一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法与流程

文档序号:12639181阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法,包括以下步骤:

1)将米尔贝霉素发酵液进行絮凝、过滤,得到菌丝渣;

2)用非水溶性溶剂萃取菌丝渣,得到一次萃取液;

3)将一次萃取液依次进行酸洗、浓缩、碱处理,然后用二次萃取溶剂萃取,得到二次萃取液;

4)对二次萃取液进行酸洗,降温沉淀,过滤取滤液得一次纯化上柱液;

5)用硅胶柱层析分离一次纯化上柱液,收集得一次层析液;

6)对一次层析液中的米尔贝霉素进行衍生处理,然后用碱洗涤,浓缩,结晶,干燥晶体,再将晶体溶解,过滤取滤液得衍生纯化上柱液;

7)用硅胶柱层析分离衍生纯化上柱液,收集得二次层析液;

8)浓缩二次层析液,结晶,分离,得到米尔贝霉素衍生物晶体;

9)将米尔贝霉素衍生物水解、萃取、浓缩、结晶、干燥得到米尔贝霉素A3和A4含量大于80%的米尔贝霉素。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)采用的絮凝剂为聚丙烯酰胺、聚合氯化铝和/或聚合硫酸铁;过滤前加入助滤剂珍珠岩粉和/或硅藻土助滤。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)萃取用所述非水溶性溶剂为醋酸丁酯和/或乙酸乙酯,萃取温度20~50℃,萃取一次或多次,每次时间2~5小时,合并为一次萃取液。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)用0.05-0.2mol/L的盐酸或硫酸对一次萃取液进行酸洗;酸洗后真空浓缩蒸尽萃取溶剂,加碱使pH在11~13,搅拌得粘稠料液,然后用二次萃取溶剂进行萃取。

5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)通过浓缩或稀释二次萃取液,使其米尔贝霉素单位为8000~10000μg/mL,然后采用0.05mol/L的盐酸或硫酸进行酸洗,再降温至8~10℃,静置沉淀8~10小时,过滤分离沉淀,收集滤液得一次纯化上柱液。

6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤5)和步骤7)中硅胶柱所用硅胶为60~150目的干硅胶,用二次萃取溶剂浸泡后上柱,层析柱的径高比为1:6;所用解析液为二次萃取溶剂∶醋酸丁酯或乙酸乙酯体积比为6:4~7:3的混合溶液;步骤5)收集米尔贝霉素A4的HPLC色谱峰面积比≥30%的解吸液;步骤7)收集米尔贝霉素A4的HPLC色谱峰面积比≥50%的解吸液。

7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤6)中用衍生试剂、酸束缚剂对一次层析液进行衍生反应,所述衍生试剂为对硝基苯甲酰氯、邻硝基苯甲酰氯和/或苯甲酰氯,所述酸束缚剂为吡啶、二乙胺和/或三乙胺。

8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤6)将一次层析液进行真空浓缩至米尔贝霉素单位为2-4万μg/mL,控制温度28~30℃,加入米尔贝霉素总当量的2~2.5倍当量的衍生试剂和2.5~3倍当量的酸束缚剂,搅拌反应2~4小时,待HPLC色谱检测中米尔贝霉素的峰面积小于1%即终止反应;然后用5%NaHCO3溶液对反应液进行洗涤;对洗涤后的反应液进行真空浓缩,降温结晶,控制结晶终点温度5~10℃,分离收集潮晶,真空干燥除去有机溶剂;用二次萃取溶剂溶解衍生物结晶,控制溶液浓度1.5~3w/v%,过滤得衍生纯化上柱液。

9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤8)将二次层析液进行真空浓缩,得粘稠物,加入二次萃取溶剂,控制温度为50-60℃,米尔贝霉素衍生物单位为8-10万μg/mL,然后降温结晶,控制结晶终点温度5~10℃,分离收集潮晶,于50-60℃真空干燥除去有机溶剂,得米尔贝霉素衍生物晶体。

10.如权利要求1、4、6、8或9所述的方法,其特征在于,所述二次萃取溶剂为庚烷、己烷、甲苯和/或二甲苯。

11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤9)将干燥的米尔贝霉素衍生物用水溶性有机溶剂溶解,于5~10℃加碱进行水解,水解后用有机溶剂萃取,真空浓缩,降温结晶,分离晶体,干燥得米尔贝霉素。

12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,步骤9)中,用于溶解米尔贝霉素衍生物的水溶性有机溶剂为二氧六环、四氢呋喃和/或乙醇;水解加入的碱为2~4mol/L的NaOH或KOH溶液;水解后萃取所用有机溶剂为庚烷、甲基环己烷或环己烷;结晶终点温度控制在5~10℃。

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