本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种高效提取土壤中微生物磷脂脂肪酸的方法。
背景技术：
磷脂脂肪酸是活体生物细胞膜磷脂的重要成分，周转速率极快且随细胞死亡而迅速降解，脂肪酸结构与种类多样，对环境因素敏感，分析结果重复性较好，既可以确定微生物总量，也可以根据特殊微生物类群的标志脂肪酸来进行特殊微生物类群的生物量分析，同时可以根据脂肪酸种类来确定微生物群落结构。
土壤磷脂脂肪酸(plfa)提取技术的发展很快，首先基于酯类物质提取方法演变而来。bligh和dyer(1959)采用提取剂氯仿：甲醇：水，提取冻鱼中的脂质物质，方法简便，快速，但此方法仅限于食品，特别是鱼类的磷脂提取，而且是总酯的提取，只能来表征总微生物生物量。20世纪70年代末white等进一步发展了这个方法，将提取剂改为氯仿：甲醇：磷酸盐缓冲液(体积比为1:2:0.8)，分析了河口和海底沉积物中磷脂的含量，并与atp和dna合成等表征沉积物生物量的方法进行了比较，认为磷脂可以作为表征微生物生物量的一个指标。tunlid等(1985)，通过提取和分离磷脂脂肪酸来对油菜根际微生物生物量和群落结构进行了分析，最终奠定了现代plfa分析技术的雏形。20世纪90年代初，frostegard等人，用酸性柠檬酸代替中性磷酸盐缓冲液可提取酸性高的有机质土壤，可提高磷脂回收率且避免无机磷污染，这一改进方法目前应用较广。
但上述磷脂脂肪酸分析技术存在诸多的不足，在土壤中加入提取液后，直接就进行了振荡，土壤并不能很好地与提取液混合，导致提取的磷脂脂肪酸不是很充分，主要表现在真菌，放线菌等难破壁微生物的含量较低。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种高效提取土壤中微生物磷脂脂肪酸的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种高效提取土壤中微生物磷脂脂肪酸的方法，将冷冻干燥土样加入过量的提取液中，涡旋振荡混匀，而后于室温超声处理30-40分钟，超声后，加入玻璃珠，室温下避光振荡1-1.5小时，离心收集上清液，沉淀再经提取液重悬，涡旋振荡混匀，而后于室温超声处理 30-40分钟，超声后，室温下避光振荡1-1.5小时，离心，收集上清液与上述上清液合并，合并后加入柠檬酸缓冲液和三氯甲烷，室温下，于黑暗中静置过夜；
收集上述静置后下层的三氯甲烷层，经n2吹干，吹干后经过量的氯仿重悬，而后经硅酸柱分离，并依次用氯仿、丙酮和甲醇依次洗脱，收集甲醇洗脱液，即得到磷脂脂肪酸。
其中，提取液为6.4-6.8ml柠檬酸缓冲液、8-9ml三氯甲烷和16-18ml甲醇。
所述磷脂脂肪酸于-20℃冰箱中避光保存。
所述涡旋时间为30-40s。
所述玻璃珠的加入量为0.5-0.8粒/ml，玻璃珠直径为5mm。
所述离心的条件均为转速4000-5000r/min，离心时间为10-15分钟。
本发明的优点在于：本发明在土壤中提取微生物磷脂脂肪酸，其是利用漩涡，超声和加入玻璃珠避光振荡，便于打碎土壤团聚体结构，使土壤和提取液更充分的混合，微生物细胞更充分的破碎，从而提高土壤微生物磷脂脂肪酸的提取效率，获得更准确的结果。
具体实施方式
实施例1
准确称取冷冻干燥土样4-8克，装入特氟隆离心管中。在离心管中加入提取液(按顺序依次加入柠檬酸缓冲液6.4毫升，三氯甲烷8毫升，甲醇16毫升)，涡旋振荡30s以混匀，然后通过超声震荡器室温(25℃)超声30分钟，超声后，加入玻璃珠15粒(直径5mm)，在水平摇床上避光振荡1小时。离心(4000r/min,10min)，将上清液转移至分液漏斗；离心管中的沉淀用上述提取冷冻干燥土样相等量的提取液重悬，重复涡旋振荡、超声，避光振荡，离心收集离心液(4000r/min，10min)，将其与转移至分液漏斗的上清液合并。合并后加入16ml毫升柠檬酸缓冲液和16ml毫升三氯甲烷，室温下，于黑暗中静置过夜。
所述玻璃珠：
(1)清洗。取直径为5mm的玻璃珠200个，清洗干净，把它们放进一个玻璃瓶中。
(2)高压灭菌。把玻璃瓶放进灭菌锅中高压灭菌，条件是压力101kpa，温度121℃，时间为30分钟。
(3)正己烷清洗。高压蒸汽灭菌后，在烘箱中烘干，冷却，然后用正己烷冲洗玻璃珠和玻璃瓶两遍，待正己烷挥发后，将清洗后的玻璃珠在室温贮存，使用的时候再取出来。
而后，收集分液漏斗中下层三氯甲烷层于玻璃试管中，n2吹干， 用5毫升氯仿预处理硅酸柱，再将提取物以5ml氯仿分5次溶解后转移到柱中，进行柱层析分离，分别用8ml氯仿，16ml丙酮和8ml甲醇依次洗脱硅酸柱，收集最后的甲醇洗脱液，即得到从土壤中提取的磷脂脂肪酸，放入-20℃冰箱中避光保存。
将上述获得脂类样品溶解在1ml甲醇与甲苯的混合溶液(甲醇：甲苯＝1:1(v/v))中，而后加入1ml0.2mkoh甲醇溶液，再于35℃水浴保温15分钟，室温冷却，加入2ml去离子水，0.3ml1m冰醋酸和2ml正己烷，旋涡混匀，离心(4000r/min,10min)，将上层正己烷溶液转移至5ml玻璃瓶中，待用；离心剩余物质再由1ml的甲醇与甲苯的混合溶液(甲醇：甲苯＝1:1(v/v))溶解，而后加入1ml0.2mkoh甲醇溶液，再于35℃水浴保温15分钟，室温冷却，加入2ml去离子水，0.3ml1m冰醋酸和2ml正己烷，旋涡混匀，离心(4000r/min,10min)，收集将上层正己烷溶液与上述转移至玻璃瓶中的正己烷溶液合并，合并后经n2吹干，得到磷脂脂肪酸甲酯。-20℃避光保存。
使用正己烷溶解磷脂脂肪酸甲酯样品，加入内标，即可用于气相色谱分析。
由上述检测可知，通过经过本发明提供的磷脂脂肪酸的分离效率提高15％，其中表征细菌的十五烷酸甲酯(15:0)，十六碳烯酸甲酯(16:1w7c)，环十七烷酸甲酯(cy17:0)，异十六烷酸甲酯(i16:0)，反异构十五烷酸甲酯(a15:0)提高26％。表征真菌的γ-亚麻酸甲酯(18:3w6c)，亚油酸甲酯(18:2w6c)，油酸甲酯(18:1w9c)以及表征放线菌的10-甲基十六烷酸甲酯(16:010-methyl)，10-甲基十八烷酸甲酯(18:010-methyl)脂肪酸产量分别提高11.3％和8.9％。