生产鼠李糖脂的方法与流程

本发明涉及用于从碳源生产至少一种鼠李糖脂的方法和细胞。

发明背景

在市场上对于作为目前可得的从石油化学原料获得的表面活性剂的合适替代物的、从可再生原料生产的、生物可降解的表面活性剂存在普遍需求。该需求特别地随着可预见的石油化学原料短缺和增加的对于表面活性剂的需求而得到加强。鼠李糖脂是这样的表面活性剂的至少一个例子。鼠李糖脂代表了经济上令人感兴趣的类别，因为它们可以潜在地代替从石油或其产品制造的常规的表面活性剂，并因此常常改善所得制剂的环保性能。

这些鼠李糖脂包含至少一个单鼠李糖基脂质或两个鼠李糖基团(二鼠李糖基脂质)和一个或两个3-羟基脂肪酸残基(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology,2010)。它们具有表面活性特性，这是在所有种类的应用中对于用作表面活性剂所需要的(参见Leitermann等人,2009)。特别地，鼠李糖脂可以在很大程度上在家庭、清洁、美容、食品加工、制药、植物保护和其他应用中用作表面活性剂。

目前所使用的用于生产这些鼠李糖脂的方法采用各种各样的人和动物的致病菌，特别是假单胞菌属(Pseudomonas)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的成员，的野生型分离株(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology,2010)。这些致病生物能够对消费者引起疾病这一事实相当大地降低了消费者对于这些常规地生产的鼠李糖脂的接受。进一步地，更高的安全性要求也增加了生产成本，这是由于增加的资本支出和可能额外的生产步骤。由于其中使用了这些鼠李糖脂的产品大多数是可以以非常低的成本生产的批量规模化学品，因此鼠李糖脂还必须能够以尽可能低的成本生产，其中没有对于消费者的健康风险并且尽可能具有确定的特性。

可用于生产鼠李糖脂的目前的方法包括使用这些致病生物和作为唯一底物或共底物的植物油(Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology,2010)。然而，相比于其他碳源，例如葡萄糖、蔗糖或多糖(例如淀粉、纤维素和半纤维素)、甘油、CO，CO₂或CH₄而言，植物油是相当昂贵的原料。还通过使用碳源例如葡萄糖、蔗糖或多糖由非致病生物来生产鼠李糖脂，如在WO2012013554A1中所教导的。

但是，对于通过使用非致病生物和备选的可再生原料有效地(即便宜地和从健康观点来看安全地)和以不止足够的量来生产鼠李糖脂(特别地，单鼠李糖基脂质和/或二鼠李糖基脂质)仍然存在需要。

发明描述

根据一个方面，本发明涉及能够解决现有技术中所存在的问题的方法。特别地，本发明涉及通过在至少一种碳源存在下培养重组细胞来生产至少一种鼠李糖脂的方法，其中所述碳源为至少一种具有恰好4个碳原子的C₄分子。所述重组细胞包含相比于所述细胞的野生型而言增加的酶α/β水解酶、鼠李糖基转移酶I或鼠李糖基转移酶II中至少一种的活性。该方法可能尤其是有利的，因为它可以允许单鼠李糖基脂质和/或二鼠李糖基脂质的高选择性生产，其中所产生的不希望的副产物和中间体的数量减少。例如，相比于目前可得的方法而言，可以至少存在更少的中间体，例如根据本发明的任一方面所形成的β-羟基脂肪酸的二聚体(脂肪酸二聚体)。

根据本发明的任一方面的方法的进一步优点包括但不限于：可以使用非致病的和培养简单的生物。进一步的优点可以包括：用根据本发明的任一方面的方法，可以不是必需的是，油类和简单碳水化合物底物(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)是唯一底物或共底物。根据本发明的任一方面，另一个优点可以是：可以产生具有确定的和可调节的特性的鼠李糖脂。另外，特别地，可以产生二鼠李糖基脂质。进一步的优点可以是：可以以比用未增强这些活性的细胞更高的空间-时间和碳产率来产生鼠李糖脂。

根据本发明的任一方面，可以通过使用本发明的任一方面而产生的鼠李糖脂和/或其鼠李糖脂混合物同样可以是本发明的主题。有利地可以至少在清洁或护理试剂中，在美容学、皮肤病学或药学制剂中，以及在植物保护制剂、表面活性剂浓缩物等中使用可以根据本发明的任一方面而产生的鼠李糖脂和混合物。

术语“护理试剂”在此是指实现下列目的的制剂：维持物品处于其原始形式，降低或避免外部影响(例如，时间、光、温度、压力、污染、与接触该物品的其他反应性化合物的化学反应等)和老化、污染、材料疲劳的效应，和/或甚至用于改善该物品的所希望的正面特性。物品的所希望的正面特性的例子可以包括诸如物品的经改善的毛发光泽或更大的弹性等的特征。

“植物保护制剂”在此是指通过其制备的性质而用于植物保护的那些制剂。如果在该制剂中包含至少一种从由除草剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、针对鸟害的保护性物质、植物营养物和土壤结构改善试剂组成的组中选择的化合物，那么这特别地是该情况。

根据本发明的任一方面而产生的鼠李糖脂可以用作在家政、工业中(特别是在硬表面、皮革和/或纺织品上)使用的护理和清洁试剂的组分。

根据本发明的一个方面，提供了至少一种制备至少一种鼠李糖脂的方法，该方法包括：

-使重组细胞与包含碳源的培养基相接触；和

-在对于由所述细胞从所述碳源制备所述鼠李糖脂来说合适的条件下培养所述细胞，

其中所述重组细胞已经如此地进行了基因工程改造，从而所述细胞具有相比于所述细胞的野生型而言增加的酶E₁、E₂和E₃中至少一种的活性，其中酶E₁为α/β水解酶，酶E₂为鼠李糖基转移酶I，和酶E₃为鼠李糖基转移酶II，并且其中所述碳源为C₄分子。

根据本发明的另一个方面，提供了能够从C₄分子形成至少一种鼠李糖脂的细胞，其中所述细胞已经如此地进行了基因工程改造，从而所述细胞具有相比于所述细胞的野生型而言增加的氧化还原酶以及酶E₁、E₂和E₃中至少一种的活性，其中酶E₁为α/β水解酶，酶E₂为鼠李糖基转移酶I，和酶E₃为鼠李糖基转移酶II。

更特别地，根据本发明的任一方面的细胞可以能够形成鼠李糖脂，并且具有相比于其野生型而言增加的基因产物rhlA、rhlB和rhlC的至少一种基因产物或同系物的活性。至少在一个实例中，可以将来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的基因rhlA、rhlB和rhlC引入到GRAS(“generally regarded as save(通常被认为安全的)”)生物中(如在WO2012013554A1中所描述的)，以从C₄分子生产鼠李糖脂。在一个特别的实例中，根据本发明的任一方面的细胞可以为菌株KT2440的恶臭假单胞菌(P.putida)。

特别地，在此所提及的C₄分子可以是包含C、H和/或O的结构。特别地，所述C₄分子可以是任何这样的化合物，在所述化合物的结构中包含恰好4个碳原子(即在每个单元中不大于或不小于4个碳原子)。根据本发明的任一方面的“C₄分子”是指这样的有机化合物，其包含恰好四个C原子和可变数目的H原子，这取决于在具有4个碳原子的该化合物的结构中所发现的其他原子。所述C₄分子还可以包含O原子。特别地，根据本发明的任一方面的C₄分子可以是丁烷和丁烷的氧化产物。丁烷的氧化产物至少包括1-丁醇、2-丁醇、1-丁醛、丁酮和丁酸。特别地，所述C₄分子可以选自由下列各项组成的组：丁烷、1-丁醇、2-丁醇、1-丁醛、丁酮、丁酸(丁酸盐)及其组合。所述C₄分子还可以是四糖。

更特别地，根据本发明的任一方面进行使用的C₄分子可以仅仅是一种类型的C₄分子(即仅丁烷、1-丁醇、2-丁醇、1-丁醛、丁酮或丁酸)。在一个实例中，所使用的C₄分子可以是任何从由下列各项组成的组中选择的C₄分子的组合：丁烷、1-丁醇、2-丁醇、1-丁醛、丁酮和丁酸。例如，根据本发明的任一方面的C₄分子可以是丁烷和1-丁醇、丁烷和2-丁醇、丁烷和1-丁醛、丁烷和丁酮、丁烷和丁酸等的组合。在一个实例中，可以存在至少3、4、5或6种不同的C₄分子，其用作根据本发明的任一方面的碳源。在另一个实例中，可以存在丁烷、1-丁醇和丁酸的组合，其用作根据本发明的任一方面的C₄分子。在另一个实例中，可以单独地或者与丁烷和丁烷氧化产物相组合地使用四糖，作为根据本发明的任一方面的碳源。

根据本发明的任一方面进行使用的培养基包含至少一种碳源。在所述培养基中的碳源可以至少为C₄分子。特别地，在所述培养基中的碳源可以基本上由C₄分子组成或者实质上包含C₄分子。特别地，C₄分子的总量至少为或等于所述培养基中总碳含量的20重量％、40重量％、50重量％、60重量％或70重量％的在总培养基中的C₄分子碳源。更特别地，C₄分子的总量至少为或等于所述培养基中碳源的50重量％、70重量％或80重量％。更加特别地，所述C₄分子可以至少为或等于所述培养基中碳源的90重量％或大约100重量％。

在一个实例中，所述培养基可以包含第二种碳源。特别地，所述碳源可以是碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素和半纤维素，植物油和动物油和脂肪例如大豆油、红花油、花生油、大麻子油、麻风树油、椰子脂、葫芦油、亚麻子油、玉米油、罂粟子油、月见草油、橄榄油、棕榈仁油、棕榈油、菜子油、芝麻油、向日葵油、葡萄子油、核桃油、小麦胚芽油和椰子油，脂肪酸例如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、花生四烯酸、山萮酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、γ-亚麻酸和其甲基或乙基酯以及包含上面提及的任何脂肪酸的脂肪酸混合物、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯，醇类例如甘油、乙醇和甲醇，烃类例如甲烷，含碳气体和气体混合物例如CO、CO₂、合成气或烟道气，氨基酸例如L-谷氨酸或L-缬氨酸，或者有机酸例如乙酸。这些物质可以独个地或作为混合物进行使用。可以使用碳水化合物，特别是单糖、寡糖或多糖，作为碳源，如在US 6,01,494和US 6,136,576中所描述的，以及烃类，特别是烷烃、烯烃和炔烃以及从其衍生的单羧酸和从这些单羧酸衍生的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯，以及甘油和乙酸盐。可以使用包含甘油与辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、花生四烯酸、山萮酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和/或γ-亚麻酸的酯化产物的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。

根据本发明的任一方面，下述事实是一个巨大的优势：所述细胞可以能够从最简单的碳源例如丁烷形成鼠李糖脂，从而在根据本发明的任一方面的培养基中提供更长链的碳源可以不是必需的。在在根据本发明的任一方面的培养基中可检测量的具有大于六个碳原子的链长的羧酸或者从这些可衍生出的酯或甘油酯无法可得的情况下，这可以尤其是有利的。

可以在所述培养基中适当地使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨气或氨水或者酸性化合物例如磷酸或硫酸，以用于培养物的pH控制。可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯，以用于控制泡沫发展。可以向所述培养基中添加合适的选择性地起作用的物质例如抗生素，以用于维持质粒的稳定性。为了维持有氧条件，可以将氧气或含氧气体混合物例如空气掺入到培养物中。

培养物的温度通常大于或等于20℃，25℃，其也可以大于或等于40℃，其中有利地，可以使用至少或等于95℃，特别地至少或等于90℃，和更加特别地至少或等于80℃的培养温度。

技术人员将会理解什么是对于培养根据本发明的任一方面的重组细胞以从至少一种C₄分子生产鼠李糖脂来说合适的条件。

通过使用本领域中已知的基本方法，技术人员将会能够改变所述培养基中的条件以适合根据本发明的任一方面所使用的相关细胞。

在根据本发明的任一方面的方法中，可以将由所述细胞所形成的鼠李糖脂任选地从细胞和/或培养基中分离。可以应用所有本领域中已知用于从复杂组合物中分离低分子量物质的方法。例如，诸如过滤、提取、吸附(色谱法)、结晶等的方法可以在产物相中使用。

在产物相中的分离出的产物也可以包含其他不想要的生物质残留物和各种杂质，例如油、脂肪酸和其他营养培养基成分。这些杂质等的分开可以以无溶剂的过程来进行。因此，例如，可以首先将分离出的产物用水进行稀释以促进pH的调整。然后，可以通过经由分别用酸或碱降低或升高pH而将鼠李糖脂转化成水溶性形式来使产物和水性均质化。可以通过在较高的温度下(例如在60至90℃下)温育反应混合物和/或用持续不断的混合来协助鼠李糖脂在水相中的可溶性。然后，通过随后用碱或酸升高或降低pH，可以将鼠李糖脂再次转化成水不溶性形式，从而它们可以容易地与水相相分开。然后，可以用水洗涤产物相一次或数次以去除水溶性杂质。

可以将油残留物分离开，例如通过借助于合适的溶剂(有利地借助于有机溶剂)进行提取。可以使用烷烃例如正己烷等作为溶剂。

作为上面所描述的无溶剂过程的备选方案，可以通过使用合适的溶剂(例如，酯例如乙酸乙酯、乙酸丁酯等)来实施产物与水相的分开。这些提取步骤可以以任何所希望的顺序来进行。技术人员将会能够容易地改变惯常适合于所述细胞和待提取的鼠李糖脂的步骤顺序和/或溶剂。

在另一个实例中，可以在根据本发明的任一方面而产生的鼠李糖脂的提取中使用溶剂。特别地，可以使用有机溶剂。更特别地，可以使用正戊醇作为溶剂。例如，进行蒸馏以去除溶剂。随后，可以进一步纯化经冻干的产物，例如借助于色谱学方法。作为实例，可以采用借助于合适的溶剂进行沉淀，借助于合适的溶剂进行提取，络合(例如借助于环糊精或环糊精衍生物)，结晶，借助于色谱学方法进行纯化或分离，或者将鼠李糖脂转化为可容易地分开的衍生物。

根据本发明的任一方面所使用的重组细胞已经如此地进行了基因工程改造，从而所述细胞具有相比于所述细胞的野生型而言增加的酶E₁、E₂和E₃中至少一种的活性，其中酶E₁为α/β水解酶，酶E₂为鼠李糖基转移酶I，和酶E₃为鼠李糖基转移酶II。根据本发明的任一方面所使用的重组细胞可以按照在WO2012013554A1中公开的方法来制备。

特别地，在根据本发明的任一方面的细胞中，酶E₁可以能够催化3-羟基链烷酰基-ACP经由3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸-ACP转化为羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸；酶E₂可以是鼠李糖基转移酶I并且可以能够催化dTDP-鼠李糖和3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯；和酶E₃可以是鼠李糖基转移酶II并且可以能够催化dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯，其中这些酶E₁、E₂和E₃可以选自由下列各项组成的组：至少一种酶E₁，其包含从由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6及其片段组成的组中选择的氨基酸序列；至少一种酶E₂，其包含从由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及其片段组成的组中选择的氨基酸序列；和至少一种酶E₃，其包含从由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及其片段组成的组中选择的氨基酸序列。关于酶E₁、E₂或E₃中任一个的片段可以包含这样的多肽序列，在所述多肽序列中相比于各自酶的序列而言至多25％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且所述片段包含各自酶的酶活性的至少10％。

特别地，在根据本发明的任一方面的细胞中的酶E₁可以选自由下列各项组成的组：

酶E_1a，其具有多肽序列SEQ ID NO:2，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:2而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:2的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_1a的酶活性可以是指将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸-ACP转化为羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；

酶E_1b，其具有多肽序列SEQ ID NO:3，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:3而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:3的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_1b的酶活性可以是指将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸-ACP转化为羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；

酶E_1c，其具有多肽序列SEQ ID NO:4，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:4而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:4的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_1c的酶活性可以是指将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸-ACP转化为羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；

酶E_1d，其具有多肽序列SEQ ID NO:5，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:5而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:5的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_1d的酶活性可以是指将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸-ACP转化为羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；和

酶E_1e，其具有多肽序列SEQ ID NO:6，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:6而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:6的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_1e的酶活性可以是指将3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸-ACP转化为羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力。

特别地，在根据本发明的任一方面的细胞中所使用的酶E₂可以选自由下列各项组成的组：

酶E_2a，其具有多肽序列SEQ ID NO:7，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:7而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:7的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_2a的酶活性可以是指优先地将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；

酶E_2b，其具有多肽序列SEQ ID NO:8，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:8而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:8的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_2b的酶活性可以是指优先地将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；

酶E_2c，其具有多肽序列SEQ ID NO:9，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:9而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:9的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_2c的酶活性可以是指优先地将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；

酶E_2d，其具有多肽序列SEQ ID NO:10，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:10而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:10的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_2d的酶活性可以是指优先地将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；和

酶E_2e，其具有多肽序列SEQ ID NO:11，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:11而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:11的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_2e的酶活性可以是指优先地将dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力。

特别地，在根据本发明的任一方面的细胞中所使用的酶E₃可以选自由下列各项组成的组：

酶E_3a，其具有多肽序列SEQ ID NO:12，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:12而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:12的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_3a的酶活性可以是指优先地将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；

酶E_3b，其具有多肽序列SEQ ID NO:13，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:13而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:13的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_3b的酶活性可以是指优先地将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；

酶E_3c，其具有多肽序列SEQ ID NO:14，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:14而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:14的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_3c的酶活性可以是指优先地将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力；和

酶E_3d，其具有多肽序列SEQ ID NO:15，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:15而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:15的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于90％，其中关于酶E_3d的酶活性可以是指优先地将dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力。

技术人员将会理解，上面对于酶E_1a至E_3b所指出的活性仅是这些酶的更宽的活性谱的特殊示例性选择；所提及的各自活性是这样的活性，对于该活性来说，在给定的酶的情况下可靠的测量方法是可得的。因此，明显的是，有着具有非支化的、饱和的C₁₀-烷基基团的底物的酶也可以能够转化那些包含C₆-或C₁₆-烷基基团(其任选地也可以是支化的或不饱和的)的底物。

根据本发明的任一方面的重组细胞也可以如此地进行了基因工程改造，从而所述细胞具有相比于所述细胞的野生型而言增加的氧化还原酶的活性。特别地，所述细胞可以如此地进行了基因工程改造，从而所述细胞具有增加的E₁、E₂或E₃或其组合以及氧化还原酶的活性。更特别地，所述细胞可以具有增加的E₁、E₂、E₃和氧化还原酶的活性。在一个实例中，所述细胞具有增加的E₁和E₂以及氧化还原酶，或者E₁和E₃以及氧化还原酶，或者E₂和E₃以及氧化还原酶的活性。

所述氧化还原酶可以是alkB类型的氧化还原酶。该类别的氧化还原酶，alkB，是来自恶臭假单胞菌AlkBGT系统的氧化还原蛋白，其依赖于两种辅助多肽即alkG和alkT。alkT是FAD依赖性玉红氧还蛋白还原酶，其将电子从NADH转移至alkG。alkG是玉红氧还蛋白(一种含铁的氧化还原蛋白)，其作为对alkB的直接电子供体起作用。在一个特别的实例中，所述alkB类型的氧化还原酶是来自恶臭假单胞菌Gpo1的alkB(登录号：CAB54050.1(版本1)，SEQ ID NO:1，在申请中所使用的任何登录号是指来自由NCBI运行的Genbank数据库的各自序列，其中所提及的发行本是在2014年4月4日在线可得的那个)。

所述alkB类型的氧化还原酶具有多肽序列SEQ ID NO:1，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于参考序列SEQ ID NO:1而言直至25％、20％、15％，特别地直至10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有参考序列SEQ ID NO:1的酶的酶活性的至少10％、50％、80％，特别地大于92％，其中关于alkB类型的氧化还原酶的酶活性可以是指当使用丁烷作为碳源时，即当使用丁烷作为根据本发明的任一方面的C₄分子时，优先地将丁烷转化为1-丁醇和/或2-丁醇的能力。

所述氧化还原酶可以是单加氧酶。特别地，所述单加氧酶可以是P450类型的单加氧酶，例如来自热带假丝酵母(Candida tropicalis)或鹰嘴豆(Cicer arietinum)的细胞色素P450。更特别地，CYP153单加氧酶，例如来自博尔库姆食烷菌(Alcanivorax borkumensis)SK2的细胞色素P450-单加氧酶(YP_691921)。可以在丁烷至醇的第一次氧化中使用单加氧酶。

在另一个实例中，所述氧化还原酶可以是NAD(P)H依赖性醇脱氢酶(ADH)。特别地，所述ADH可以来自大肠杆菌(Escherichia coli)MS 187-1(ZP_07145023)、来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(P42328)、来自富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(ACB78191.1)、来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(YP_795183.1)、来自高加索乳杆菌(Lactobacillus kefiri)(ACF95832.1)、来自马肝、来自泛养副球菌(Paracoccus pantotrophus)(ACB78182.1)或来自矢野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)(EU427523.1)。在一个实例中，所述ADH可以是黄素依赖性ADH，例如来自热带假丝酵母的那种(AAS46878.1)。当使用丁醇作为碳源时，即当使用丁醇作为根据本发明的任一方面的C₄分子时(所述丁醇直接地或以从丁烷原位产生的方式进行使用)，可以使用ADH。

在一个实例中，所述氧化还原酶可以来自葡萄糖-甲醇-胆碱-氧化还原酶家族，尤其是来自柄杆菌属物种(Caulobacter sp.)K31的那种(ABZ74557.1)。当使用丁醇作为碳源时，即当使用丁醇作为根据本发明的任一方面的C₄分子时(所述丁醇直接地或以从丁烷原位产生的方式进行使用)，也可以使用该特别的氧化还原酶。

术语“增加的酶的活性”是指增加的细胞内活性。

下面关于增加细胞中的酶活性的描述和定义应用于酶E₁至E₃和氧化还原酶的活性的增加，以及应用于所有在本公开内容中随后提及的其活性可以任选地被增加的酶。特别地，所有在整个本说明书中关于酶E₁、E₂和E₃所描述的方法可以应用于可以任选地存在于根据本发明的任一方面的重组细胞中的氧化还原酶。

原则上，酶活性的增加可以通过下列方式来实现：增加编码所述酶的基因序列的拷贝数；使用强启动子或经改善的核糖体结合位点；减弱基因表达的负调控，例如通过转录调节蛋白，或放大基因表达的正调控；改变所述基因的密码子使用；以各种方式增加mRNA或酶的半寿期；改变所述基因的表达调控；或者使用编码合适的具有增加的活性的酶的基因或等位基因；和任选地，将这些措施相组合。根据本发明的任一方面，产生经基因工程改造的细胞，例如通过转化、转导、接合或这些方法的组合，其中使用包含所希望的基因、该基因的等位基因或其部分和任选地包含使所述基因的表达成为可能的启动子的载体。特别地，异源表达通过将所述基因或等位基因整合到细胞的染色体中或整合到染色体外复制型载体中来实现。

DE-A-10031999给出了数个用于增加细胞中的酶活性的方式的例子，其通过丙酮酸羧化酶来例示。技术人员将会容易地能够使用在DE-A-10031999中所公开的方法来增加在根据本发明的任一方面的细胞中的酶活性。

借助于1-维和/或2-维蛋白质凝胶分开和随后的通过使用合适的分析软件的在凝胶中蛋白质浓度的光学鉴定，上面和所有随后提及的酶或基因的表达是可检测的。如果酶活性的增加唯一地基于相应的基因的表达的增加，那么所述酶活性的增加的定量可以以简单的方式通过在野生型和经基因工程改造的细胞之间比较1-维和/或2-维蛋白质分开来测定。用于在棒杆菌属(Corynebacterium)情况下的蛋白质凝胶的制备和用于蛋白质鉴定的惯常方法为由Hermann等人,2001所描述的程序。蛋白质浓度可以通过下述方式来分析：使用对于待检测的蛋白质来说特异的抗体的Western印迹杂交(Sambrook等人,1989)，和随后的使用合适的用于浓度测定的软件的光学分析(Lohaus和Meyer,1989)。DNA结合蛋白的活性可以借助于DNA条带移位测定法(也称为凝胶阻滞)来测量(Wilson等人,2001)。DNA结合蛋白对于其他基因的表达的作用可以通过各种众所周知的报道基因测定法方法来检测(Sambrook等人,1989)。细胞内酶活性也可以按照各种已建立的方法来测定(Donahue等人,2000；Ray等人,2000；Freedberg等人,1973)。如果在下面的实施例中对于某种精确的酶的活性的测定没有指出特定的方法，那么酶活性的增加的测定或酶活性的减少的测定可以借助于在Hermann等人,2001，Lohaus等人,1998，Lottspeich，1999和Wilson等人,2001中所描述的方法来进行。

如果酶活性的增加通过内源基因的突变来完成，那么此类突变可以随机地产生，这要么通过常规方法例如通过UV辐射或通过诱变化学品来进行，要么借助于基因工程方法例如缺失、插入和/或核苷酸交换而选择性地来进行。通过这些突变来获得经修饰的细胞。酶的突变体特别地还是那些这样的酶，其不再是反馈可抑制的、产物可抑制的或底物可抑制的，或者至少相比于野生型酶而言在减小的程度上是反馈可抑制的、产物可抑制的或底物可抑制的。

如果酶活性的增加是通过酶的合成的增加来完成的，那么可以增加相应的基因的拷贝数，或者可以使位于结构基因上游的启动子和调控区或核糖体结合位点突变。在结构基因上游掺入的表达盒以相同的方式发挥作用。借助于至少诱导型启动子，也可能在任何所希望的时间点增加基因的表达。也可以给目的酶基因分配“增强子”作为调控序列，其同样地借助于经改善的在RNA聚合酶和DNA之间的相互作用而带来增加的基因表达。作为用于延长mRNA的寿命的措施的结果，同样地改善了表达。此外，通过阻止酶蛋白质的降解，也可以增加酶活性。在此，所述基因或基因构建体要么存在于具有不同拷贝数的质粒中，要么整合在染色体中并在其中扩增。在另一个实例中，所涉及的基因的过表达可以通过改变培养基组成和培养管理来实现。本领域技术人员能够找到关于此的指导，尤其是在Martin等人,1987，Guerrero等人,1994，Tsuchiya和Morinaga,1988，Eikmanns等人,1991，EP-A-0472869，US 4,601,893，Schwarzer和Pühler,1991，Reinscheid等人,1994，LaBarre等人,1993，WO96/15246A，Malumbres等人,1993，JP10229891A，Jensen和Hammer,1998中，和在已知的遗传学和分子生物学教科书中。像突变那样，上面所描述的措施同样地导致可以在本发明的任一方面中使用的经基因工程改造的细胞。

例如，将附加型质粒用于增加各自基因的表达。合适的质粒或载体原则上均是对于本领域技术人员来说为了该目的在理论上可得的。此类质粒和载体可以取自例如Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech或Gibco BRL这些公司的小册子。特别地，质粒和载体可以在下列文献中找到：Glover,D.M.,1985；Rodriguez,R.L.和Denhardt,D.T.,1988,Butterworth,Stoneham；Goeddel,D.V.,1990；Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,1989。

然后，将包含待扩增的基因的质粒载体通过接合或转化而转换至所希望的菌株。接合的方法例如描述在等人,1994中。用于转化的方法例如至少描述在Thierbach等人,1988，Dunican和Shivnan,1989和Tauch等人,1994中。在借助于“交换(cross-over)”事件的同源重组后，所得的菌株包含至少两个拷贝的所涉及的基因。通过使用该方法，至少可以在所述菌株中将所述基因的拷贝数增加至所希望的数目。

在上面和在下面实施例中所使用的措词之下，“相比于其野生型而言增加的酶(E_x)的活性”总是是指各自酶E_x的活性的增加程度为至少2倍，特别地至少10倍，更特别地至少100倍，更加特别地至少1,000倍，和最特别地至少10,000倍。特别地，具有“相比于其野生型而言增加的酶(E_x)的活性”的根据本发明的任一方面的细胞还包括这样的细胞，其野生型不包含该酶E_x的活性或至少不包含可检测的该酶E_x的活性，并且其仅在增加了酶活性(例如通过过表达)之后才显示出可检测的该酶E_x的活性。在该背景下，术语“过表达”或在下面实施例中所使用的措词“增加表达”还包括这样的情况，其中起始细胞，例如野生型细胞，不具有酶E_x的表达或至少不具有可检测的酶E_x的表达，并且可检测的酶E_x的合成仅通过重组方法来诱导。E_x也可以是指氧化还原酶。

细胞的“野生型”在此指定其基因组以如通过进化而天然地形成的那样的状态存在的细胞。该术语用于整个细胞以及独个基因。因此，术语“野生型”特别地不包括其基因序列至少部分地被人借助于重组方法进行了修饰的那些细胞或那些基因。

特别地，相对于野生型细胞而言酶活性的增加可以通过使用本领域已知的常规方法来测量。例如E₁、E₂和E₃的活性的增加可以通过使用在Burger,M.M.,1963和Burger,M.M.,1966中所公开的方法来测量。

不导致给定多肽的特性和功能的显著变化的给定多肽序列的氨基酸基团的变化是本领域技术人员已知的。因此，例如“保守氨基酸”可以互相交换。此类氨基酸置换的例子包括但不限于：Ala置换为Ser；Arg置换为Lys；Asn置换为Gln或His；Asp置换为Glu；Cys置换为Ser；Gln置换为Asn；Glu置换为Asp；Gly置换为Pro；His置换为Asn或Gln；Ile置换为Leu或Val；Leu置换为Met或Val；Lys置换为Arg或Gln或Glu；Met置换为Leu或Ile；Phe置换为Met或Leu或Tyr；Ser置换为Thr；Thr置换为Ser；Trp置换为Tyr；Tyr置换为Trp或Phe；Val置换为Ile或Leu。同样地知晓，以例如氨基酸插入或缺失的形式的变化(特别是在多肽的N-或C-末端处)常常对于该多肽的功能不产生显著的影响。

酶的活性可以通过以本领域技术人员已知的方式(例如借助于球磨机、弗式压碎器或超声破碎器)使包含该活性的细胞破裂来测定。随后，可以通过在13,000rpm和4℃下至少离心10分钟来进行细胞、细胞碎片和破裂助剂(例如玻璃珠)的分开。

然后，可以通过使用所得的无细胞的粗提取物来进行具有随后的产物的LC-ESI-MS检测的酶测定法。备选地，所希望的酶可以通过本领域技术人员已知的手段，例如通过色谱学方法(例如镍-氨三乙酸亲和色谱法、链霉抗生物素蛋白亲和色谱法、凝胶过滤色谱法或离子交换色谱法)来进行富集，或者纯化至同质。

酶E₁的活性可以通过使用如上面所描述的那样而获得的酶样品以下面的方式来进行测定：标准测定法可以在120μL的最终体积中包含100μΜ大肠杆菌ACP，1mMβ-巯基乙醇，200μΜ丙二酸单酰辅酶A，40μΜ辛酰辅酶A(对于E_1a)或十二烷酰辅酶A(对于E_1b)，100μΜNADPH，2μg的大肠杆菌FabD，2μg的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)FabH，1μg的大肠杆菌FabG，0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)和5μg的酶E₁。将ACP、β-巯基乙醇和磷酸钠缓冲液在37℃下温育30分钟以完全地还原ACP。然后，通过添加酶E₁来开始反应。所述反应可以通过使用2ml的已用HCl酸化至pH 2.0的水来终止，并随后用2ml的氯仿/甲醇(2:1(v:v))提取两次。然后，通过离心(16,100g，5分钟，室温)来进行相分开。可以取出下部的有机相，将其在真空离心机中完全蒸发，并且可以将沉淀物吸收在50μl的甲醇中。未溶解的成分通过离心(16,100g，5分钟，室温)作为沉淀物被除去，并且将样品借助于LC-ESI-MS来进行分析。产物的鉴定通过相应的质量迹线(mass trace)和MS²谱的分析来进行。

酶E₂的活性可以如下地通过使用如上面所描述的那样而获得的酶样品以下面的方式来进行测定：标准测定法可以包含185μl的10mM tris-HCl(pH 7.5)，10μl的125mM dTDP-鼠李糖和50μl的蛋白质粗提取物(大约1mg的总蛋白质)或在溶液中的经纯化的蛋白质(5μg的经纯化的蛋白质)。通过添加10μl的10mM的3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸(对于E_2a)或3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸(对于E_2b)的乙醇溶液来开始反应，并将其在摇动(600rpm)下于30℃温育1小时。随后，所述反应可以用1ml的丙酮进行处理。未溶解的成分通过离心(16,100g，5分钟，室温)作为沉淀物被除去，并且将样品借助于LC-ESI-MS来进行分析。产物的鉴定通过相应的质量迹线和MS²谱的分析来进行。

酶E₃的活性可以通过使用如上面所描述的那样而获得的酶样品如下地来进行测定：标准测定法可以包含185μl的10mM tris-HCl(pH 7.5)，10μl的125mM dTDP-鼠李糖和50μl的蛋白质粗提取物(大约1mg的总蛋白质)或在溶液中的经纯化的蛋白质(5μg的经纯化的蛋白质)。通过添加10μl的10mM的α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸(对于E_3a)或α-L-吡喃型鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸(对于E_3b)的乙醇溶液来开始反应，并将其在摇动(600rpm)下于30℃温育1小时。随后，所述反应用1ml的丙酮进行处理。通过离心(16,100g，5分钟，室温)来沉淀出未溶解的成分，并且将样品借助于LC-ESI-MS来进行分析。产物的鉴定通过相应的质量迹线和MS²谱的分析来进行。

根据本发明的任一方面的重组细胞可以具有增加的至少E₁、E₂和/或E₃的活性。特别地，所述细胞可以具有增加的E₁、E₂或E₃或者其组合的活性。更特别地，所述细胞可以具有增加的E₁、E₂和E₃的活性。在一个实例中，所述细胞具有增加的E₁和E₂，或E₁和E₃，或E₂和E₃的活性。

氧化还原酶的活性可以通过本领域中已知的任何方法来测定。特别地，alkB类型的氧化还原酶的活性可以通过使用在WO2009/077461A1中所公开的方法来测定，P450类型的单加氧酶的活性可以通过使用在Scheps,D等人,2011中所提供的方法来测定，和ADH的活性可以通过在Benson,S.,Shapiro,J.,J.Bacteriol.1976,126,794-798中所提供的方法来测定。

可以使根据本发明的任一方面的经基因工程改造的细胞在分批过程(分批培养)中或者在补料分批过程(补料过程)或重复的补料分批过程(重复补料过程)中与培养基连续地或不连续地相接触以为了产生上面提及的产物，并因此进行培养。半连续过程也是可想到的，如在GB-A-1009370中所描述的。已知的培养方法的概括描述在Chmiel的教科书中或描述在Storhas的教科书中。待使用的培养基必须以合适的方式满足各自菌株的需求。不同酵母菌株的培养基的描述例如包含在Klaus Wolf,1996中。

根据本发明的任一方面的细胞可以是原核生物或真核生物。这些细胞可以是哺乳动物细胞(例如，来自人的细胞)，植物细胞，或者微生物例如酵母、真菌或细菌，其中微生物是特别优选的，并且细菌和酵母是最优选的。

合适的细菌、酵母或真菌特别地为作为细菌、酵母或真菌菌株保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,GmbH(DSMZ)),Brunswick,Germany中的那些细菌、酵母或真菌。根据本发明合适的细菌属于在http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm之下所列出的类别；根据本发明合适的酵母属于在http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm之下所列出的那些类别；和根据本发明合适的真菌为在http://www.dsmz.de/species/fungi.htm之下所列出的那些。

特别地，所述细胞可以选自下列属：曲霉属(Aspergillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、乳杆菌属(Lactobacillus)、副球菌属(Paracoccus)、乳球菌属(Lactococcus)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、糖酵母属(Saccharomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、耶氏酵母属(Yarrowia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红细菌属(Rhodobacter)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、梭菌属(Clostridium)和贪铜菌属(Cupriavidus)。更特别地，所述细胞可以选自由下列各项组成的组：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、广泛产碱菌(Alcaligenes latus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)、巴西伯克霍尔德氏菌(B.brasilensis)、喀里多尼亚伯克霍尔德氏菌(B.caledonica)、加勒比伯克霍尔德氏菌(B.caribensis)、石竹伯克霍尔德氏菌(B.caryophylli)、真菌状伯克霍尔德氏菌(B.fungorum)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(B.gladioli)、格氏伯克霍尔德氏菌(B.glathei)、荚壳伯克霍尔德氏菌(B.glumae)、禾草伯克霍尔德氏菌(B.graminis)、好客伯克霍尔德氏菌(B.hospita)、久留里伯克霍尔德氏菌(B.kururiensis)、吩嗪伯克霍尔德氏菌(B.phenazinium)、瘤块伯克霍尔德氏菌(B.phymatum)、固植伯克霍尔德氏菌(B.phytofirmans)、植物伯克霍尔德菌(B.plantarii)、甘蔗伯克霍尔德氏菌(B.sacchari)、新加坡伯克霍尔德氏菌(B.singaporensis)、肮脏伯克霍尔德氏菌(B.sordidicola)、地生伯克霍尔德氏菌(B.terricola)、热带伯克霍尔德氏菌(B.tropica)、结节伯克霍尔德氏菌(B.tuberum)、乌汶伯克霍尔德氏菌(B.ubonensis)、B.unamae、食异伯克霍尔德氏菌(B.xenovorans)、花伯克霍尔德氏菌(B.anthina)、吡咯菌素伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)、泰国伯克霍尔德氏菌(B.thailandensis)、布兰克假丝酵母(Candida blankii)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、善变副球菌(Paracoccus versutus)、阿根廷假单胞菌(Pseudomonas argentinensis)、P.borbori、香茅醇假单胞菌(P.citronellolis)、变黄假单胞菌(P.flavescens)、门多萨假单胞菌(P.mendocina)、硝基还原假单胞菌(P.nitroreducens)、食油假单胞菌(P.oleovorans)、类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)、食树脂假单胞菌(P.resinovorans)、稻草假单胞菌(P.straminea)、桔黄假单胞菌(P.aurantiaca)、致金色假单胞菌(P.aureofaciens)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、莓实假单胞菌(P.fragi)、隆德假单胞菌(P.lundensis)、腐臭假单胞菌(P.taetrolens)、南极假单胞菌(P.antarctica)、产氮假单胞菌(P.azotoformans)、布拉奇福德假单胞菌(P.blatchfordae)、十字花科假单胞菌(P.brassicacearum)、布伦纳假单胞菌(P.brenneri)、雪松假单胞菌(P.cedrina)、皱纹假单胞菌(P.corrugata)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、热莎尔假单胞菌(P.gessardii)、黎巴嫩假单胞菌(P.libanensis)、曼德尔假单胞菌(P.mandelii)、边缘假单胞菌(P.marginalis)、地中海假单胞菌(P.mediterranea)、南方假单胞菌(P.meridiana)、米古拉假单胞菌(P.migulae)、霉味假单胞菌(P.mucidolens)、东方假单胞菌(P.orientalis)、人参假单胞菌(P.panacis)、溶蛋白假单胞菌(P.proteolytica)、罗德岛假单胞菌(P.rhodesiae)、类黄假单胞菌(P.synxantha)、赛维瓦尔假单胞菌(P.thivervalensis)、托拉氏假单胞菌(P.tolaasii)、维罗纳假单胞菌(P.veronii)、反硝化假单胞菌(P.denitrificans)、百日咳假单胞菌(P.pertucinogena)、酪着色假单胞菌(P.cremoricolorata)、黄褐假单胞菌(P.fulva)、蒙泰伊假单胞菌(P.monteilii)、莫塞尔假单胞菌(P.mosselii)、副黄假单胞菌(P.parafulva)、恶臭假单胞菌(P.putida)、巴利阿里假单胞菌(P.balearica)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、扁桃假单胞菌(P.amygdali)、洋榛假单胞菌(P.avellanae)、番木瓜假单胞菌(P.caricapapayae)、菊苣假单胞菌(P.cichorii)、晕斑假单胞菌(P.coronafaciens)、天仙果假单胞菌(P.ficuserectae)、向日葵假单胞菌(P.helianthi)、苦楝假单胞菌(P.meliae)、萨氏假单胞菌(P.savastanoi)、丁香假单胞菌(P.syringae)、番茄假单胞菌(P.tomato)、绿黄假单胞菌(P.viridiflava)、嗜松香烷假单胞菌(P.abietaniphila)、嗜酸假单胞菌(P.acidophila)、伞菌假单胞菌(P.agarici)、嗜碱假单胞菌(P.alcaliphila)、解碱假单胞菌(P.alkanolytica)、淀粉皮假单胞菌(P.amyloderamosa)、铁角蕨假单胞菌(P.asplenii)、P.azotifigens、大麻假单胞菌(P.cannabina)、海污假单胞菌(P.coenobios)、P.congelans、科斯坦廷假单胞菌(P.costantinii)、克罗斯韦假单胞菌(P.cruciviae)、德里假单胞菌(P.delhiensis)、外囊假单胞菌(P.excibis)、极东假单胞菌(P.extremorientalis)、弗雷德里克斯堡假单胞菌(P.frederiksbergensis)、褐鞘假单胞菌(P.fuscovaginae)、石花菜假单胞菌(P.gelidicola)、格莱蒙特假单胞菌(P.grimontii)、印度假单胞菌(P.indica)、热桑假单胞菌(P.jessenii)、晋州假单胞菌(P.jinjuensis)、基尔假单胞菌(P.kilonensis)、P.knackmussii、高丽假单胞菌(P.koreensis)、亚麻假单胞菌(P.lini)、藤黄假单胞菌(P.lutea)、摩拉维亚假单胞菌(P.moraviensis)、耳炎假单胞菌(P.otitidis)、P.pachastrellae、P.palleroniana、罂粟假单胞菌(P.papaveris)、P.peli、腐卵假单胞菌(P.perolens)、早熟禾假单胞菌(P.poae)、浦项假单胞菌(P.pohangensis)、嗜冷假单胞菌(P.psychrophila)、耐冷假单胞菌(P.psychrotolerans)、拉梭假单胞菌(P.rathonis)、食爬虫假单胞菌(P.reptilivora)、嗜树脂假单胞菌(P.resiniphila)、根际假单胞菌(P.rhizosphaerae)、浅红假单胞菌(P.rubescens)、萨洛莫假单胞菌(P.salomonii)、P.segitis、败血假单胞菌(P.septica)、猿猴假单胞菌(P.simiae)、猪假单胞菌(P.suis)、耐热假单胞菌(P.thermotolerans)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、山黄麻假单胞菌(P.tremae)、次要假单胞菌(P.trivialis)、陀螺形假单胞菌(P.turbinellae)、杜蒂戈林假单胞菌(P.tuticorinensis)、阴城假单胞菌(P.umsongensis)、温哥华假单胞菌(P.vancouverensis)、弗拉诺夫假单胞菌(P.vranovensis)、黄色海洋假单胞菌(P.xanthomarina)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobile)。更加特别地，所述细胞选自由下列各项组成的组：恶臭假单胞菌、大肠杆菌和泰国伯克霍尔德氏菌。

根据本发明的任一方面，处于其野生型的细胞可以不能够形成可检测量的鼠李糖脂，和/或不具有酶E₁、酶E₂、酶E₃和/或氧化还原酶的活性或者不具有可检测的酶E₁、酶E₂、酶E₃和/或氧化还原酶的活性。

根据本发明有利的是，所述细胞以其野生型能够形成具有C₆-C₁₆的单链烷酸酯链长的聚羟基链烷酸酯。此类细胞例如为伯克霍尔德氏菌属物种、泰国伯克霍尔德氏菌、假单胞菌属物种、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、食油假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、香茅醇假单胞菌、食树脂假单胞菌、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、广泛产碱菌和富养罗尔斯通氏菌。在该背景下，根据本发明的任一方面的细胞可以如此地进行基因工程改造，从而它们能够形成相比于其野生型而言更少的聚羟基链烷酸酯。此类细胞例如至少描述在De Eugenio等人,2010和Rehm等人,2001中。这样的能够形成相比于其野生型而言更少的聚羟基链烷酸酯的重组细胞的特征特别地在于，它具有相比于其野生型而言减少的至少一种酶E₉或E₁₀的活性。

E₉表示聚羟基链烷酸酯合酶，EC:2.3.1.，其特别地具有多肽序列SEQ ID NO:20(E_9a)或SEQ ID NO:21(E_9b)，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于各自的参考序列SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21而言至多25％、20％、15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有各自的参考序列SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的酶的酶活性的至少10％、50％，特别地80％，特别地大于90％，其中关于酶E₉(E_9a和E_9b)的酶活性可以是指将3-羟基链烷酰辅酶A转化为聚-3-羟基链烷酸，特别地将3-羟基十四烷酰辅酶A转化为聚-3-羟基十四烷酸的能力。

E₁₀表示3-羟基链烷酰基-ACP:辅酶A转移酶，其特别地具有多肽序列SEQ ID NO:22(E_10a)或SEQ ID NO:23(E_10b)，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于各自的参考序列SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23而言至多25％、20％，特别地15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有各自的参考序列SEQ ID NO:22(E_10a)或SEQ ID NO:23(E_10b)的酶的酶活性的至少10％、50％，特别地80％，特别地大于90％，其中关于酶E₁₀(E_10a和E_10b)的酶活性可以是指将3-羟基链烷酰基-ACP转化为3-羟基链烷酰辅酶A，特别地将3-羟基链烷酰基-ACP转化为3-羟基十四烷酰辅酶A的能力。

酶E₉(E_9a和E_9b)的活性可以例如通过使用如上面对于酶E₁至E₃所描述那样而获得的样品以下述方式来测定：首先混合560μl的100mM tris/HCl(pH 7.5)、20μl的在DMSO中的35mM DTNB和20μl的41mM 3-羟基癸酰辅酶A。随后，添加在100μl的tris/HCl(pH 7.5)中的5μg的经纯化的酶E₉，并随后在分光光度计中在1分钟期间内连续地记录随时间而发生的在412nm处的消光的增加(由于添加5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸盐)(DTNB)以释放SH基团而引起)(ΔΕ/分钟)。

酶E₁₀(E_10a和E_10b)的活性可以例如通过使用如上面对于酶E₁至E₃所描述那样而获得的样品来测定。标准测定法可以在200μl的总体积中包含3mM MgCl₂、40μM羟基癸酰辅酶A和20μM大肠杆菌ACP(在50mM tris-HCl(pH 7.5)中)。通过添加在50μl的tris-HCl(pH 7.5)中的5μg的经纯化的酶E₁₀来开始反应，并将其在30℃下温育1小时。所述反应通过添加50％(w/v)三氯乙酸和10mg/ml的BSA(30μl)来终止。所释放出的辅酶A可以通过记录随时间而发生的在412nm处的消光的增加(其由于添加5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸盐)(DTNB)以释放SH基团而引起)以分光光度法来测定。

关于本发明的任一方面而使用的短语“减少的酶E_x的活性”可以是指活性的减少程度为至少0.5倍，特别地至少0.1倍，更特别地至少0.01倍，更加特别地至少0.001倍，和最特别地至少0.0001倍。短语“减少的活性”还包括不可检测的活性(“零活性”)。某种酶的活性的减少可以例如通过选择性突变或者通过本领域技术人员已知用于减少某种酶的活性的其他措施来实施。

特别地，例如至少在Dubeau等人,2009，Singh&2008，Lee等人,2009等中，本领域技术人员可找到关于借助于间断特定的基因来实现蛋白质表达的修饰和减少以及伴随的酶活性降低(尤其是对于假单胞菌属和伯克霍尔德氏菌属)的指导。

根据本发明的任一方面的细胞的特征在于，酶活性的减少通过修饰包含所述核酸序列之一的基因来实现，其中所述修饰选自包括下列各项的组或由下列各项组成的组：在所述基因中外源DNA的插入，所述基因的至少部分的缺失，在所述基因序列中的点突变，RNA干扰(siRNA)，反义RNA，或者位于所述基因侧翼的调控序列例如启动子和终止子或者核糖体结合位点的修饰(插入、缺失或点突变)。

在该背景下，外源DNA是指任何这样的DNA序列，其对于所述基因来说(而不是对于所述生物来说)是“外来的”，即在该背景下内源性DNA序列也可以担当“外源DNA”。在该背景下，特别优选的是，所述基因通过插入选择标记基因而被间断，因此所述外源DNA为选择标记基因，其中所述插入优选地通过在所述基因座位中的同源重组来实施。

特别地，可以根据本发明的任一方面进行使用的细胞可以是恶臭假单胞菌细胞，其具有相比于其野生型而言减少的聚羟基链烷酸酯合成。此类细胞例如至少作为KTOY01和KTOY02而描述在Ren等人,1998，Huisman等人,1991，De Eugenio等人,2010和Ouyang等人,2007中。

根据本发明的方法而形成的鼠李糖脂可以至少具有通式(I)或其盐，

其中

m＝2、1或0，特别地1或0，

n＝1或0，特别地1，

R¹和R²＝相互独立地，相同或不同的、具有2至24个(优选地5至13个)碳原子的有机基团，特别地，任选地支化的、任选地经取代的(特别地经羟基取代的)、任选地不饱和的(特别地任选地单不饱和、双不饱和或三不饱和的)烷基基团，其可以选自由下列各项组成的组：戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一碳烯基和十三碳烯基，以及(CH₂)_o-CH₃，其中o＝1至23，优选地4至12。

对于根据本发明的任一方面的细胞能够形成具有m＝1的鼠李糖脂的情况，所述基团可以为

其借助于衍生自下列化合物的R¹和R²来定义：3-羟基辛酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基十二碳烯酸、3-羟基十二碳烯酰基-3-羟基辛酸、3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十二碳烯酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四碳烯酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基十二碳烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四碳烯酸、3-羟基十四碳烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基十二烷酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二碳烯酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷酰基-3-羟基十二碳烯酸、3-羟基十二烷酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十六烷酸或3-羟基十六烷酰基-3-羟基十六烷酸。

对于本领域技术人员来说明显的是，根据本发明的任一方面，可以形成不同的具有通式(I)的鼠李糖脂的混合物。

在该背景下，根据本发明的任一方面的细胞可以能够形成具有通式(I)的鼠李糖脂的混合物，其特征在于，在大于80重量％，大于90重量％，特别地大于95重量％的所形成的鼠李糖脂中，n＝1，并且在小于10重量％，小于5重量％，特别地小于2重量％的所形成的鼠李糖脂中，借助于R¹和R²进行定义的基团衍生自3-羟基癸酰基-3-羟基辛酸或3-羟基辛酰基-3-羟基癸酸，其中所指出的“重量％”涉及所有所形成的具有通式(I)的鼠李糖脂之和。

由于根据本发明的任一方面的细胞可以有利地用于生产鼠李糖脂并且由于这些脂质随后任选地进行纯化，因此如果根据本发明的任一方面的细胞具有相比于其野生型而言增加的至少一种酶E₈(其催化具有通式(I)的鼠李糖脂从细胞中输出到周围的培养基中)的活性，那么这是有利的。

在该背景下，蛋白质E₈选自由下列各项组成的组：

酶E₈，其具有多肽序列SEQ ID NO:16(E_8a)、SEQ ID NO:17(E_8b)、SEQ ID NO:18(E_8c)或SEQ ID NO:19(E_8d)，或者具有这样的多肽序列，在该多肽序列中相比于各自的参考序列SEQ ID NO:16(E_8a)、SEQ ID NO:17(E_8b)、SEQ ID NO:18(E_8c)或SEQ ID NO:19(E_8d)而言至多25％，至多20％，特别地至多15％，特别地至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸基团通过缺失、插入、置换或其组合而被修饰，并且该多肽序列仍然有着具有各自的参考序列SEQ ID NO:16(E_8a)、SEQ ID NO:17(E_8b)、SEQ ID NO:18(E_8c)或SEQ ID NO:19(E_8d)的酶的酶活性的至少50％、65％，特别地80％，特别地大于90％，其中关于酶E₈(E_8a、

E_8b、E_8c和E_8d)的酶活性是指将具有通式(I)的鼠李糖脂从细胞中输出到周围的培养基中的能力。

表1.根据本发明的任一方面所使用的酶的序列

附图简述

图1是图解说明了依赖于不同碳源而形成的鼠李糖脂产物的组成(以百分比表示)的图。

实施例

下面描述了优选的实施方案，其如本领域技术人员将会理解的，可以经历在设计、构建或操作方面的改变或修饰，而不背离权利要求书的范围。例如，这些改变旨在由权利要求书的范围所涵盖。

在用恶臭假单胞菌生产鼠李糖脂中，于在不同的实施例中测定产物浓度之前，将反应样品在发酵之后立即用丙酮以1:1的体积比进行稀释，并在21,000g和4℃下离心2分钟。然后，将样品上清液通过HPLC进行测量。

实施例1(比较实施例，非本发明的)

用BS-PP-001从葡萄糖生产鼠李糖脂

在包含50mg/l卡那霉素的LB琼脂平板上，将一个接种环的恶臭假单胞菌菌株KT2440pBBR1MCS-2::ABC(BS-PP-001)的甘油冷冻培养物进行划线。产生载体pBBR1MCS-2::ABC的方法提供在DE102010032484A1的实施例2中。然后，将恶臭假单胞菌用该载体进行转化并储存。将琼脂平板在30℃下温育24小时。将包含25ml的具有卡那霉素的LB培养基的100ml的具有挡板的瓶用长满了的琼脂平板的单个培养物进行接种，并在摇动培养器中在30℃和200rpm下温育24小时以产生预培养物。将预培养物在室温下以5500g离心10分钟。然后弃去上清液。将粒状沉淀重悬浮在25ml的M9培养基(组成：6.8g/l Na₂PO₄·2H₂O，2.4g/l KH₂PO₄，0.4g/l NaCl，1.6g/l NH₄Cl，0.5g/l MgSO₄·7H₂O，1ml的由36.5g/l的强度为37％的盐酸、1.91g/l MnCl₂·4H₂O、1.87g/l ZnSO₄·7H₂O、0.84g/l Na-EDTA·2H₂O、0.3g/l H₃BO₃、0.25g/l Na₂MoO₄·2H₂O、4.7g/l CaCl₂·2H₂O、17.3g/l FeSO₄·7H₂O、0.15g/l CuCl₂·2H₂O组成的痕量元素溶液US3)中。然后，重复该洗涤步骤。

在300ml的发酵罐中，向180ml的上面所描述的M9培养基中添加20g/l葡萄糖和50mg/l卡那霉素。用大体积的预培养物悬浮液接种所述发酵罐，以达到0.4的起始OD₆₀₀。在发酵期间设置下列参数：2NL/小时的用空气进行的通气，通过调节搅拌速度而调节至30％的溶解氧浓度。该测量通过使用标准的氧传感器、30℃的温度、7.4的初始pH值(在整个实验中不调节)来进行。在40小时的发酵后，通过注射器供给葡萄糖溶液(在发酵罐中的浓度：15g/l)。在规定的时间处，从发酵罐中取出样品以测定所产生的鼠李糖脂和脂肪酸二聚体的浓度。

结果显示在下面的表2和图1中。

实施例2

用BS-PP-001从丁酸生产鼠李糖脂

与采用葡萄糖的实施例1类似地来制备预培养物。

在300ml的发酵罐中，向180ml的在实施例1中所描述的M9培养基中添加6.5g/l丁酸钠和50mg/l卡那霉素。用大体积的预培养物悬浮液接种所述发酵罐，以达到0.4的起始OD₆₀₀。在发酵期间设置下列参数：2NL/小时的用空气进行的通气，设置在300rpm的搅拌速度，30℃的温度，7.4的初始pH值(在整个实验中不调节)。在40小时的发酵后，通过注射器供给丁酸钠溶液(在发酵罐中的浓度：5g/l丁酸)。将搅拌速度增加至900rpm。

在规定的时间处，从发酵罐中取出样品以测定所产生的鼠李糖脂和脂肪酸二聚体的浓度。

结果显示在下面的表2和图1中。

实施例3

使用BS-PP-001+alkB从正丁烷生产鼠李糖脂

在包含50mg/l卡那霉素的LB琼脂平板上，将满满一个接种环的恶臭假单胞菌菌株pBBR1MCS-2::ABC pBT10(BS-PP001+alkB)的甘油冷冻培养物进行划线。该菌株是通过向实施例1的菌株添加在WO2009/077461A1的第36和37页上所描述的基因构建体pΒΤ10(SEQ-ID 31)而产生的。将该琼脂平板在30℃下温育24小时。

将三个100ml的具有挡板的瓶装以25ml的包含卡那霉素的LB培养基，并且将每个瓶用长满了的琼脂平板的单个培养物进行接种并在摇动培养器中在30℃和200rpm下温育24小时。

三个1升的具有挡板的瓶中的每一个用于混合75ml的经改良的M9培养基(组成：15g/l葡萄糖，6.8g/l Na₂PO₄，3g/l KH₂PO₄，0.5g/l NaCl，2g/l NH₄Cl，15g/l酵母提取物，0.49g/l MgSO₄·7H₂O，50mg/l硫酸卡那霉素，15ml/l的由36.5g/l的强度为37％的盐酸、11.91g/l MnCl₂·4H₂O、1.87g/l ZnSO₄·7H₂O、0.84g/l Na-EDTA·2H₂O、0.3g/l H₃BO₃、0.25g/l Na₂MoO₄·2H₂O、4.7g/l CaCl₂·2H₂O、17.3g/l FeSO₄·7H₂O、0.15g/l CuCl₂·2H₂O组成的痕量元素溶液US3)和来自所述100ml的瓶的预培养物。将培养物在30℃和200rpm下进行温育。在3小时的温育后，通过添加0.4mM的二环丙基酮来激活alkBGT基因。将培养物在25℃和200rpm下进一步培养16小时。

合并在所述三个瓶中的培养物，并在室温下以5500g离心10分钟。弃去上清液。将粒状沉淀重悬浮在25ml的M9培养基(其组成提供在上面)中。重复该洗涤步骤以去除葡萄糖和其他可能的碳源。

在300ml的发酵罐中，向180ml的M9培养基(其组成提供在上面，但没有碳源)中添加50mg/l卡那霉素。用大体积的来自早期步骤的预培养物悬浮液接种所述发酵罐，以达到10的起始OD₆₀₀。在发酵期间设置下列参数：2NL/小时的用丁烷/空气混合物(25％/75％)进行的通气，设置在900rpm的搅拌速度，30℃的温度，7.4的初始pH值(在整个实验中不调节)。在规定的时间处，从发酵罐中取出样品以测定所产生的鼠李糖脂和脂肪酸二聚体的浓度。

结果显示在下面的表2和图1中。

表2.基于所使用的底物而产生的鼠李糖脂和脂肪酸二聚体的最终浓度

如可以看出的，表2显示了，恶臭假单胞菌这一物种的配备有来自铜绿假单胞菌的基因rhlA、rhlB和rhlC的菌株KT2440(BS-PP-001)能够产生大约1g/l的产物(其中大约110mg/l为二鼠李糖脂和81mg/l为单鼠李糖脂)，以及几乎800mg的不想要的脂肪酸二聚体(当使用葡萄糖作为底物时)。

当使用丁酸盐作为唯一碳源时，二鼠李糖脂的量显著增加，而仅形成大约三分之一的不想要的脂肪酸二聚体。在另一个实例中，将菌株进行基因工程改造以引入来自恶臭假单胞菌GPO1的氧化还原酶AlkB，并供给丁烷作为唯一碳源。在表2中所提供的结果显示，形成了直至超过1000mg/l的二鼠李糖脂，并且没有产生可测量量的不希望的脂肪酸二聚体。

图1中的结果也图解说明了依赖于不同碳源而形成的产物的组成(以百分比表示)。可以看出，丁酸盐的使用将不想要的脂肪酸二聚体的量从81％减少至64％，并且在使用丁烷和丁醇的情况下，所形成的脂肪酸二聚体的量是不可测量的。

实施例4

使用BS-PP-001+alkB从1-丁醇生产鼠李糖脂

将三个100ml的具有挡板的瓶装以25ml的包含卡那霉素和四环素的LB培养基，并且将每个瓶用100μl的恶臭假单胞菌菌株pBBR1MCS-2::ABC pBT10(BS-PP001+alkB)的甘油冷冻培养物进行接种。该菌株是通过向实施例1的菌株添加在WO2009/077461A1的第36和37页上所描述的基因构建体pBT10(SEQ-ID 31)而产生的。将所述瓶在摇动培养器中在30℃和200rpm下温育24小时。

三个1升的具有挡板的瓶中的每一个用于混合75ml的经改良的M9培养基(组成：15g/l葡萄糖，6.8g/l Na₂PO₄，3g/l KH₂PO₄，0.5g/l NaCl，2g/l NH₄Cl，15g/l酵母提取物，0.49g/l MgSO₄·7H₂O，50mg/l硫酸卡那霉素，10mg/l四环素，15ml/l的由36.5g/l的强度为37％的盐酸、11.91g/l MnCl₂·4H₂O、1.87g/l ZnSO₄·7H₂O、0.84g/l Na-EDTA·2H₂O、0.3g/l H₃BO₃、0.25g/l Na₂MoO₄·2H₂O、4.7g/l CaCl₂·2H₂O、17.3g/l FeSO₄·7H₂O、0.15g/l CuCl₂·2H₂O组成的痕量元素溶液US3)和来自所述100ml的瓶的预培养物。将培养物在30℃和200rpm下进行温育。在3小时的温育后，通过添加0.4mM的二环丙基酮来激活alkBGT基因。将培养物在30℃和200rpm下进一步培养4小时。

合并在所述三个瓶中的培养物，并在室温下以5500g离心10分钟。弃去上清液。将粒状沉淀重悬浮在25ml的M9培养基(其组成提供在上面)中。重复该洗涤步骤以去除葡萄糖和其他可能的碳源。

在300ml的发酵罐中，向180ml的M9培养基(其组成提供在上面，但没有碳源)中添加50mg/l卡那霉素。用10ml的来自早期步骤的预培养物悬浮液接种所述发酵罐，以达到5的起始OD₆₀₀。在发酵期间设置下列参数：3NL/小时的用空气进行的通气，设置在700rpm的搅拌速度，30℃的温度，7.0的pH值(在整个实验中用5％氨溶液进行调节)。通过注射器供给丁醇溶液(供给速率为0.2g/(l·小时))。在规定的时间处，从发酵罐中取出样品以测定所产生的鼠李糖脂和脂肪酸二聚体的浓度。

结果提供在上面的表2中。

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序列表

<110> Evonik Industries AG

<120> 生产鼠李糖脂的方法

<130> 2014P00077

<140> 14169799.5

<141> 2014-05-26

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 399

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(399)

<223> alkB类型的氧化还原酶

<400> 1

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Lys Tyr Leu Trp Ile Leu Ser Thr Leu Trp Pro Ala Thr Pro Met Ile

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<211> 295

<212> PRT

<213> 假单胞菌属物种（Pseudomonas sp.）

<220>

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Cys Leu Ala Glu His Phe Asn Val Val Leu Phe Asp Leu Pro Phe Ala

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Leu Lys Gln Pro Glu Pro Gln Arg Ala Glu Arg Ala Ala Gly Phe His

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<212> PRT

<213> 伯克霍尔德氏菌属物种（Burkholderia sp.）

<220>

<221> SITE

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<223> 酶E1b

<400> 3

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Gly Gly Gln Ile Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Val Glu Ala Ser Ile Lys

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Leu Leu Ser Val Ser Trp Gly Gly Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Ala

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Arg Gly Cys Ala Ser Val Arg Arg Ala Val Ile Ala Ser Phe Ser Pro

165 170 175

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Gln Ile Gly Cys Ala Val Lys Phe Ile Asn Gly Glu Leu Asp Glu Tyr

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<210> 4

<211> 295

<212> PRT

<213> 假单胞菌属物种

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(295)

<223> 酶E1c

<400> 4

Met Arg Arg Glu Ser Leu Leu Val Ser Val Cys Lys Gly Leu Arg Val

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His Val Glu Arg Val Gly Gln Asp Pro Gly Arg Ser Thr Val Met Leu

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Val Asn Gly Ala Met Ala Thr Thr Ala Ser Phe Ala Arg Thr Cys Lys

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Ser Arg Asn Pro Arg Gly Ile Arg Ser Ser Val Val Met Ala Phe Ala

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Pro Gly Leu Asn Gln Ala Met Leu Asp Tyr Val Gly Arg Ala Gln Ala

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Leu Ile Glu Leu Asp Asp Lys Ser Ala Ile Gly His Leu Leu Asn Glu

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Thr Val Gly Lys Tyr Leu Pro Pro Arg Leu Lys Ala Ser Asn His Gln

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Glu Arg Ile Gln Ser His Val His Phe Ile Asn Gly Ser Trp Asp Glu

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Cys Ser Phe Ser Arg Val Glu Gly Thr Gly His Phe Leu Asp Leu Glu

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Ser Lys Leu Ala Ala Val Arg Val His Arg Ala Leu Leu Glu His Leu

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Leu Lys Gln Pro Glu Pro Gln Arg Ala Glu Arg Ala Ala Gly Phe His

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Glu Met Ala Ile Gly Tyr Ala

290 295

<210> 5

<211> 295

<212> PRT

<213> 假单胞菌属物种

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<223> 酶E1d

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Met Arg Arg Glu Ser Leu Leu Val Ser Val Cys Lys Gly Leu Arg Val

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His Val Glu Arg Val Gly Gln Asp Pro Gly Arg Ser Thr Val Met Leu

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Val Asn Gly Ala Met Ala Thr Thr Ala Ser Phe Ala Arg Thr Cys Lys

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Leu Ile Glu Leu Asp Asp Lys Ser Ala Ile Gly His Leu Leu Asn Glu

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Ile Asp Gln Val Leu Ala Leu Asn Asp Arg Gly Tyr Leu Ala Cys Leu

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Leu Lys Gln Pro Glu Pro Gln Arg Ala Glu Arg Ala Ala Gly Phe His

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<211> 295

<212> PRT

<213> 假单胞菌属物种

<220>

<221> SITE

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<211> 426

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<223> 酶E2a

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