苯并菲啶类生物碱分子印迹磁性微球的制备方法及应用与流程

本发明涉及药物化学、有机化学及分析化学领域，具体而言，涉及苯并菲啶类生物碱（如血根碱、白屈菜红碱等）分子印迹磁性聚合物微球(简称)的制备方法及应用。

背景技术：

博落回、小果博落回、血水草、白屈菜等药用植物中富含多种苯并菲啶类生物碱（如血根碱、白屈菜红碱、二氢血根碱、二氢白屈菜红碱、氧化血根碱等），其中的血根碱、白屈菜红碱等生物碱由于具有抗病毒、杀菌、抗癌等药理活性而备受人们关注，这些生物碱的分离纯化也一直是生物碱药物研究的热点问题。传统的分离苯并菲啶类生物碱的方法主要有柱色谱、大孔吸附树脂、超临界流体萃取、制备色谱、分子印迹等技术。柱色谱在分离纯化方面有全面、系统的优势，但操作繁琐、周期长；大孔吸附树脂和膜分离技术都难以分离得到高纯度的产物；而超临界流体萃取仅适于分离纯化低极性或者非极性的生物碱；高效液相制备色谱可以得到高纯度的产物，但其成本高，难以实现工业化。为了解决这些问题，许多先进的分离方法被迅速发展起来，其中以分子印迹磁性聚合物为载体的选择性分离技术在苯并菲啶生物碱及其类似物的分离纯化研究中显示出良好的应用前景。

分子印迹技术是20世纪末出现的一种高选择性的固相萃取新技术。由于该技术中使用的分子印迹聚合物(molecular imprinted polymers，MIPs)新材料对印迹分子及其结构类似的客体分子具有特异选择性和识别性，且物理和化学稳定性良好，成本低，易制备，因此在色谱分离、固相萃取和天然活性成分分离等领域都显示出良好的应用前景; 而Fe₃O₄磁性纳米粒子具有特殊的磁导向性、超顺磁性及表面可连接生化活性功能基团等特性，使其在生化分离、分析，靶向药物、酶和细胞固定化等领域的应用得到了广泛的发展。因此，在磁性纳米粒子外表包覆聚合物并进行表面分子印迹处理，合成磁性分子印迹聚合物核壳微球，使其兼具良好的超顺磁性和高选择吸附性两大优点，将进一步拓展分子印迹与磁性微球的应用，有望对天然药物的分离纯化技术的发展起到较大的推动作用。

我们研发了一种基于苯并菲啶生物碱（如血根碱、白屈菜红碱等）药物的分子印迹磁性微球的新方法，可应用于含血根碱中药提取液中血根碱成分的分离，效果很好，不但分离成本较低，且绿色环保。经国内外文献检索，尚未发现有血根碱、白屈菜红碱等苯并菲啶生物碱分子印迹磁性微球制备的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种苯并菲啶生物碱分子印迹磁性微球的制备方法，并对目标分子具有优异的选择与识别能力，且制备的微球可重复利用，符合绿色环保要求。本发明制备的苯并菲啶生物碱磁性分子印迹聚合物微球能快速吸附分离博落回、小果博落回、血水草、白屈菜等含血根碱的中药提取液中的血根碱成分，可直接应用于血根碱的选择分离与高效富集。

本发明的技术方案如下：

（1）Fe₃O₄纳米颗粒制备

将FeCl₃·6H₂O超声分散于乙二醇中。随后在溶液中依次加入柠檬酸三钠， PEG-2000，无水乙酸钠，超声分散。搅拌至澄清透明后，将溶液转移至反应釜，于200℃下反应8h。反应结束后，经分离，洗涤，干燥后，得Fe₃O₄磁性纳米颗粒。

（2）Fe₃O₄@SiO₂颗粒制备

将Fe₃O₄颗粒分散于乙醇-水的混合溶液中。将所得溶液转移至三口瓶中，500r/min搅拌下加入氨水，滴加TEOS（正硅酸乙酯）。该混合物于40℃下反应12h。反应结束后，经分离，洗涤，干燥后，得Fe₃O₄@SiO₂磁性纳米颗粒。

（3）Vinyl- Fe₃O₄@SiO₂颗粒制备

将MPS（甲基丙烯酰氧丙基三甲氧）滴加到醋酸-水混合溶液中，于25℃下搅拌5h。随后，加入Fe₃O₄@SiO₂纳米颗粒于溶液中，60℃下搅拌5.5h。反应结束后，经分离，洗涤，干燥后，得Vinyl- Fe₃O₄@SiO₂磁性纳米颗粒。

（4）表面分子印迹磁性聚合物的合成

将模板生物碱（如血根碱、白屈菜红碱等）和功能单体4-VP（4-乙烯吡啶）加入乙腈中,在4°C下放置12 h形成预组装溶液，Vinyl- Fe₃O₄@SiO₂超声分散在乙腈中，随后加入交联剂EGDMA（乙二醇二甲基丙烯酸酯），引发剂AIBN（偶氮二异丁腈）和预组装溶液。在60℃，500r/min下搅拌24h。反应结束后,用洗涤剂洗至上清液澄清，再用洗脱液洗脱直至模板除去，最后将粒子洗至中性后干燥，得苯并菲啶生物碱（血根碱、白屈菜红碱）分子印迹磁性聚合物微球。

根据本发明，优选的，步骤（1）中FeCl₃·6H₂O为1.08g，乙二醇为80ml。

优选的，加入的柠檬酸三钠， PEG-2000，无水乙酸钠的质量比为1:2:9。

优选的，分离的方法为磁分离。

优选的，洗涤所用的洗涤剂为无水乙醇和蒸馏水。

优选的，干燥的方法为冷冻干燥。

根据本发明，优选的，步骤（2）中乙醇-水溶液的比例为无水乙醇：水=4:1。

优选的，所加入的Fe₃O₄和TEOS的质量比为25:6。

优选的，洗涤所用的洗涤剂为无水乙醇和蒸馏水。

优选的，干燥的方法为冷冻干燥。

根据本发明，优选的，步骤（3）中醋酸-水溶液的比例为水：冰醋酸=10:1。

优选的，所加入的MPS和Fe₃O₄@SiO₂的质量比为1:14。

优选的，洗涤所用的洗涤剂为无水乙醇和蒸馏水。

优选的，干燥的方法为冷冻干燥。

根据本发明，优选的，步骤（4）中模板：功能单体：交联剂的摩尔比为血根碱：4-vp：EGDMA=1：10：50。

优选的，反应为密闭反应

优选的，洗脱剂的选择为甲醇-乙酸溶液，进一步优选的，甲醇：乙酸的体积比为9:1。此处洗涤为除去模板分子，是在70℃下回流2h。

应用本发明的技术方案，利用溶胶-凝胶法将SiO₂壳包覆在水热法制备的Fe₃O₄纳米颗粒表面，使其不容易氧化也更易于下一步改性。进一步的，利用MPS将其表面进行C=C改性。再进一步的，改性过的磁性微球和血根碱在4-vp功能单体和交联剂EGDMA的存在下，由引发剂AIBN引发聚合反应生成表面含有血根碱模板分子的核壳印迹磁性微球。洗脱剂洗脱模板后，磁性微球表面产生了具有固定形态和大小的血根碱模板分子专一孔穴，产生了血根碱分子印迹磁性聚合物微球。

本发明所具有的优点：

1.本法制备的苯并菲啶类生物碱（血根碱或白屈菜红碱等）分子印迹磁性聚合物微球，反应条件温和、经济环保、重现性好，具有良好的应用前景。

2.本发明所得的颗粒大小均匀，单分散性好，成球性好，具有高吸附容量可实现血根碱的特异性分离。

3.本发明所制得颗粒磁性较强，在外部磁场下易分离，大大改善了传统吸附材料不易分离的问题。

4．本发明制备的血根碱分子印迹的磁性聚合物微球可应用于博落回、小果博落回、血水草等含苯并菲啶类生物碱的提取液中，快速、高效纯化血根碱、白屈菜红碱等苯并菲啶类生物碱。

附图说明：

图1为所制得Fe₃O₄粒子的SEM图。

图2为所制得的MMIPs的TEM图。

具体实施方案：

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例中所用原料均为常规试剂，市购产品，所用设备均为常规设备。

实施例1

1. Fe₃O₄纳米颗粒制备

将1.08g FeCl₃·6H₂O超声分散于80ml乙二醇中。随后在溶液中依次加入0.5g柠檬酸三钠，1g PEG-2000，超声分散。最后，加入4.5g的无水乙酸钠。搅拌溶液至澄清透明后，将溶液转移至100ml反应釜，于200℃下反应8h。磁分离后，利用水和无水乙醇交替洗三次。冷冻干燥后，得Fe₃O₄纳米颗粒。

2. Fe₃O₄@SiO₂颗粒制备

将0.25g Fe₃O₄颗粒加入乙醇-水的混合溶液中（160ml无水乙醇/40ml水），超声分散30min。将所得溶液转移至250ml三口瓶中，500r/min搅拌15min后，加入5ml氨水，搅拌10min后，滴加0.6mlTEOS（正硅酸乙酯）。该混合物于40℃，500r/min下反应12h，磁分离，无水乙醇与水交替洗三次后，冷冻干燥得Fe₃O₄@SiO₂纳米颗粒。

3. Vinyl- Fe₃O₄@SiO₂颗粒制备

将250ulMPS（甲基丙烯酰氧丙基三甲氧）滴加到55ml含有10%醋酸的醋酸-水混合溶液（水50ml，冰醋酸5ml）中，于25℃，700r/min下搅拌5h。随后，加入0.34g Fe₃O₄@SiO₂纳米颗粒于溶液中，60℃，700r/min下搅拌5.5h。磁分离，无水乙醇与水交替洗三次后，冷冻干燥得Vinyl-Fe₃O₄@SiO₂纳米颗粒。

4. 表面分子印迹聚合物MMIPs的合成

将0.01g模板白屈菜红碱碱和0.1ml功能单体4-VP（4-乙烯吡啶）加入到50 ml的乙腈中,在4℃下放置12 h形成预组装溶液,50 mg Vinyl- Fe₃O₄@SiO₂超声分散在10 ml乙腈中,随后加入947ul交联剂EGDMA（乙二醇二甲基丙烯酸酯），0.2g引发剂AIBN（偶氮二异丁腈）和预组装溶液。氮气保护下,在60℃，500r/min下搅拌24h。最后,产物磁分离后,用乙腈洗至上清液澄清,再用甲醇和醋酸的混合液(90:10,V/V)洗脱直至模板除去,用甲醇将粒子洗至中性后冷冻干燥。

实施例2

1. Fe₃O₄纳米颗粒制备

将1.08g FeCl₃·6H₂O超声分散于80ml乙二醇中。随后在溶液中依次加入0.5g柠檬酸三钠，1gPEG-2000，超声分散。最后，加入4.5g的无水乙酸钠。搅拌溶液至澄清透明后，将溶液转移至100ml反应釜，于200℃下反应8h。磁分离后，利用水和无水乙醇交替洗三次。冷冻干燥后，得Fe₃O₄纳米颗粒。

2. Fe₃O₄@SiO₂颗粒制备

将0.25g Fe₃O₄颗粒加入乙醇-水的混合溶液中（160ml无水乙醇/40ml水），超声分散30min。将所得溶液转移至250ml三口瓶中，500r/min搅拌15min后，加入5ml氨水，搅拌10min后，滴加0.6mlTEOS（正硅酸乙酯）。该混合物于40℃，500r/min下反应12h，磁分离，无水乙醇与水交替洗三次后，冷冻干燥得Fe₃O₄@SiO₂纳米颗粒。

3. Vinyl- Fe₃O₄@SiO₂颗粒制备

将550ulMPS（甲基丙烯酰氧丙基三甲氧）滴加到55ml含有10%醋酸的醋酸-水混合溶液（水50ml，冰醋酸5ml）中，于25℃，700r/min下搅拌5h。随后，加入0.34g Fe₃O₄@SiO₂纳米颗粒于溶液中，60℃，700r/min下搅拌5.5h。磁分离，无水乙醇与水交替洗三次后，冷冻干燥得Vinyl-Fe₃O₄@SiO₂纳米颗粒。

4. 表面分子印迹聚合物MMIPs的合成

将0.03g模板血根碱和0.1ml功能单体4-VP（4-乙烯吡啶）加入到50 ml的乙腈中,在4℃下放置12 h形成预组装溶液， 50 mg Vinyl- Fe₃O₄@SiO₂超声分散在10 ml乙腈中,随后加入947ul交联剂EGDMA，0.2g引发剂AIBN和预组装溶液。氮气保护下,在60℃，500r/min下搅拌24h。最后,产物磁分离后,用乙腈洗至上清液澄清,再用甲醇和醋酸的混合液(90:10,V/V)洗脱直至模板除去,用甲醇将粒子洗至中性后冷冻干燥。

实例3

1. 博落回提取液的制备

取博落回果荚200g，用90℃的1 %盐酸水5倍量渗漉提取3次，每次1 h。固液分离后，滤液稀释3倍，作为提取液备用。

2. 提取液中血根碱与白屈菜红碱的分离纯化

在提取液中加入10g的血根碱表面分子印磁性印迹聚合物微球，充分震荡30min后，静置30min,再用强磁铁插入提取液，将血根碱表面分子印磁性迹聚合物微球吸附出来，再将微球放直径1cm的层析柱中，以2%盐酸的酸性甲醇100ml连续缓慢洗脱（淋洗）2次，再将洗脱液浓缩后重结晶处理即得98%的血根碱1.1g。将10g白屈菜红碱表面分子印磁性印迹聚合物微球重新加入到除去血根碱后的提取液，同样的方法操作即得98%的白屈菜红碱0.5g。