用于借助膜过滤进行液体的微生物研究的陪替氏培养皿和方法与流程

细菌、霉菌和酵母可能不利地损害液体，例如饮料、水或化妆品的品质和可贮藏性。这种类型的微生物可在加工过程中存在于原材料中、空气中或表面上。因此通常在生产过程中就尝试，一方面防止污染，另一方面通过在关键点的定期取样和测试发现可能的污染物。系统地进行的取样和分析程序能使制造商在源头处发现和清除污染物以免其发展成更大的问题。为了待过滤的液体的微生物分析，通常使用过滤器，使待研究的液体流经该过滤器。在过滤后，取出该过滤器并放入例如琼脂皿中，该过滤器在其上在培养箱中在升高的温度下储存几天。可能从液体中过滤出的微生物通过琼脂获得刺激生长的营养素，以使该微生物能够繁殖并可测定或计数。这种已知方法的主要难点是通常极其敏感的过滤器的操作。它们通常用镊子夹住并放置在陪替氏培养皿的培养基上。过滤器和陪替氏培养皿的培养基在该操作过程中绝不能受到破坏或变形。恰好是对必须并行研究大量样品的实验室而言，另一问题是各个陪替氏培养皿的空间要求。通常使用直径明显大于要研究的过滤器的陪替氏培养皿。这是必须的，因为否则无法将过滤器放置在位置远低于皿边缘的培养基上。例如，直径60毫米或更大的陪替氏培养皿用于直径47毫米的过滤器。大的陪替氏培养皿的使用意味着陪替氏培养皿和位于其中的培养基的更大材料消耗，以及特别是在该皿的培养过程中在研究实验室中的更大空间要求。本发明的目的因此是在将过滤器放置在陪替氏培养皿上的过程中简化过滤器的操作并且还提供尽可能节省空间的皿。已经发现，数十年来已为人所知并使用许多、有时复杂的装置进行的该方法可以通过使用几乎完全装满培养基或优选一直装到边缘的陪替氏培养皿而明显简化。由此可以将过滤器放置并定位在培养基上而不受陪替氏培养皿边缘的阻碍。操作更快速，并且对过滤器或培养基的破坏更少。此外，可由此节省空间和培养基，因为可以将陪替氏培养皿的直径减小到几乎该过滤器的直径。本发明因此涉及陪替氏培养皿，其包括皿和盖，该皿装载培养基至少到该皿的边缘下方1毫米，但最多到该皿的边缘，该盖封闭该皿。在一个优选实施方案中，所述皿完全装满培养基，即直到边缘。在另一优选实施方案中，所述培养基是琼脂培养基。在另一实施方案中，所述皿和盖是圆形的。在一个优选实施方案中，所述盖的内径至少略大于所述皿的外径，以使所述盖可倒置在所述皿上以封闭该皿。在另一优选实施方案中，所述盖底部不置于所述皿的边缘上。为此，引起所述盖底部不直接置于所述皿的边缘上的一个或多个装置优选位于所述皿的壁上或所述盖上。在一个实施方案中，通过将至少3个突起（所述盖置于其上）施加到所述皿的边缘上，防止所述盖底部置于该皿的边缘上。在另一实施方案中，在所述皿的壁上（在内侧或优选在外侧）安装例如隆起（Wulst）形式或密封装置形式的支架，所述盖的边缘置于其上。本发明还涉及检测液体或气体中的微生物的方法，其特征在于下列方法步骤a)通过过滤器过滤所述液体或气体b)将所述过滤器施加到本发明的陪替氏培养皿的培养基上c)用盖密封所述陪替氏培养皿d)培养来自步骤c)的陪替氏培养皿e)评估微生物生长。在一个优选实施方案中，过滤液体。在一个优选实施方案中，过滤器和陪替氏培养皿是圆形的。在一个优选实施方案中，所述陪替氏培养皿的内径比所述过滤器的直径大2至10毫米。所述过滤器优选具有0.2至0.45微米的排阻限。所述过滤器优选主要由乙酸纤维素和/或硝酸纤维素构成。本发明还涉及本发明的陪替氏培养皿用于检测过滤器上的微生物的用途。为此，将所述过滤器置于所述陪替氏培养皿的培养基上，培养并随后评估微生物。图1显示本发明的陪替氏培养皿的皿的两个可能的实施方案。在各种情况下都没有显示盖。根据本发明，陪替氏培养皿是用于容纳营养培养基的容器，其中营养培养基被理解为例如营养溶液或固体培养基（Nährboden），其特别用于培养微生物、细胞培养物、细菌等。该容器包括皿和密封该皿的盖。在此应该指出，盖可以围绕皿或嵌入皿中。因此，该皿和盖通常被理解为互相接合以形成或多或少封闭的空间的部件。为简单起见，下面称为皿和盖。该皿和盖各自包括优选为圆形面形式的底部（皿底部和盖底部）和从底部突出的优选为圆环形的壁（皿壁和盖壁）。在此，壁的上缘被称作边缘。壁之一，优选盖壁的内径至少略大于另一个壁，优选皿壁的外径，以使得可以将一个壁倒置于另一个上（或反之亦然）以封闭该皿。陪替氏培养皿因此通常是具有优选搭接的盖的平坦、圆形、通常透明的玻璃皿或塑料皿。这样的皿通常用于生物学或化学。它们用于培养微生物（也称作微生物），并且用于存放细胞培养物。关于通用的容器，可以仅举例参考DE4406725A1，从中获知在陪替氏培养皿意义上的容器。盖用于密封容器。通常将盖倒置于皿或皿壁上。培养基在本发明的意义上是固体的营养培养基或固体培养基，在其上非特异性的各种微生物或特异性的某些微生物可生长。培养基的基本组成通常由主要组分水、可用于各自的微生物的能源，例如有机化合物以及该微生物需要的营养素（有机或无机碳源、氮源、硫源和磷酸盐源和其它必需营养素）构成。用于异养生物的营养培养基中的营养素通常是碳水化合物（“糖”）、蛋白水解物（胨）和任选的脂肪酸。此外，无机盐为微生物提供生存必需的离子，例如铵、钾、钠、磷酸根、硫酸根和痕量元素。此外，还可含有：-染料或其前体（显微术染料、显色底物）-胶凝剂（固化剂），如琼脂或明胶，-抑制剂（例如抗生素）和用于防止不希望的微生物生长的选择性试剂（例如用于酵母/霉菌固体培养基的氯霉素）-用于指示变化，例如pH值变化以及用于指示某些代谢产物或代谢活动的指示剂-用于稳定pH值的缓冲物质-生长因子，如激素、维生素等。根据本发明优选的是基于琼脂的培养基，即包含琼脂的培养基。用于检测微生物的培养基是本领域技术人员已知的。合适的培养基的实例可见于例如MicrobiologyManual2000,MerckKGaA,德国。下表示例性提及一些培养基和要用它们检测的微生物。培养基微生物m-Green酵母和霉菌mTGE全部(总计数)溴棕三甲铵-萘啶酮酸绿脓杆菌SlanetzBartley肠球菌Chromocult®大肠菌大肠杆菌/大肠菌LactoseTTC大肠杆菌/大肠菌m-Endo大肠菌mFC大肠菌TSC产气荚膜梭菌（Clostridiaperfringens）mCP产气荚膜梭菌BCYE军团菌属GVPC军团菌属BAT脂环酸芽孢杆菌过滤器在本发明的意义上是适用于收集微生物，如霉菌、酵母或细菌的所有过滤器。这些可以是纸过滤器或例如由塑料制成的膜过滤器。例如，由PVDF制成的过滤器是合适的。特别优选的是基于纤维素混合酯的过滤器。这些是包含至少乙酸纤维素和/或硝酸纤维素的过滤器。过滤器的孔径取决于要分离的微生物的尺寸。典型排阻尺寸是0.2至0.45微米。这意味着该过滤器具有0.2至0.45微米的孔径。通常使用具有30至80毫米，优选40至50毫米的直径的过滤器。适合用于本发明的方法的示例性过滤器是来自MerckMillipore,德国的EZ-PAK®膜。这是具有0.45微米孔径的基于纤维素酯的膜过滤器。已经发现，装载培养基至少到皿的边缘下方1毫米，但最多到皿的边缘的本发明陪替氏培养皿显著简化过滤器的分析。一方面，在该皿的培养基上放置敏感的过滤器明显更容易。另一方面，该皿的直径可以与过滤器的直径匹配。恰好在必须并行研究大量样品的实验室中，各个陪替氏培养皿的空间要求应该尽可能小。本发明现在提供相对于过滤器的直径而言使用更小陪替氏培养皿的可能性，因为将过滤器放置在装载到边缘的陪替氏培养皿上明显比将过滤器往下放置在皿的深处更简单。该皿通常装载培养基至少到皿的边缘下方1毫米，但最多到皿的边缘。该皿优选装载培养基刚好到边缘，即完全装满。培养基装载的高度由陪替氏培养皿的壁高得出。壁高在此是指陪替氏培养皿内侧的壁高。这与皿的外侧壁高相差陪替氏培养皿的底厚度。陪替氏培养皿的内侧壁高应该为至少3毫米，以形成至少3毫米的培养基高度。培养基的高度优选为3至7毫米。因此对陪替氏培养皿得出3至8毫米的优选壁高。通过陪替氏培养皿的壁高的选择，能够影响培养基的消耗。该培养基优选是琼脂培养基。在一个优选实施方案中，该皿和盖是圆形的并且盖的内径至少略大于皿的外径，以使盖可倒置在皿上以封闭该皿。为了实现通常需要的供氧培养并且为了防止过滤器和盖之间的接触，优选提供皿和盖以使盖底部不直接置于皿的边缘上。这可以以各种方式实现。例如，该皿的边缘可具有至少3个突起，盖置于它们上。盖因此以稳定方式搁置，但由于这些突起，与皿的实际边缘具有间距。这种类型的一个实施方案图示在图1A中。该图显示圆皿，在其边缘上部有四个突起。为了更好地理解，四个突起之一在该图中用数字“1”标示。如果现在将盖置于这一皿上，这些突起产生盖底部和皿边缘之间的间距。在另一实施方案中，皿壁可具有使盖边缘置于其上的装置，如内侧或外侧的隆起或一个或多个支架。如果盖壁的高度现在该隆起或支架上方高于皿壁的高度，盖底部就不置于皿的边缘上。在一个实施方案中，该隆起设计成外侧的圆形凹槽，盖嵌入其中。这种类型的一个实施方案图示在图1B中。该图显示穿过由壁(2)和底部(3)构成的皿的横截面。环形围绕整个壁的隆起(4)位于壁(2)的外侧。盖能够嵌入由此形成的凹处或凹槽(5)中。如果现在选择相应高的盖壁，盖底部就不置于皿的边缘上。在另一实施方案中，外侧支架不仅实现盖底部和皿边缘之间的间距，还另外引起盖的锁定。为此，可以将该支架设计成例如向外突起的定位横档（Rastnase）、法兰、螺纹状部分、不同嵌接件的组合等。这种类型的可密封陪替氏培养皿是例如WO2008/141597中已知的。本发明还涉及检测液体或气体中的微生物的方法，其特征在于下列方法步骤a)通过过滤器过滤所述液体或气体b)将所述过滤器施加到本发明的陪替氏培养皿的培养基上c)用盖密封所述陪替氏培养皿d)培养来自步骤c)的密封陪替氏培养皿e)评估微生物生长。通过过滤和随后在陪替氏培养皿中培养过滤器研究液体或气体样品的一般方法是本领域技术人员已知的。液体在此特别是水、饮料、液体食品或液体化妆制品。最常研究的气体是空气，例如在药品或饮料和/或食品生产中。该方法通常如下进行。1.过滤器和陪替氏培养皿的提供根据本发明，提供装载培养基至少到边缘下方1毫米，最多到边缘的陪替氏培养皿。在一个优选实施方案中，过滤器和陪替氏培养皿是圆形的。在一个优选实施方案中，陪替氏培养皿内部的直径比过滤器的直径大2至10毫米，优选1至8毫米。由此可以使用具有尽可能小直径的陪替氏培养皿。对于具有47毫米直径的过滤器，例如具有55毫米直径的陪替氏培养皿因此是合适的。上文已经公开了陪替氏培养皿和过滤器的其它必需和优选的性质。2.将过滤器引入漏斗或用于过滤液体或气体的另一装置中。这种类型的装置是本领域技术人员已知的。用于过滤液体的装置的实例可见于WO2008113443和其中引用的文献。通常，使50至500毫升，优选100至250毫升液体经过过滤器。此时，微生物保持附着在过滤器上。3.从过滤装置中移除过滤器任选地，可以在从过滤装置中取出前冲洗该过滤器，以排除在随后检测微生物的过程中原始液体的可能的干扰影响。4.将过滤器引入陪替氏培养皿中通常使用无菌镊子将该过滤器放置在敞开的陪替氏培养皿的培养基上。然后用盖密封该皿。5.培养密封的陪替氏培养皿为此，通常将陪替氏培养皿放置在培养器中。对于不同的微生物类型，培养时间和培养温度不同。培养时间通常为12至48小时。温度通常为大约36℃。对于在显色大肠菌琼脂上的大肠杆菌/大肠菌，培养时间为例如在大约36℃下优选18至24小时。本领域技术人员能够将温度和培养时间与各种待检测的微生物匹配。6.评估微生物生长在完成培养后，可以从培养器中移除该板并评估。这可以目视或使用合适的仪器进行。评估方法是本领域技术人员已知的。可以通过对形成的微生物集落计数和/或通过评估其它特征进行微生物生长的评估。通常进行在琼脂上形成的集落的计数。如果在琼脂上发现例如20个集落，推测已从样品中滤出20个微生物。根据所用的样品体积，可以由此计算每单位体积的微生物数。其它特征的评估包括检测变色，其例如归因于pH值变化或显色底物的代谢。但是，其它特征的评估也可能意味着分离一种或多种微生物并借助其它试验，例如PCR或抗体基试验对其鉴别。本发明因此提供借助过滤测定液体或气体中的微生物的显著改进。通过简单增加陪替氏培养皿中的培养基装载高度就显著地简化操作。此外，可以降低相对于过滤器而言陪替氏培养皿的尺寸。上文连同附图解释的实施例仅用于所要求保护的教导的举例说明，而非将其限制于这些实施例。即使没有进一步详述，也推测本领域技术人员能够在最广泛的范围内利用上述说明。上下文中引用的所有申请、专利和出版物，特别是2014年8月14日提交的相应申请EP14002840.8的整个公开内容，经此引用并入本申请。当前第1页1 2 3