专利名称：一种柳枝稷的体外繁殖方法
技术领域：
本发明涉及生物能源植物柳枝稷的生物技术领域，进一步涉及一种柳枝稷体外繁殖的方法。
背景技术：
柳枝稷(英文名Switchgrass，拉丁名Panicum virgatum Linn)属于禾本科，黍属，是一种多年生的优良牧草，在我国已有悠久的栽培历史。近几年来，因其栽培技术简单，适应性广，防风固沙能力强，耐瘠薄，生物学产量高，可利用低质地或荒漠化土壤，被国际上确定为替代粮食资源以生产燃料乙醇的首选生物能源植物。目前，世界上以美国为代表的许多国家都投入了大量的人力、物力进行柳枝稷的研究开发。其中，采用生物技术增强柳枝稷的抗逆性，提高光合效率，增加生物学产量，降低木质素含量和提高乙醇产率等方面已成为目前的研究热点之一。
体外繁殖技术是生物技术的主要组成部分之一，在遗传转化体系的建立，优良种质规模的扩张(包括常规品种和转基因材料)和濒危物种的繁殖保存等方面都具有十分重要的意义。目前，在柳枝稷的体外繁殖方面，主要采用从人工诱导的愈伤组织中再生植株的传统方法。然而，与大多数禾本科植物的组织培养相似，柳枝稷在人工诱导愈伤组织方面也存在基因型差异，培养周期长，再生率低，成本较高等缺点，使生物技术在柳枝稷上的应用受到了一定限制。探索一种避开通过愈伤组织再生植株的体外繁殖方法，对柳枝稷的生物技术研究将起到很大的促进作用。
发明内容
针对上述现有柳枝稷体外繁殖技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种柳枝稷的体外繁殖方法，以拓宽柳枝稷组织培养和遗传转化的基因型范围，缩短培养周期，提高再生率，降低实验成本，加速转基因植株后代的繁殖，推进生物技术在柳枝稷上的广泛应用。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案一种柳枝稷的体外繁殖方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行步骤一选择适宜生长发育阶段的茎节组织在柳枝稷生长发育至有5～6个节时，去除顶端和基部的2个茎节，人工切取中间3～4个茎节处的茎节组织，茎节组织包含切取茎节的上下区段各1～1.5cm长度。
步骤二诱导初生再生芽对茎节组织进行灭菌，以MBP培养基人工诱导初生再生芽，其中，MBP培养基为MS无机盐和维生素混合物4.43g/L，麦芽糖30g/L，6-苄基氨基嘌呤3mg/L，琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8，28℃条件下光照培养至再生芽长度为0.5cm～1.5cm。
步骤三丛生芽块生长点的人工处理沿再生芽基部2mm～3mm处切除再生芽，28℃条件下继续光照培养至再生芽长度为0.5cm～1.5cm时，再次切除再生芽，重复进行4～5次，至茎节组织处的丛生芽块直径为0.5cm左右。
步骤四丛生芽的大量诱导再以MBP培养基对丛生芽块进行人工诱导，28℃条件下，光照培养至丛生芽长度平均为2.0cm～2.5cm，再生出较大规模的丛生芽。
步骤五丛生芽生根培养沿丛生芽块基部切取并分离出每个丛生芽，转入生根培养基SMO中，28℃，光照条件下培养2～4星期至每个丛生芽幼苗高度约为5cm以上，得到再生植株；其中，生根培养基SMO为MS无机盐和维生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、琼脂粉7.0g/L，pH＝5.8。
步骤六移栽至温室或大田将再生植株炼苗3～5天后，移栽至温室或大田即可。
本发明与传统的通过人工诱导愈伤组织再生植株的柳枝稷体外繁殖方法相比，在组织培养和遗传转化的基因型选择，培养周期，再生频率及促进转基因植株后代的繁殖等方面都取得了较大的提高，效果显著。具体表现在1.拓宽了柳枝稷组织培养和遗传转化的基因型范围与大多数禾本科植物的组织培养相似，柳枝稷在人工诱导愈伤组织方面也存在基因型差异。因为愈伤组织的分化能力在很大程度上是受基因型影响的，这使柳枝稷组培或转化材料的选用受到了很大限制，造成目前组培或转化都集中在个别基因型(目前主要选用的基因型为Alamo)，而这些基因型又并非生产实践所需要或在生产上应用很有限。育种上要利用导入的外源目的基因，目前还只能采用传统的常规育种方法如回交、杂交等方法将其转育到生产上推广的优良品种中，造成了人力、物力的浪费。本发明利用柳枝稷茎节生长点直接再生植株，不需要经过愈伤组织的分化阶段，实践证明可以利用生产上现有的所有基因型，极大地拓宽了柳枝稷组织培养和遗传转化的基因型范围，为利用生物技术对柳枝稷进行遗传改良奠定了良好的基础。
2.提高了柳枝稷的再生频率柳枝稷愈伤组织的分化能力在很大程度上是受基因型影响的，因此，不同基因型材料的再生频率存在较大差异。除个别基因型可获得较高的再生频率外，大多数材料的再生频率都较低，个别材料甚至不能获得再生植株。本发明利用茎节生长点直接再生植株，再生率接近100％，同时获得再生植株的比例也较传统愈伤组织培养法大幅度地提高。一般情况下，采用传统愈伤组织再生法每块胚性愈伤组织可再生出1～数十个再生植株，而本发明每个茎节生长点平均可再生出50～100个以上的再生植株。如果同时将获得胚性愈伤组织的概率计算在内(通常柳枝稷胚性愈伤组织得率大多低于10％或更少)，本发明大幅度地提高了柳枝稷的再生频率。
3.缩短了柳枝稷的培养周期采用传统愈伤组织再生法，从诱导愈伤组织开始到再生植株移栽至温室，一般需要120～150天。本发明利用柳枝稷茎节生长点直接再生植株，不需要经过愈伤组织的分化阶段，通常只需要80～100天，缩短了柳枝稷的培养周期。
4.降低了实验成本与传统的从人工诱导的愈伤组织中再生植株的柳枝稷体外繁殖方法相比，本发明不需要增加额外的昂贵试剂，缩短了培养周期，提高了再生频率，使实验成本相应降低。通过计算，较传统的柳枝稷体外繁殖方法单株再生植株成本可降低50％以上。
5.可迅速扩大转基因植株的规模利用本发明的柳枝稷体外繁殖方法，结合分子生物学实验技术，可迅速扩大含有外源目的基因的转基因植株的规模，为目标基因的功能验证和利用转基因技术对柳枝稷进行遗传改良奠定了一个强有力的基础。
具体实施例方式
本发明选择柳枝稷适宜生长阶段的茎节组织，在MBP培养基上诱导再生芽，对丛生芽块生长点进行人工处理，采用人工方法大量诱导丛生芽，丛生芽的生根培养，将再生植株移栽至温室或大田。具体按如下步骤进行(1)选择适宜生长发育阶段的茎节组织在柳枝稷生长发育至有5～6个节时，去除顶端和基部的2个茎节，人工切取中间3～4个茎节处的茎节组织，每个茎节组织取材包含茎节的上下区段各1～1.5cm长度。
(2)诱导再生芽
a.采用70％质量分数的酒精表面消毒1分钟；b.采用20％质量分数的商业用次氯酸钠(加入0.1％的吐温80)灭菌15分钟；c.以MBP培养基人工诱导初生再生芽，其中，MBP培养基为MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)3mg/L、琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8；d.28℃，光照培养7～10天至再生芽长度为0.5～1.5cm。
(3)丛生芽块生长点的人工处理a.沿再生芽基部2～3mm处切除再生芽；b.将茎节组织重置于MBP培养基上，28℃，光照培养；c.在再生芽长度为0.5～1.5cm时，沿再生芽基部2～3mm处再次切除再生芽；d.重复进行切除培养4～5次，至茎节组织处的丛生芽块直径为0.5cm左右。
(4)丛生芽的大量诱导a.将茎节组织转移至MBP培养基上(MBP培养基配方同上)；b.28℃，光照培养至丛生芽长度平均为2.0～2.5cm，每个丛生芽块上可再生出较大规模的丛生芽。
(5)丛生芽生根培养a.沿丛生芽块基部切取并分离出每个丛生芽；b.转入生根培养基SMO中，28℃，光照条件下培养2～4星期至幼苗高度约为5cm以上，得到再生植株。其中，生根培养基SMO为MS无机盐和维生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、琼脂粉7.0g/L，pH＝5.8。
(6)移栽至温室或大田将再生植株炼苗3～5天后，移栽至温室或大田即可。
本发明的总体操作流程为选择适宜生长阶段的茎节组织→诱导再生芽→丛生芽块生长点的人工处理→丛生芽的大量诱导→丛生芽生根培养→移栽至温室或大田。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例1对Alamo，Blackwell，GA-001A和N.Switchgrass四个柳枝稷品种进行体外繁殖。具体生产过程为(1)切取茎节组织在柳枝稷四个品种分别生长发育至有5～6个节时，去除顶端和基部的2个茎节，人工切取中间3～4个茎节处，每个茎节取材包含茎节处的上下区段各1～1.5cm长度。
每个品种分别切取来源不同植株的茎节组织100个。
(2)诱导再生芽a.将茎节组织置于培养皿中，采用70％质量分数的酒精表面消毒1分钟；b.弃去酒精，采用20％质量分数的商业用次氯酸钠(加入0.1％的吐温80)灭菌15分钟；c.用无菌水冲洗3次，在MBP培养基上人工诱导初生再生芽，每皿放置2个茎节组织；其中，MBP培养基为MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)3mg/L、琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8；d.28℃，光照培养7～10天至再生芽长度为0.5～1.5cm。
其中，Alamo有4个茎节未诱导出初生再生芽，Blackwell和GA-001A各有1个茎节组织未诱导出初生再生芽。
(3)丛生芽块生长点的人工处理a.用无菌刀片沿再生芽基部2～3mm处切除再生芽，注意不能伤及茎节组织的生长点；b.将茎节组织重置于MBP培养基上，28℃，光照培养；c.在再生芽长度为0.5～1.5cm时，沿再生芽基部2～3mm处切除再生芽；d.Alamo重复进行切除培养5次，其余三个品种重复进行切除培养4次，至茎节组织处的丛生芽块直径为0.5cm左右。
(4)大量丛生芽的诱导a.将Alamo，Blackwell，GA-001A和N.Switchgrass四个品种的茎节组织连同丛生芽块转移至MBP培养基上(MBP培养基配方同上)，每皿放置1个茎节组织；b.28℃，光照培养至丛生芽长度平均为2.0～2.5cm，每个丛生芽块上可再生出大量的丛生芽。
经过调查，Alamo每个茎节组织的丛生芽块平均可再生出62.5个丛生芽，Blackwell为96.5个，GA-001A为87.9个，N.Switchgrass为91.3个。
(5)丛生芽生根培养a.沿丛生芽块基部切取并分离出每个丛生芽；b.将每个丛生芽转入生根培养基SMO中，28℃，光照条件下培养3～4星期至幼苗高度约为5cm以上，得到再生植株。其中，生根培养基SMO为MS无机盐和维生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、琼脂粉7.0g/L，pH＝5.8。
(6)移栽至温室打开培养瓶封口，将再生植株炼苗3～5天后，移栽至温室即可。
经过调查，不计在生根培养阶段和幼苗阶段死亡的丛生芽或幼苗，Alamo共获得5725株再生植株，Blackwell共获得9150株再生植株，GA-001A共获得8371株再生植株，N.Switchgrass共获得8639株再生植株。
实施例2对导入叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT的T1代Alamo转基因植株进行体外繁殖。具体生产过程为(1)切取茎节组织经过PCR和Southern杂交检测，鉴定出含有PSAG12-IPT目标基因的T1代Alamo转基因植株。在转基因植株生长发育至有6个节时，去除顶端和基部的2个茎节，人工切取中间4个茎节处，每个茎节组织取材包含茎节上下区段各1～1.5cm长度，共切取100个来源不同转基因植株的茎节组织。
(2)诱导再生芽a.将茎节组织置于培养皿中，采用70％质量分数的酒精表面消毒1分钟；b.弃去酒精，采用20％质量分数的商业用次氯酸钠(加入0.1％的吐温80)灭菌15分钟；c.用无菌水冲洗3次，在MBP培养基上人工诱导初生再生芽(MBP培养基配方同实施例1)，每皿放置2个茎节组织；d.28℃，光照培养7～10天至再生芽长度为0.5～1.5cm。其中，有2个茎节未诱导出初生再生芽。
(3)丛生芽块生长点的人工处理a.用无菌刀片沿再生芽基部2～3mm处切除再生芽；b.将茎节组织重置于MBP培养基上，28℃，光照培养；c.在再生芽长度为0.5～1.5cm时，沿再生芽基部2～3mm处切除再生芽；d.重复进行切除培养5次，至茎节组织处的丛生芽块直径为0.5cm左右。
(4)大量丛生芽的诱导
a.将Alamo T1代转基因植株的茎节组织连同丛生芽块转移至MBP培养基上，每皿放置1个茎节组织；b.28℃，光照培养至丛生芽长度平均为2.0～2.5cm，每个丛生芽块上可再生出大量的丛生芽。经过调查，每个茎节组织的丛生芽块平均可再生出57.3个丛生芽。
(5)丛生芽生根培养a.沿丛生芽块基部切取并分离出每个丛生芽；b.将每个丛生芽转入生根培养基SMO中，28℃，光照条件下培养3～4星期至幼苗高度约为5cm以上，得到再生植株。
(6)移栽至温室打开培养瓶封口，将再生植株炼苗3天后，移栽至温室即可。
经过调查，不计在生根培养阶段和幼苗阶段死亡的丛生芽或幼苗，共获得5227株再生植株。随机提取50株再生植株的基因组DNA，经过PCR和Southern杂交检测，50株再生植株全部含有PSAG12-IPT目标基因，表明本发明可以作为柳枝稷转基因植株后代快速纯合和繁殖的有效手段。
权利要求
1.一种柳枝稷的体外繁殖方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行步骤一选择适宜生长发育阶段的茎节组织在柳枝稷生长发育至有5～6个节时，去除顶端和基部的2个茎节，人工切取中间3～4个茎节处的茎节组织，茎节组织包含切取茎节的上下区段各1～1.5cm长度；步骤二诱导初生再生芽对茎节组织进行灭菌，以MBP培养基人工诱导初生再生芽，其中，MBP培养基为MS无机盐和维生素混合物4.43g/L，麦芽糖30g/L，6-苄基氨基嘌呤3mg/L，琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8，28℃条件下光照培养至再生芽长度为0.5cm～1.5cm；步骤三丛生芽块生长点的人工处理沿再生芽基部2mm～3mm处切除再生芽，28℃条件下继续光照培养至再生芽长度为0.5cm～1.5cm时，再次切除再生芽，重复进行4～5次，至茎节组织处的丛生芽块直径为0.5cm左右；步骤四丛生芽的大量诱导再以MBP培养基对丛生芽块进行人工诱导，28℃条件下，光照培养至丛生芽长度平均为2.0cm～2.5cm，再生出较大规模的丛生芽；步骤五丛生芽生根培养沿丛生芽块基部切取并分离出每个丛生芽，转入生根培养基SMO中，28℃，光照条件下培养2～4星期至每个丛生芽幼苗高度约为5cm以上，得到再生植株；其中，生根培养基SMO为MS无机盐和维生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、琼脂粉7.0g/L，pH＝5.8；步骤六移栽至温室或大田将再生植株炼苗3～5天后，移栽至温室或大田即可。
全文摘要
本发明公开了一种柳枝稷的体外繁殖方法。具体为在柳枝稷生长发育至有5～6个节时，切取中间3～4个茎节处，在MBP培养基上人工诱导再生芽；对丛生芽生长点人工重复切除处理4～5次至丛生芽块直径为0.5cm左右，在新的MBP培养基上诱导获得较大规模的丛生芽；将再生植株在生根培养基SMO中培养成苗，移栽至温室或大田。本发明建立的柳枝稷的体外繁殖方法，拓宽了柳枝稷组织培养和遗传转化的基因型范围，缩短了培养周期，提高了再生频率，降低了实验成本，同时可以作为柳枝稷转基因后代快速繁殖的有效手段，为生物技术在柳枝稷上的广泛应用奠定了基础。
文档编号C12N5/04GK101081005SQ20071001826
公开日2007年12月5日 申请日期2007年7月13日 优先权日2007年7月13日
发明者奚亚军, 刘曙东 申请人:西北农林科技大学