本发明涉及制备5-异硫氰酸荧光素酯的方法。
背景技术：
5-异硫氰酸荧光素酯(5-FITC)是目前应用最广泛的荧光标记试剂之一。其最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为525～530nm，呈现出非常便于人眼观测的明亮黄绿色荧光。5-异硫氰酸荧光素酯能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。5-异硫氰酸荧光素酯也用于医学，农学和畜牧等方面，可对由细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。
目前文献报道的制备5-异硫氰酸荧光素酯的方法是以5-氨基荧光素为原料，与硫光气在有机溶剂中反应制得(ACS Med.Chem.Lett.2012，3，774-779)，化学反应式为
该方法有两个非常明显的缺点：第一、所使用的硫光气毒性非常大，气味也非常大，工艺操作安全性很差；第二、硫光气价格较高，公斤级价格在3000元以上，并且购买不便，导致5-异硫氰酸荧光素酯的生产成本居高不下。该合成工艺生产危险性大，并且生产成本高昂，并不适应于工业化生产的需求。
鉴于目前制备5-异硫氰酸荧光素酯的工艺存在生产危险性大，生产成本高昂的问题，因此，寻找一种绿色合成5-异硫氰酸荧光素酯的工业化生产方法具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明之目的在于提供一种生产危险性小、成本较低的制备5-异硫氰酸荧光素酯的工业化生产方法。
为解决上述技术问题，根据本发明的第一方面，提供一种制备5-异硫氰酸荧光素酯的方法，其中，包括如下步骤：
步骤一：以5-氨基荧光素为原始原料，在催化剂和溶剂作用下，与二硫化碳反应制得荧光素-5-二硫胺甲酸盐，化学反应式为：
步骤二：将步骤一中得到的所述荧光素-5-二硫胺甲酸盐，在催化剂和溶剂作用下，反应得到5-异硫氰酸荧光素酯，化学反应式为：
优选地，步骤一中，所述5-氨基荧光素与二硫化碳的摩尔比为1:1～5。
优选地，所述溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇、甲苯、二甲苯、乙醚、丙酮、丁酮、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基亚砜(DMSO)中的一种或多种。
优选地，步骤一中所述催化剂为氨水、氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、三乙胺、二乙胺、DBU、三丁胺、N,N-二异丙基乙胺、三乙烯二胺、4-二甲胺基吡啶、吡啶中的一种或多种。
优选地，步骤二中所述催化剂为苯磺酰氯、对甲苯磺酰氯、磺酰氯、邻硝基苯磺酰氯、对硝基苯磺酰氯、邻硝基苯磺酰氯、对硝基苯磺酰氯、硫酸铜、氯化铜中的一种或多种。
优选地，所述催化剂的添加量为反应原料总量的1～500wt％。
优选地，所述反应的温度为-20～100℃。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明采用的合成原料二硫化碳毒性较低，工艺操作安全性较高；
(2)本发明所采用的合成工艺所采用的除5-氨基荧光素外的其他原料和催化剂价格低廉，生产成本比较低；
(3)本发明的合成工艺简单、反应条件温和，且5-异硫氰酸荧光素酯的产率较高；
(4)本发明的合成工艺反应操作简便、适用范围广，能充分满足产品工业化生产的需求。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构及技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
本发明提供了一种制备5-异硫氰酸荧光素酯的方法，包括如下步骤：
步骤一：以5-氨基荧光素为原始原料，在催化剂和溶剂作用下，与二硫化碳反应制得荧光素-5-二硫胺甲酸盐，化学反应式为：
步骤二：将步骤一中得到的荧光素-5-二硫胺甲酸盐，在催化剂和溶剂作用下，反应得到5-异硫氰酸荧光素酯，化学反应式为：
需要说明的是，步骤一中，5-氨基荧光素与二硫化碳的摩尔比为1:1～5。
在本发明的进一步实施例中，溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇、甲苯、二甲苯、乙醚、丙酮、丁酮、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基亚砜(DMSO)中的一种或多种。
需要说明的是，反应的温度为-20～100℃。
在本发明的进一步实施例中，步骤一中催化剂为氨水、氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、三乙胺、二乙胺、DBU、三丁胺、N,N-二异丙基乙胺、三乙烯二胺、4-二甲胺基吡啶、吡啶中的一种或多种。
在本发明的进一步实施例中，步骤二中催化剂为苯磺酰氯、对甲苯磺酰氯、磺酰氯、邻硝基苯磺酰氯、对硝基苯磺酰氯、邻硝基苯磺酰氯、对硝基苯磺酰氯、硫酸铜、氯化铜中的一种或多种。
需要说明的是，催化剂的添加量为反应原料总量的1～500wt％。
本发明的方法合成原料二硫化碳毒性较低，工艺操作安全性较高，合成工艺简单、反应条件温和。同时本发明所采用的合成工艺所采用的除5-氨基荧光素外的其他原料和催化剂均价格低廉，生产成本比较低，且5-异硫氰酸荧光素酯的产率较高，反应操作简便，适用范围更广，能充分满足产品工业化生产的需求。
以下结合具体示例对本发明做进一步说明，当然具体示例是用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
示例1
本实施例所述制备5-异硫氰酸荧光素酯的方法，包括如下步骤：
步骤一：荧光素-5-二硫胺甲酸三乙铵盐的制备，化学反应式为：
在室温搅拌下，向50L反应釜中依次加入20L四氢呋喃和6.95Kg 5-氨基荧光素。然后冷却至0℃，向其中滴加6.07Kg三乙胺，1小时滴完，滴加过程中反应体系稍微放热。滴完三乙胺后，再向其中滴加1.53Kg二硫化碳，30分钟滴完，该滴加过程中反应体系放热比较明显。滴完后，0℃保温反应2h，再升温至30℃继续反应2小时，反应结束。
所得反应混合物不经处理，直接进行下一步反应。
步骤二：5-异硫氰酸荧光素酯的制备，化学反应式为：
向步骤一所制备的反应混合物中滴加3.63Kg苯磺酰氯，1小时内滴完，搅匀。滴完后，30℃保温反应2小时，反应结束。然后过滤，收集滤饼。滤液旋干后与滤饼合并，先用20L水打浆洗涤1h，再用叔丁基甲醚打浆洗涤1h。真空烘箱40℃烘干4h，得到黄色固体产品7.06Kg，收率为90.6％。
产品核磁数据为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.20(brs，2H)，8.04(d，1H)，7.81(dd，1H)，7.35(d，1H)，6.71(d，2H)，6.55-6.64(m，4H)ppm。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神及范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围及边界、或者这种范围及边界的等同形式内的全部变化及修改例。