用于增加产量的组合物和方法与流程

本发明一般涉及用于在宿主细胞中产生生物分子(例如，生物制剂)，例如治疗性、预防性和诊断性蛋白质的方法和组合物。本发明还涉及增加来自培养的细胞的生物分子的产量。

发明背景

许多生物制剂，例如治疗性、预防性和诊断性蛋白质，生产于宿主细胞中。疫苗抗原，例如用于流感疫苗的免疫抗原，通常在哺乳动物细胞或鸡蛋中产生(Govorkova等，Dev Biol Stand 98:39-51，(1998))。类似地，许多重组蛋白质，包括单克隆抗体和基于肽的治疗剂，产生于合适的宿主细胞中。然而，这些生产系统中的产量常保持在次优状态。

已有若干研究意图增加由细胞培养物或鸡蛋产生的抗原性蛋白质或病毒的产量。流感(药物)制造商已将25μg/ml氢化可的松作为添加剂纳入新鲜接种物，用于感染鸡胚(国际专利申请公开文本WO 02/074336)。已测试采用小分子化合物、药物或蛋白质的处理以增加细胞培养物的生产能力。国际专利申请公开文本WO 2012/134130鉴定了CHD6蛋白和流感病毒聚合酶(作为病毒复制的负调节剂)之间的相互作用。CHD6基因通过用短发夹RNA转染流感感染的HEK293T或A549细胞系来沉默。该技术使得病毒效价增加是对照细胞的约5-10倍。

在另一项研究中，美国专利7,132,271公开了对于干扰素介导的抗病毒应答，尤其是双链RNA依赖性激酶的阻遏，能够改变细胞培养物的许可度以诱导增加的病毒再生。稳定或瞬态细胞经修饰以产生PKR缺陷型或2-5A合成酶缺陷型突变，然后用病毒感染。其公开了EMCV(脑心肌炎病毒)可在PKR缺陷型细胞中以0.001TCID50/细胞复制，导致病毒复制相对于对照的多达1000倍的增加。

在美国专利公开文本2013-0315954中，公开了一种用于改善流感病毒的生成的方法，其中，在Mdm2蛋白和p53蛋白之间的相互作用的小分子抑制剂的存在下进行生成。所述小分子化合物包括咪唑啉衍生物、咪唑衍生物、羟吲哚衍生物、螺吲哚满酮衍生物、喹诺酮衍生物、二芳基磺酰胺衍生物、苯二氮衍生物、哌啶衍生物、苯氧基乙酸衍生物、苯氧基甲基四唑衍生物、查耳酮衍生物、四唑衍生物、二硫化物衍生物、二氨基芳基衍生物和Mdm2蛋白的肽抑制剂。在一个具体实验中，用流感H3N2病毒感染的MDCK细胞系用0.1μM、1.0μM和10μM二氢咪唑化合物(Nutlin-3)处理。上清液中的病毒基因组的检测显示，初始感染复数(MOI)是10^-3，而采用Nutlin在感染后24小时的预处理相比对照在上清液中产生多达19倍更多的病毒基因组拷贝。

国际专利申请公开文本WO 2012/136852公开了采用药学药物来增加MDCK或A549细胞中的甲型(Type A)流感病毒的生产能力。感染后采用药物孵育24-48小时之后，检测了病毒效价和神经氨酸苷酶活性。在用流感亚型A病毒接种之前添加0.01-10μM辛伐他汀，并且在1.0μM浓度下产生了约1.5–3倍H1N1病毒效价增加。仅一种流感亚型A毒株(H1N1但不是H3N2和H5N1)显示在辛伐他汀处理的细胞中产生高于约1.5倍的病毒效价。对于采用甲型流感毒株测试的其它药学药物的病毒产量增加是毒株、剂量和/或药物依赖性的。

迄今为止，没有专利或文献描述采用极低浓度(例如0.05μM或更低)的小分子化合物来增加来自宿主细胞系统的生物分子的产量。仍然需要生产强健、生产效率提高且成本有效的用于治疗性、预防性和诊断性应用的生物产物工艺。

技术实现要素：

本发明一般提供增加蛋白质产量的方法，所述蛋白质适用于药学应用，例如诊断性、治疗性或预防性应用。因此，本发明适于药品，例如，生物制品，包括疫苗的制造。

本发明广义上涵盖对于宿主细胞系统中某些细胞通路的调节的识别，所述识别能够导致宿主细胞中增强的生物分子的生成。在一些实施方式中，可用于本发明的化合物能够调节蛋白质脂化(异戊烯化)、胆固醇生物合成，和/或G蛋白偶联受体信号转导，例如胞内cAMP依赖性信号转导。

更具体地，在一方面中，本发明提供用于增加宿主细胞系统中生物分子(例如重组蛋白质和病毒颗粒)的产量的方法，所述方法通过调节他汀相关联的细胞通路来进行。不希望受具体理论限制，本文中所提供的数据表明，增强作用可通过甲羟戊酸通路介导，同时涉及胆固醇依赖性和胆固醇非依赖性作用机理。

在另一个方面中，本发明提供用于增加宿主细胞系统中生物分子(例如重组蛋白质和病毒颗粒)的产量的方法，所述方法通过调节多巴胺和/或血清素相关联的细胞通路来进行。在一些实施方式中，影响多巴胺通路和/或血清素通路的合适的化合物是一种或多种受体的选择性配体，例如，激动剂和拮抗剂(例如，完全激动剂、部分激动剂、中性拮抗剂、反向激动剂等)。在一些实施方式中，所述化合物通过宿主细胞中至少一种血清素受体的信号转导来作用，所述血清素受体包括但不限于，5-HT7、5-HT1和/或5-HT5受体。在一些实施方式中，所述化合物通过5-HT7受体信号转导作用。在一些实施方式中，所述化合物能降低胞内cAMP水平。

惊人地，本申请的发明人发现，观察到的增强作用不限于宿主细胞中的病毒生成，也不限于具体细胞系。相反，采用本文所述的合适的化合物(例如，能够调节他汀相关联和/或5HTR相关联的信号转导的化合物，包括他汀和他汀样分子、受体配体、结构类似物或衍生物、功能等同物，及其组合)可提供在多种宿主细胞系统中增加蛋白质产量的更通用的方式。此外，发明人已鉴定出本文提供的某些分子，它们在以惊人地低的浓度使用时能有效增强病毒/蛋白质生产。这特别有利于制造需要适于人类应用的高纯度的药品。因此，所述方法适于生物制品的商业规模生产。

因此提供用于从宿主细胞系统(例如细胞培养物或鸡胚)产生蛋白质的方法，包括使宿主细胞与选自表1的至少一种试剂接触，或用选自表1的至少一种试剂处理宿主细胞。所述化合物的残基在下文中详细说明。

表1

在一些实施方式中，至少一种试剂(例如，一种或多种试剂)选自下表中提供的化合物以进行本发明。

表4

从商业和安全性角度来看，通过采用较低浓度的本文所述的化合物特别有利于实现宿主细胞系统(例如细胞培养物和鸡蛋)中增强的蛋白质产量。因此，本发明提供一种用于从宿主细胞系统(例如细胞培养物或鸡蛋)生产生物分子的方法，其包括：使宿主细胞与低浓度的至少一种化学剂(例如他汀或他汀衍生物)接触。在一些实施方式中，所述他汀或所述衍生物不是辛伐他汀。当宿主细胞是细胞培养物时，所述试剂可以0.001μM–10μM，优选0.05μM或更小的终浓度存在。当宿主细胞是鸡胚时，所述化学剂可以至少10-20、30、40、50、60、70、80、90、100μM/鸡蛋或更高的浓度存在。

本发明中所用的合适的化学剂是，当用于细胞或动物时具有治疗功效但无毒的那些。特别希望所述化合物就用于调节目的而言具有充分表征的安全性概况。因此，有用的化学剂可选自市售可得的药学药物，其已经批准为对人类应用安全，因此已经历严格的毒性和清除测试。此类试剂特别适合作为生物生产系统中的生长增强剂。因此，本发明的方法涵盖已知的药学物质、化学剂及其类似物，如本文所述。优选地，这些试剂以一定量使用，其用量使得生物产物的产量比对比对照有效增加至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍，或高达约10倍或更高。

本发明的方法还使按本文所述产生的生物分子或生物产物的产量相比对照增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、500％或更多。优选地，产量的增加可通过如下方式度量：将培养物上清液中产生的生物分子的量，例如总颗粒(vRNA拷贝/ml)、感染性颗粒(IU/ml)或蛋白质(μg/ml)的量，与对照相比。对于流感病毒制造而言，优选地，HA抗原产量的增加通过与对照相比来度量。出于本发明目的，产量增加优选通过ELISA检测待生产的目标产物来度量，对于流感疫苗是HA-ELISA。

优选的化学剂是不被宿主细胞高度代谢的那些。所述化学剂是稳定的，并且在宿主细胞，试剂和生产条件存在下不显著降解并且可在整个生产过程中通过可行的测定法来跟踪。本文中还提供用于检测本文所述的宿主细胞系统中所用的化学剂的清除或降解的方法。

尽管化学剂不应该存在于纯化的样品(例如，产物)中，所述试剂可在制造过程中被追踪。所述试剂是化学稳定的，并且可在与宿主细胞接触0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、55小时和60小时之后，在细胞培养物上清液中检测或测定到其未被代谢的形式。优选地，所述试剂在终产物中不被质谱检测出降解，检测限为纯溶剂(约50％乙腈)中0.5ng/ml。对于流感疫苗生产，未经代谢的化学剂不存在或是不可检测的，即，在长达60小时感染(例如10^-3或10^-4的低MOI病毒感染)后的细胞培养物上清液中，处在于纯溶剂中0.5ng/ml或更少的检测限(LOD)下不被检测到的水平。

在本发明的一些实施方式中，提供一种在宿主细胞系统中制造生物产物(例如感兴趣的蛋白质和病毒)的方法，其特征是：该制造在至少一种化学剂的存在下进行，所述化学剂具有0.05μM或更小的终浓度，或由此获得产物的2倍增加。

在一些实施方式中，本发明提供采用至少一种化学剂从细胞培养物或鸡胚制造病毒的方法，所述化学剂具有0.001μM-1.0μM的终浓度，且由此获得抗原产量的至少2倍增加。

通过改善病毒生长，增加细胞生产力，提高病毒效价、HA抗原的表达和/或产量，本发明在流感疫苗制造中具有特别的应用和效果。本发明的方法产生增加的每制造批次获得的抗原性产物的量和剂量。因此，本发明提供一种在宿主细胞中生产流感病毒的方法，所述宿主细胞优选是哺乳动物细胞，更优选是培养的细胞，所述方法的特征在于：所述生产在至少一种试剂的存在下进行，所述试剂的浓度是1μM或更小，优选是0.05μM或更小，并且，病毒颗粒或抗原由此以高于对照的2倍的产量被生产。

在一些实施方式中，本发明提供一种在宿主细胞系统(例如细胞培养物或鸡胚)中生产乙型(Type B)流感毒株的方法，其特征在于：所述生产在试剂或其衍生物的存在下进行，并且，产出病毒颗粒或抗原的产量高于对照的2倍。

在一些实施方式中，可在用病毒或另一种载体转染/感染宿主细胞之前、同时或之后用至少一种化学剂处理宿主细胞。在转染/感染之前或之后，可使宿主细胞与至少一种化学剂接触0-1小时、0-2小时、0-3小时、0-4小时、0-5小时、0-12小时、0-20小时、0-30小时、0-40小时、0-50小时、0-60小时的时间段，从而实现感兴趣的生物产物的产率的增加。

本发明还提供增加重组蛋白质(或其片段)的产量的方法，当在某些宿主细胞中于典型生长条件下表达时，该重组蛋白质(或其片段)的产量被认为是次优的(例如，“低生产者”和“中等生产者”)。当产量通常处于2-10mg/L范围中(“中等到低生产者”)时，特别是约5mg/L或更低(“低生产者”)时，蛋白质产量被认为是次优的。所述方法包括采用由本发明公开内容所涵盖的一种或多种化合物，例如，他汀及其结构类似物(包括辛伐他汀)，以及其功能等同物，和本文所述的某些GPCR结合剂。本发明的方法特别有利于增强低生产者的蛋白质产量。

附图说明

图1显示用于鉴定改善HA产量的化学剂的方法流程图。

图2显示采用H3N2毒株IVR-165在感染后(hpi)60小时MOI＝10^-4处通过ELISA检测的HA产量的剂量响应增强。

图3显示的柱状图说明，采用1μM磺酰胺或0.05μM匹伐他汀，由多重流感亚型A H3N2毒株获得的增强的HA产量。在这些研究中通常观察到2-3倍HA产量。

图4显示柱状图表明，对于1μM磺酰胺和0.05μM匹伐他汀，由多重亚型B毒株获得的增强的HA产量。基于毒株，通常观察到至少2-10倍HA产量。

图5显示通过RNA酶抗性流感M转录本的qPCR检测的HA产量增强，(a)总颗粒可与1μM磺酰胺或0.05μM匹伐他汀的HA产量相比，(b)总颗粒与采用0.05μM匹伐他汀的HA产量增加的比较。

图6显示的线性图指示，采用质谱来检测匹伐他汀和磺酰胺的化合物追踪能力。该试验具有约0.5ng/ml的纯溶剂(50％乙腈)的检测限。

图7显示来自细胞的亚型AH3N2HA产量(μg/ml)，所述细胞用氟伐他汀衍生物处理，采用0.05μM的对照和匹伐他汀做比较。

图8显示用市售可得的他汀处理的细胞的亚型A/Texas X223A HA产量(μg/ml)的比较。

图9描述甲羟戊酸通路的关联：(A)说明甲羟戊酸通路的示意图；和(B)用特定酶抑制剂组合阻遏甲羟戊酸通路的全部三个臂能够模拟他汀对于宿主细胞中蛋白质产量的作用。

图10提供Ambr15对比摇瓶中的HA产量的并行比较；其均导致Ambr15中的CDM和DM134培养基中的低表达型B/Mass/2/12的化合物增强的产量。

图11提供Ambr15对比摇瓶中的HA产量的并行比较；在Ambr15中的CDM和DM134培养基中对于高表达型A/Vic/361/11(IVR165)仅AFZ077增强产量。

图12提供甲型和乙型毒株中的HA产量，其中采用两种不同细胞密度(低和高ICD)下两种浓度的两种先导(lead)化合物，如HA-ELISA所检测。

图13提供的图显示用BYF589以所示浓度测试的乙型毒株中的HA产量。

图14提供的图显示用AFZ077以所示浓度测试的乙型毒株中的HA产量。.

图15提供的图显示，通过AFZ077的流感HA产量增强依赖于5HT7受体的降低的活性。DM134培养基中的乙型流感毒株(B/Mass)；通过ELISA测得的65小时HA产量(μg/ml)。

图16总结了来自甲型毒株(IVR165)的HA产量的ELISA结果；其用所示不同浓度下的指示化合物处理。

图17提供的图显示可从SAR获得的类似物的HA产量，相对于AFZ077。

图18提供两幅图：(A)BFY589处理的对比未处理的细胞的蛋白质产量，其中各数据点代表测试的目标蛋白质；(B)蛋白质表达(以倍数增长计)与对照产量(未处理的)之间的关系，其中各数据点表示测试的目标蛋白质。

发明详述

发明人已鉴定出一种促进宿主细胞系统中生物产物的产量或表达增加的方法。相比由采用合适的载剂(例如DMSO)处理的、处于其它情况下的等同条件下的对应的对照细胞产生的生物分子，采用低浓度的本文涵盖的至少一种化学剂的产量显著提高。

因此，在一些实施方式中，来自宿主细胞系统的生物分子的产量的增加是对应的对照的至少2倍。在本发明中所用的化学剂的存在下产生的生物分子的产量可根据具体宿主细胞、病毒、蛋白质、化学剂、对于构成所需细胞活性的因素的测定，或给定的实验分析中常用的其它个性化参数的个别特点而变化。在一些实施方式中，与对照相比(即，在不存在所述化合物，但其它情况等同的条件下生长)，感兴趣的生物产物的产量增加至少20％，例如，至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、350％、400％、450％，和500％。

本发明中所用的化学剂的合适的浓度可选自约0.1nM–10μM的范围。用于进行本发明的化合物的合适的浓度指与对照相比，能有效增加产量的浓度。合适的浓度的范围可以是，例如，0.1-5000nM，例如，0.5-1000nM、0.5-500nM、0.5-250nM、0.5-200nM、0.5-150nM、0.5-100nM、0.5-75nM、0.5-50nM、0.5-25nM、0.5-20nM、0.5-15nM、0.5-10nM、0.5-5nM、1-100nM、1-75nM、1-50nM、1-25nM、1-20nM、1-15nM、1-10nM、2-50nM、2-40nM、2-20nM、2-10nM等。在一些实施方式中，有效浓度是≤50nM，例如，≤40nM、≤30nM、≤25nM、≤20nM、≤15nM、≤14nM、≤13nM、≤12nM、≤11nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM。例如，本发明中所用的化学剂可以如下终浓度存在：0.001μM-0.5μM，优选约0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM，或0.10μM。优选地，所述化学剂以最低浓度与宿主细胞接触，所述最低浓度能够实现产物产量的至少20％的增加。更优选地，所述化学剂以最低浓度与宿主细胞接触，所述最低浓度能够实现产物产量的至少两倍增加。

化学剂的浓度将取决于能够产生本发明所述结果并保持对宿主细胞、病毒或生物产物无毒的特定试剂、系统或条件。实现本发明结果的最优浓度可采用常规方法调节。例如，可修改实验条件以获得用于生产规模的合适的条件和结果。

本文所述的某些化学剂可通过其物理、化学和药学质量来表征。这些试剂可经化学操作以提供最优浓度的试剂，以增加宿主细胞系统中，尤其是细胞培养物和鸡蛋中的生物产物的产量。

在一个方面中，如果增加与宿主细胞接触的某些化学剂的亲脂性，则可增强该试剂的效果或活性。所述试剂的化学和结构修饰可能会增强细胞膜转运或蛋白质表达。在一个具体方面中，化学剂可经化学修饰以产生前药类似物。制造和使用前药的标准技术是对本发明中所用的化学剂合适可行的。参见《医用化学实践》(The Practice of Medicinal Chemistry)，第31-32章(Wermuth编，加利福尼亚州圣迭戈的学术出版社(Academic Press)，2001)。

本发明所用试剂的示例性前药是市售可得的药学物质，已知在向对象给予该前药之后能显示体内生理作用，例如水解、代谢等。一般而言，生物前体前药是这样的化合物：其相比对应的活性药物化合物而言是失活的或具有低活性，其包含一个或多个保护基团，并且通过代谢或溶剂分解作用而被转化成活性形式。活性药物形式和任何释放的代谢产物均需具有可接受的低毒性。载体前药是这样的药物化合物：其包含运输部分，例如，其改善摄取和/或向作用位点的局部递送。对于此类载体前药的希望是，其药物部分和运输部分之间的连接是共价键，该前药是失活的或活性低于其药物化合物，并且释放的任何运输部分均是可接受地无毒的。对于其中需要运输部分来增强摄取的前药而言，通常，运输部分的释放应快速进行。在其它情况中，希望采用提供缓慢释放的部分，例如，某些聚合物或其它部分，例如环糊精。例如，可采用载体前药来改善如下一种或多种性质：增加的亲脂性、增加的药理作用持续时间、增加的位点特异性、减少的毒性和不良反应，和/或药物制剂的改善(例如，稳定性、水溶性、对不希望的感官或生理化学性质的抑制)。例如，亲脂性可通过如下方式来提高(a)用亲脂性羧酸(例如，具有至少一个亲脂部分的羧酸)对羟基基团酯化，或(b)用亲脂醇(例如，具有至少一个亲脂部分的醇，例如脂族醇)对羧酸基团酯化。如本发明所用，修饰所述化学剂以促进宿主细胞系统的生产能力，以在体外表达生物产物。

因此，本发明涵盖传统药学上可接受的酸的形式的化学剂，例如马来酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、乙酸、富马酸、水杨酸、柠檬酸、乳酸、扁桃酸、酒石酸和甲磺酸。化学剂还可形成溶剂合物，例如水合物，并且本发明也拓展到这些形式。

应注意，本发明中所用的化学剂中的一些的结构可具有一个或多个立体中心，并且各中心可以R或S构型或其组合存在。类似地，本文所述的化合物可具有一个或多个双键，并且各双键可以E(反式)或Z(顺式)构型或其组合存在。一种具体立体异构体、区域异构体、非对映异构体、对映异构体或差向异构体的展示应理解为包括所有可能的立体异构体、区域异构体、非对映异构体、对映异构体或差向异构体及其混合物。因此，本文展示的化合物包括所有不同的构型立体异构、区域异构、非对映异构、对映异构和差向异构形式及其对应的混合物。对于包含一个或多个手性中心但没有指定具体的立体化学的化合物而言，一种具体化学结构或化学名称的展示应理解为包括所有可能的立体异构体，包括所有可能的立体异构体的混合物、一种具体立体异构体的纯形式或基本纯形式，以及替代性的立体异构体的纯形式或基本纯形式。用于使具体立体中心反向或保持不变的技术，以及用于解离立体异构体的混合物的方法，是本领域熟知的，并且，针对具体情况选择合适的方法完全属于本领域技术人员的能力范围内。参见例如，Furniss等(编),《沃格尔实践有机化学百科全书》(VOGEL'S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY)第5版,朗文科技有限公司(Longman Scientific and Technical Ltd.),艾塞克斯,1991,809-816；和Heller,Acc.Chem.Res.1990,23,128。

本发明所用试剂的任何非对称原子(例如，碳等)可以外消旋或对映异构体富集的形式存在，例如(R)-、(S)-或(R,S)-构型。在某些实施方式中，各非对称原子在(R)-或(S)-构型中具有至少50％对映体过量、至少60％对映体过量、至少70％对映体过量、至少80％对映体过量、至少90％对映体过量、至少95％对映体过量，或至少99％对映体过量。位于不饱和键处的原子的取代基可以(如果可能)顺式-(Z)-或反式-(E)-形式存在。本文涵盖的化学剂可以外消旋混合物形式存在，所述外消旋混合物包含R-或S-形式，或者是R-或S-形式对映异构体富集的，和/或取决于各对映体的所需功能活性水平。

任何所得的异构体混合物均可基于成分的物理化学差异而被分离成纯或基本纯的几何或光学异构体、非对映异构体、外消旋体，例如，通过色谱和/或分级结晶。

本发明中所用的化学剂可通过常规化学分析来设计或建模。例如，本领域技术人员可采用结构-活性关系(SAR)将化合物的成分和侧基团修饰成构象类似物。SAR意在提供足够的各活性化合物用于进一步表征生物活性。可初步基于质谱和核磁共振数据来确定结构。

必要时，化学剂、中间体和类似物的分离和纯化可通过任何合适的分离或纯化过程，例如，过滤、提取、结晶、柱色谱、薄层色谱、薄层色谱、离心色谱、HPLC，或这些过程的组合来实现。合适的合成和分离过程的具体说明可参考本文中所述的专利，其通过引用其全文纳入本文。

向制造过程添加合成化合物的担忧之处是由降解产物(例如代谢物)产生毒性的可能性。降解产物可以是化合物在宿主细胞中生物转化而产生的代谢物，例如生物转化成更具极性的分子，例如通过氧化、还原。降解产物可以如下方法与原始化合物区分开：如分子量、溶解度，和分子结构或组成。降解产物经历制造过程时，这些降解产物有可能的浓缩至不可接受的水平，这在下游过程中尤其会产生问题。

可基本按本文中所述来完成用于化学剂、代谢物或其类似物的清除的试验。用于定量或鉴定代谢物的方法是本领域技术人员已知的，包括采用标准分析方法，包括HPLC、TLC、电化学分析、质谱、折射率光谱、紫外光谱法、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱、核磁共振光谱、光散射分析和本领域已知的其它方法。

一方面，本发明中所用的化学剂在流感HA抗原的加工、纯化或浓缩过程中基本不被代谢或降解。在流感病毒纯化之后，通过质谱可检测到残余的痕量的未经代谢的化合物，通常在纯化过程后剩余不到原始输入量的0.25％。

培养基或产物中存在的代谢物水平应不超过，母化合物的至少一种测试的活性或所选化学剂的输入量的，例如，高于约1％，2％，高于约3％，高于约4％，高于约5％，高于约10％，高于约20％，高于约30％，高于约40％，高于约50％。

一方面，在纯化的样品中检测不到化学剂。所述化学剂可如本文说明在约0.5ng/ml纯溶剂(50％乙腈)的检测限(LOD)示踪。优选地，纯化样品中可能存在的任何化学剂在细胞培养物上清液，更优选地在纯化的样品(例如包含单价批次的流感病毒或抗原的单份的终产物)中以0.5ng/ml或更小被检测到。

他汀类似物

辛伐他汀作为生长增强剂的应用已于先前被描述(见上文)。然而，发明人已发现若干其它他汀化合物促进宿主细胞系统中产生的生物分子的增加的产量。这些他汀试剂可在低他汀浓度下实现至少2倍产量。在一个具体方面中，本发明所述的化学剂在特别低的浓度下对于许多流感亚型和毒株具有惊人地广泛的应用性。

本发明的原理一般广泛地适用于多种他汀但优选地排除辛伐他汀。3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶-A还原酶抑制剂("HMG-CoA抑制剂")在本发明中的含义和定义指的是HMG-辅酶A还原酶的任何选择性、竞争性抑制剂，其为将HMG-辅酶A转化成甲羟戊酸的限速酶，一般称作胆固醇降低型他汀。

他汀共有特征性结构，由连接至芳族或脂环族核心的庚烯酸或庚酸部分(游离酸、盐或内酯)组成。他汀的生物活性与其立体化学紧密相关，尤其是所述庚烯酸或庚酸部分的手性原子的构型。他汀及其类似物市售可得并且广泛用于抑制HMG-辅酶A还原酶作用的甲羟戊酸向胆固醇的转化。用于确定他汀是否通过该生物通路作用的试验公开于美国专利4,231,938。

他汀可被分为两类：发酵源性的和合成的。天然产生的他汀是真菌代谢物的衍生物(ML-236B/康帕丁/单钙素K)，分离自终极腐霉(Pythium ultimum)，红曲霉(Monascus ruber)，柑桔青霉(Penicillium citrinum)，短密青霉(Penicillium brevicompactum)和土曲霉(Aspergillus terreus)，不过，显示它们也可通过合成制备。举例而言，他汀可选自：阿托伐他汀、美伐他汀(或康帕丁)、氟吲他汀(fluindostatin)、维洛他汀(velostatin)、氟伐他汀、达伐他汀、西立伐他汀、喷司他汀、罗素伐他汀、洛伐他汀(例如洛伐他汀)、匹伐他汀、辛伐他汀，或其类似物。

他汀衍生物是文献中熟知的并且可通过如下文献中所公开的方法制备：《肽：分析、合成、生物学》，卷5(The Peptides:Vol.5,Analysis,Synthesis,Biology)，纽约学术出版社(Academic Press)(1983)；和US 4397786。多种增加生物分子和产物，尤其是流感病毒产物的表达和产量的他汀类似物从培养的细胞和鸡蛋中产生。

任何这些他汀及其类似物均可用于本发明。

式1–氟伐他汀和相关的类似物

在一个优选方面中，本发明涉及式1化学剂在用于在宿主细胞系统(例如细胞培养物或鸡蛋)中制造生物产物(具体是流感疫苗)中的应用。式1包含具有如下结构的他汀：

其中，R和R_o之一是

并且，其它是伯或仲C_1-6烷基且不包含非对称碳原子、C_3-6环烷基或苯基-(CH₂)_m―，其中，R₄是氢、C_1-3烷基，正丁基，异丁基，叔丁基，C_1-3烷氧基，正丁氧基，异丁氧基，三氟甲基，氟，氯，苯氧基或苄氧基，R₅是氢，C_1-3烷基，C_1-3烷氧基，三氟甲基，氟，氯，苯氧基或苄氧基，R_5a是氢，C_1-2烷基，C_1-2烷氧基，氟或氯，且m是1，2或3，限制条件是当R₄是氢时，R₅和R_5a均必须是氢，当R₅是氢时，R_5a必须是氢，R₄和R₅中不多于一个是三氟甲基，R₄和R₅中不多于一个是苯氧基，且R₄和R₅中不多于一个是苄氧基，R₂是氢，C_1-3烷基，正丁基，异丁基，叔丁基，C_3-6环烷基，C_1-3烷氧基，正丁氧基，异丁氧基，三氟甲基，氟，氯，苯氧基或苄氧基，R₃是氢，C_1-3烷基，C_1-3烷氧基，三氟甲基，氟，氯，苯氧基或苄氧基，限制条件是当R₂是氢时，R₃必须是氢，R₂和R₃中不多于一个是三氟甲基，R₂和R₃中不多于一个是苯氧基，且R₂和R₃中不多于一个是苄氧基，X是―(CH₂)_n―或―CH＝CH―，其中，n是0，1，2或3，并且Z是

其中，R₆是氢或C_1-3烷基，且R₇是氢，C_1-3烷基，正丁基，异丁基，叔丁基，苄基或M，其中，M是药学上可接受的阳离子。

氟伐他汀钠，诺华制药公司(Novartis Pharmaceuticals)商品名LESCOL，可如美国专利5,354,772所述制备。在一个具体的优选实施方式中，式1的他汀类似物是氟伐他汀(C₂₄H₂₆FNO₄或(3R,5S,6E)-7-[3-(4-氟苯基)-1-(丙-2-基)-1H-吲哚-2-基]-3,4-二羟基庚-6-烯酸)，其具有如下结构：

通过0.001μM-10μM范围内的氟伐他汀或其类似物的终浓度可获得增加的细胞活性。在某个优选但非限制性的方面，氟伐他汀的最优终浓度是0.05μM或更小。

式2-匹伐他汀和相关的类似物

在另一个优选方面中，本发明涉及式2化学剂在用于在宿主细胞系统(例如细胞培养物或鸡蛋)中制造生物产物(具体是流感疫苗)中的应用。优选地，式2包含具有如下结构的他汀：

其中，R和R_o各自独立地是C_1-6烷基(伯、仲或叔)、C_3-7环烷基或环A

R₁，R₂，R₃，R₄和R₅各自独立地是氢，C_1-4烷基，C_1-4烷氧基，三氟甲基，氟，氯，苯氧基，苄氧基或羟基；限制条件是R₁和R₂中不超过一个是三氟甲基，R₁和R₂中不超过一个是苯氧基，R₁和R₂中不超过一个是苄氧基，R₁和R₂中不超过一个是羟基，R₃-R₅中不超过一个是三氟甲基，R₃-R₅中不超过一个是羟基：

X是–(CH₂)₂—或—CH≡CH—(顺式和/或反式)：

Z是

其中，Q是

限制条件是Q可以是

仅当X是–CH＝CH和/或R₆是C_1-3烷基时；R₆是氢或C_1-3烷基；

R₇是氢、R₈或M；R₈是生理学可接受且可水解的酯基团；并且，M是药学上可接受的阳离子。

匹伐他汀钙，兴和株式会社(Kowa Co)商品名LIVALO，可按照美国专利5,753,675等所述制备。在一个具体的优选实施方式中，采用匹伐他汀(Pitavasatin)(描述为表4中的化合物G)，其是式2(C₂₅H₂₄FNO₄或(3R,5S,6E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基)-3,5-二羟基庚-6-烯酸)的他汀类似物，其具有如下结构：

0.001–10μM范围内的式2的衍生物的终浓度获得增加的细胞活性。在某些优选但非限制性的实施方式中，匹伐他汀的最优终浓度是0.05μM或更小。如本文中进一步示例，预料之外地，发现匹伐他汀化合物在5nM比在50nM能够更有效地增加蛋白质产量，其进而比在500nM更为有效。这特别有利于制造用于人类应用的治疗性组合物。

然而，本发明不仅限于匹伐他汀或氟伐他汀制剂。式1和2的类似物已经测试并产生了令人吃惊的效果，其被本发明涵盖。这些类似物如下进一步所述经测试。

式3–阿托伐他汀和相关的类似物

在一个方面中，本发明涉及式3化学剂在用于在宿主细胞系统(例如细胞培养物或鸡蛋)中制造生物产物(具体是流感疫苗)的应用。优选地，式3包含具有如下结构的他汀类似物：

其中，X是―CH₂―，―CH₂CH₂―，―CH₂CH₂CH₂―或―CH₂CH(CH₃)―。

R₁是1-萘；2-萘；环己基；降冰片烯基；2-,3-或4-吡啶基；苯基，被氟、氯、溴、羟基取代的苯基；三氟甲基；1-4个碳原子的烷基，1-4个碳原子的烷氧基，或2-8个碳原子的酰基氧基。R₂或R₃是―CONR₅R₆，其中R₅和R₆独立地是氢；1-6个碳原子的烷基；2-,3-或4-吡啶基；苯基；被氟、氯、溴、氰基、三氟甲基或3-8个碳原子的碳烷氧基取代的苯基；并且，R₂或R₃中的另一个是氢；1-6个碳原子的烷基；环丙基；环丁基；环戊基；环己基；苯基；或被氟、氯、溴、羟基取代的苯基；三氟甲基；1-4个碳原子的烷基，1-4个碳原子的烷氧基，2-8个碳原子的酰基氧基。R₄是1-6个碳原子的烷基；环丙基；环丁基；环戊基；环己基；或三氟甲基。

阿托伐他汀钙，辉瑞公司(Pfizer)商品名LIPITOR，按照美国专利5,273,995等所述制备。在一个具体的优选实施方式中，式3的他汀类似物是阿托伐他汀(C₃₃H₃₄FN₂O₅；[R-(R*,R*)]-2-(4-氟苯基)-β,δ-二羟基-5-(1-甲基乙基)-3-苯基-4-[(苯基氨基)羰基]-1H吡咯-1-庚酸，钙盐(2:1)三水合物)，其具有如下结构：

式4–西立伐他汀和相关的化合物

在另一个方面中，本发明涉及式4的化学剂在用于在细胞培养物或鸡蛋中制造生物产物(具体是流感疫苗)中的应用。优选地，式4包含具有如下结构的他汀类似物：

其中，A―B表示式―CH＝CH―或―CH₂―CH₂―的原子团，

Z表示式―CH的原子团或氮原子，R₁、R₂和R₃彼此独立地表示氢、饱和或不饱和的、直链或支化的烃原子团，其具有至多6个碳原子并可任选地在末端碳上被如下部分取代：饱和或不饱和的具有3-6个碳原子的环烃原子团、具有3-7个碳原子并且是饱和或是一次或二次不饱和的环烃原子团、选自下组的芳族原子团：苯基、呋喃基、噻吩基或吡啶基，其可任选地在核中携带选自如下基团的1-3个相同或不同的取代基：卤素，三氟甲基，烷基或烯基，其各自具有至多6个碳原子，羟基，具有1-6个碳原子的烷氧基，羧基，或在烷氧基部分中具有1-6个碳原子的烷氧羰基，R₄表示氢、直链或支化的、饱和或不饱和的具有至多5个碳原子的烃原子团，其核可被如下部分取代1-2次的苄基基团：卤素或具有1-4个碳原子的烷基基团，碱金属或铵离子NR₅R₆R₇R₈，其中R₅、R₆、R₇和R₈是相同或不同的，并且表示氢、具有1-4个碳原子的烷基或具有1-4个碳原子的羟基烷基。

西立伐他汀钠，拜耳公司(Bayer)商品名BAYCOL，可按美国专利5,177,080等所述制备。在一个具体的优选实施方式中，式4的他汀类似物是西立伐他汀([S-[R*,S*-(E)]]-7-[4-(4-氟苯基)-5-甲氧基甲基)-2,6双(1-甲基乙基)-3-吡啶基]-3,5-二羟基-6-庚烯酸酯；C₂₆H₃₃FNO₅Na)，其具有如下结构：

式5–洛伐他汀/美伐他汀和相关的化合物

在另一个方面中，本发明涉及式5的化学剂在用于在细胞培养物或鸡蛋中制造生物产物(具体是流感疫苗)中的应用。优选地，式5包含具有如下结构的他汀类似物：

其中，R是氢原子、羟基基团或2-甲基丁酰基氧基基团(―OCOCH(CH₃)CH₂CH₃)。

洛伐他汀，默克公司(Merck)商品名MEVACOR，可按美国专利4,231,938等所述制备。在一个具体的优选实施方式中，式5的他汀类似物是洛伐他汀([1S-[1α(R*),3α,7α,8α(2S*,4S*),8aα]]-1,2,3,7,8,8a-六氢-3,7-二甲基-8-[2-(四氢-4-羟基-6-氧代-2H-吡喃-2-基)乙基]-1-萘基2-甲基丁酸酯；C₂₄H₃₆O₅)，其具有如下结构：

在另一个具体的优选实施方式中，式5的他汀类似物是美伐他汀(1S,7R,8S,8aR)-8-{2-[(2R,4R)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基]乙基}-7-甲基-1,2,3,7,8,8a-六氢萘-1-基(2S)-2-甲基丁酸酯；C₂₃H₃₄O₆)，其具有如下结构：

在本发明的某些实施方式中，不采用辛伐他汀，其为式5的类似物。

式6–普伐他汀和相关的化合物

在另一个方面中，本发明涉及式6的化学剂在用于在细胞培养物或鸡蛋中制造生物产物(具体是流感疫苗)中的应用。优选地，式6包含具有如下结构的他汀类似物：

其中，R表示如下一组结构：

及其环闭合内酯、盐和酯。

普伐他汀钠，百时美施贵宝公司(Bristol-Myers-Squibb)商品名PRAVACHOL，可按美国专利4,346,227等所述制备。在一个具体的优选实施方式中，式6的他汀类似物是普伐他汀(1-萘-庚酸,1,2,6,7,8,8a六氢-β,δ,6-三羟基-2-甲基-8-(2-甲基-1-氧代丁氧基)-,单钠盐，[1S[1α(βS*,δS*),2α,6α,8β(R*),8aα]；C₂₃H₃₅NaO₇]，其具有如下结构：

式7–罗素伐他汀和相关的化合物

在另一个方面中，本发明涉及式7的化学剂在用于在细胞培养物或鸡蛋中制造生物产物(具体是流感疫苗)中的应用。优选地，式7包含具有如下结构的他汀类似物：

其中，R₁是低级烷基、芳基或芳烷基，其各自具有一个或多个取代基；R₂和R₃各自独立地是氢、低级烷基或芳基，并且所述低级烷基和芳基各自可具有一个或多个取代基；R₄是氢、低级烷基或能够形成无毒的药学上可接受的盐的阳离子；X是硫、氧或磺酰基，或亚氨基，其可具有取代基；虚线表示存在或不存在双键，或对应的闭合环内酯。

罗素伐他汀钠，阿斯利康公司(AstraZeneca)商品名CRESTOR，可按美国专利4,346,227等所述制备。在一个具体的优选实施方式中，式7的他汀类似物是罗素伐他汀双[(E)-7-[4-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-[甲基(甲基磺酰基)氨基]嘧啶-5-基](3R,5S)-3,5-二羟基庚-6-烯酸]；C₂₂H₂₇FN₃O₆S₎₂]，其具有如下所示的结构。

本发明还涵盖用于增强宿主细胞中感兴趣的生物产物的生成产量的方法，其包括抑制所述宿主细胞的甲羟戊酸通路。在一些实施方式中，甲羟戊酸通路的抑制涉及对于甲羟戊酸本身的直接或间接抑制。或者或此外，甲羟戊酸通路的抑制可涉及抑制下游信号转导级联，即，分别控制蛋白质异戊烯化和胆固醇生物合成的通路。如图9B中所示，用特定酶抑制剂组合阻滞甲羟戊酸通路的全部三个臂能够模拟他汀对于宿主细胞中蛋白质产量的作用。因此，在一些实施方式中，采用催化该通路的酶的特定抑制剂，例如，角鲨烯合酶抑制剂(例如，萨拉哥酸(zaragozic acid))、法尼基转移酶抑制剂、香叶基香叶基转移酶抑制剂，及其任何组合。因此，本发明提供甲羟戊酸通路的一种或多种抑制剂，用于在宿主细胞中制造生物制品。本发明还提供制造生物产品的方法，其包括如下步骤：抑制宿主细胞的甲羟戊酸通路，其中，所述抑制可包括使所述宿主细胞接触参与蛋白质异戊烯化和胆固醇合成的酶的一种或多种抑制剂。本发明涵盖通

过所述方法中任一种产生的生物产物。

非他汀化合物

本发明还涵盖非他汀化合物，其可用于增加宿主细胞中生物分子的产量。在一些实施方式中，用于进行本发明的合适的非他汀化合物是通过血清素相关联的通路、多巴胺相关联的通路，或其组合作用的试剂。在一些实施方式中，合适的化合物是调节某些G蛋白偶联受体的试剂。

式8–磺酰胺，其类似物和5HT7的其它反向激动剂

一方面，本发明中所用的化学剂包括磺酰胺类似物。磺酰胺类似物已被鉴定为G蛋白偶联-受体(GPCR)的反向激动剂，尤其是5HT7的反向激动剂。因此，本发明还涵盖与5HT7受体相互作用或调节5HT7受体的化学剂，具体是5HT7的反向激动剂。本发明涵盖的5HT7的其它激动剂包括但不限于：基于芳基哌嗪和1,2,3,4-四氢异喹啉的芳基磺酰胺类(Vermeulen等.(2004)Journal of Medicinal Chemistry,47,5451–5466)、5-羟色氨酸、8-羟基-2-(二-正丙基氨基)萘满1-Br(8-OH DPAT)和5-羧基-氨基色胺(5-CT)(Siddiqui等.(2007)Pharmacology Biochemistry and Behavior,87,386–392)。

一方面，本发明提供式8的化学剂用于在细胞培养物或鸡蛋中制造生物产物(具体是流感疫苗)的应用。优选地，式8包含磺酰胺化合物，其具有如下结构：

其中，Ar是任选取代的单或双环芳族环或杂芳环；R¹和R²独立地是氢、C_1-6烷基、芳基C_1-6烷基或与其相连的氮原子一起形成任选取代的5-7元杂环，任选还包含选自氮、硫或氧的杂原子，所述氮原子被如下部分取代：氢、C_1-6烷基、环C_3-7烷基，或任选被取代的芳基、杂芳基或芳基C_1-6烷基基团；R³是氢或C_1-6烷基；X是氧、硫或键；n是2或3；且m是1或2。C_1-6烷基基团，其单独或作为另一基团的部分，可以是直链或支化的。芳族和杂芳族基团的任选的取代基包括C_1-6烷基，其任选被如下部分取代：NR⁷R⁸、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_1-6含硫烷基、氰基、硝基、卤素、CF₃、C₂F₅、NR₇R₈、CONR₇R₈、NR₇COR₈、S(O)_p NR₇R₈、CHO、OCF₃、SCF₃、COR₉、CH₂OR₉、CO₂R₉或OR₉，其中p是1或2，且R₇、R₈和R₉各自独立地是氢、C_1-6烷基、任选取代的芳基或任选取代的芳基C_1-6烷基。可存在超过一个取代基，并且在多重取代基的情况中，这些可以是相同或不同的。

合适地，Ar是任选取代的单或双环芳族或杂芳族环。优选地Ar是任选取代的萘、苯基或噻吩基基团。更优选地，Ar是萘、苯基或噻吩基，其被一个或多个卤素取代，具体是2,3-二-溴代噻吩基。在R₁和R₂中，杂环的任选取代基包括C_1-6烷基。优选地，R₁和R₂形成任选取代的5-7元杂环，具体是任选取代的6元环。最优选地，R₁和R₂形成哌啶环，其任选地由一个或两个甲基基团取代，或R₁和R₂形成哌嗪环，其在氮上被任选取代的芳环取代。优选地，R₃是氢。

优选地，X是键。优选地，n和m具有的值使得与X一起形成5或6元环的部分。

式8的优选的最优终浓度是1.0μM或更小。

式8的尤其优选的磺酰胺类似物是(C₁₉H₃₀N₂S0₂)，其可按照美国专利6,265,408中所述制备，并且具有如下结构：

一个非限制性实施方式示为表4中的化合物E，其是血清素5HT-2和5HT-7受体的反向激动剂。反向激动剂是与激动剂结合至相同受体的物质，但诱导的药理学反应与激动剂诱导的相反。因此，反向激动剂反应的首要条件是，在不存在任何配体的情况下，该受体必需具有本质的(也称为固有的或基础的)水平活性。这意味着，反向激动剂将该活性降低至基础水平以下。

已知在配体结合之后，5HT7受体通过腺苷酸环化酶(AC)活性的胞内cAMP增加来产生信号。实施例13(图15)中的结果表明，生成产量增强依赖于5HT7受体的配体介导的活性的降低，因为该增强作用可通过血清素(5HT)的存在而被消除，其应与抑制剂竞争结合至受体。

式9–脱品醇酯，其类似物和自受体的其它抑制剂

在另一个优选方面，本发明提供式9的化学剂用于在细胞培养物或鸡蛋中制造生物产物(具体是流感疫苗)的应用。该类分子已被鉴定为突触前自受体的抑制剂，并且像抗胆碱能类物质一样发挥作用。因此，本发明涵盖这样的化学剂的应用，所述化学剂调节突触前自受体和胆碱能突触上的其它突触前异身受体，包括但不限于：7-(4-[4-(2,3-二氯苯基)-1-哌嗪基]丁氧基)-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮(Kikuchi等.(1995)The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，274，329–336)和(-)-3-(3-羟基苯基)-N-丙基哌啶[(-)-3-PPP](Thorberg等.(1987)Journal of Medicinal Chemistry,30,2008–2012)。本发明涵盖的抗胆碱能类物质包括但不限于：新斯的明、格隆铵、毒扁豆碱和吡斯的明。(Nair等.(2004)Continuing Education in Anaesthesia,Critical Care&Pain,4,164–168)。

优选地，式9包含托烷基(tropanyl)类似物，其具有下式：

其中，Ar是苯基或β-萘基，或包含两个氮原子之一的芳香族杂环6元环；R₁是Ar核的一个或个取代基；优选在对位，且选自下组：H、CH₃、CH₂―CH(CH₃)₂、O―CH₃、Cl、F、Br、CF₃、NH₂、S―CH₃、CN、NO₂；R₂＝H、CH₃、C₂H₅、CH(CH₃)₂；R₃是

其中，R₄是H，CH₃，C₂H₅；R₅是H，CH₃；X不存在或是O，S，NH，NCH₃，―CH＝CH―，―C≡C―；Y是O，NH。

优选的式9的托烷基类似物是(C₁₈H₂₅NO₂S)，其可按WO 94/01435等所述制备，且具有如下结构：

式10–苯并异噻唑(Benziothiazole)，其类似物和其它多巴胺、5HT2A和5HT1A结合试剂

在另一方面中，本发明提供式10的化学剂用于在细胞培养物或鸡蛋中制造生物产物(具体是流感疫苗)的应用。该类分子已被鉴定为具有神经安定活性。因此，本发明涵盖这样的化学剂，其对多巴胺D2和血清素5HT2A和5HT1A受体具有亲和性(Hrib等，J.Med.Chem，22；37(15):2308-2314(1994))。本发明涵盖的其它多巴胺、5HT2A和5HT1A结合试剂包括但不限于：氯氮平、氟哌啶醇和羟基化的二苯并氮杂(Hamacher等.,(2006)BMC Pharmacology，6，11)。

优选地，式10包含苯并异噻唑和苯并异噁唑类似物，其具有下式：

其中，R表示

其中n是3或4，R₁和R₂独立地是1-4个碳原子的低级烷基，Y是氧或硫，Z是氢或卤素，或其药学上可接受的无毒酸加成盐。

一方面，式10的类似物是(C₂₄H₃₂N₄O₂S)，其可按DE3247530等所述制备，且具有如下结构：

式11–苯并吡喃(Benzypyran)，其类似物和其它抗心律不齐试剂

在另一方面中，本发明提供式11的化学剂用于在细胞培养物或鸡蛋中制造生物产物(具体是流感疫苗)的应用。该类分子已被鉴定为具有抗心律不齐活性。因此，本发明涵盖具有I类、II类、III类或IV类抗心律不齐活性的化学剂，其包括利多卡因、二苯基谷氨酰胺、奎尼丁、普鲁卡因胺、氟卡胺、β阻断剂、维拉帕米、洋地黄、溴苄胺、伊布利特、索他洛尔、胺碘酮、多非利特。(Kowey等.(2000)American Heart Journal,140,12–20)

优选地，式11包含苯并吡喃类似物，其具有下式：

其中，R₁是氢、卤素、羟基、烷氧基、硝基、氨基或烷基磺酰胺、双(烷基磺酰基)氨基，或酰基氨基，X表示氮原子或>CH―基团，R是具有下式的基团：

其中，A是单键、亚甲基，或者当X是氮原子时是羰基，并且，R₂和R₃相同或不同地是氢，卤素，羟基，烷基，烷氧基，硝基，氨基，烷基磺酰胺，双(烷基磺酰基)氨基，酰基氨基，氨磺酰基或氰基，或R₂和R₃在其相邻时一起形成亚甲基二氧基或亚乙基二氧基基团，或者，R是吡啶基或2(2H)-苯并咪唑啉酮基，如果X表示>CH―，且R'和R"相同地是氢或烷基，及其盐。

式11的类似物是(C₂₄H₃₁NO₃)，其可按EP300908等所述制备，且具有如下结构：

式12–四氢吡啶，其类似物和MAO的其它抑制剂

在另一方面中，本发明提供式12的化学剂用于在细胞培养物或鸡蛋中制造生物产物(具体是流感疫苗)的应用。这类分子已被鉴定为在精神抑郁的治疗中具有治疗性益处。因此，本发明涵盖这样的化学剂的应用，其抑制单胺氧化酶(MAO)或拮抗丁苯那嗪的作用，或靶向脑中的多巴胺能和5-羟色胺能系统(Mattson，《博士论文》(Doctorates Thesis)，哥德堡大学(Gothenborg University)，ISBN:978-628-8741-4(2013))。本发明涵盖的其它MAO抑制剂包括但不限于：噁二唑酮、四唑、噁二嗪酮、茚并哒嗪衍生物，和(1H)-吡唑衍生物。(Chimenti等.(2006)Chemical Biology&Drug Design,67,206–214)。

优选地，式12包含四氢吡啶和哌啶类似物，其具有下式：

其中，R₁表示氢、含1-4个碳原子的烷基基团，并且其可被如下部分取代：羟基或氧基基团、各自包含3-4个碳原子的烯基或炔基基团、包含4-7个碳原子的环烷基甲基基团，或苄基基团，其中，苯基基团可被选自下组的至多3个取代基取代：各包含1-4个碳原子的烷基和烷氧基基团，但在如下情况中，R₁必须不是甲基基团：A表示亚乙基基团且B表示亚甲基基团，且R₂、R₃、R₄和R₅同时各表示氢，R₂表示氢或包含1-4个碳原子的烷基，R₃表示氢、各包含1-4个碳原子的烷基或烷氧基基团、原子序数至多为35的卤素或羟基基团，或R₃和R₄一起表示三亚甲基或四亚甲基基团，或者，对应于稠合的(fused-on)苯环，1,3-丁二烯(buatdienylene)基团，R₅表示氢或包含1-4个碳原子的烷基基团，A表示亚乙基或亚甲基基团或直接键，B表示亚甲基、亚乙基或三亚甲基基团，由此A和B一起总是包含3个碳原子，并且X和Y各自表示氢原子，或它们一起表示额外的键，以及其与无机酸和有机酸的加成盐。

式12的类似物是(C₁₅H₁₉NO)，其可按DE2408476等所述来制备，且具有如下结构：

式13-二甲氧基苯基-哌啶甲醇，其类似物。

在另一方面中，本发明提供式13的化学剂用于在细胞培养物或鸡蛋中制造生物产物(具体是流感疫苗)的应用。这些类似物已经被描述作为5HT2拮抗剂和抗心律失常药发挥作用。因此，本发明涵盖具有I类、II类、III类或IV类抗心律不齐活性的化学剂，其包括利多卡因、二苯基谷氨酰胺、奎尼丁、普鲁卡因胺、氟卡胺、β阻断剂、维拉帕米、洋地黄、溴苄胺、伊布利特、索他洛尔、胺碘酮、多非利特。(Kowey等.(2000)American Heart Journal,140,12–20)

优选地，式13的类似物具有下式：

其中，n是2、3或4且R和R₁各自独立地表示氢、C_1-6烷基，卤素，三氟甲基，羟基，C_1-6烷氧基，或氨基，R和R₁取代基就C_1-6烷基而言是甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，戊基，己基，环丙基，环戊基，其中优选甲基和乙基。涵盖所有的卤素，优选氟和氯。代表性的C_1-6烷氧基取代基是甲氧基、乙氧基、异丙氧基和通过氧连接的前述的烷基基团。在其中R或R₁不是氢的那些情况中，所述取代基可位于任何位置(邻位、间位或对位)，但对于单取代的苯基部分优选对位。本文涵盖2,3-、2,4-、2,5-、3,4-或3,5-双取代的苯基部分。

一方面，式13的类似物是α-(2,3-二甲氧基苯基)-1-[2-(4-氟苯基)乙基]-4-哌啶甲醇(C₂₂H₂₈NO₃F)，其可按美国专利5,134,149所述制备，且具有如下结构：

本发明包括在宿主细胞中产生感兴趣的生物分子方面具有相似药理学活性的其它试剂。在一些实施方式中，所述试剂包括对相同或重叠的细胞信号转导通路具有作用的那些。因此，在一些实施方式中，所述试剂共有相同或重叠的作用机制，以在宿主细胞中实现某些细胞结果。此类机制等同试剂彼此可以结构上相关或不相关。

因此，本发明提供在宿主细胞中产生感兴趣的生物产物，或增强所述产物的产量的方法，包括：使所述宿主细胞与试剂接触，由此增强所述宿主细胞中的蛋白质产量，其中，所述试剂选自下组：抑制5HT7受体信号转导的试剂、抑制一种或多种多巴胺受体信号转导的的试剂、是一种或多种组胺受体的反向激动剂的试剂、阻滞离子通道(例如，钠通道、钙通道等)的试剂、抑制cAMP生成的试剂、抑制组胺受体信号转导的试剂，及其任何组合。所述方法一般包括：使宿主细胞与所述试剂接触；使所述宿主细胞生长或培养一段时间，其至少部分在所述试剂的存在下进行，从所述宿主细胞收获感兴趣的生物产物，任选地进一步纯化所述生物产物，将该生物产物配制成药物组合物，所述药物组合物包含所述生物产物和任选药学上可接受的载体和/或赋形剂，任选对该药物组合物进行无菌过滤，将该无菌药物组合物包装成合适的剂型。本发明涵盖通过本文所述方法制备的药物组合物。

在一些实施方式中，所述试剂抑制5HTR信号转导，其中，所述试剂可以是该受体的反向激动剂。在一些实施方式中，所述试剂可以是多巴胺受体的抑制剂。在一些实施方式中，所述试剂可以是多巴胺D1和/或D2拮抗剂。因此，本发明涵盖作为5HT7R的反向激动剂发挥作用的试剂用于制造包含生物制剂的治疗性组合物的应用。

这样的试剂的例子包括但不限于：SB-258719(中性5HT7R拮抗剂，可获自GSK)，SB-258741(“AFZ”；部分反向5HT7R激动剂，可获自GSK)，SB-269970(强5HT7R反向激动剂，可获自GSK)，利培酮(D1和D2多巴胺受体的拮抗剂和5HT7血清素受体的反向激动剂；并且是H1和H2组胺受体的反向激动剂)，舍吲哚(结合至D2，5-HT2A，5-HT2C，5-HT6，5-HT7，D3，a1)；齐拉西酮(结合至D2，5-HT2A，5-HT1A，5-HT1D，5-HT2C，5-HT7，D3，a1，NRI，SRI)；克塞平(结合至D2，5-HT2A，5-HT6，5-HT7，D1，D4，a1，M1，H1，NRI)；佐替平(结合至D2，5-HT2A，5-HT2C，5-HT6，5-HT7，D1，D3，D4，a1，H1，NRI)；氯氮平(结合至D2，5-HT2A，5-HT1A，5-HT3，5-HT6，5-HT7，D1，D3，D4，a1，a2，M1，H1)；奥氮平(结合至D2，5-HT2A，5-HT2C，5-HT3，5-HT6，D1，D3，D4，D5，a1，M1-5，H1)，奎硫平(结合至D2，5-HT2A，5-HT6，5-HT7，a1，a2，H1)；异丙嗪(H1组胺受体的强拮抗剂，其对5HT2a/c血清素受体和多巴胺D2受体具有弱到中等的亲和性；并且是Na+通道阻滞剂)。某些离子通道阻滞剂也可能是合适的。示例包括但不限于：电压依赖性Na+通道和胆碱酯酶的抑制剂和阻滞剂，其参与脂质转运和代谢，例如辛可卡因(丁炔酸酯酶(Butynesterase)抑制剂)；电压门控L型钙通道的抑制剂和阻滞剂(例如尼莫地平)；钠通道的抑制剂和阻滞剂，例如安搏律定(1b类抗心律不齐膜稳定剂)、阿米洛利(上皮钠通道ENaC的直接阻滞剂)；和，延迟内向整流性钾通道和L型钙通道的抑制剂和阻滞剂，例如伊布利特半延胡索酸盐(III类抗心律不齐剂)。

宿主细胞的处理

除非另有说明，本发明中使用的重组蛋白、细胞培养、免疫学和微生物学技术是标准方法，其是本领域技术人员熟知的。这类技术描述并解释于文献中，例如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》)，约翰韦利森出版社(John Wiley and Sons)(1984)，J.Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室指南》)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory Press)(1989)，T.A.Brown(编)，Essential Molecular Biology:A Practical Approach(《精编分子生物学：实践指南》)，卷1和2，IRL出版社(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编)，DNA Cloning:A Practical Approach(《DNA克隆：实践指南》)，卷1-4，IRL出版社(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等(编)，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，格林出版联合公司和韦利科学公司(Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience)(1996)和J.E.Coligan等(编)，Current Protocols In Immunology(《新编免疫学实验指南》)，约翰韦利森出版社(包括直至今日的所有更新)，并且其均通过引用纳入本文。

本发明的方法的特点是，具有提高宿主细胞系统中生产的生物分子或产物的产量的作用。本文所述的生物分子的产量指，由宿主细胞产生的可回收的重组表达的生物分子的总量，所述生物分子例如：蛋白质、多肽、抗体(例如，全长或其抗原结合片段、工程改造的对应物、其人源化的对应物等)、核酸、病毒、酶、病毒样颗粒，所述宿主细胞优选地是真核细胞培养物，例如植物、禽类或哺乳动物细胞培养物，其在适于表达、分泌或生成的条件下产生。具体而言，所述生物分子可进一步被加工成所需的生物产物，例如疫苗。

增加的产量通常以毫克蛋白质/毫升体积(mg/mL)或克蛋白质/升体积(g/L)计。

增加的产量还可以通过如下方式计：相比相应的对照，接触本发明中所用的化学剂的宿主细胞系统产生的生物分子的倍数增加，所述对照包括未用所述化学剂处理的对应的宿主细胞系统。

采用本发明的方法，表达的生物分子的水平增加超过对照产生的约2倍至多达约20倍。在优选的实施方式中，相较于比较型对照的产量，产量的增加是至少约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍，或高达约10倍或更高。

在替代性的方面中，任何产量增加可度量为高于比较型对照的百分比。例如，产量或细胞生产力的增加可包括：相比对照，任何测量的参数的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、500％或更大的增加。

如后文实施例所示，本发明的优选方面的特征是：度量培养物上清液中产生的病毒颗粒(vRNA拷贝/ml)、感染性颗粒(IU/ml)或病毒蛋白质(μg/ml)的的增加的量。在一种类型的度量中，HA或NP蛋白的增加指示化学剂增加由宿主细胞系统产生的抗原性蛋白质产量的能力。细胞生产力的增加也可通过如下方式来表征：度量指示病毒颗粒、感染性病毒颗粒或病毒蛋白质，优选HA产量的至少2倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍增加的参数。

产量的度量可在病毒制造的上游加工过程中进行，例如在病毒基因转录、蛋白质表达或病毒颗粒生成或从细胞培养物释放的过程中。用于检测重组系统中生物产物的标准方法可根据所检测的生物分子的特点来采用。检测可指示宿主细胞系统的生产力和能力，其可通过本领域熟知的方法来完成，例如，采用技术例如流式细胞术或免疫细胞化学(例如，用组织特异性或细胞标志物特异性抗体染色细胞)度量形貌和细胞表面标志物的变化，采用光学或共聚焦显微镜检测细胞形貌，或采用本领域熟知的技术(例如PCR和基因表达特征分析)度量基因表达的变化。

在一个优选方面中，对颗粒生成、感染性颗粒或抗原性蛋白质检测病毒表达产物，优选流感病毒产物。流感病毒和抗体可通过如下技术来度量，例如，通过免疫学度量分析抗原表达，这些免疫学测定包括但不限于：使用诸如Western印迹、免疫组化、放射性免疫实验、ELISA(酶联免疫吸附实验)、“夹心”免疫实验、免疫沉淀实验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散实验、凝集实验、补体结合实验、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫实验和FACS分析等技术的竞争性和非竞争性测定系统。

可通过焦点形成测定和血细胞凝集测定来度量宿主细胞系统中的病毒效价。本领域熟知这些测定技术。

本发明的方法意在用于宿主细胞系统，例如细胞培养物或鸡蛋中。在一个优选方面中，在大于约200微升，例如高于约1毫升的细胞培养物体积中用至少一种化学剂处理细胞培养物。更优选，细胞培养物体积是约1毫升-10000升，例如约2毫升-约10000升。在一些实施方式中，合适的生产的批次体积是约15mL、50mL、75mL、100mL、150mL、200mL、250mL、500mL、1L、5L、10L、15L、20L、30L、40L、50L、75L、100L、150L、200L、350L、300L、400L、500L、1,000L、2,000L、3,000L、4,000L、5,000L，或更大。

在一个优选方面中，细胞可在足够量的化学剂的存在下，在适于复制和组装病毒或表达生物产物的条件下，在培养物中生长。在一些方面中，细胞可在低于约37℃的温度下，优选地在等于或低于约35℃的温度下培养。典型地，细胞在试剂的存在下于约32℃～约35℃的温度下培养。在一些实施方式中，细胞在约32℃～34℃的温度下，例如，约33℃的温度下培养。在一个优选方面中，本文中所用的MDC细胞在约34℃培养。

可根据由研究人员确定的实验条件使细胞与化学剂接触。下文实施例显示可用于哺乳动物细胞的至少一种功能性条件组合，尤其是在悬浮条件下。在一个优选方面中，与宿主细胞接触的步骤可在细胞孵育或扩增过程中和在病毒接种之前或同时进行。

宿主细胞中生物分子的重组表达是本领域技术人员已知的标准技术。用于转染细胞的方法可包括电穿孔(基因电转移)、声孔效应法、光学转染、原生质体融合、穿刺转染法(impalefection)、磁转染，或病毒转导。常用的转染试剂包括，例如，磷酸钙、DEAE-右旋糖和脂质。对于具体方案的示例，多篇参考文献可获自例如《新编分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，第9章，Ausubel等.编，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons),1998。在病毒或细菌的情况中，细胞以所需的感染复数(MOI)感染或接种。转染和感染在本文中可互换使用。

用化学剂处理的宿主细胞产生的生物分子的量可在用病毒接种之前、之后或同时度量。在添加化学剂时刻及前后监测细胞膜的病毒感染响应，能够提供对于如下信息的了解：例如，病毒进入细胞、受影响的病毒基因组DNA和/或RNA的水平、病毒基因组DNA进入RNA的转录水平、一种或多种病毒蛋白质表达的水平、细胞内部形成的病毒颗粒数量，和/或从细胞释放的病毒颗粒的数量。不意在受理论限制，据信化学剂在宿主细胞中于病毒生长期发挥其作用。

可在转染后和收获宿主细胞或表达的生物分子的时间段之前、同时或之后的时间段中将试剂添加至包含该宿主细胞的培养基。例如，宿主细胞可在转染前或转染后或感染后以0-1小时，0-2小时，0-3小时，0-4小时，0-5小时，0-12小时，0-20小时，0-30小时，0-40小时，0-50小时，0-60小时的时间间隔与有效浓度的化学剂接触。接触时间可被优化以使产量水平是对照所达到的水平的至少2倍。惊人地，本发明中所用的化学剂可与宿主细胞接触较短的时间，优选地，所述细胞不需要预处理，并且所述化学剂可与病毒同时添加。

在选择合适的试剂来协助感兴趣的生物分子在宿主细胞系统中的增强的生产时，一项希望的特征可能是，该试剂在以较低浓度下使用时能有效增加产量，至少出于以下两个原因。首先，较小量的所述试剂是用于所述产物的商业规模制造所需的。其次，对于药学、营养学和美容应用而言，希望终产品是纯的形式，不含污染物或杂质。在制造过程中所用的低浓度的所述试剂意味着，能够更容易地将该试剂从终产物移除。对于协助产生感兴趣的生物分子的合适的试剂的另一个希望的特征是，所述试剂是已经批准、市售可得的产物，其安全性概况是经充分表征的。

在一些实施方式中，本发明所用试剂在转染时以足够的浓度存在。本领域技术人员可调节并优化条件以实现用于增加生物分子产量所需的参数。如上所述，优选地，增强感兴趣的生物分子的生成或产量的有效量足够低，从而其在商业方面可行且能安全用于人类应用。通常，有效量通过该试剂存在时的制备物总体积(例如，细胞培养物的批体积)中的浓度来测量。在一些实施方式中，本文中所用的合适的试剂的有效量是0.1nM～10μM，优选低于5μM，更优低于1μM，甚至更优选低于100nM。

代表增加的产量或生产力的参数的最优浓度可根据表达系统的个别特点、用户需求而改变，并且对于给定实验方案中任何一种或多种表达增强剂的最优浓度的组成因素的确定是本领域普通技术人员能够预期的。

可使化学剂的组合与宿主细胞系统接触，例如依次添加或以混合形式添加的至少两种、至少三种、至少四种试剂。后续试剂的添加可以第一或先前化合物添加后的0-1小时、2小时、3小时、4小时、5小时间隔进行。取决于病毒、宿主细胞、转染条件和表达产物，采用化学剂或化学剂组合的处理可能会导致超加性(“协同”)效应。例如，除了增加的产量以外，可能会获得超出实际预期的如下效应：制造的生物产物的剂量数量增加，从生产到递送药物至患者的时间缩短，治疗的患者的数量增加，蛋白质/抗原表达的增加，病毒颗粒释放的增加，表明增加的病毒颗粒生成的NP检测的增加，病毒颗粒上HA抗原密度的增加，化学剂组合产生生物产物的功效增加。协同效应可通过本文所述的可行方法检测。

一方面，宿主细胞的处理可在培养基中进行，这允许宿主细胞系统与化学剂相互作用而无需改变培养基。在一个优选的实施方式中，本发明涵盖一种培养基，其中，在采用病毒接种之前，细胞的培养和转染均可在至少一种化学剂的存在下进行。

其中处理宿主细胞的培养基还可包含多种组分，包括氨基酸、维生素、有机盐和无机盐、糖和其它组分，各成分以支持哺乳动物上皮细胞体外培养的量存在。

对于一些应用而言，可优选进一步富集完全培养基的营养成分以支持宿主细胞的快速生长和生物分子产量的增强，优选地，为需要复杂营养的哺乳动物细胞的培养提供更合适的环境。为了完成该富集，可任选将一种或多种增补物添加至本发明的完全培养基或基础培养基。可有利地被添加至现有培养基的增补物包括：一种或多种细胞因子(例如，生长因子，例如EGF，aFGF，bFGF，IGF-1，IGF-2，HB-EGF，KGF，HGF等)，肝素(以稳定肝素结合生长因子，例如FGF，HB-EGF，KGF和HGF)和一种或多种动物源性肽(例如，HSA或BSA)，酵母源性肽(例如，酵母提取物，酵母粉(yeastolate)或酵母提取物超滤物)或植物源性肽(例如，大米或大豆肽)。细胞因子，其可以是天然或重组，市售可得自例如生命技术公司(Life Technologies,Inc.)。(马里兰州洛克维尔)或R&D系统公司(明尼苏达州罗切斯特)，并且可以生产商针对待培养的具体细胞类型推荐的浓度(通常是约0.00001-10mg/升的终浓度)添加至培养基。肝素是市售可得的，例如来自西格玛公司(Sigma)(密苏里州圣路易斯)，并且优选是猪粘膜肝素，其在培养基中以约1-500U.S.P.单位/升的终浓度使用。动物，酵母和植物肽可以是市售可得的(例如，来自西格玛的动物肽；来自马萨诸塞州诺维尔的Difco公司的酵母肽；和来自纽约州诺威奇的奎斯特国际公司(Quest International)的植物肽)，或可以来源或配制进入现有的培养基，如1996年10月10日提交的共通待审、共同拥有的的美国申请号60/028,197详述，通过引用其公开内容全文纳入本文。

在本发明的一些方面中，用于实践本发明的特别合适的培养基类型是无蛋白质培养基(有时称作"PFM培养基")，其完全不含蛋白质(例如，无血清蛋白，例如血清白蛋白或附着因子、营养蛋白质例如生长因子，或金属离子载体蛋白，例如转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白等)。

理想上，均设想用于本发明的无血清和无蛋白质培养基将进一步避免任何动物源性物质，或完全或部分源自动物来源的任何物质，包括重组动物DNA或重组动物蛋白DNA。

细胞系和细胞培养物

根据本发明，可采用任何宿主细胞系统，优选地真核宿主细胞系统，优选哺乳动物宿主细胞系统。典型地，脊椎动物宿主细胞包括但不限于：来自灵长类(例如，人、猴等)、狗、鸟(例如，鸡、鸭等)、锚、牛、马、绵羊、猪、山羊、啮齿类和兔的细胞。在一个优选方面中，脊椎动物细胞来自鸡胚。

在另一个方面，所述细胞是癌细胞。培养的细胞通常根据用于疫苗生成的WHO要求来验证。用于验证此类细胞系的要求包括利用如下至少一种的表征：谱系、生长特性、免疫学标志物、病毒易感性、致肿瘤性和贮存条件，以及通过在动物、鸡蛋和细胞培养物进行测试。适于本发明的宿主细胞的非限制性包括真核细胞，例如植物细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞(例如鸭细胞)、昆虫细胞、酵母细胞等。合适的细胞的非限制性示例包括：原代细胞，例如原代上皮细胞(例如，角质形成细胞，宫颈上皮细胞，支气管上皮细胞，气管上皮细胞，肾上皮细胞和视网膜上皮细胞)和建立的细胞系及其品系或衍生物(例如，293胚胎肾细胞，BHK细胞，HeLa宫颈上皮细胞和PER-C6视网膜细胞，MDBK(NBL-1)细胞，911细胞，CRFK细胞，MDCK细胞，CaCo-2，CapT细胞，CHO细胞，BeWo细胞，Chang细胞，Detroit 562细胞，FRllK-4，HEK-293，HeLa 229细胞，HeLa S3细胞，Hep-2细胞，KB细胞，LS180细胞，LS174T细胞，NC异H-548细胞，RPMI 2650细胞，SW-13细胞，T24细胞，W异28VA13，2RA细胞，WISH细胞，BS-C-I细胞，LLC-MK2细胞，克隆M-3细胞，1-10细胞，RAG细胞，RD，TCMK-1细胞，Y-1细胞，LLC-PK1细胞，PK(15)细胞，GH1细胞，GH3细胞，L2细胞，LLC-RC 256细胞，MH1C1细胞，XC细胞，MDOK细胞，VSW细胞，和TH-I，B1细胞，或其衍生物)，NS0(鼠骨髓瘤细胞)，干细胞，例如胚胎干细胞(例如，细胞)，来自任何组织或器官的成纤维细胞细胞(包括但不限于心脏，肝，肾，结肠，肠，食道，胃，神经组织(脑，脊髓)，肺，血管组织(动脉，静脉，毛细管)，淋巴组织(淋巴腺，腺样体，扁桃体，骨髓和血液)，脾，和成纤维细胞和成纤维细胞样细胞系(例如，CHO细胞，TRG-2细胞，IMR-33细胞，Don细胞，GHK-21细胞，瓜氨酸血症细胞，Dempsey细胞，Detroit 551细胞，Detroit 510细胞，Detroit 525细胞，Detroit 529细胞，Detroit 532细胞，Detroit 539细胞，Detroit 548细胞，Detroit 573细胞，HEL 299细胞，IMR-90细胞，MRC-5细胞，W异38细胞，W异26细胞，MiCl.亚型1细胞，CHO细胞，CV-1细胞，COS-1细胞，COS-3细胞，COS-7细胞，Vero细胞，DBS-FrhL-2细胞，BALB/3T3细胞，F9细胞，SV-T2细胞，M-MSV-BALB/3T3细胞，K-BALB细胞，BLO-11细胞，NOR-10细胞，C.亚型.3H/IOTI/2细胞，HSDM1C3细胞，KLN2O5细胞，McCoy细胞，小鼠L细胞，种系2071(小鼠L)细胞，L-M毒株(小鼠L)细胞，L-MTK-(小鼠L)细胞，NCTC克隆2472和2555，SCC-PSA1细胞，Swiss/3T3细胞，印度麂细胞，SIRC细胞，CII细胞，和Jensen细胞，或其衍生物)。优选地，哺乳动物细胞选自下组：MDCK细胞、293细胞、PER-C6细胞、CHO细胞或其衍生物。

对于给定动物细胞类型的最优铺板和培养条件可由本领域技术人员仅使用常规实验决定。对于常规单层培养条件，可将细胞铺板在不含附着因子的培养容器的表面上。或者，容器可用天然、重组或合成附着因子或肽片段(例如，胶原，纤连蛋白，玻连蛋白，层粘连蛋白等，或其天然或合成片段)预被覆，其为市售可得的，例如来自生命技术公司(Life Technologies,Inc.)(马里兰州洛克维尔)、R&D系统公司(明尼苏达州罗切斯特)、健赞公司(Genzyme)(马萨诸塞州剑桥)和西格玛公司(Sigma)(密苏里州圣路易斯)。也可将分离的细胞接种到天然或合成三维支持物基质(例如预成型胶原凝胶或合成生物聚合材料)之内或之上。对于悬浮培养，细胞通常悬浮于培养基中，并导入便于该细胞以悬浮形式培养的培养容器，例如旋转瓶、灌注装置或生物反应器(参见Freshney,R.I.，《动物细胞培养：基础技术手册》(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)，纽约：阿兰·R·丽丝有限公司(Alan R.Liss,Inc.)，第123-125页(1983))。理想地，将使培养基和悬浮细胞的搅动最小化以避免培养过程中培养基组分变性和对细胞的剪切影响。

在一个优选方面中，用于生产流感病毒的细胞可培养在含血清或无血清培养基中。在一些情况中，例如，对于纯化病毒的制备而言，希望使细胞在无血清条件下生长。细胞可以小规模培养，例如，少于25ml培养基，培养管或培养瓶，或在振荡大培养瓶中，在旋转瓶中，或在细颈瓶、培养瓶或反应器培养物中的微载体珠(例如，DEAE-右旋糖微载体珠，例如Pfeifer&Langen公司的Dormacell；福乐实验仪器公司(Flow Laboratories)的Superbead；苯乙烯共聚物-三-甲基胺珠，例如安娜堡SoloHill公司的Hillex)上。微载体珠是为每体积细胞培养物的贴壁细胞生长提供大表面积的小球(直径在100-200微米范围内)。例如，一升培养基可包含多于2千万微载体珠，这提供超过8000平方厘米的生长表面。对于病毒的商业生产而言，例如，疫苗生成，通常希望在生物反应器或发酵罐中培养细胞。生物反应器可用体积从小于1升到超过100升，例如，Cyto3生物反应器(奥斯莫尼斯公司(Osmonics)，明尼苏达州明尼通卡)；NBS生物反应器(新不轮瑞克科学公司(New Brunswick Scientific)，纽约州艾迪森)；来自B.Braun生物技术国际公司的实验室和商业规模生物反应器(B.Braun Biotech，德国梅尔松根)。

根据优选的方面，可在与化学剂接触之前、同时或之后使宿主细胞与病毒接触。用病毒感染哺乳动物细胞的最优方法是本领域熟知的，且是本领域普通技术人员所熟悉的。细胞的病毒感染可以多种方式定量。MOI是感染性病毒颗粒与被感染的细胞数量之比。因此，平均每10个细胞接种1个病毒颗粒的MOI结果为0.1。MOI的一般理论是向培养物中存在的每个宿主细胞导入一个感染性病毒颗粒。然而，同一细胞可被超过一个病毒感染，从而产生了未经感染的细胞百分比。可通过利用较高MOI来确保每个细胞均被感染，以减少该现象。因此，所提供的病毒颗粒可如本文所述以0.001～100的MOI，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100的MOI给予细胞。

可预期在试剂存在下以悬浮形式培养的病毒感染的哺乳动物细胞产生比未与候选化合物接触的那些细胞更高的病毒效价(例如，2-、3-、5-、10-、20-、25-、50-、100-、250-、500-或1000倍更高效价)。这些方法可用于产生多种哺乳动物病毒和病毒载体，包括但不限于逆转录病毒等，且最优选用于产生流感病毒。在感染的细胞用化学剂处理后，包含病毒、病毒载体、病毒颗粒或其组分(蛋白质和/或核酸(DNA和/或RNA))的所用的培养基可用于多种目的，包括用于细胞转染或基因治疗、动物或细胞培养物感染，病毒蛋白质和/或核酸研究等的疫苗生产、病毒载体生产。或者，根据本领域技术人员熟悉的蛋白质和/或核酸分离技术，病毒、病毒载体、病毒颗粒或其组分可任选从所用的培养基分离。

本发明还可用于从哺乳动物细胞(尤其是从悬浮形式生长的哺乳动物细胞)生产重组蛋白质的方法。在与化学剂接触之前，细胞可经遗传工程改造，或其可用一种或多种外源性核酸分子转染，然后与足量的化学剂接触。用于遗传工程改造哺乳动物细胞以表达感兴趣的多肽的最优方法是本领域熟知的，因此将是本领域普通技术人员熟悉的。根据本文所述的方法，遗传工程改造的细胞可在试剂存在下，以单层培养物或更优选以悬浮培养物形式培养。在细胞培养之后，感兴趣的生物分子可任选地根据本领域技术人员熟悉的蛋白质分离技术从细胞和/或所用的培养基纯化。通过本发明方法产生的生物分子或其衍生物的分离和纯化通过本领域技术人员已知的常用方法进行。

一般而言，蛋白质分离首先依赖于其来源。胞内和胞外蛋白质存在差异。如果蛋白质位于细胞体之内，那么首先需要破坏细胞，这例如通过剪切力或溶细胞方式来进行。之后，例如通过离心分离不溶性物质，例如细胞膜和细胞壁。默认情况下，离心用于分离细胞、细胞器和蛋白质。分离能力方面，更有效的方法是脉冲电泳。此外，在分离其它细胞组分之后，仍然需要分离不同大小的蛋白质、肽和氨基酸。蛋白质的分离可通过一维或二维凝胶电泳或毛细管电泳进行。在氨基酸和肽的情况中，例如，采用色谱方法，例如亲和色谱、离子交换色谱(IEC)或逆相色谱(RPC)。脂质的存在，以及必要的蛋白酶的去除或灭活对于纯化不利。胞外基质中存在的蛋白质无需从细胞提取，但在分离所有不溶物之后，其被高度稀释且含量通常远小于胞内蛋白质。

病毒加工

在培养宿主细胞一段合适的时间以允许病毒复制达到高效价之后，可回收病毒。病毒通常可从其中感染的细胞已生长的培养基回收。一般而言，粗培养基经澄清化，然后浓缩流感病毒。常规方法包括过滤、超滤、硫酸钡吸附和洗脱，以及离心。例如，来自感染的培养物的粗培养基首先可通过以例如1000-2000xg离心足以移除细胞碎片和其它大颗粒物质的时间(例如，10～30分钟)来澄清化。或者，培养基经过滤通过0.8μM醋酸纤维素滤器以去除完整细胞和其它大颗粒物质。任选地，然后对澄清化的培养基上清液例如以15,000xg离心约3-5小时，以使流感病毒沉降。将病毒沉淀在合适的缓冲液(例如STE(0.01M Tris-HC1；0.15M NaCl；0.0001M EDTA)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)中重悬之后，通过在蔗糖(60％-12％)或酒石酸钾(50％-10％)上进行密度梯度离心来浓缩病毒。连续或步进式梯度，例如，12％和60％之间的四个12％步骤中的蔗糖梯度，是合适的。梯度以一定速度离心足以使病毒浓缩成供于回收的可见条带的一段时间。或者，并且对于最大规模的商业应用而言，利用以连续模式运行的分带离心机转子从密度梯度洗脱病毒。足以指导本领域技术人员完成从组织培养到流感病毒制备的其它细节提供于，例如，Furminger.《疫苗生产》(Vaccine Production)，刊于Nicholson等.(编)《流感手册》(Textbook of lnfluenza)第324-332页；Merten等.(1996)《在细胞培养物中产生流感病毒用于疫苗制备》(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)，刊于Cohen与Shafferman(编)《疫苗设计与生产新策略》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)第141-151页，和美国专利5,690,937、美国公开申请号20040265987、20050266026和20050158342，其通过引用纳入本文。必要时，可将回收的病毒在作为稳定剂的蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)的存在下贮存于-80℃。

通过本发明的方法产生的病毒可加工成疫苗制备物。可通过以下方法获得这类疫苗制备物，其是特别优选的实施方式：流感病毒疫苗可如下制备：使流感病毒在细胞培养物中生长，例如，在MDCK悬浮细胞中(WO 1997/037000)。通过0.45微米过滤和CS色谱收获、纯化和浓缩病毒。在加入去污剂(例如80)之后，用BPL处理病毒制备物。之后用CTAB裂解病毒。在超速离心和吸附步骤之后，病毒蛋白质制备物经离子交换色谱(使用TMAE或Sartobind Q作为树脂)。可在辛酸钠(对于Sartobind为50mM；对于TMAE为100mM)和氯化钠(对于Sartobind为400mM，并且对于TMAE为200mM)存在下进行色谱。在组合使用去污剂和离子交换色谱之前，可通过用阳离子去污剂如CTAB沉淀来去除片段化的残留DNA，如Onions等，Biologicals 2010，(38)544-551中所述。本发明可用作Onions方法的部分。

之后，通过超滤浓缩蛋白质制备物。蛋白质可能任选地掺混其它病毒制备物(在三价或四价季节性疫苗的情况中)，并且任选地经无菌过滤、填充和包装。本发明部分包括可通过该方法获得的流感病毒疫苗。

测定

在一个实例中，接触化学剂的宿主细胞的细胞生产力的分析可涉及对细胞生产力的测定，例如，对至少一种表达产物的度量。本文中所用的细胞生产力指，在特定生长条件下，每单位时间细胞产生的重组表达的蛋白质(例如，多肽、抗体等)或颗粒的总量。

细胞生产力还可通过如下方式来确定：与不存在化学剂的情况下对应的对照相比，鉴定在该试剂存在下，该生物产物性质或细胞表型的变化。优选地，该方法中的表达或生物产物能度量病毒颗粒、核酸或蛋白质的生成。

在一个具体方面中，生物分子的直接度量比标准噬斑试验更为准确。

在一个优选实例中，表达产物是HA蛋白，其采用ELISA和本领域技术人员易用的技术来度量。HA蛋白可以是纯化的糖蛋白，或结合至病毒组分例如裂解或全病毒粒膜。

为了度量编码重组蛋白质的核酸序列的合成，可采用熟知的方法例如利用经典核酸杂化技术的Northern印迹方法以及RT-PCT来度量RNA或DNA。

抗原

抗原可以是可被免疫系统组分识别的任何分子(例如，核酸、DNA、RNA、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、碳水化合物、脂质、脂肽、多糖)，无关其能否出发免疫系统的活化。

抗原可与病原体相关联，例如痘苗病毒、禽痘病毒、土耳其流感病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、禽流感、鸡肺炎病毒、犬细小病毒、马流感、FHV、新城疫病毒(NDV)、鸡/Pennsylvania/1/83流感病毒、感染性支气管炎病毒；登革病毒、麻疹病毒、风疹病毒、伪狂犬病病毒、EB病毒、HIV、SIV、EHV、BHV、HCMV、汉坦(Hantaan)、破伤风梭菌、腮腺炎、麻疹病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、人巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、沙门氏菌、奈瑟氏菌、疏螺旋体属、衣原体、博德特氏菌属、疟原虫属(例如、恶性疟原虫和间日疟原虫)、弓形虫、隐球菌、链球菌、葡萄球菌、嗜血杆菌、白喉、破伤风、百日咳、埃希氏菌属、假丝酵母属、曲霉属、内阿米巴、贾第鞭毛虫和锥虫。所述抗原可以是天然产生的抗原或模拟天然产生的抗原或天然产生的抗原的部分的合成分子的片段或部分。

在一个优选方面中，本发明涵盖任何流感病毒毒株或亚型。优选地，所述流感病毒毒株对应于甲型或乙型流感病毒的至少一种流行毒株的临床分离物。甲型病毒基于两种病毒表面糖蛋白，血细胞凝集素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)，被主要分成抗原性亚型。目前有16种鉴定的HA亚型(标为H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)，其均可见于野生水鸟。自从于1933年首次分离该病毒以来，HA和NA的135种可能的组合中，仅四种(H1N1、H1N2、H2N2、H5N1和H3N2)在人群中广泛流行。

本发明的方法显示对曾经难以生产的亚型和毒株的生产方面的具体改善。例如，一般不对乙型流感疫苗进行重配处理，因为缺乏具备足够明显抗原性的合适的高产乙型流感供者株。更可能的是，重配作为一项加工已被低估，因为仅采用获自HA基因的数据度量乙型流感病毒的演化。不过，本发明以更恒定且更省力的方式显著提高了获自乙型毒株的抗原性蛋白质的产量，这在本发明之前不可实现。通过对蔗糖纯化的病毒培养物进行RP-HPLC测得，乙型毒株可以高于20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml生产。乙型抗原的产量是毒株特异性的，并且某些毒株的生产可能低于在常见流感毒株和亚型中观察到的平均20μg/ml。在产量依赖于毒株或类型的情况中，产量的增加可以是相对度量，其可通过与对照毒株或类型做比较来确定。

乙型流感疫苗可以部分是单价、二价、三价、四价或七价疫苗，其可包括超过一种亚型B毒株，并且可包括其它毒株例如但不限于H1、H2、H3、H5、H7和/或H9毒株的组合。

通过本发明产生的亚型B流感病毒的合适毒株包括乙型流感病毒、流感病毒B/Ann Arbor 1/86、流感病毒B/Harbin/7/94、流感病毒B/Hong Kong/5/72、流感病毒B/Lee/40、流感病毒B/Victoria组、流感病毒B/Yamagata 16/88、流感病毒B/Yamagata组、流感病毒B/Yamanashi/166/98、乙型流感病毒/Panama 45/90。

在特别有利的方面，本发明的方法增强流行性流感毒株的产量，包括但不限于，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Ireland/1378/83(H5N8)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/England/63(H7N3)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/England/66(H6N2)，A/Turkey/England/69(H7N2)，A/Turkey/Scotland/70(H6N2)；土耳其流感病毒毒株A/Turkey/England N28/73(H5N2)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/England/110/77(H6N2)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/England/647/77(H1N1)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Ontario/7732/66(H5N9)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/England/199/79(H7N7)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Ontario/7732/66(H5N9)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Ireland/1378/85(H5N8)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/England/50-92/91(H5N1)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Wisconsin/68(H5N9)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Massachusetts/65(H6N2)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Oregon/71(H7N3)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Ontario/6228/67(H8N4)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Wisconsin/66(H9N2)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/England/647/77(H1N1)，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Ontario/6118/68(H8N4)，土耳其流感病毒毒株A/Tur/Ger 3/91，土耳其流感病毒毒株A/Turkey/Minnesota/833/80(H4N2)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Indonesia/03(H5N1)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/FPV/Rostock/1934，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Texas/298313/04，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Texas/167280-4-/02，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Hong Kong/220/97，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Italy/8/98，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Victoria/76(H7N7)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Germany/79(H7N7)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Scotland/59(H5N1)；鸡流感病毒毒株A/Chicken/Pennsylvania/1370/83(H5N2)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Queretaro-19/95(H5N2)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Queretaro-20/95(H5N2)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Hong Kong/258/97(H5N1)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Italy/1487/97(H5N2)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Leipzig/79(H7N7)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Victoria/185(H7N7)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Victoria/92(H7N3)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Queensland/95(H7N3)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Pakistan/1369/95(H7N2)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Pakistan/447-4/95(H7N3)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/HK/G9/97(H9N2)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Nakom-Patom/Thailand/CU-K2/2004(H5N1)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Hong Kong/31.2/2002(H5N11)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Vietnam/C58/04(H5N1)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Vietnam/38/2004(H5N1)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Alabama/7395/75(H4N8)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Germany/N/49(H100N7)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Hong Kong/G23/97(H9N2)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Pennsylvania/8125/83(H5N2)，鸡流感病毒毒株A/Chicken/Hong Kong/97(H5N1)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Anyang/AVL-1/01，鸭流感病毒毒株A/Duck/New York/17542-4/86(H9N1)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Alberta/28/76(H4N6)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Nanchang/4-165/2000(H4N6)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Germany/49(H10N7)，鸭流感病毒毒株A/Black Duck/Australia/702/78(H3N8)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Vietnam/11/2004(H5N1)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Alberta/60/76(H12N5)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Hong Kong/196/77(H1)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Wisconsin/1938/80(H1N1)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Bavaria/2/77(H1N1N1)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Bavaria/1/77(H1N1)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Australia/749/80(H1N1)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)，鸭流感病毒毒株A/Duck/Alberta/35/76H1N1)，禽流感病毒毒株A/Mallard duck/Gurjev/263/82(H14N5)，禽流感病毒毒株A/Mallard duck/PA/10218/84(H5N2)，禽流感病毒毒株A/Mallard duck/Astrakhan/244/82(H14N6)，鹅流感病毒毒株A/Goose/Guangdong/1/96，鹅流感病毒毒株A/Goose/Leipzig/137-8/79(H7N7)，鹅流感病毒毒株A/Goose/Hong Kong/W222/97(H6N7)，鹅流感病毒毒株A/Goose/Leipzig/187-7/79(H7N7)，鹅流感病毒毒株A/Goose/Leipzig/192-7/79(H7N7)，禽流感病毒毒株A/Env/HK/437-4/99，禽流感病毒毒株A/Env/HK/437-6/99，禽流感病毒毒株A/Env/HK/437-8/99，禽流感病毒毒株A/Env/HK/437-10/99，禽流感病毒毒株A/禽疫病毒毒株/Dutch/27(H7N7)，禽流感病毒毒株A/禽疫病毒毒株/Dobson/27(H7N7)，禽流感病毒毒株A/禽疫病毒毒株/Rostock/34(H7N1)，禽流感病毒毒株A/禽疫病毒毒株/Egypt/45(H7N1)，禽流感病毒毒株A/禽疫病毒毒株/Weybridge(H7N7)，禽流感病毒毒株A/Tem/South Africa/61(H5N3)，禽流感病毒毒株A/Tern/Australia/G70C/75(H11N9)，禽流感病毒毒株A/Quail/Vietnam/36/04(H5N1)，禽流感病毒毒株A/Gull/Maryland/704/77(H13N6)，禽流感病毒毒株A/Black-headed gull/Sweden/5/99(H16N3)，禽流感病毒毒株A/Herring gull/DE/677/88(H2N8)，禽流感病毒毒株A/Swan/Italy/179/06(H5N1)，禽流感病毒毒株A/Hong Kong/156/97(A/HK/156/97)，禽流感病毒毒株A/Quail/HK/G1/97(H9N2)，禽流感病毒毒株A/Quail/Hong Kong/AF157/93(H9N2)，禽流感病毒毒株A/Teal/HK/W312/97(H6N1)，禽流感病毒毒株A/Shearwater/West Australia/2576/79(H15N9)，禽流感病毒毒株A/Shearwater/Australia/72(H6N5)，禽流感病毒毒株A/Hong Kong/212/03，禽流感病毒毒株A/England/321/77(H3N2)，禽来源的禽流行性流感A病毒，禽H5N1流感病毒，禽H7N1流感毒株，禽H9N2流感病毒，和禽流感病毒，冷适应(ca)和温敏性(ts)主供者毒株，A/Leningrad/134/17/57(H2N2)。

流感病毒疫苗可包含所述流感病毒的所有蛋白质、肽或其部分，以及编码这些这些蛋白质、肽或其部分的核酸，以及流感病毒颗粒本身，重组流感病毒蛋白质，包括流感包膜蛋白、亚病毒颗粒、病毒样颗粒(VLP)、VLP-复合物和/或其部分，其可用于抵抗流感的免疫目的。

失活的流感病毒疫苗通常可采用已知的方法，例如但不限于，福尔马林或β-丙内酯处理，通过本发明的失活型复制的病毒来提供。可用于本发明的失活的疫苗类型可包括全病毒(WV)疫苗或亚病毒粒子(SV)病毒疫苗。WV疫苗包含完整、失活的病毒，而SV疫苗包含纯化的病毒，其采用去污剂破坏，所述去污剂使含脂质的病毒包膜稳定，然后对剩余病毒进行化学灭活。

此外，可用的疫苗包括含有分离的HA和NA表面蛋白的那些，其称作表面抗原疫苗。一般而言，对SV表面抗原(即，纯化的HA或NA)疫苗的应答是相似的。包含与传染性病毒免疫学相关的NA抗原和不相关的HA的实验失活的WV疫苗的有效性似乎低于传统疫苗。同时包含相关表面抗原的失活的疫苗是优选的。

采用复制的病毒的，减毒的活流感病毒疫苗，也可根据已知的方法步骤用于预防或治疗流感病毒感染：减毒优选根据已知的方法通过将来自减毒的供者病毒的减毒基因转至复制的分离或重配的病毒以单一步骤完成(参见例如，Murphy，Infect.Dis.Clin.Pract.2:174-181(1993))。鉴于对于甲型流感病毒的抗性通过发展针对HA和NA糖蛋白的免疫应答来介导，编码这些表面抗原的基因必须来自重配病毒或高生长性的临床分离物。减毒基因源自减毒的亲本。在该方法中，减毒的基因优选不编码HA和NA糖蛋白。否则，这些基因可能无法被转入携带临床病毒分离物的表面抗原的重配物。已评价许多供者病毒的再生减毒流感病毒的能力。作为非限制性示例，A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)冷适应(ca)供者病毒可用于减毒的疫苗生成(参见例如，Edwards，J.Infect.Dis.169:68-76(1994)；Murphy，Infect.Dis.Clin.Pract.2:174-181(1993))。此外，减毒的活重配病毒疫苗可通过使供者病毒与本发明的剧毒复制病毒配对来产生。然后在25℃(限制剧毒病毒复制)，于H2N2抗血清(其抑制携带减毒的AI AAI6/60(H2N2)ca供者病毒表面抗原的病毒的复制)存在下，选择重配子代。

可通过定点诱变将其它减毒突变引入流感病毒基因，以援救携带这些突变体基因的感染性病毒。可将减毒突变导入基因组的非编码区域，以及编码区。还可将所述减毒突变导入除HA或NA以外的基因，例如，PB2聚合酶基因(Subbarao等.，J.Virol.67:7223-7228(1993))。因此，也可产生携带通过定点诱变导入的减毒突变的新供者病毒，并且所述新供者病毒可用于，以与上文关于AI AAI6/60ca供者病毒所述相类似的方式进行的活减毒重配物H1N1和H3N2候选疫苗的生成。类似地，其它已知且合适的减毒的供者毒株可与本发明的复制流感病毒重配，以获得适用于哺乳动物疫苗接种的减毒的疫苗。(Ewami等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3802-3805(1990)；Muster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5177-5181(1991)；Subbarao等，J.Virol.67:7223-7228(1993)；美国专利申请系列号08/471,100，其通过引用全文纳入本文)。

疫苗制剂

适于接种或用于胃肠外或口服给予的，本发明的疫苗组合物，包含减毒的或失活的流感病毒，任选还包含无菌水性或非水性溶液、悬液和乳液。该组合物还可包含本领域已知的助剂或赋形剂。

用于胃肠外给予的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和/或乳液，其可包含本领域已知的助剂或赋形剂。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。

载体或封闭敷料可用于增加皮肤透过度且增强抗原吸收。用于口服给予的液体剂型可一般包含含有该液体剂型的脂质体溶液。用于悬浮脂质体的合适的形式包括含有本领域常用的惰性稀释剂(例如纯化的水)的乳剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂和酏剂。除了这些惰性稀释剂，该组合物还可包含佐剂、湿润剂、乳化剂和助悬剂，或甜味剂、调味剂或香料。参见例如，Berkow(下文)，Goodman(下文)，Avery's(下文)，Osol(下文)和Katzung(下文)，其通过引用全文纳入本文，包括其中所引的全部参考文献。

当本发明的疫苗组合物用于给予个体时，其还可包含盐、缓冲剂、佐剂或希望用以改善组合物功效的其它化合物。

佐剂是可用于放大特异性免疫应答的化合物。一般而言，佐剂和组合物在给予免疫系统之前混合，或分开给予，但给予至接受免疫的哺乳动物的相同位点。

疫苗中的异质性可通过混合至少两种流感病毒毒株，例如2-50种毒株或其间任何范围或值的复制的流感病毒来提供。

根据本发明，采用本领域已知技术，疫苗可以流感病毒的单一毒株或流感病毒的超过一种毒株的多种变化形式提供。

一旦制备，该疫苗组合物即可给予有需要的对象。因此，一般而言，本发明的减毒或失活的疫苗组合物可在感染发作之前提供(由此预防或减轻相关的感染)或实际感染起始之后提供。例如，所述疫苗组合物的给予可通过多种胃肠外途径进行，例如皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、经口或经皮途径。胃肠外施用可以通过推注或随时间逐渐灌注。使用本发明的疫苗组合物的优选的模式是通过肌内或皮下施予。参见例如，Berkow(下文)，Goodman(下文)，Avery(下文)和Katzung(下文)，其通过引用全文纳入本文，包括其中所引的全部参考文献。

疫苗组合物以有效量给予对象。疫苗组合物的有效量是足以实现所需生物作用的量。应理解，有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重，同时治疗的种类(如果有)，治疗频率以及所需作用的特性。如下提供的有效剂量的范围不意在限制本发明且代表优选的剂量范围。然而，应对个体对象调整最优选的剂量，这是本领域技术人员能够理解和确定的，无需赘述。

本专利包括如下特定实施方式。在一个实施方式中，本发明涉及一种从宿主细胞系统产生治疗性、预防性或诊断性生物分子的方法，所述方法包括：使宿主细胞系统与选自表1的至少一种化学剂接触。所述宿主细胞可以是细胞培养物或鸡胚。所述细胞培养物优选地选自下组：MDCK、Vero、BHK、PERC6或CHO。在优选实施方式中，所述生物分子是抗体、抗体片段，或疫苗抗原，具体是病毒抗原，尤其优选流感抗原。在优选实施方式中，除辛伐他汀以外的他汀或他汀类似物被用作化学剂。在优选实施方式中，这些非辛伐他汀的他汀的浓度是0.001μM～10μM，特别优选低于或等于0.05μM。在优选实施方式中，采用如下通式的化合物：

在特别优选的实施方式中，采用氟伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀或罗素伐他汀，或这些化合物的衍生物，具体是氟伐他汀或匹伐他汀或衍生物。

在本发明的另一个优选的实施方式中，产生的生物分子经进一步加工以产生最终无菌的产物，例如通过进一步浓缩、纯化、过滤、配制、灭菌和装填步骤。因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种从宿主细胞产生治疗性、预防性或诊断性生物分子的方法，所述方法包括：使所述宿主细胞与表1所述的化学化合物接触，收获所述生物分子，并将所述生物分子加工成最终的治疗性、预防性或诊断性产物。优选地，所述产物是流感疫苗，具体是乙型流感疫苗。

定义

术语"宿主细胞"指，包含异源核酸(例如载体)，并且支持该核酸复制和/或表达的细胞，并且其任选生成一种或多种编码的产物，包括多肽和/或病毒。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，或真核细胞，例如酵母、昆虫、两栖类、鸟类或哺乳动物细胞，包括人细胞和鸡胚中的细胞。术语宿主细胞涵盖，培养的细胞、宿主细胞的组合或混合物，包括，例如，不同细胞类型或细胞系(例如，Vero和CEK细胞)的混合的培养物。

本文中所用的“生物分子”、“生物产物”包括从活生物体分离的任何分子，及其衍生物、突变体或变体和/或生物活性片段。在本发明内容中，生物分子或生物产物涵盖生物药物或生物制品。例如，生物产物可以是蛋白质，例如：抗原、酶(例如，激酶、蛋白酶、磷酸酶、转移酶、凝血因子等)、肽、抗体、受体、融合蛋白、生长因子、激素、细胞因子(例如，趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子)、神经毒素等。生物产物可以是核酸、核苷酸、碳水化合物、脂质、病毒或细菌蛋白质，例如用于疫苗、病毒颗粒。优选地，所述生物分子可用作药物制备物(例如疫苗或药物)中的活性组分。在本发明内容中，术语“产物”、“蛋白质”和生物分子可在本文中互换使用。在一些实施方式中，合适的生物分子是重组蛋白，包括但不限于：分泌蛋白质、蛋白质片段(例如，跨膜蛋白的胞外结构域)、嵌合蛋白和/或带标签的蛋白质。若存在，一种或多种标签可位于蛋白质的C末端、N末端和/或位于蛋白质中(例如两个模块之间)。在一些实施方式中，所述重组蛋白可包含一种或多种信号肽部分。在一些实施方式中，所述重组蛋白可以是前体形式(例如，激素原)或其代谢物。

术语"改善/提高"、“增加"或"增强"指，相比对应的对照，统计学上显著的或生理学显著的量。

术语“候选化合物”或“化学剂”指用于调节生物分子在宿主细胞系统(例如细胞培养物或鸡蛋)中的表达或生成的任何化学实体、药学物质、药物等。本文中所用的化学剂还包括类似物和药学上可接受的载体、稀释剂及其制剂。

本文中所用的术语"异构体"指，具有相同分子式但原子排列与构型不同的不同的化合物。本文中所用的术语"光学异构体"或"立体异构体"指，多种立体异构构型中的任一种，其可以本发明给定的化合物形式存在，且包括几何异构体。应理解，取代基可在碳原子手性中心处连接。因此，本发明包括所述化合物的对映体、非对映体或外消旋体。"对映异构体"是一对立体异构体，它们是彼此的可重叠镜像。一对对映体的1:1混合物是"外消旋"混合物。该术语用于表示合适的外消旋混合物。"非对映异构体"是具有至少两个非对称原子的立体异构体，但它们彼此是非镜像的。绝对立体化学根据Cahn-Ingold-Prelog R-S系统指定。当化合物是纯对映异构体时，各手性碳原子处的立体化学可通过R或S指定。未知其绝对构象的解离的化合物可根据它们使钠D线的波长处的平面偏振光旋转的方向(右旋的或左旋)指定(+)或(-)。本文中所述的某些化合物包含一个或多个非对称中心或轴线，并且可因此产生对映体、非对映体，和在绝对立体化学方面如(R)-或(S)-可确定的其它立体异构体形式。本发明意在包括全部此类可能的异构体，包括外消旋混合物，任选纯的形式和中间体混合物。光学活性的(R)-和(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术解析。如果化合物包含双键，其取代基可以是E或Z构型。如果化合物包含双取代的环烷基，则环烷基取代基可具有顺式-或反式-构型。还意在包括全部互变异构形式。

本文中所用"前药"是可在生理条件下或通过溶剂分解转化成指定化合物或所述化合物的药学上可接受的盐的化合物。前药包括其中氨基酸残基或两个或更多个氨基酸残基的多肽链通过酰胺键或酯键共价接合至游离氨基、羟基或羧酸基团的化合物。设想的氨基酸残基包括但不限于20种天然发生的氨基酸。其它合适的氨基酸包括4-羟基赖氨酸、羟赖氨酸、锁链(赖氨)素(demosine)、异锁链(赖氨)素(isodesmosine)、3-甲基组氨酸、正缬氨酸、β-丙氨酸、δ-氨基丁酸、瓜氨酸、同型半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸和甲硫氨酸砜。

术语“处理”、“治疗”、"接触”、“在……的存在下”指在溶液或培养基中添加或混合化学剂，其促进细胞与试剂的相互作用。述及向对象(例如，患者)的给予时，术语“处理”或“治疗”指，治疗性和/或预防性干预的作用以获得所述对象中所需的结果，例如，以减轻病症或疾病、治愈病症或疾病、延迟病症或疾病发作、减轻病症或疾病严重性、预防或减小群体中病症或疾病复发的可能性。例如，可进行本发明以制造药物组合物(治疗性和/或预防性)，其可用于治疗有需要的对象的方法，其中所述方法包括给予所述对象有效量的所述组合物。

本文中所用的术语"有效量"和"有效剂量"指，足以可接受的益处/风险比实现其意图的目的(即，组织或对象中所需的生物学或医学反应)的化合物或组合物的任何量或剂量。相关的所需目的可以是客观的(即通过测试或标记物可测量的)或主观的(即治疗对象表示出迹象或感觉到效果)。在一些实施方式中，有效量是这样的量，当将其给予符合某些临床标准的对象群体时，在该群体中获得统计学显著的反应。有效的量通常以可包括多个单位剂量的给药方案给予。对于任何具体药物制剂，有效的量(和/或有效给药方案内的合适单位剂量)可能变化，例如，根据给药途径、与其他药剂的组合。在一些实施方式中，有效量是这样的量：其在目标群体中引发统计学显著的足够的(例如，保护性)免疫应答。在一些实施方式中，对于任何具体患者的特定有效的量(和/或单位剂量)可能取决于多种因素，包括接受治疗的疾病和疾病的严重性；采用的特定药剂的活性；采用的特定组合；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药的时间、给药途径、和/或采用的特定试剂的排除或代谢速率；治疗的持续时间；和医药领域所熟知的类似因素。在一些实施方式中，有效量是这样的量：当根据具体方案给予该量时，产生合理的可接受的水平的负面副作用的积极结果，从而该副作用(若存在)是患者足以耐受以继续该方案的。本领域普通技术人员将理解，在本发明的一些实施方式中，如果单位剂型包含适于在与积极结果相关的给药方案中给予的量，则该其可被视作包含有效量。

“群体”(如在“目标群体”中)可以指符合某些临床标准的个体(例如，患者)的群体。通常，统计学显著的生物作用可在至少50个个体，优选更多个体的群体中观察到。群体可通过年龄界定，例如老年人(例如，65岁或更高龄)；小儿(例如，新生儿、婴儿、2-12岁、3-6岁、2-7岁或6-12岁儿童)、青少年(例如，12-16岁、12-18岁、13-19岁或19-21岁)、年轻成人(例如，17-24岁)、成人(例如，18-64岁)等。或者或此外，群体可通过某些医学病症来界定，例如具有抑制免疫的那些，具有特定病症前史的那些，具有发展具体医学病症的较高风险的那些，具有某些遗传背景的那些，诊断患有具体疾病或紊乱的那些，接受或经安排以接受具体治疗疗法的那些，或其任何组合。

“对照”指，宿主细胞或包括宿主细胞的系统，其经历基本相同的测试，但其未与化学剂接触，或其用DMSO处理。或者，对照指，用作与其它化合物或系统做比较的对比剂的测试化合物。

本文中所用的短语“低浓度”指存在0.1nM-10μM的化合物。低浓度是相对量并能涵盖高于本文公开的浓度。合适地，术语低浓度指一浓度范围，其相比具体系统的对照而言足以产生本文所需结果。

本文所用的术语"降解产物"指，在制造和/或贮存组合物的过程中由例如光、温度、pH、水或通过与赋形剂反应和/或直接容器封闭系统的反应带来的组合物中的化学变化所产生的杂质。

实施例

科学方法概述

为了鉴定合适于增强来自生物生产系统的生长或产物回收(例如，MDCK细胞中的流感病毒生成)，采用如下方法：(1)采用小分子文库进行高通量筛选，该小分子文库包括靶向流感病毒生命周期的不同阶段的相关生物过程和细胞通路的先天免疫抑制剂和低毒性化合物。(2)采用多种流感毒株和亚型在研究规模的MDCK悬液细胞培养物中证实先导化合物的作用。(3)进行先导化合物的SAR分析，并筛选其它结构-相关的类似物。(4)分析先导化合物的作用机制(MOA)，(5)在生物反应器系统中完成概念验证研究。鉴定了数种化合物，其甚至在低浓度下也能在多种流感毒株和亚型(包括乙型流感毒株)中产生产量的显著增加。

实施例1–高通量筛选

在试验方法(高通量筛选(HTS))中，化合物在包含MDCK 33016PF细胞(细胞描述于US6455298)的384孔格式中测试，该细胞用A/reassortant/NYMC X-183H3N2流感感染。采用核蛋白(NP)-ELISA，以1μM的化合物浓度对14,398种化学剂的文库进行初次筛选。来自该初次筛选的1547个选中物在剂量响应试验中经历NP-ELISA，采用0.001μM-10μM的化合物浓度范围。然后，通过HA-ELISA在剂量响应试验中，对来自初次筛选的268个选中物进行二次筛选。二次筛选产生88个选中物，以低于10μM的化合物浓度，这些选中物中的80种显示NP和/或HA的至少50％的增加。

在一个情况中，对于测试的最高浓度，HA和NP信号都不是可测得的。例如，10.0μM的他汀药物浓度产生了-12.34％的HA增加和-11.44％的NP信号。可能在该高剂量下，他汀功能导致来自例如宿主细胞膜或病毒膜的胆固醇消耗，由此影响了细胞和病毒膜完整性。选择用于测试的排名最前的十种化合物示于表2。

选择用于进一步测试的两种最有效的化合物是：磺酰胺(式3类似物)

和匹伐他汀(式2类似物)

表2

实施例2–先导化合物的证实性研究

对所选的两种最佳化合物进行证实性测试，其在10ml悬浮培养物中采用多重流感毒株和亚型进行。病毒孵育后，收获上清液并定量病毒/HA产量。HA产量通过ELISA检测。感染性颗粒通过基于NP的焦点形成测定(FFA)来检测。病毒颗粒通过核酸序列的qPCR定量来检测。采用磺酰胺类似物(后文称“磺酰胺类似物”)或匹伐他汀，相比对照，培养上清液中度量的总病毒颗粒、感染性颗粒和HA产量显示类似的增加。然而，相比磺酰胺类似物，匹伐他汀在显著更低的浓度提高了产量。H3N2毒株IVR-165的剂量响应性增强研究示于图2。甚至在低至0.05或甚至0.01μM的浓度，匹伐他汀导致HA产量的3倍增加。

实施例3–采用多种流感病毒毒株测试先导化合物

为了研究可用本文化合物影响的流感毒株的范围，MDCK细胞用不同的流感病毒毒株和亚型感染，采用1μM磺酰胺或0.05μM匹伐他汀。病毒感染在34℃，以10^-3或10^-4的MOI进行约60小时。

I.甲型流感

病毒接种后60小时从上清液获得样品，用于作用机制研究，以鉴定基因表达或蛋白质表达。如图3所示，对于多种流感毒株例如流感亚型A H1N1(毒株A/Brisbane/10/10和A/Solomon x145)、流感亚型A H3N2(毒株A/Victoria/361/11、A/Brisbane/10/07、A/Uruguay/716/07和A/Texas/50/12)观察到显著的HA产量增强。

II.流感亚型B

本发明中所用的化学剂对于流感亚型B病毒/蛋白质的生成具有显著作用。如图4所示，在多种流感亚型B毒株(毒株B/Panama/45/90、B/Florida/4/06、B/Wisconsin/1/10、B/Brisbane/60/08和B/Mass/2/12)中，相对于对照，磺酰胺和匹伐他汀产生了至少2倍HA增加。

该数据显示所述化合物的作用不限于特定病毒毒株。

实施例4–作用机制和细胞活力研究

进行作用机制研究，以确定化学剂对于病毒生命周期的不同阶段的作用。在细胞感染-32小时、-24小时、-8小时、-1小时、+2小时、+4小时、+6小时时研究添加时间。在单一周期病毒感染研究中，细胞用以MOI为5的病毒，在冰上孵育1小时，允许病毒附接。1小时之后，冲洗掉未附接的病毒，将细胞移至34℃以允许病毒融合并进入细胞。1.0uM磺酰胺或0.05uM匹伐他汀在清洗步骤之后的不同时间点添加(T＝0、2、4、6小时)。磺酰胺类似物和匹伐他汀似乎在培养物中稳定长达32小时，然后用流感H3N2毒株IVR-165(A/Victoria/361/2011)感染。对于磺酰胺类似物，在感染后6小时，观察到HA产量从约20μg/ml下降至约5μg/ml，并且，对于匹伐他汀，在感染后2小时，从约20μg/ml下降至约5μg/ml。结果表明，HA产量依赖于病毒感染后的添加时间，其可能是特定试剂和病毒生命周期的特定阶段的作用的结果。

细胞活力试验采用MDCK细胞进行，该细胞用1uM磺酰胺或DMSO对照处理。在长达60小时的时间内采用VI-CELL细胞仪(Beckman Coulter)监测细胞活力(细胞活力基于台盼蓝排除法来度量)。本文所用的磺酰胺类似物并非市售药物，因此进行毒性测试以鉴定10μM的最高测试浓度和60小时接触下的孵育过程中的细胞活力。磺酰胺和匹伐他汀对细胞活力均无不利影响。在用磺酰胺处理的细胞中检测到至少91％活力。

实施例5–质谱分析

液相色谱-质谱(LC-MS)分析采用多反应监测(MRM)模式下的三重四极杆质谱仪进行，其经开发以监测在细胞培养物上清液中和通过蔗糖密度梯度病毒纯化处理后的化合物的存在/清除度。对于检测限(LOD)的估计通过化合物在疫苗单批液体(monobulk fluid)中的连续稀释来确定，然后采用单批液体将化合物连续稀释至1ng/ml的浓度。在分析之前，向所有样品添加乙腈(50％v/v)，然后使样品在台式离心机上离心5分钟以去除蛋白质沉淀。对于磺酰胺和匹伐他汀的1ng/ml样品而言，估计信噪比超过100(在磺酰胺情况中超过400)。从在1ng/ml浓度观察到的信噪比水平，将检测限保守地估计为低于0.5ng/ml，且定量限估计为约5ng/ml(图6A)。观察到各化合物的从1ng/ml～超过50ng/ml的校准曲线一致为线性，其中R2值高于0.95(图6A，6B)。为了确定化合物是否在细胞培养物中代谢或降解，将化合物加入单独培养基，或加入培养基+MDCK细胞。在0和60小时获取来自这些加入的样品的上清液用于质谱分析。在60小时之后没有观察到化合物损失(图6B)。为了确定化合物在病毒纯化过程后能否从细胞培养物上清液清除，MDCK细胞在化合物的存在下用甲型或乙型流感病毒感染。60小时之后，将澄清化的细胞培养物上清液(1)冷冻在-80℃用于后续LC-MS分析；或(2)进行病毒纯化过程，其涉及蔗糖-密度梯度离心和病毒颗粒的沉降。还对进行这些“纯化的”样品也通过LC-MS测试，以确定该化合物是否在纯化过程中被清除。在这些纯化的样品仅检测到痕量(低于LOQ，且接近LOD)。病毒纯化后留下的化合物总量(以ng计)低于输入细胞培养物原始输入量的0.25％(图6C)。

实施例6–扩大规模体积中的研究

为了鉴定HA产量能否在较大测试体积中重现，两种先导化合物在DMSO中稀释，并以0.2μM和5μM的浓度施加至包含用H3N2毒株(IVR165)以MOI＝10^-4感染60小时的MDCK细胞培养物的10ml或60ml样品体积。病毒颗粒通过对RNA酶抗性的RNA转录本例如流感M基因的qPCR检测(参见Ngaosuwankul等,Virology Journal 7:75(2010)doi:10.1186/1743-422X-7-75)。HA产量针对对照标准化。研究显示，在10ml和60ml培养物中均观察到对应的HA产量的增加。

如图5所示，结果指示，通过ELISA和qPCR证实，HA产量或颗粒增加成比例相关。

测试了先导化合物的多种类似物用于彼此比较。大多数类似物在测试浓度下增加了流感的产量。然而，对于某些类似物，测试的浓度并非最优。如图8所示，测试了他汀类似物用于比较0.05μM下的活性。罗素伐他汀被鉴定为这样的类似物，其在0.05μM没有输出比较性他汀的产量潜力。然而，替代性浓度和实验条件应被最优化以调整测试的化学剂(例如罗素伐他汀)的作用。

实施例7–SAR研究

进行结构活性关系(SAR)研究以鉴定先导化合物的类似物。鉴定了88种磺酰胺类似物，测试了其中3种化合物。一种类似物导致与先导化合物类似的产量增加。鉴定了155种匹伐他汀类似物，测试了其中超过148种。此外，测试了数种其它市售可得的他汀(图8)。大多数测试的类似物显示出病毒颗粒的产量的至少2倍增加。具体而言，显示(i)先导化合物匹伐他汀优于若干其它市售可得的他汀包括辛伐他汀(图8)，(ii)氟伐他汀和若干氟伐他汀衍生物如氟伐他汀甲基或乙基酯的性能甚至优于匹伐他汀(图7)。具体地，本发明的他汀类似物的优选的实施方式包括表3中所列的试剂，通过ELISA检测，其相对于对照呈现HA产量的至少2倍增加，所述对照在上述条件下采用DMSO处理。

表3

实施例8–信号转导通路的说明

在我们的用以增强细胞培养物中的生物制剂生成的化学添加剂方法中，评估了观察到的增强作用的作用机制。为了鉴定并表征用于应用的化学添加剂，我们的MDCK 33016PF细胞中的流感疫苗生成被用作工作模型，且用于确定该方法在制造此种产物中的可行性。为此，选择流感的多种毒株和亚型中使HA产量增强至少两倍的排名首位的化合物，BYF589(表4中的化合物G)进行详细评估。为了确定由BYF589所致的HA产量增强是否是HMGCR抑制的结果，进行研究以更好地了解其在该系统中的作用模式。为了检测甲羟戊酸(MEV)通路，采用特定酶抑制剂(示于图9A)。这些酶抑制剂选择性地靶向MEV通路的特定支路，为BYF作用机制(“MOA”)测定提供较好的途径。

测试了BYF589以及该通路的多种酶抑制剂对细胞活力和总细胞胆固醇水平的可能的作用。测试的样品包括DMSO、BYF589(1μM)、MEV(100μM)、FTI(0.5μM)、ZA(1μM)和GTI(0.5μM)。处理24小时之后，通过Cell Titer Glow度量没有检测到对细胞活力的负面作用。

游离胆固醇被胆固醇氧化酶氧化以形成胆固醇酮和H₂O₂，其然后与Amplex Red+HRP反应以产生荧光产物试卤灵。对于实验的该部分，度量了均对DMSO标准化的HA产量和细胞胆固醇，采用BYF处理的细胞中HA增强与较低胆固醇相关，并且这是剂量依赖性的，表明增强中可能牵涉到胆固醇含量。单独的MEV对细胞胆固醇水平没有作用。当与BYF联用时，MEV减小了HA产量增强，但没有补偿细胞胆固醇水平，表明单独的胆固醇减少不足以提供HA增强。

当MEV通路的对应臂的三种抑制剂以多种组合使用时，观察到加和效果，表明在增强效果的获得中实际上牵涉到该通路的多重支路。结果总结于图9B。这些结果显示用特定酶抑制剂组合对该通路的全部三个臂进行阻滞能够模拟化合物的HA增强作用。还确认了双磷酸盐类(BYF589作用的下游抑制剂，但处于信号转导支点上游)能引发与HA作用类似的剂量依赖性增强，尽管其不如BYF589强。

实施例9–基因表达研究

文献中的证据表明，他汀能够阻抑IFN和IFN-介导的基因，例如IP10(CxCL10)。因此，测试了流感HA增强能否与他汀响应的干扰素(IFN)的抑制相联系。IP10和IFNB1的基因表达在BYF589化合物存在或不存在的感染之后度量。初步的qRT-PCR数据表明，在BYF589存在下病毒感染的MDCK细胞中IFNb和IP10的延迟/阻遏的诱导。相比不存在BYF589化合物的情况下基因诱导(测于峰值)的时间，在BYF589化合物存在下测试的两种基因中观察到的延迟时间至少是2小时。

实施例10–采用增强剂的宿主细胞处理的时间

为了评估两种先导化合物(BYF589和AFZ077)能否通过常规通路作用，将各化合物在感染后多个时间添加至宿主细胞培养物，并在感染后24小时检测对HA产量的影响。结果显示，与在不含所述化合物的条件下生长的对照相比，当BYF589在病毒感染时(T＝0)添加时，在24小时获得HA产量的约4倍增加。然而，当BYF589化合物在较晚的时间(T＝2、4或6)添加时，在24小时没有观察到HA产量的显著增强。相反，在感染时(T＝0)以及较晚时间(T＝2和4)添加AFZ077时，感染后24小时达到HA产量的约4倍增加；然而，当AFZ077在感染后6小时(T＝6)添加时，没有观察到显著增加。这些结果指示，通过这两种化合物所致的HA增强依赖于向感染的宿主细胞培养物添加的时间。此外，基于各化合物的效果的时间性差异，可能这两种化合物靶向病毒生命周期的不同阶段。或者或此外，这两种化合物可调节宿主细胞的不同通路。

实施例11–迷你生物反应器并列比较

在市售可得的小规模生物反应器系统ambr15^TM(TAP生物系统公司)中进一步测试这两种先导化合物。ambr15系统模拟微量级别(10-15ml)的经典生物反应器的特点，其通过自动化工作站控制，这允许快速评估微量级别的多重生物反应器培养物。

为测试这两种先导化合物，在控制条件下对其进行并排测试，采用两种感染培养基制剂(DM134和CDM)和两种流感毒株，A/Victoria/361/2011(IVR-165)(高表达)和B/Massachusetts/2/2012(低表达)。实验中所用的感染参数如下：接种密度为1.0x10⁶细胞/ml或2.5x10⁶细胞/mL；pH是7.1+/-0.02(pH由采用0.05N NaOH和CO₂气体的双重控制来控制)；DO为50％(50-80％范围)，通过O₂气体控制；搅动为1000rpm(原位控制)；温度是34.0℃，采用生物反应器控制器探针原位监测；容器类型是Spargeless，温度延伸型容器；并且，运行过程中的通气率是1mL/分钟。

来自ambr15实验的结果汇总于图10和11。这两种前导化合物在两种培养基中对于低表达乙型毒株增强了HA产量。然而，对于测试的高表达甲型毒株，AFZ077在两种测试的培养基中均获得了高得多的HA产量增强。HA的定量采用ELISA进行，然后由HPLC证实。显示AFZ077能够在具有该系统中的低(1x10⁶/mL)和高(2.5x 10⁶/mL)感染细胞密度的DM134培养基中增加HA产量。对于后者而言，通过将高ICD形式与AFZ处理联合，AFZ077的增强导致相比原始产量的约4倍更高的产量，胜过初始的2倍目标(图12)。总而言之，采用ambr15系统，AFZ077增加了摇瓶和15ml生物反应器中的DM134培养基中的目前测试的所有毒株的HA产量。对于差表达乙型流感毒株而言，BYF589增加了摇瓶和15ml生物反应器中的DM134培养基中的HA产量。总体上，对于低表达毒株观察到较大的增强效应。此外，采用AFZ077和较高的感染细胞密度观察到加成效应。

实施例12–大规模生物反应器

在先前的研究中，显示AFZ077化合物增加研究摇瓶和15mL生物反应器中的DM134培养基中的HA产量。该结果采用3种不同病毒(高、中和差表达毒株)证实。显示BYF589对于差表达乙型流感毒株增加了研究摇瓶和15mL生物反应器中的DM134培养基中的HA产量，但对高表达H3N2毒株并非如此。为了在较大规模的系统中证实这些结果，采用了TD ambr^TM250mL生物反应器。采用高和低表达毒株测试了两种先导化合物(以及单独DMSO作为阴性对照，并且无化合物/无DMSO作为双阴性对照)，以确定小规模中观察到的增强能否在较大规模的系统中重现。采用如下参数：耗费DM134:新鲜PFM(1:3)；病毒毒株是A/Victoria/361/2011(IVR-165)和B/Massachusetts/02/2012；MOI对于A/Victoria IVR-165是10^-5且对B/Massachusetts是10^-4；ICD：2.0e6–3.0e6个细胞/mL；N-1处理：1B(无培养基交换)；并且，收获时间是感染后65-72小时。HA产量通过两种方法度量：RP-HPLC和HA-ELISA。数据提供于图13和14。图13显示，通过HA-HPLC测定，相比无DMSO对照，0.005μM剂量的BYF589显示约37％的产量增加。图14显示，在测试的具体条件下，在ambr250系统中对B/Massachusetts毒株测试的任何剂量下，相比对照，AFZ077似乎没有产生HA产量上的显著的增加。注意到，误差线表示偏离平均值的一个标准偏差，以说明试验重复之间的HA-ELISA试验的变异度。

实施例13–机制相关的化合物(功能等同物)

发现AFZ077对于流感HA的增强作用依赖于降低的5HT7受体活性，因为AFZ作用能够因添加血清素(5HT)作为配体而消除(参见图15)。这表明，此类作用由受体活性介导，指示能够介导相同或相似细胞作用的其它试剂也可以先导化合物的方式增强蛋白质产量。基于式8(例如，化合物E)展开研究，以鉴定可能会共用某些作用机制的可能的化合物，汇总于下表5。

表5

来自用以评价相对HA产量的比较研究的结果示于图16。进一步测试了这些候选物中的一些相对于AFZ077的增强HA产量的能力(图17)。

进行进一步的SAR研究以进一步鉴定增加产量的候选化合物。采用H3N2毒株，以0.05uM在10ml病毒培养物中测试了165种类似物。相比无化合物(DMSO)对照，BYF589获得产量的约2倍增强。在测试的浓度下，165种的14种被筛选为在HA产量增强方面与BYF589同样好或优于BYF589。发现最佳类似物比BYF589更优约2倍。

实施例14–重组蛋白表达的增强

为了进一步评估HA产量研究中鉴定的化合物的通用性，采用异源细胞，测试了先导化合物之一，BYF589，对重组蛋白表达的作用。具体而言，采用了先前发现难以在HEK293细胞中表达的蛋白质，其被称作“低产者”。在一个典型的最优化系统中，低产者鉴定为具有5mg/L的产量或更小。选择具有2-10mg/L的一般产量的目标蛋白质的约20种构建体用于实验。它们是哺乳动物蛋白质，其为全长对应物的截短形式。各构建体(pRS5a载体的变体形式)包含至少一种标签(例如，至少一个C末端FlagHis标签。此外，许多在N或C末端融合至小鼠IgG1Fc)。选择大致相等数量的各标签类型来降低偏差。

移除产量<1mg/L或>10mg/L的全部目标。接下来，通过标签类型分选目标。最终，如果看似大量代表了具体分子量范围，则剔除一些“重复”。然后，为了选择样品，从各标签类型纳入前6-7种而无需额外选择标准。所得的目标列表如下再现。

将BYF589化合物溶解于DMSO以最终提供70μM工作储液(1000x)。

所用细胞是HEK293自由式(Freestyle)细胞(生命技术公司(Life Technologies))，其来自低传代主细胞库(low-passage Master Cell bank)，其可直接追溯产品接收。细胞在2.5L Thomson UltraYield培养瓶中的HEK293F培养基中生长，其被分成20万个细胞/ml，并允许倍增3天至15万细胞/ml的目标密度。然后，在感染前，将细胞等分进入1L标准康宁(Corning)旋盖培养瓶，装填体积为300ml。对于各目标，一个培养瓶添加有300ul的BYF589，而其它没有。然后，细胞用PEI质粒复合物转染，其制备如下：大量质粒提取(Maxiprep)质粒经冻融、混合，然后以指示的体积添加至293F培养基。线性25,000MW PEI(Polysciences#23966-2)的2mg/ml储液用293F培养基稀释至1mg/ml，然后将指示体积添加至质粒DNA，颠倒混合，然后允许静置2-10分钟。然后将等体积的PEI/DNA混合物添加至各两个培养瓶(一个具有化合物，而另一个没有)，然后将其剧烈旋转，送回摇床，并在37C，120rpm振荡和8％CO₂条件下孵育(与上述生长条件相同)。所用的量反映了我们先前最优化的条件，其为1.6ml培养基中的(每升)400ug质粒+3.2ml的1mg/ml PEI。

收集培养基上清液的小样品(Filipp Gortalum)并用Octet分析。在未处理的初始产量和处理与未处理的细胞的产量之比之间进行校准。

根据标准方案，将细胞悬液加载至Ni-NTA树脂柱。采用基于咪唑的纯化方法，其为本领域熟知的。采用BCA试验进行蛋白质产量的初步分析，然后进行LC90电泳来验证。

实验结果汇总于图18。左图(图18A)显示在存在和不存在BYF589化合物(70nM)的条件下的蛋白质产量之间的关系。图中的各数据点表示20个测试的目标。该图显示如下趋势：化合物能够增加蛋白质产量，尽管程度不同。右图(图18B)描绘了蛋白质产量的倍增与初始产量(未用该化合物处理时)之间的关系。其显示如下一般趋势：趋于已具有高产量的蛋白质(“高产者”)不再因所述化合物的存在而进一步增强，而低产者的表达更有可能被所述化合物增强。在20种测试的蛋白质中，在测试条件下，用BYF589化合物处理时，产量为约≤4mg/L的那些均显示至少1.5倍产量增加。总之，这些发现表明测试的化合物对于广泛的蛋白质显示对于蛋白质产量的普遍增强作用。

表6

本发明实施方式

1.一种用于从宿主细胞系统产生治疗性、预防性或诊断性生物分子的方法，所述方法包括：使宿主细胞系统与选自表1-5的至少一种化学剂接触。

2.根据实施方式1所述的方法，其中，所述宿主细胞系统是细胞培养物或鸡胚。

3.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述细胞培养物选自下组：MDCK、Vero、BHK、EB66或CHO细胞。

4.根据实施方式1所述的方法，其中，所述化学剂是他汀或其类似物，或血清素受体配体，其终浓度是0.0001μM-10μM。

5.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述化学剂包含0.05μM或更小的浓度和如下结构：

6.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞系统被病毒感染。

7.根据实施方式6所述的方法，其中，所述化学剂与所述宿主细胞的病毒接种同时地添加。

8.根据实施方式7所述的方法，其中，病毒是流感。

9.根据实施方式8所述的方法，其中，通过所述宿主细胞系统生产的生物分子选自：流感病毒颗粒、裂解流感病毒体或流感病毒糖蛋白。

10.根据实施方式9所述的方法，其中，所述流感病毒糖蛋白是血细胞凝集素。

11.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，通过ELISA度量，与对照相比，所述生物分子的产量增加至少2倍。

12.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，类似物选自下组：氟伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀或其异构体。

13.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述化学剂是氟伐他汀或匹伐他汀或其异构体。

14.一种用于在细胞培养物中产生治疗性、预防性或诊断性流感蛋白质的方法，其包括：使细胞培养物与浓度为0.05μM或更小的至少一种他汀化合物或其类似物接触。

15.一种用于在细胞培养物中生产治疗性、预防性或诊断性蛋白质的方法，其特征是：所述生产在不是辛伐他汀的、至少一种他汀或其衍生物的存在下进行，其中，通过ELISA度量，与对照相比，所述蛋白质的产量增加至少1.5倍。

16.如实施方式14或15所述的方法，其中，所述他汀是

及其类似物。

17.根据实施方式16所述的方法，其中，他汀类似物选自下组：氟伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀或其异构体。

18.根据实施方式17所述的方法，其中，所述他汀试剂是氟伐他汀或匹伐他汀或其异构体。

19.一种在宿主细胞中生产乙型流感毒株的方法，其包括：使该宿主细胞与化学剂接触，该化学剂在0.05μM或更小的浓度下使得通过ELISA度量的产量增加至少1.5倍。

20.根据实施方式19所述的方法，其中，所述化学剂是

及其类似物。

21.根据实施方式19或20所述的方法，其中，产生乙型流感毒株病毒颗粒、裂解乙型流感病毒粒或乙型流感病毒糖蛋白。

22.根据实施方式21所述的方法，其中，所述乙型流感病毒糖蛋白是血细胞凝集素。

23.一种从宿主细胞生产治疗性、预防性或诊断性生物分子的方法，其包括：

(a)如前述实施方式中任一项所述的所述的方法；

(b)将生产的分子加工成最终的治疗性、预防性或诊断性产物。

24.用于生产流感疫苗的方法，其中进行以下步骤：

a.在包含细胞培养物和选自表1的至少一种化学剂的培养基中使病毒生长；

b.加工该病毒以产生无菌疫苗。

25.用于生产乙型流感病毒疫苗的方法，其中进行以下步骤：

a.使病毒在包含细胞培养物和至少一种化学剂的培养基中生长，以通过ELISA度量，相比对照，产生至少1.5倍的乙型流感增加，和

b.加工该病毒以产生无菌疫苗。

26.根据实施方式23-25所述的方法，其中，所述化学剂选自表1或3。

27.用于生产流感疫苗的方法，其中进行以下步骤：

a.使病毒在细胞培养物中于浓度为0.05μM或更小的他汀试剂的存在下生长；

b.加工该病毒以产生无菌疫苗。