃取30～40分钟，然后静置、分离，萃取两次，合并萃取液。
上述步骤4)通过浓缩或稀释二次萃取液，控制米尔贝霉素单位8000～10000μg/mL(米尔贝霉素单位指米尔贝霉素的w/v浓度，下同)，用酸性洗水洗涤优选采用0.05mol/L的盐酸或硫酸水溶液，搅拌洗涤10～15分钟，静置0.5～1小时，分离排尽洗涤废水；然后降温至8～10℃，静置沉淀8～10小时，过滤分离沉淀，收集滤液得一次纯化上柱液。
上述步骤5)进行一次层析所用硅胶优选为60～150目的干硅胶，层析柱的径高比为1:6；可用二次萃取溶剂浸泡干硅胶后装入层析分离柱。上柱：将一次纯化上柱液按1VB/小时的流量，1-2g/mL硅胶吸附量进行吸附；解析：解析液为裝柱用二次萃取溶剂∶醋酸丁酯(或乙酸乙酯)体积比为6:4～7:3的混合溶液，解析流量0.6-1.0VB/小时，用量5-6倍VB体积，收集米尔贝霉素A4色谱峰面积比≥30％(注：HPLC检测色谱峰面积比)的解吸液。
上述步骤6)用衍生试剂、酸束缚剂对一次层析液进行衍生反应，衍生试剂优选为对硝基苯甲酰氯、邻硝基苯甲酰氯和/或苯甲酰氯，酸束缚剂优选为吡啶、二乙胺和/或三乙胺。在本发明的一个实施例中，将一次层析液进行真空浓缩至米尔贝霉素单位为2-4万μg/mL，控制温度28～30℃，加入米尔贝霉素总当量的2～2.5倍当量的衍生试剂和2.5～3倍当量的酸束缚剂，搅拌反应2～4小时，用HPLC检测控制反应时间，待色谱检测中米尔贝霉素的峰面积小于1％，即可终止反应。然后对反应液进行洗涤，可加入于反应液等体积的5％NaHCO3溶液，搅拌洗涤10～15分钟，静置30～40分钟，分离废水。对洗涤后的反应液进行真空浓缩，降温结晶，控制结晶终点温度5～10℃，分离收集潮晶，真空干燥除去有机溶剂；用二次萃取溶剂溶解上述衍生物结晶，控制溶液浓度1.5～3w/v％，过滤得衍生纯化上柱液。
上述步骤7)进行二次层析所用硅胶优选为60～150目的干硅胶，层析柱的径高比为1:6，可用二次萃取溶剂浸泡干硅胶20-30分钟，装入层析分离柱。上柱：将衍生纯化上柱液按1VB/小时的流量，2～3g/mL硅胶吸附量进行吸附；解析：解析液为裝柱用的二次萃取溶剂∶醋酸丁酯(或乙酸乙酯)提交比为6:4～7:3的混合溶液，解析流量0.6-1.0VB/小时，用量5-6倍VB体积，收集米尔贝霉素A4面积比≥50％(HPLC检测色谱峰面积比)的解吸液。
上述步骤8)将二次层析液进行真空浓缩，得粘稠物，加入二次萃取溶剂剂，控制温度为50-60℃，米尔贝霉素衍生物单位为8-10万μg/mL，然后降温结晶，控制结晶终点温度5～10℃，分离收集潮晶，于50-60℃真空干燥除去有机溶剂。
上述步骤9)将干燥后的米尔贝霉素衍生物用水溶性有机溶剂溶解，例如二氧六环、四氢呋喃、乙醇等，控制温度5～10℃，加入碱液进行水解反应，所用碱液优选为2～4mol/L的NaOH、KOH溶液，水解时间一般为5～8小时，HPLC检测控制水解底物的色谱峰面积残留小于1％即可终止水解。向水解液中加入其2～3倍体积的纯化水稀释，然后用有机溶剂萃取多次，优选地，所用有机溶剂为庚烷、甲基环己烷或环己烷；分离收集有机萃取相，真空浓缩，降温结晶，终点温度控制5～10℃，分离晶体，于50-60℃干燥得米尔贝霉素，其中米尔贝霉素A4和A3的含量≥85％。
本发明提取并纯化米尔贝霉素的方法，对生产设备的要求较低，条件温和，简单易操作，获得的米尔贝霉素纯度高，适宜进行规模化生产、经济效益明显。
具体实施方式
实验原材料和设备：
米尔贝霉素发酵液：重庆大新药业股份有限公司生产
米尔贝霉素的发酵生产过程：
将培养基调pH为7.0，然后121℃灭菌30min备用。
将制备好的链霉菌种子液(菌液浓度18-25％，为离心测得的菌沉淀的体积百分含量)1L接种于30L已制备好的发酵培养基中。28℃培养220-250小时，根据HPLC色谱检测计算发酵液中的米尔贝霉素单位。
工业盐酸：10-11mol/L，重庆天原化工厂
NaOH：含量≥95％，重庆三阳化工有限公司
聚合氯化铝：AL2O3≥28％，巩义市永昌净水材料厂
醋酸丁酯：含量≥95％，重庆川东化工有限公司
醋酸乙酯：含量≥95％，重庆川东化工有限公司
旋转蒸发器RE5220：上海亚荣生化仪器厂
JJ-1电动搅拌器：江苏金坛荣化仪器制造公司
液相色谱仪LC-2010AHT：日本岛津
实施例1
米尔贝霉素发酵液的絮凝、过滤。取重庆大新药业股份有限公司生产的米尔贝霉素发酵液20L(米尔贝霉素单位980μg/mL)，加热至65℃，保温40分钟，同时搅拌；加入絮凝剂PAM 0.05％W/V，絮凝30分钟；加入400g珍珠岩粉助滤剂，真空抽滤得湿菌丝渣1500g。
实施例2
米尔贝霉素发酵液的絮凝、过滤。取重庆大新药业股份有限公司生产的米尔贝霉素发酵液20L(米尔贝霉素单位1020μg/mL)，加热至80℃，保温30分钟，同时搅拌；加入絮凝剂聚合氯化铝1％W/V，絮凝30分钟；加入400g珍珠岩粉助滤剂，真空抽滤得湿菌丝渣1700g。
实施例3
菌渣萃取：将实施例1得到的1500g湿菌丝渣，加入5L醋酸丁酯，于28-30℃搅拌萃取3.5小时，过滤收集萃取液4.1L；将过滤渣用5L醋酸丁酯重复对菌渣萃取，于28-30℃搅拌萃取2小时，过滤收集萃取液，合并收集萃取液9.2L，即为一次萃取液(米尔贝霉素单位2002μg/mL)。
实施例4
菌渣萃取：将实施例2得到的1700g湿菌丝渣，加入5.2L乙酸乙酯，于28-30℃搅拌萃取3.5小时，过滤收集萃取液4.5L；将过滤渣用5.2L乙酸乙酯重复对菌渣萃取，于28-30℃搅拌萃取2.5小时，过滤收集萃取液，合并收集萃取液9.5L，即为一次萃取液(米尔贝霉素单位1905μg/mL)。
实施例5
在室温下，将实施例3的一次萃取液，加入4.6L 0.1mol/L的盐酸，搅拌洗涤10分钟，静置40分钟，分离排尽酸性洗涤废水。
将酸洗后的一次萃取液，进行真空浓缩，温度控制50-90℃，蒸尽醋酸丁酯，得浓缩物950g，加入1.0L 0.3mol/L的NaOH溶液，搅拌均匀，pH在12；加入庚烷1.0L，搅拌萃取30 分钟，静置、分离，将下层物料用1.0L庚烷进行重复萃取，搅拌萃取40分钟，静置、分离，合并的两次的萃取液，得二次萃取液1.8L(米尔贝霉素单位9050μg/mL)。
将上述1.8L二次萃取液，用1.0L的0.05mol/L的盐酸搅拌洗涤10分钟，静置0.5小时，分离排尽洗涤废水。降温至10℃，静置沉淀10小时，过滤分离沉淀，收集滤液得一次纯化上柱液1.75L(米尔贝霉素单位9020μg/mL)。
实施例6
在室温下，将实施例4的一次萃取液9.2L，加入4.6L 0.05mol/L的硫酸，搅拌洗涤15分钟，静置30分钟，分离排尽酸性洗涤废水。
将酸洗后的一次萃取液，进行真空浓缩，温度控制50-80℃，蒸尽乙酸乙酯，得浓缩物940g，加入1.0L 0.3mol/L的NaOH溶液，搅拌均匀，pH在11；加入己烷1.0L，搅拌萃取30分钟，静置、分离，将下层物料用1.0L己烷进行重复萃取，搅拌萃取30分钟，静置、分离，合并的两次的萃取液得二次萃取液1.7L(米尔贝霉素单位9010μg/mL)。
将上述1.7L二次萃取液，用1.0L的0.05mol/L的硫酸搅拌洗涤15分钟，静置40分钟，分离排尽洗涤废水。降温至8℃，静置沉淀8小时，过滤分离沉淀，收集滤液得一次纯化上柱液1.65L(米尔贝霉素单位8950μg/mL)。
实施例7
用庚烷2.0L浸泡60-150目的干硅胶1500g，搅拌20分钟，装入径高比为1:6的层析分离柱；上柱：将实施例5的1.75L一次纯化上柱液按1VB/小时的流量，上柱；解析：解析液用6:4V/V(庚烷：醋酸丁酯)10L，解析流量0.6VB/小时，收集米尔贝霉素A4色谱峰面积比≥30％的解吸液(HPLC检测的色谱峰面积比)。合并收集的解吸液得一次层析液8.0L(米尔贝霉素单位2010μg/mL)。
实施例8
用己烷2.0L浸泡60-150目的干硅胶1500g，搅拌20分钟，装入径高比为1:6的层析分离柱；上柱：将实施例6的1.65L一次纯化上柱液按1VB/小时的流量，上柱；解析：解析液用7:3V/V(己烷：乙酸乙酯)10L，解析流量1.0VB/小时，收集米尔贝霉素A4色谱峰面积比≥30％的解吸液(HPLC检测的色谱峰面积比)。合并收集的解吸液得一次层析液7.5L(米尔贝霉素单位1960μg/mL)。
实施例9
将实施例7的8.0L一次层析液进行真空浓缩至500mL，控制温度28-30℃，加入米尔贝霉素总当量的2倍当量的衍生试剂对硝基苯甲酰氯和2.5倍当量的酸束缚剂三乙胺，搅拌反应3.5小时，色谱检测中米尔贝霉素的峰面积小于1％终止反应；加入0.5L的5％的NaHCO3溶液，搅拌洗涤15分钟，静置40分钟，分离废水。将洗涤后的反应液进行真空浓缩至250mL，降温、搅拌结晶，控制结晶终点温度8℃，保持5小时，分离收集潮晶，于50-60℃真空干燥除去有机溶剂，得干品42g。用庚烷2.0L溶解结晶物，过滤得衍生纯化上柱液。
实施例10
将实施例8的7.5L一次层析液进行真空浓缩至500mL，控制温度28-30℃，加入米尔贝霉素总当量的2.5倍当量的衍生试剂邻硝基苯甲酰氯和3.0倍当量的酸束缚剂吡啶，搅拌反应4小时，色谱检测中米尔贝霉素的峰面积小于1％终止反应；加入0.5L的5％的NaHCO3溶液，搅拌洗涤15分钟，静置30分钟，分离废水。将洗涤后的反应液进行真空浓缩至270mL，降温、搅拌结晶，控制结晶终点温度8℃，保持5小时，分离收集潮晶，于50-60℃真空干燥除去有机溶剂，得干品45g。用己烷2.0L溶解结晶物，过滤得衍生纯化上柱液。
实施例11
用庚烷2.0L浸泡60-150目的干硅胶1000g，搅拌20分钟，装入径高比为1:6的层析分离柱；上柱：将实施例9的2.0L衍生纯化上柱液按1VB/小时的流量，上柱；解析：解析液用6:4V/V(庚烷：醋酸丁酯)6L，解析流量0.8VB/小时，收集米尔贝霉素A4色谱峰面积比≥50％的解吸液(HPLC检测的色谱峰面积比)。合并收集的解吸液得二次层析液4.8L(米尔贝霉素单位2500μg/mL)。
实施例12
用己烷2.0L浸泡60-150目的干硅胶1000g，搅拌20分钟，装入径高比为1:6的层析分离柱；上柱：将实施例10的2.0L衍生纯化上柱液按1VB/小时的流量，上柱；解析：解析液用7:3V/V(己烷：乙酸乙酯)6L，解析流量0.7VB/小时，收集米尔贝霉素A4色谱峰面积比≥50％的解吸液(HPLC检测的色谱峰面积比)。合并收集的解吸液得二次层析液4.6L(米尔贝霉素单位2350μg/mL)。
实施例13
将实施例11的4.8L二次层析液进行真空浓缩，得粘稠物，加入150mL庚烷，控制温度50-60℃溶解，搅拌、降温结晶，控制结晶终点温度8℃，保持4小时，分离收集潮晶，于50-60℃ 真空干燥除去有机溶剂，得干品25g；将干燥后的米尔贝霉素衍生物用二氧六环500mL溶解，控制温度6-8℃，加入2.0mol/L NaOH溶液进行水解反应8小时，HPLC检测控制水解底物的色谱峰面积残留小于1％终止水解。
向水解液中加入其1000mL纯化水稀释，加入500mL庚烷搅拌萃取米尔贝霉素，分离，再用500mL庚烷萃取一次，分离收集合并庚烷相，真空浓缩至250mL，降温结晶，终点温度控制10℃，分离，于50-60℃干燥得米尔贝霉素12g，含量87.5％(HPLC检测)。
实施例14
将实施例12的4.6L二次层析液进行真空浓缩，得粘稠物，加入150mL环己烷，控制温度50-60℃溶解，搅拌、降温结晶，控制结晶终点温度8℃，保持5小时，分离收集潮晶，于50-60℃真空干燥除去有机溶剂，得干品22g；将干燥后的米尔贝霉素衍生物用二氧六环500mL溶解，控制温度6-8℃，加入2.0mol/L NaOH溶液进行水解反应6小时，HPLC检测控制水解底物的色谱峰面积残留小于1％终止水解。
向水解液中加入其1000mL纯化水稀释，加入500mL环己烷，搅拌萃取米尔贝霉素，分离，再用500mL环己烷萃取一次，分离收集合并环己烷相，真空浓缩至240mL，降温结晶，终点温度控制10℃，分离，于50-60℃干燥得米尔贝霉素9.8g，含量85.6％(HPLC检测)。
其他实施例
根据本领域的基本相关技术，对本发明的工艺的各相关参数和试剂的选择进行了部分调整，实验均得到了理想结果，产品米尔贝霉素的含量均大于80％，收率均在40％以上，进一步放大生产收率会有进一步的提高。
以上通过实施例描述了本发明所提供的从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法，从事相关领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明实质的范围内，可以对本发明做一定的变化或修改，因此本发明的保护范围视权利要求范围所界定。